CN114350629B

CN114350629B - 维生素d3 c-25位p450羟化酶及其基因、表达载体、菌株及应用

Info

Publication number: CN114350629B
Application number: CN202210101216.1A
Authority: CN
Inventors: 李会; 许正宏; 侯懿娜; 史劲松; 张晓梅; 龚劲松
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-01-27
Filing date: 2022-01-27
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2042-01-27
Also published as: CN114350629A

Abstract

本发明涉及一种维生素D3 C‑25位P450羟化酶及其基因、表达载体、菌株及应用，属于酶工程技术和基因工程技术领域。维生素D3 C‑25位P450羟化酶CYP109E1‑H的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，并将基因cyp109E1‑H插入pMA5质粒中，以枯草芽孢杆菌WB600为表达宿主构建菌株，实现了维生素D3 C‑25位P450羟化酶CYP109E1‑H的异源表达，且成功实现了对维生素D₃的高效转化，同时专一性高，减少反应副产物，降低了生产成本，为其进一步的工业化应用奠定基础。

Description

维生素D3 C-25位P450羟化酶及其基因、表达载体、菌株及应用

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种维生素D3 C-25位P450羟化酶及其基因、表达载体、菌株及应用。

背景技术

在人体内，维生素D主要以维生素D₃形式存在，维生素D₃是最重要的维生素D族化合物。维生素D₃(VD₃)是没有活性的，只有转化成有活性的代谢产物才能发挥作用。维生素D3的活性衍生物主要有25(OH)VD₃(骨化二醇)、1α,25(OH)₂VD₃(骨化三醇)等。维生素D₃在肝脏中代谢可形成代谢产物25(OH)VD₃，在体内吸收速度很快，性质稳定且半衰期长。因此，25(OH)VD₃被作为衡量体内可利用维生素D水平的最佳指标。25(OH)VD₃是获得美国食品药品管理局(FDA)认证的一般公认安全级(GRAS)维生素D₃代谢物，在临床上用于治疗甲状腺功能衰退、牛皮癣、慢性肾功能衰竭、骨质疏松症、佝偻病、骨软化症等代谢性骨病的治疗，以及血液透析所致的低血钙症，使血清钙水平增高。除此之外，在饲料添加剂等方面也有广泛应用。

传统生产25(OH)VD₃是化学合成法，由Zhu等提出的以胆固醇及相关衍生物为原料，通过多步化学反应。但是化学合成法步骤多、转化率低，污染大且过程复杂。因此微生物转化法生产25(OH)VD₃具有广泛的应用前景。研究表明，一些微生物能够将维生素D3转化成骨化二醇和骨化三醇，曾志刚等(放线菌SIIA243对维生素D3的羟基化研究[J].中国抗生素杂志,2014,39(2):114-117.DOI:10.3969/j.issn.1001-8689.2014.02.009.)采用放线菌SIIA243对维生素D₃进行羟基化，得到25(OH)VD₃和1α,25(OH)₂VD₃。但得到的混合产物后续分离纯化步骤复杂，且纯度不高。因此，仍需一种高纯度生产25(OH)VD₃的方法。付跃等(生物法生产25-羟基维生素D3条件优化[J].安徽农业科学,2017(2).DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2017.02.003.)采用放线菌UV-FY-141进行发酵，通过优化发酵条件，确定发酵培养基的组成为葡萄糖15.00g，蛋白胨20.00g，NaCl 5.00g，CaCO₃ 2.00g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，去离子水1000mL，优化后转化条件为发酵初始pH为6.5，发酵温度为28℃，摇床转速为200r/min，发酵时间为72h，使25(OH)VD₃的产量提高到13.13mg/L。但以上方法存在纯度低、产量低、生产成本高等问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种维生素D3 C-25位P450羟化酶，其可以介导选择性催化底物维生素D₃生成产物25(OH)VD₃的过程，对25(OH)VD₃的高效生产具有重要意义。

本发明的第一个目的是提供一种维生素D3 C-25位P450羟化酶，该维生素D3 C-25位P450羟化酶可催化维生素D₃的C-25位羟基化，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码上述维生素D3 C-25位P450羟化酶的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种重组表达载体，该重组表达载体含有编码维生素D3 C-25位P450羟化酶的基因。

