CN106906201A - 一种生产橙花叔醇的萜类合酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产橙花叔醇的萜类合酶及其应用，属于合成生物学领域。通过提供一种合成橙花叔醇的萜类合酶TPF09930，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，与含有甲羟戊酸途径相关基因一起构建用于生产橙花叔醇的菌株。对甲羟戊酸途径的来源于大肠杆菌XL1‑blue的atoB基因或idi基因过表达，合成大量催化底物法尼基焦磷酸FPP，可以进一步促进生产橙花叔醇。本发明的萜类合酶具有专一性和高效性，可以提高橙花叔醇的产量，极大地克服了原料投入量大而橙花叔醇产率低的弊端，降低了研究成本，并且保证绿色环保。

Description

一种生产橙花叔醇的萜类合酶及其应用

技术领域

本发明属于合成生物学领域，涉及一种生产倍半萜化合物—橙花叔醇(nerolidol)的萜类合酶及其应用。

背景技术

萜类化合物是含有异戊二烯单元的化合物的总称。它在自然界广泛存在，迄今为止，人们已从动物、植物以及微生物体内发现大约76 000种萜类化合物。该化合物具有许多生理活性，所以被广泛应用于香水生产行业、保健品行业、农业生产领域以及医疗行业。

萜类化合物的生产方法有天然提取、化学合成法和发酵法。但由于天然提取法生产成本居高不下，化学合成法可能的毒害作用和国际上对天然产物的日益推崇，人们开始大量研究利用微生物发酵法生产萜类化合物。

生物体利用2-甲基-赤藓糖醇磷酸(MEP途径)或者甲羟戊酸途径(MVA途径)以及异戊烯焦磷酸异构酶Idi合成IPP以及DMAPP，随后IPP以及DMAPP在异戊烯转移酶催化下合成GPP、FPP，GGPP以及GFPP等不同链长的异戊二烯单元。随后萜类合酶(terpene synthase，TS)可以这些不同链长的异戊二烯单元为底物，合成单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C120)、二倍半萜(C25)、三萜(C30)、四萜(C40)以及多萜。

这其中，单萜和倍半萜为香水及香料化合物的主要来源，对有关这些化合物生物合成基因的挖掘及在萜类化合物微生物合成高产平台中进行代谢工程改造，将使得我们能够高效经济地实现这些高附加值产物的合成。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明提供一种新型的萜类合酶TPF09930及含有该萜类合酶基因的生产橙花叔醇的菌株，以实现倍半萜化合物橙花叔醇微生物合成，提高产量、降低成本，为香水及香料化合物的主要来源，减少毒害作用。

本发明的第一方面，提供一种萜类合酶TPF09930，其具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

进一步地，本发明提供一种核酸分子，其编码上述萜类合酶TPF09930，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的第二方面，提供萜类合酶TPF09930的用途，用于生产橙花叔醇。

本发明的第三方面，提供一种生产橙花叔醇的菌株，该菌株含有甲羟戊酸途径(MVA途径)和橙花叔醇合成的相关基因；所述的甲羟戊酸途径的相关基因包括(1)将乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A的基因atoB、(2)将乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合为HMG-CoA的基因erg13、(3)将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因thmg1、(4)将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因erg12、(5)将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因erg8、(6)将甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊烯焦磷酸的基因mvd1和(7)将异戊烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi；所述的橙花叔醇合成的相关基因包括ispA和萜类合酶TPF09930基因，所述的TPF09930基因，其序列如SEQ ID NO：2所示。合成的目标萜类化合物橙花叔醇具有下列式(I)的结构：

所述的甲羟戊酸途径的相关基因优选为来源于大肠杆菌XL1-blue的atoB基因(AM946981.2)、idi(CP010152.1)和来源于酿酒酵母INVSC1的erg13基因(CP005477.2)、tHMG1(CP005464.2)、erg12(CP008027.1)、erg8(CP005426.1)、mvd1(CP005554.2)。

所述的萜类合酶TPF09930基因来源于真菌交链格孢TPF6菌株(Alternariaalternata TPF6)的TPF09930，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其氨基酸序列为SEQ IDNO：1。

优选的，所述的生产橙花叔醇的菌株为含有质粒pMH1、质粒pFZ81和质粒pGB136的大肠杆菌；所述的质粒pMH1以pBBR1MCS为骨架载体、启动子为lac启动子，复制子替换为p15A复制子，包含atoB、erg13和thmg1基因，pMH1的序列(不含骨架载体序列)如SEQ IDNO.3所示；所述的质粒pFZ81以pBBR1MCS-2为骨架载体、启动子为lac启动子、复制子为质粒自带的pBBR1MCS复制子，包含erg12、erg8、mvd1和idi基因，pFZ81的序列(不含骨架载体序列)如SEQ ID NO.4所示；所述的质粒pGB286以pET21为骨架载体、启动子为T7启动子、复制子为质粒自带的高拷贝的pBR322复制子，包含TPF09930、ispA、idi基因，pGB286的序列(不含骨架载体序列)如SEQ ID NO.5所示。

优选的，所述的生产橙花叔醇的菌株原核表达时过表达来源于大肠杆菌XL1-blue的atoB基因或idi基因，合成大量催化底物法尼基焦磷酸FPP。

本发明的第四方面是提供上述生产橙花叔醇的菌株在生产橙花叔醇中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：本发明首次利用萜类合酶TPF09930基因结合外源的甲羟戊酸途径获得了稳定生产橙花叔醇的大肠杆菌。本发明的萜类合酶具有专一性和高效性，可以提高橙花叔醇的产量，极大地克服了原料投入量大而橙花叔醇产率低的弊端，降低了研究成本，并且保证绿色环保。

附图说明

图1为GC-MS检测TPF09930体外反应色谱图；

图2为质粒pMH1结构示意图；

图3为质粒pFZ81结构示意图；

图4为质粒pGB286结构示意图；

图5为用于TPF09930-FPP发酵合成萜类化合物的质粒及突变株的构建示意图；

图6为E.coli菌株N1的发酵产物的GC-MS色谱图；

图7为化合物橙花叔醇的谱图，

其中a为橙花叔醇的结构示意图；b为碳谱图(13C NMR，CDCl₃，101MHz)；c为氢谱图(1H NMR，CDCl₃，400MHz)。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

【实施例1】体外验证萜类合酶的功能

1、质粒pGB136的构建

以反转录的Alternaria alternata TPF6的cDNA为模板，用引物P27/P29(见表1)扩增获得TPF09930的编码区并连接到质粒pET28a上获得质粒pGB136。TPF09930的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2、蛋白的纯化

将含有目的基因(SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列)的表达载体pGB136转化表达宿主E.coli BL21(DE3)，转化后挑取单克隆至含相应抗生素的LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养。按1％接种量转接至1L含相应抗生素的新鲜的LB培养基中，37℃，220rpm培养至OD₆₀₀约为0.6-0.8，降温至16℃，加入终浓度为0.1mM的IPTG，16℃，220rpm培养16-18h。8 000rpm离心5min收集细胞，之后用30-40mL蛋白纯化缓冲液A(Buffer A：50mM Tris-HCl，300mMNaCl，4mMβ-巯基乙醇，pH 7.6)彻底重悬细胞，超声破碎(脉冲5s，停顿8s，超声破碎5min)。4℃，12,000g离心30min以上，收集上清，4℃，20,000rpm离心1h，收集上清，用0.45μm滤膜进行过滤，加入6％buffer B(Buffer B：500mM咪唑加入到Buffer A中)使咪唑约为30mM，混匀备用。

使用Bio-Rad的Biologic DuoFlow Chromatography System纯化组氨酸标签蛋白。蛋白分离柱加载至FPLC上加以控制，FPLC的流速始终为1.5mL/min，而样品自动上样的流速为2mL/min。所得到的上清样品用5mL Hitrap HP Ni-NTA柱子经Biorad做第一步纯化，该镍离子螯合柱先经过30mL(6个柱体积)缓冲液A(Buffer A：50mM Tris-HCl，300mM NaCl，4mMβ-巯基乙醇，pH7.6)的平衡，然后通过自动进样器将准备好的30mL上清液加载到柱子上，再用20mL的缓冲液A(4个柱体积)对柱子进行清洗，这时启动缓冲液B(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，250mM Imidazole pH 7.6)的线性梯度，在100mL(20个柱体积)的流量内，缓冲液B由0％增长为100％，再用20mL(4个柱体积)100％的缓冲液B清洗柱子。根据紫外吸收收集并通过SDS-PAGE检测带有组氨酸标签的目的蛋白。挑选比较纯的组分收集起来，通过Millipore公司的离心浓缩管Amicon Centricon-10(分子量在10,000以下的会被滤出)来离心浓缩至2.5mL，然后通过Pharmacia公司的PD-10柱子脱盐并交换到缓冲液C(含有10％甘油的50mM磷酸缓冲液，pH 7.6)中，分装后液氮速冻并保存于-80℃冰箱。

3、体外催化反应

我们设立了以下体外酶促反应体系：向200μL终浓度为50mM含有10％甘油的PBbuffer(pH 7.6)缓冲液中添加10μM纯化的蛋白，100μM的底物GPP、FPP或GGPP，以及2mM的Mg²⁺，30℃过夜反应。随后用等体积的正己烷萃取2次，合并有机相并用GC-MS检测生成的产物。

萜类化合物检测所用的GC-MS为Thermo TRACE GC ULTRA气相色谱配备TSQQUANTUM XLS MS，气相色谱柱为TRACE TR-5MS(30m×0.25mm×0.25um)。每次分析进样1μL，以高纯的氦气为载气，设置流速为1mL/min。GC条件为80℃维持1min，随后以10℃/min的速率升温到220℃，再在220℃维持15min。进样器和传输线温度分别设定为230℃和240℃。

结果显示，TPF09930(简称AaTS)能够以GPP、FPP或GGPP为底物，合成单萜、倍半萜和二萜产物(图1)。

【实施例2】构建表达载体

用Qiagen公司的Blood and Cell Culture DNA Mini Kit纯化获得大肠杆菌XL1-blue基因组DNA和酿酒酵母INVSC1基因组DNA。

质粒pMH1含有甲羟戊酸途径前三个基因：来源于大肠杆菌XL1-blue的atoB基因(乙酰乙酰辅酶A硫酯酶，AM946981.2)，来源于酿酒酵母INVSC1的erg13(HMG-CoAsynthase，CP005477.2)和tHMG1(HMG-CoA还原酶，删除了HMG1的跨膜区域，CP005464.2)。

质粒pFZ81含有甲羟戊酸途径后四个基因：来源于酿酒酵母INVSC1的erg12(甲羟戊酸激酶，CP008027.1)，erg8(甲羟戊酸-5-磷酸激酶，CP005426.1)和mvd1(甲羟戊酸-5-焦磷酸激酶，CP005554.2)，来源于大肠杆菌XL1-blue的idi(异戊烯焦磷酸异构酶，CP010152.1)基因。