本发明的第四个目的是提供一种表达上述维生素D3 C-25位P450羟化酶的重组枯草芽孢杆菌，该重组枯草芽孢杆菌含有上述编码维生素D3 C-25位P450羟化酶的基因或含有编码维生素D3 C-25位P450羟化酶的基因的重组表达载体。

进一步地，上述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600为宿主，以pMA5为质粒。

上述维生素D3 C-25位P450羟化酶或表达维生素D3 C-25位P450羟化酶的重组枯草芽孢杆菌在制备25(OH)VD₃中的应用，具体地，以维生素D3为底物，羟基化其C-25位。

进一步地，采用重组枯草芽孢杆菌合成25-羟基维生素D3时，将重组枯草芽孢杆菌接种至种子液培养基中培养，得到种子液；将种子液接种至发酵培养基中，发酵制备25-羟基维生素D3；其中，种子液培养基的成分包括3-10g/L酵母粉、5-15g/L蛋白胨和5-15g/LNaCl；发酵培养基的成分包括5-15g/L酵母粉、15-30g/L蛋白胨、1-10g/L K₂HPO₄、5-20g/LKH₂PO₄和20-50mL/L甘油。

进一步地，底物维生素D3的浓度为0.15-1.5g/L。

进一步地，表达维生素D3 C-25位P450羟化酶的重组枯草芽孢杆菌发酵生产25(OH)VD₃时，发酵条件为25-40℃，200-250r·min^-1转化12～120h。

本发明的维生素D3 C-25位P450羟化酶及重组枯草芽孢杆菌在制药和制备饲料(如作为动物饲料添加剂)等方面均有巨大应用潜力，如制备甲状腺功能衰退、牛皮癣、慢性肾功能衰竭、骨质疏松症、佝偻病、骨软化症等代谢性骨病以及低血钙症的治疗药物。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明提供了一种维生素D3 C-25位P450羟化酶CYP109E1-H，并将基因cyp109E1-H插入pMA5质粒中构建重组表达质粒pMA5-CYP109E1-H，以枯草芽孢杆菌WB600为表达宿主，实现维生素D3 C-25位P450羟化酶CYP109E1-H的异源表达，且成功实现了对维生素D₃的高效转化，同时专一性高，减少反应副产物，降低了生产成本，为其进一步的工业化应用奠定基础。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为枯草芽孢杆菌重组菌蛋白SDS-PAGE图谱；其中，M为Marker，泳道为枯草芽孢杆菌WB600-pMA5-CYP109E1-H全蛋白样品；

图2为不同初始pH下骨化二醇25(OH)VD₃的产量；

图3为枯草芽孢杆菌WB600-pMA5-CYP109E1-H转化维生素D₃为25(OH)VD₃化合物的HPLC图谱；

图4为枯草芽孢杆菌WB600-pMA5-CYP109E1-H转化维生素D₃为25(OH)VD₃化合物的MS图谱；

图5为VD₃和25(OH)VD₃的浓度随时间变化情况；

图6为更换不同宿主后的重组菌发酵液HPLC液相图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

种子液培养基配方为LB培养基：酵母粉5(g/L)；蛋白胨10(g/L)；NaCl10(g/L)；

发酵培养基配方为：酵母粉10(g/L)；蛋白胨20(g/L)；K₂HPO₄ 3(g/L)；KH₂PO₄ 12(g/L)；甘油40(mL/L)。

维生素D3 C-25位P450羟化酶CYP109E1-H催化反应产物HPLC分析条件为：

用1mL二氯甲烷分两次提取反应产物2分钟。将两次提取的二氯甲烷混合后晾干。然后将残留物溶解在1mL甲醇中。在Agilent TC-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)上以50-100％乙腈-水为流动相进行线性梯度洗脱12min，然后用100％乙腈洗脱13min。第二次进样前，进行5分钟的重新平衡。进样量20μL，检测波长为265nm，流速1.0mL/min，柱温40℃。