质粒pGB286含有合成倍半萜化合物的三个基因，分别是来源于真菌交链格孢TPF6菌株(Alternaria alternata TPF6)的TPF09930(SEQ ID NO：2)，其氨基酸序列为SEQ IDNO：1；来源于大肠杆菌XL1-blue的Idi；来源于大肠杆菌XL1-blue的ispA，能够以甲羟戊酸产物异戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)为底物合成法尼基焦磷酸，用于倍半萜的合成。

所有基因均通过PCR扩增获得，所用引物见表1。

表1引物序列表

具体构建方法如下：

①质粒pMH1的构建

首先将pBBR1MCS质粒的复制子替换为来源于pMSD15质粒的p15A复制子。以质粒pBBR1MCS为模板用引物P1/P2进行扩增，同时p15A复制子用引物P3/P4扩增(引物序列见表1)，扩增条件为：98℃，2min预变性，然后30个PCR循环98℃,20s；60℃，20s；72℃，6min，最后72℃充分延伸10min。经PCR产物纯化后用Nanodrop测定DNA浓度，然后将20ng pCR扩增的p15A片段和等摩尔的pBBR1MCS片段混合，随后转化大肠杆菌XL1-blue获得质粒pBBR1MCS/p15A。

用引物P5/P6以pBBR1MCS/p15A为模板扩增pMH1质粒骨架，同时用P7/P8、P9/P10、P11/P12为引物扩增相应基因。经PCR产物纯化之后，取50ng pBBR1MCS/p15A扩增产物和等摩尔的各基因扩增产物混合，并用去离子水调整体积到5μL，随后加入至15μL的Gibson缓冲液中混匀，50℃反应1h后转化大肠杆菌XL1-blue，挑取克隆，并将阳性克隆测序获得质粒pMH1(图2)。

②质粒pFZ81的构建

用引物P13/P14以pBBR1MCS-2为模板扩增pFZ81质粒骨架，同时用P15/P16、P17/P18、P19/P20、P21/P22为引物扩增相应基因。经PCR产物纯化之后，取50ng pBBR1MCS-2扩增产物和等摩尔的各基因扩增产物混合，并用去离子水调整体积到5μL，随后加入至15μL的Gibson缓冲液中混匀，50℃反应1h后转化大肠杆菌XL1-blue，挑取克隆，并将阳性克隆测序获得质粒pFZ81(图3)。

③质粒pGB285的构建

以反转录的Alternaria alternata TPF6的cDNA为模板，用引物P27/P28扩增获得TPF09930的编码区并连接到质粒pET21上获得质粒pGB285。

④质粒pGB286的构建

用引物P23/P24以及P25/P26分别从E.coli BL21(DE3)基因组上扩增ispA以及idi基因，随后将ispA克隆至pET21a获得质粒pGB305；将idi克隆至pET21a(+)获得质粒pGB306。分别用XbaI/XhoI，SpeI/XhoI酶切质粒pGB305和pGB306，随后借助同尾酶将pGB306上酶切下来的idi片段连接至质粒pGB305从而获得质粒pGB308。随后用XbaI/XhoI从pGB308上酶切下来ispA-idi片段并借助同尾酶分别将其连接至质粒pGB285，获得质粒pGB286(图4)。

【实施例3】大肠杆菌体内合成TPF09930来源的倍半萜化合物

为了生产倍半萜化合物，将甲羟戊酸途径的两个质粒pMH1和pFZ81同时转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得BL21(DE3)/pMH1/pFZ81，命名为PS，随后将pGB286转化进入菌株PS中，获得菌株N1，随后分别挑取单克隆至10mL的LB培养基中(同时含有100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素)，37℃，220rpm过夜培养，随后按1％接种量接种到新鲜的同一培养基中37℃，220rpm继续培养至OD600约为0.6～0.8时，降温至16℃并加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达，诱导表达18h后升温至28℃发酵72h，随后对其进行发酵及产物萃取，收集菌体及发酵液用等体积的正己烷萃取2次，减压蒸馏后甲醇复溶(加入甲醇前先加入少量DMSO助溶)，用于产物纯化。

结果显示，含有TPF09930的突变株E.coli N1能够以FPP为底物合成保留时间为11.11min的具有木质清香的化合物橙花叔醇(图6)。

【实施例4】化合物鉴定

1H NMR和13C NMR结果显示(图7)GC-MS保留时间为11.11min的化合物为无色油状物反式橙花叔醇(trans-nerolidol)。¹H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ5.91(dd,J＝17.3,10.8Hz,1H),5.21(dd,J＝17.3,1.3Hz,1H),5.13(t,J＝5.8Hz,1H),5.10–5.05(m,1H),5.06(dd,J＝10.8,1.3Hz,1H),2.11–2.00(m,4H),1.99–1.95(m,2H),1.67(s,3H),1.59(s,6H),1.58(m,2H),1.27(s,3H)。¹³C NMR(101MHz,cdcl3)δ145.02,135.60,131.46,124.20,124.17,111.66,73.52,42.01,39.69,27.90,26.62,25.70,22.71,17.69,16.01。橙花叔醇[M-OH]⁺的理论分子量为205.1951，高分辨质谱检测结果显示其实际分子量为205.1939。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 一种生产橙花叔醇的萜类合酶及其应用

<160> 34

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 328

<212> PRT

<213> 交链格孢

<400> 1

Met Arg Tyr Gln Tyr Ser Glu Arg Val Glu Ser His Arg Tyr Arg Asp

1 5 10 15

Asp Gly Leu Ala Asn Asn Ile His Leu Arg Ile His Lys Asp Ser Tyr

20 25 30

Lys Glu Val Ile Gly Thr Leu Arg Ala Gln Asn Asp Trp Ser Arg Leu

35 40 45

Val Ser Ser Met Thr Lys Tyr His Gly Gly Leu Gly Asp Leu Phe Ser

50 55 60

Phe Ile Ser Val Thr Ile Pro Glu Cys Leu Pro Glu Arg Leu Glu Val

65 70 75 80

Val Ala Tyr Ala Asn Glu Tyr Ala Phe Leu Tyr Asp Asp Gln Met Glu

85 90 95

Arg Leu Asp Leu Lys Asp Phe Arg Glu Gly Arg Asp Asp Met Leu Asp

100 105 110

Ile Phe Gly Ile His Gly Gly Ala Ser Asn Leu Glu Asp Arg Arg Pro

115 120 125

Glu Lys Thr Leu Gln Leu Gln Ile Phe Asp Glu Leu Met Ala Ile Asp

130 135 140

Gln Asp Arg Ala Ile Val Thr Met Gln Ala Trp Ala Lys Phe Ile Asp

145 150 155 160

Leu Ala Ser Arg Thr Arg Val Glu Pro Phe Asn Thr Leu Ala Ala Tyr

165 170 175

Leu Pro Ser Arg Thr Ile Asp Ala Gly Glu Leu Phe Trp Phe Gly Met

180 185 190

Leu Thr Phe Ala Met Ala Leu Thr Ile Pro Ala His Glu Leu Asp Val

195 200 205

Cys Met Arg Leu Ala Arg Pro Gly Tyr Glu Ala Ile Ser Leu Ile Asn

210 215 220

Asp Ile Tyr Ser Trp Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Glu Lys Ala Gly

225 230 235 240

Gln Asp Tyr Val Phe Asn Ala Val Trp Val Val Met Lys Glu Arg Lys

245 250 255

Cys Asp Glu Gln Lys Ala Thr Glu Phe Cys Lys Asn Leu Ala Arg Gln

260 265 270

Ser Ile Gln Asp Phe Ser Thr Ser Val Asn Thr Pro Gln Val Thr Glu

275 280 285

Leu Ser Cys Asp Ser Arg Thr Tyr Leu Gly Ala Val Arg Leu Ser Tyr

290 295 300

Val Gly Asn Leu Val Trp Ser Ile Tyr Cys Pro Arg Tyr Asn Ile Ala

305 310 315 320

Val Pro Val Tyr His Ser Lys Leu

325

<210> 2

<211> 984

<212> DNA

<213> 交链格孢

<400> 2

atgcgttacc agtatagcga gcgtgtggaa agccaccgtt atcgtgacga tggtctggcg 60

aacaacattc acctgcgtat ccacaaggat agctacaaag aagtgattgg caccctgcgt 120

gcgcaaaacg actggagccg tctggttagc agcatgacca agtatcacgg tggcctgggc 180

gacctgttca gctttattag cgttaccatc ccggaatgcc tgccggagcg tctggaagtg 240

gttgcgtacg cgaacgagta tgcgttcctg tacgacgatc agatggaacg tctggacctg 300

aaagatttcc gtgagggtcg tgacgatatg ctggacatct ttggcattca cggtggcgcg 360

agcaacctgg aggatcgtcg tccggaaaag accctgcagc tgcaaatttt tgacgagctg 420

atggcgattg accaggatcg tgcgatcgtg accatgcaag cgtgggcgaa attcatcgat 480

ctggcgagcc gtacccgtgt tgaaccgttt aacaccctgg cggcgtatct gccgagccgt 540

accattgacg cgggcgagct gttctggttt ggcatgctga ccttcgcgat ggcgctgacc 600

atcccggcgc acgaactgga tgtgtgcatg cgtctggcgc gtccgggtta tgaggcgatc 660

agcctgatta acgacatcta cagctggccg aaggaacgtg cggaggcgga aaaagcgggc 720

caggattacg tgtttaacgc ggtttgggtg gttatgaagg agcgtaaatg cgacgaacaa 780

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cgtctgagct acgtgggcaa cctggtttgg agcatttatt gcccgcgtta caacatcgcg 960

gtgccggttt accacagcaa gctg 984

<210> 3

<211> 4515

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca ccgcggtggc ggccgctcta 60

gaactagtgg atccttagga tttaatgcag gtgacggacc catctttcaa acgatttata 120

tcagtggcgt ccaaattgtt aggttttgtt ggttcagcag gtttcctgtt gtgggtcata 180

tgactttgaa ccaaatggcc ggctgctagg gcagcacata aggataattc acctgccaag 240

acggcacagg caactattct tgctaattga cgtgcgttgg taccaggagc ggtagcatgc 300

gggcctctta cacctaataa gtccaacatg gcaccttgtg gttctagaac agtaccacca 360

ccgatggtac ctacttcgat ggatggcatg gatacggaaa ttctcaaatc accgtccact 420

tctttcatca atgttataca gttggaactt tcaacatttt gtgcaggatc ttgtcctaat 480

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acaggcacca gatcttttca aagttgggaa acggactact gggcctcttg tcataccatc 1020

cttagttaaa acagttgttg caccaccgcc agcattgatt gccttacagc cacgcatggc 1080

agaagctacc aaacaaccct ctgtagttgc cattggtata tgataagatg taccatcgat 1140

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agcgccaaat acgcggtcgt agtcataatt tttatatggt aaacgatcag atgctaatac 1260