实施例1宏基因组筛选

基于宏基因组技术，在提前埋有维生素D3的土壤收集土样，用土壤基因组提取试剂盒提取样品总DNA，为宏基因组DNA为模板。以P450酶的保守序列进行简并引物设计并且进行PCR扩增，筛选目的P450酶基因，然后根据测序结果进一步设计引物通过PCR技术扩增获得完整的基因编码序列。扩增获得的片段测序后与NCBI数据库进行比对，根据结果再进一步设计引物，扩增获得完整的维生素D3 C-25羟化P450酶基因编码序列，命名为维生素D3C-25羟化P450酶CYP109E1-H及其基因序列cyp109E1-H。

实施例2枯草芽孢杆菌WB600-pMA5-CYP109E1-H的构建

(1)维生素D3 C-25位P450羟化酶CYP109E1-H及其基因序列cyp109E1-H的克隆

前期通过宏基因组筛选获得了有关维生素D3 C-25位P450羟化酶CYP109E1-H及其基因序列cyp109E1-H，设计引物扩增目的基因，引物序列如下：

引物F：

AAAAGGAGCGATTTACATATGATGAAAACAGAAAGAGAAAACGGAA；

引物R:

GAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTATACGTTTTTACGAATCAATAATTCTTT

以获得的DNA序列为模板，以上述核苷酸序列作为引物，PCR扩增维生素D3 C-25位P450羟化酶CYP109E1-H及其基因序列cyp109E1-H。PCR反应在50μL的体系中进行，反应条件为：95℃预变性3min后开始循环；95℃变性30s，58.4℃退火30s，72℃延伸1.5min，共34个循环；72℃终延伸5min。

通过对获得PCR产物进行测序、基因走读和基因拼接，获得了cyp109E1-H基因全序列(1215bp)，如SEQ ID NO.2所示。经与已报道来源于DSM319的cyp109E1核酸序列比对，同源性仅为94.07％。经翻译获得了CYP109E1-H氨基酸序列(404aa)，如SEQ ID NO.1所示。经与已报道来源于DSM319的CYP109E1氨基酸序列比对，同源性仅为96.78％。因此，确定为一新的P450酶基因。

(2)重组表达质粒pMA5-CYP109E1-H的构建

本实施例所采用的表达质粒是表达质粒pMA5，将质粒pMA5与维生素D3 C-25位P450羟化酶CYP109E1-H的PCR产物分别双酶切后割胶回收，用T4连接酶在16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，在含氨苄抗性(50mg/L)的LB平板培养过夜，筛选阳性转化子，进行富集培养后提取质粒，命名为重组表达质粒pMA5-CYP109E1-H。

(3)枯草芽孢杆菌WB600-pMA5-CYP109E1-H的构建及诱导表达

取上述获得的枯草芽孢杆菌重组表达质粒pMA5-CYP109E1-H转化枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600感受态细胞，在含Kana抗性(100mg/L)的LB平板培养过夜，筛选阳性转化子WB600-pMA5-CYP109E1-H。挑取转化子至10mL LB液体培养基37℃培养36h，对菌液的蛋白进行SDS-PAGE分析。

结果如图1所示，泳道为枯草芽孢杆菌WB600-pMA5-CYP109E1-H菌液样品，目的蛋白CYP109E1-H大小约为46kDa，从图看到在相应的位置出现正确的条带，证明该酶蛋白可以在枯草芽孢杆菌中可溶性表达。