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acctaatttt ttctccaaag cgtacaaagg taacttaccg tgaataacca aggcagcgac 1380

ctctttgttc ttcaattgtt ttgtatttcc actacttaat aatgcttcta attcttctaa 1440

aggacgtatt ttcttatcca agctttcaat atcgcgggaa tcatcttcct cactagatga 1500

tgaaggtcct gatgagctcg attgcgcaga tgataaactt ttgactttcg atccagaaat 1560

gactgtttta ttggttaaaa cgaattcgga tccgcgaccc atttgctgtc caccagtcat 1620

gctagccata tggctgccgc gcggcaccag gccgctgctg tgatgatgat gatgatggct 1680

gctgcccata gtgtaatcct ccttattttt taacatcgta agatcttcta aatttgtcat 1740

cgatgttggt caagtagtaa acaccacttt gcaaatgctc aatggaacct tgaggtttga 1800

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tttcggtgat tctcttggct aatttgttag taatatctaa ttccttgata atatgttgga 1920

cgtcaccaac aattttgcaa gaatatagag atgcagctaa accggaaccg taagaaaata 1980

aaccaacacg cttgccttgt aagtcgtcag atccaacata gtttaataga gatgcaaagg 2040

cggcataaac agatgcggtg tacatgttac ctgtgtttgt tggaacaatc aaagattggg 2100

caactctctc tttgtggaat ggcttagcaa cattaacaaa agttttttca atgttcttat 2160

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aggttggaac atggaaaacg ttgtagtcga aatatttcaa aacgttcaaa gcatccgaac 2340

cagcgggatc gctaaccaac cctttagaaa tagccttctt ggaataactc ttgtaaactt 2400

gatcaagagc cttgacgtaa caagttaatg aaaaatgacc atcgacgtaa ggatattcgc 2460

tggtgaaatc tggcttgtaa aaatcgtagg cgtgttccat gtaagaagct cttacagagt 2520

caaatacaat tggagcatca ggaccgatcc acatagcaac agtaccggca ccaccggttg 2580

gtcttgcggc acccttatcg tagatggcaa tatcaccgca aactacaatg gcgtctctac 2640

catcccatgc gttagattca atccagttca aagagttgaa caacgcgttg gtaccaccgt 2700

aacaggcatt aagcgtgtca ataccttcga cgtcagtgtt ttcaccaaac aattgcatca 2760

agacagactt gacagacttg gacttgtcaa tcagagtttc agtaccgact tctaatctac 2820

caattttgtt ggtgtcgatg ttgtaactct tgatcaactt agacaaaaca gttagggaca 2880

tcgagtagat atcttctctg tcattgacaa aagacatgtt ggtttggccc agaccaattg 2940

tgtatttacc ttgagaaacg ccatcaaatt tctctagctc agattggttg acacattgag 3000

ttgggatgta aatttggata cctttaatac cgacattttg aggtctggtt ttttgttcag 3060

cggtcttttg tttttttagt tcagtcattt gcaagtttgt attgtgtaat tgttgttgct 3120

tttgcggcct aagtcttcct ttaataccac accaacaaag tttagttgag agtttcattt 3180

agctgtcctc cttaattcaa ccgttcaatc accatcgcaa ttccctgacc gccgccaatg 3240

cacagtgttg ccagccccag cgttttatcg cgtgcctgca tggcatgtaa tagtgtgacc 3300

agaatacgag caccactggc accgatagga tgcccgagcg cgatggcccc gccgttgaca 3360

ttcactttct cagaatcaaa gcccaggttt ttcccaacgg caaggaactg tgcagcaaat 3420

gcttcattag cctcaatgag atcaatatcc gccagttgca gccccgccag ttgtaacgct 3480

ttttgcgtgg caggtactgg ccccataccc atcaatgcgg ggggcacgcc accgctggca 3540

taacttttaa tgcgagccag gggggtaagg cctgctgcca gcgccgcaga ttcttccata 3600

atcaccagag cggcagcacc gtcgttaata ccagacgcgt tcccagcggt gactgttcct 3660

gctttatcga aggccgggcg caatgcacct aacgcttcag ccgttgaatt cgctttcggg 3720

aattcgtctt gactgaagac gaaggttttc tttcgagtga caacatttac cgggacgatt 3780

tcggctgtaa aagcaccgga ctcaattgcg gctgccgctt tacgctgtga atgtagcgcc 3840

agttcatcct gcatttcacg ggtaattccg tactctttag ccacgttttc ggcggtaatc 3900

cccatatgat aaccatgggt ggcgcacatc aggccatcgc gcaggattac gtcataaacc 3960

tgtccgtctc caagacgata accagagcgt gcttttgcat cgagtaagta gggggctaaa 4020

ctcatatttt ccataccccc cgccacaatg ctctgcgcct gacctgcctg aatggcctgg 4080

gcggcaagcg ccacactttt aagacccgaa ccacatactt tattgaccgt gaatccgcac 4140

accgtttctg ccagcccgct ttttaacagt gcctgacgcg ccggattttg ccccagcccg 4200

gcttgtaaca cgttacccat aatcacttca tcaacgtgtt gtgaatcgat ttttgcacgt 4260

tcaatggcgg ctttaattac tgtcgccccc aggtcgatgg cgctggtgga agcgagtgaa 4320

ccgttaaaac taccgatagc agtacgtacc gcactgacga tgacacaatt tttcatttta 4380

tattcctcct agtcgactct agaggatccc cgggctgcag gaattcgata tcaagcttat 4440

cgataccgtc gacctcgagg gggggcccgg tacccagctt ttgttccctt tagtgagggt 4500

taattgcgcg ctggg 4515

<210> 4

<211> 4667

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcgcgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctct tatttaagct gggtaaatgc 60

agataatcgt tttctggctt cgcgatttgt cgcctgcatc accatccacg gactgaacgc 120

ccacggcgtg gcatcaatac cgtgtaatac atctgctaaa tcacaccatt gataatccat 180

cacttcatca tcattgatct gtaacgcact agtggtgcgt gcggcaaata ccggacacac 240

ttcattttcc acaatgccac tcggatcggt ggcgcggtag cgaaagtcag gatagataga 300

ttcaggaggc gtaatttcca cgccaagctc ataacggcaa cggcggatca ctgcgtcttc 360

gttgctttct cccagttgtg ggtgcccaca aaccgagtta gtccacacgc caggccatgc 420

ttttttgctc agtgcgcggc gggtaactaa taattgtcct ttggcattaa acagccaact 480

ggagaacgcg agatgtaagc gggtgtctgc cgtgtgtgcg gcatactttt ccagcgtacc 540

cgtgggaact ccctgtgcat tcaataaaat gacgtgttcc gtttgcatat ggctgccgcg 600

cggcaccagg ccgctgctgt gatgatgatg atgatggctg ctgcccatat agtaatcctc 660

ctcccgggct gcagttattc ctttggtaga ccagtctttg cgtcaatcaa agattcgttt 720

gtttcttgtg ggcctgaacc gacttgagtt aaaatcactc tggcaacatc cttttgcaac 780

tcaagatcca attcacgtgc agtaaagtta gatgattcaa attgatggtt gaaagcctca 840

agctgctcag tagtaaattt cttgtcccat ccaggaacag agccaaacaa tttatagata 900

aatgcaaaga gtttcgactc attttcagct aagtagtaca acacagcatt tggacctgca 960

tcaaacgtgt atgcaacgat tgtttctccg taaaactgat taatggtgtg gcaccaactg 1020

atgatacgct tggaagtgtc attcatgtag aatattggag ggaaagagtc caaacatgtg 1080

gcatggaaag agttggaatc catcattgtt tcctttgcaa aggtggcgaa atctttttca 1140

acaatggctt tacgcatgac ttcaaatctc tttggtacga catgttcaat tctttcttta 1200

aatagttcgg aggttgccac ggtcaattgc ataccctgag tggaactcac atccttttta 1260

atatcgctga caactaggac acaagctttc atctgaggcc agtcagagct gtctgcgatt 1320

tgtactgcca tggaatcatg accatcttca gcttttccca tttcccaggc cacgtatccg 1380

ccaaacaacg atctacaagc tgaaccagac ccctttcttg ctattctaga tatttctgaa 1440

gttgactgtg gtaattggta taacttagca attgcagaga ccaatgcagc aaagccagca 1500

gcggaggaag ctaaaccagc tgctgtagga aagttatttt cggagacaat gtggagtttc 1560

cattgagata atgtgggcaa tgaggcgtcc ttcgattcca tttcctttct taattggcgt 1620

aggtcgcgca gacaattttg agttctttca ttgtcgatgc tgtgtggttc tccatttaac 1680

cacaaagtgt cgcgttcaaa ctcaggtgca gtagccgcag aggtcaacgt tctgaggtca 1740

tcttgcgata aagtcactga tatggacgaa ttggtgggca gattcaactt cgtgtccctt 1800

ttcccccaat acttaagggt tgcgatgttg acgggtgcgg taacggatgc tgtgtaaacg 1860

gtcatgagta ttacctccta tttatcaaga taagtttccg gatctttttc tttcctaaca 1920

ccccagtcag cctgagttac atccagccat tgaaccttag aaaatctttt gtcattagcg 1980

gtttgagccc taagatcaac atcttgctta gtaatcactg caatggcgtc ataaccacca 2040

gcaccaggta ttaagcaagt aagaactcct tttaaggtct ggcaatcatc caataagcta 2100

gtttgtacgg gaggttcgat atcggcacca gattctttag ttatttttct aaaggaacgt 2160

ctaattgtgg caactgcatc tctaacttct gtgatttcag gatacttttg acaggtacag 2220

tcattcctct caagagactc aaatatctga tcgctgtaat cgtcatgagt ctcgtgtaag 2280

cgatctagtt tagatagtcc atccataaat ctagaatttg catgatcgag ttctgtatat 2340

attttcaagc tttctggcat atgcgaatca taccaatttt ttaccttctg gaccagtttt 2400

actgtttctg aaccattctt aatatcgccc atccataaag ttaatcccga aggtaaatgg 2460

ttacttttaa tcgtaatatt ccagtcttct tcatcaacca aatgcgccag tttactgccg 2520

taagtagcac ttccaatatc tggcaaatta gagattaatg cgggtgggaa tcttctatat 2580

ctgatagatc catatgctgc cgccgctaca tcaaacccgc ttccaatttt accctgagct 2640

tgacaatgag caacttgtgc taaattatga ataacttctc tatatttgtc tacattattt 2700

tccaggtccg atacaaaaaa ggaggccaaa gctgtagtta aaactgtgac taaacctgcc 2760

gaggagccca gccctgtttt gggaacttct tcaattctgt gcgaatgaaa actcaatctt 2820

ctgttgccac gatgttcggt aacgctatcc tcctgagaat ggtaggcatc atcagagaaa 2880

atatcaataa cgaacaagtt tctattgcag tagtcgtcca tgttaggttt aaagtagcta 2940

aatacgttag cgataacttt ttcaatgaaa gggttcttag atccgcctat cgaaacagga 3000

atgaagccac ttttaggact tatatggtac agccactccc catctttaaa ttgtttactt 3060

ttcacacgca cttcaaactt atcagaccct tgcaatgaac cgtaaggatg ggctacagca 3120

tgcattcttg ccgataatcc gactacaaat gcttcatatt ttgtatctaa aactaaatat 3180

ccaccagcta gtaacgcttt ccctggggca ctgaaggctc tcaactctga catttgatct 3240

gcctcctatg aagtccatgg taaattcgtg tttcctggca ataatagatc gtcaatttgt 3300

tgctttgtgg tagttttatt ttcaaataat tggaatacta gggatttgat tttaggatct 3360

ttattcaaat tttttgcgct taacaaacag cagccagtcc cacccaagtc tgtttcaaat 3420

gtctcgtaac taaaatcatc ttgcaatttc tttttgaaac tgtcaatttg ctcttgagta 3480

atgtctcttc gtaacaaagt caaagagcaa ccgccgccac cagcaccggt aagttttgtg 3540

gagccaattc tcaaatcatc gctcagattt ttaataagtt ctaatccagg atgagaaaca 3600

ccgattgaga caagcagtcc atgatttatt cttatcaatt ccaatagttg ttcatacagt 3660

tcattattag tttctacggc ctcgtcatcg gtgcctttac atttacttaa ctttgtcatg 3720

atctctaagc cttgtagggc acattcaccc atggcatcta gaattggctt cataacttca 3780

ggaaatttct cggtgaccaa cacacgaacg cgagcaacaa gatcttttgt agaccttgga 3840

attctagtat aggttaggat cattggaatg gctgggaaat catctaagaa cttaaaattg 3900

tttgtattta ttgttccatt atgtgagtct ttttcaaata gcagggcatt accataagtg 3960

gccacagcgt tatctattcc tgaaggggta ccgtgaatac acttttcacc tatgaaggcc 4020

cattgattca ctatatgctt atcgttttct gacagctttt ccaagtcatt agatcctatt 4080

aaccccccca agtaggccat agctaaggcc agtgatacag aaatagaggc gcttgagccc 4140

aacccagcac cgatgggtaa agtagacttt aaagaaaact taatattctt ggcatggggg 4200

cataggcaaa caaacatata caggaaacaa aacgctgcat ggtagtggaa ggattcggat 4260

agttgagcta acaacggatc caaaagacta acgagttcct gagacaagcc atcggtggct 4320

tgttgagcct tggccaattt ttgggagttt acttgatcct cggtgatggc attgaaatca 4380

ttgatggacc acttatgatt aaagctaatg tccgggaagt ccaattcaat agtatctggt 4440

gcagatgact cgcttattag caggtaggtt ctcaacgcag acacactagc agcgacggca 4500

ggcttgttgt acacagcaga gtgttcacca aaaataataa cctttcccgg tgcagaagtt 4560

aagaacggta atgacatggt taattcctcc tactgcagga attcgatatc aagcttatcg 4620

ataccgtcga cctcgagggg gggcccggta cccagctttt gttcccc 4667

<210> 5

<211> 2914

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caaaaaaccc ctcaagaccc gtttagaggc cccaaggggt tatgctagtt attgctcagc 60