实施例3维生素D3 C-25位P450羟化酶CYP109E1-H的最适温度

分别在30℃、37℃进行全细胞转化72h，其余条件同实施例2。骨化二醇25(OH)VD₃的产量如下表。

由上表可知，维生素D3 C-25位P450羟化酶CYP109E1-H的最适催化温度为30℃。

实施例4维生素D3 C-25位P450羟化酶CYP109E1-H的最适pH

不同初始pH下(30℃)骨化二醇25(OH)VD₃的产量如下表(图2)。

由上表可知，维生素D3 C-25位P450羟化酶CYP109E1-H的最适pH为7.5。

实施例5维生素D3 C-25位P450羟化酶CYP109E1-H催化转化维生素D₃

将重组菌枯草芽孢杆菌WB600-pMA5-CYP109E1-H在LB培养基培养12h，后转接至发酵培养基中，加入0.25g/L的VD₃进行转化。30℃，220r·min^-1转化72h后，取样进行LC-MS分析，液相色谱结果如图3所示。重组菌枯草芽孢杆菌WB600-pMA5-CYP109E1-H发酵液产物与25(OH)VD₃标准品液相色谱出峰时间相对应。MS图谱如图4所示。重组菌枯草芽孢杆菌WB600-pMA5-CYP109E1-H发酵液产物MS图谱与25(OH)VD₃标准品MS图谱相对应计算得到CYP109E1-H转化维生素D₃为25(OH)VD₃，转化率达98％。

重组菌枯草芽孢杆菌WB600-pMA5-CYP109E1-H转化96h，从0h起，每隔12h测定底物VD₃和产物25(OH)VD₃的浓度，结果见图5。

对比例1更换宿主

宿主菌除枯草芽孢杆菌以外，申请人还尝试构建了重组大肠杆菌BL21-pET28a-CYP109E1-H和重组毕赤酵母GS115-pPIC3.5K-CYP109E1-H，经SDS-PAGE表达验证实验证实以上重组菌均能表达目标酶，重组菌发酵液HPLC液相图谱如图6所示，重组大肠杆菌和重组毕赤酵母均不能转化维生素D3生产目标产物，只有重组枯草芽孢杆菌有完整羟化功能。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 江南大学

<120> 维生素D3 C-25位P450羟化酶及其基因、表达载体、菌株及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 404

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Met Lys Thr Glu Arg Glu Asn Gly Ile Val Arg Gln Val Asn Thr Ile

1 5 10 15

Gln Thr Lys Glu Glu Arg Phe Asn Pro Phe Ser Trp Tyr Glu Glu Met

20 25 30

Arg Asn Ser Glu Pro Val Gln Trp Asp Glu Glu Arg Gln Val Trp Asp

35 40 45

Val Phe His Tyr Asp Gly Val Lys Glu Val Leu Glu Gln Lys Asn Ile

50 55 60

Phe Ser Ser Asp Arg Arg Pro Pro Gln Asn Gln Arg Gln Thr Ala Leu

65 70 75 80

Gly Thr Ser Leu Ile Asn Ile Asp Pro Pro Lys His Ala Glu Met Arg

85 90 95

Ala Leu Val Asn Lys Ala Phe Thr Pro Lys Ala Met Lys Ala Trp Glu

100 105 110

Pro Lys Ile Ala Arg Ile Thr His Glu Leu Leu Gln Glu Val Glu His

115 120 125

Leu Glu Asp Ile Asp Ile Val Glu His Leu Ser Tyr Pro Leu Pro Val

130 135 140

Met Val Ile Ala Asp Ile Leu Gly Val Pro Ile Glu Asp Gln Arg Gln

145 150 155 160

Phe Lys Asp Trp Ser Asp Ile Ile Val Ala Gly Pro Ser Asn Asn Glu

165 170 175

Arg Glu Thr Leu Glu Lys Leu Gln Gln Glu Lys Met Lys Ala Asn Asp

180 185 190

Glu Leu Glu Thr Tyr Phe Tyr Arg Ile Ile Glu Glu Lys Arg Thr His

195 200 205

Pro Gly Asp Asp Ile Ile Ser Val Leu Leu Gln Ala Lys Glu Glu Gly

210 215 220

Thr Gln Leu Thr Asp Glu Glu Ile Val Gly Phe Ser Ile Leu Leu Leu

225 230 235 240

Ile Ala Gly Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu Ile Ser Asn Thr Ile Tyr