ggtggcagca gccaactcag cttcctttcg ggctttgtta gcagccggat ctcagtggtg 120

gtggtggtgg tgctcgagtg cggccgcaag cttgtcgacg gagctcgaat tcttatttaa 180

gctgggtaaa tgcagataat cgttttctgg cttcgcgatt tgtcgcctgc atcaccatcc 240

acggactgaa cgcccacggc gtggcatcaa taccgtgtaa tacatctgct aaatcacacc 300

attgataatc catcacttca tcatcattga tctgtaacgc actagtggtg cgtgcggcaa 360

ataccggaca cacttcattt tccacaatgc cactcggatc ggtggcgcgg tagcgaaagt 420

caggatagat agattcagga ggcgtaattt ccacgccaag ctcataacgg caacggcgga 480

tcactgcgtc ttcgttgctt tctcccagtt gtgggtgccc acaaaccgag ttagtccaca 540

cgccaggcca tgcttttttg ctcagtgcgc ggcgggtaac taataattgt cctttggcat 600

taaacagcca actggagaac gcgagatgta agcgggtgtc tgccgtgtgt gcggcatact 660

tttccagcgt acccgtggga actccctgtg cattcaataa aatgacgtgt tccgtttgca 720

tatggctgcc gcgcggcacc aggccgctgc tgtgatgatg atgatgatgg ctgctgccca 780

tggtatatct ccttcttaaa gttaaacaaa attatttcta gttatttatt acgctggatg 840

atgtagtccg ctagcgcttc cagtgccgag gtatcgagtg actgttcagc cagttgtttc 900

agcgactgac gggcatcgtc gatcagatcc cgggctttct tccgggcttg ctcaagaccc 960

agaagtgcag ggtaggtact tttaccaagt tgctggtcgg caccctggcg ttttcccaac 1020

gttgcagtat ctcccaccac atccaggatg tcatcctgaa cctggaaggc aaggccgatg 1080

ctctctgcat acttgtcgag taccggcaga gcacgacgtc ctttatctcc ggcgcttaat 1140

gcaccaaggc gaacggcggc gcgaatcaat gcgccggttt tatgacgatg aatacgctca 1200

agcgcgtcca gaggtacgtg tttgccttcc gcgtctaaat ctaatgcctg accaccgcac 1260

attccggcaa taccactggc gctcgccagt tcagaaatca tcgaaattct gtcgcggtcc 1320

gacacttccg gcatatcggc atcgcttaaa atcgagaacg ccagcgtttg taaagcgtcg 1380

ccagcgagaa tcgcgtttgc ttcgccaaac ttcacatggc aggttggcaa accgcgacgc 1440

agatcgtcat catccattgc cggtaaatca tcatgaatta atgagtaagc gtggatacac 1500

tcaacggcgg cagcgggtgc gtccagcgtg tttgtgctaa cgccgaacat atgaccggtg 1560

gcataaacca ggaaaggtcg caggcgctta ccacctaata atgcgccata ctgcatggtt 1620

tcgaccacgg gagtgttctg aaagggcagt ggggcgataa aacggctcag cgcctggttg 1680

gcctgcttaa cgcaggcttc gagttgctgc ggaaagtcca tggatccgcg acccatttgc 1740

tgtccaccag tcatgctagc catatggctg ccgcgcggca ccaggccgct gctgtgatga 1800

tgatgatgat ggctgctgcc catggtatat ctccttctta aagttaaaca aaattatttc 1860

tagttacgcg atgttgtaac gcgggcaata aatgctccaa accaggttgc ccacgtagct 1920

cagacgaacc gcacccagat aggtacggct gtcgcagctc agctcggtaa cttgcggggt 1980

gttcacgctg gtgctaaaat cttggatgct ctgacgcgcc aggtttttgc agaactcggt 2040

cgccttttgt tcgtcgcatt tacgctcctt cataaccacc caaaccgcgt taaacacgta 2100

atcctggccc gctttttccg cctccgcacg ttccttcggc cagctgtaga tgtcgttaat 2160

caggctgatc gcctcataac ccggacgcgc cagacgcatg cacacatcca gttcgtgcgc 2220

cgggatggtc agcgccatcg cgaaggtcag catgccaaac cagaacagct cgcccgcgtc 2280

aatggtacgg ctcggcagat acgccgccag ggtgttaaac ggttcaacac gggtacggct 2340

cgccagatcg atgaatttcg cccacgcttg catggtcacg atcgcacgat cctggtcaat 2400

cgccatcagc tcgtcaaaaa tttgcagctg cagggtcttt tccggacgac gatcctccag 2460

gttgctcgcg ccaccgtgaa tgccaaagat gtccagcata tcgtcacgac cctcacggaa 2520

atctttcagg tccagacgtt ccatctgatc gtcgtacagg aacgcatact cgttcgcgta 2580

cgcaaccact tccagacgct ccggcaggca ttccgggatg gtaacgctaa taaagctgaa 2640

caggtcgccc aggccaccgt gatacttggt catgctgcta accagacggc tccagtcgtt 2700

ttgcgcacgc agggtgccaa tcacttcttt gtagctatcc ttgtggatac gcaggtgaat 2760

gttgttcgcc agaccatcgt cacgataacg gtggctttcc acacgctcgc tatactggta 2820

acgcatatgt atatctcctt cttaaagtta aacaaaatta tttctagagg ggaattgtta 2880

tccgctcaca attcccctat agtgagtcgt atta 2914

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

catcttatta atcagataaa atatttctcg agctccggca aaaagtggcc cc 52