245 250 255

Cys Leu Met Glu Asp Lys Ala Ser Phe Glu Arg Leu Lys Arg Glu Lys

260 265 270

Glu Leu Leu Pro Ser Ala Ile Glu Glu Val Leu Arg Tyr Arg Ser Pro

275 280 285

Val Gln Ala Leu His Arg Ile Val Lys Glu Asp Val Ile Leu Ala Gly

290 295 300

Lys Lys Leu Lys Ala Gly Glu His Val Ile Pro Trp Met Gly Ser Ala

305 310 315 320

His Arg Asp Ala Gln Tyr Phe Glu Asp Pro Asp Val Phe Lys Ile Asp

325 330 335

Arg Lys Pro Asn Met His Met Ala Phe Gly Arg Gly Ile His Phe Cys

340 345 350

Leu Gly Ala Pro Leu Ala Arg Ile Glu Ala Lys Ile Met Leu Ser Glu

355 360 365

Leu Ile Asp Arg Tyr Pro His Met Asp Trp Ser Pro Ser Phe Glu Leu

370 375 380

Lys Pro Ile Glu Ser Thr Phe Val Tyr Gly Leu Lys Glu Leu Leu Ile

385 390 395 400

Arg Lys Asn Val

<210> 2

<211> 1215

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

atgaaaacag aaagagaaaa cggaatcgtc cgtcaagtga atacgattca aacaaaagaa 60

gagcgcttta atcctttctc ttggtacgaa gagatgagaa acagtgaacc tgtgcagtgg 120

gatgaagaaa ggcaggtatg ggatgttttt cactatgacg gagtcaaaga agtactggag 180

caaaagaata ttttttcttc tgatcgaaga cctccacaaa accaaagaca aactgcttta 240

ggaacgagcc taattaatat tgatccgcct aagcacgctg aaatgagagc acttgttaat 300

aaagctttta cgcctaaagc aatgaaagca tgggagccta aaattgctcg cattacacat 360

gaattattac aagaagttga gcaccttgaa gacattgata tagtcgagca tctttcctac 420

ccgcttccgg ttatggtgat tgccgatata ttaggcgtgc cgatagaaga ccagcgtcag 480

tttaaagatt ggtcggatat tatcgtagcg ggtccgtcga ataatgaacg tgaaacgcta 540

gaaaaattgc agcaagagaa aatgaaggca aatgatgagc tagaaactta cttttatcga 600

atcattgaag aaaaacgcac ccatccagga gatgatatta tctccgtgct tcttcaggca 660

aaagaagaag ggacacagct aacggatgaa gaaatcgtag ggttttccat tttgctgttg 720

attgcaggaa acgaaaccac aacaaattta atttcaaata cgatttattg tttaatggaa 780

gataaagctt cttttgaacg actcaaacga gagaaagaac ttttgccttc tgcgattgaa 840

gaagttcttc gctatcgttc acccgttcaa gctcttcacc gaatcgtaaa agaagatgtg 900

attcttgcag gcaagaaatt aaaagcagga gaacacgtca ttccatggat gggatcagcg 960

caccgagacg cgcagtactt tgaagacccg gatgtattta aaatcgaccg aaagccaaat 1020

atgcatatgg catttggaag aggcattcat ttttgcttag gagcaccgct tgctcgaata 1080

gaagcaaaaa ttatgctatc tgagctgatc gaccgctatc cgcatatgga ctggagcccg 1140

tcatttgagt taaagccgat tgaaagcaca tttgtgtatg ggttaaaaga attattgatt 1200

cgtaaaaacg tataa 1215

Claims

1.一种表达维生素D3 C-25位P450羟化酶的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的维生素D3 C-25位P450羟化酶。

2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：编码所述维生素D3 C-25位P450羟化酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌WB600为宿主，以pMA5为质粒。

4.权利要求1-3任一项所述的重组枯草芽孢杆菌在催化维生素D3转化为25-羟基维生素D3中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：采用权利要求1-3任一项所述的重组枯草芽孢杆菌合成25-羟基维生素D3时，将重组枯草芽孢杆菌接种至种子液培养基中培养，得到种子液；将种子液接种至发酵培养基中，发酵制备25-羟基维生素D3；

所述种子液培养基的成分包括3-10 g/L酵母粉、5-15 g/L蛋白胨和5-15 g/L NaCl；

所述发酵培养基的成分包括5-15 g/L酵母粉、15-30 g/L蛋白胨、1-10 g/L K₂HPO₄、5-20 g/L KH₂PO₄和20-50 mL /L甘油。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：发酵条件为25-40℃，200-250 r·min^-1转化12~120 h。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述维生素D3的浓度为0.15-1.5g/L。