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catcttccag gaaatctccg ccccgctcga gaaacccacg gcggcaatgc 50

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcattgccgc cgtgggtttc tcgagcgggg cggagatttc ctggaagatg 50

<210> 9

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggggccactt tttgccggag ctcgagaaat attttatctg attaataaga tg 52

<210> 10

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tttgaaagat gggtccgtca cctgcattaa atcctaagga tccactagtt ctaga 55

<210> 11

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttttatattc ctcctagtcg actctagagg atccccgggc tgcaggaatt cgatatcaa 59

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cccggggatc ctctagagtc gactaggagg aatataaaat gaaaaattgt gtcatcgtc 59

<210> 13

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gttgagagtt tcatttagct gtcctcctta attcaaccgt tcaatcacc 49

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acggttgaat taaggaggac agctaaatga aactctcaac taaact 46

<210> 15

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tggctgctgc ccatagtgta atcctcctta ttttttaaca tcgtaagat 49

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atgttaaaaa ataaggagga ttacactatg ggcagcagcc atcatca 47

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ttaggattta atgcaggtga cgg 23

<210> 18

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cagaaaacga ttatctgcat ttacccagct taaataagag ctccaattcg ccctatagt 59

<210> 19

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttaagaacgg taatgacatg gttaattcct cctactgcag gaattcgata tcaag 55

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ctgcagtagg aggaattaac catgtcatta ccgttcttaa ct 42

<210> 21

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctcaactctg acatttgatc tgcctcctat gaagtccatg gtaa 44

<210> 22

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ttaccatgga cttcatagga ggcagatcaa atgtcagagt tgagagcctt c 51

<210> 23

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gatgctgtgt aaacggtcat gagtattacc tcctatttat caagataagt ttc 53

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

atcttgataa ataggaggta atactcatga ccgtttacac agcatccgtt 50

<210> 25

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tgcccatata gtaatcctcc tcccgggctg cagttattcc tttggtagac cagtc 55

<210> 26

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ggaataactg cagcccggga ggaggattac tatatgggca gcagccatca t 51

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ttatttaagc tgggtaaatg caga 24

<210> 28

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

atatggatcc atggactttc cgcagcaact c 31

<210> 29

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

atatgaattc actagtttat ttattacgct ggatgatg 38

<210> 30

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

atcgcatatg caaacggaac acgtcatttt attg 34

<210> 31

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

atatctcgag actagttatt taagctgggt aaatgc 36

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gcatcatatg cgttaccagt atagcgag 28

<210> 33

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

atatctcgag actagtttac gcgatgttgt aacgcgggc 39

<210> 34

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

atatgaattc ttacgcgatg ttgtaacgcg ggcaa 35

Claims (7)

1.一种萜类合酶TPF09930，其特征在于，所述萜类合酶具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的萜类合酶TPF09930，具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.权利要求1或2所述的萜类合酶TPF09930的用途，用于生产橙花叔醇。

4.一种生产橙花叔醇的菌株，其特征在于，该菌株含有甲羟戊酸途径和橙花叔醇合成的相关基因；所述的甲羟戊酸途径的相关基因包括atoB、erg13、thmg1、erg12、erg8、mvd1 和idi基因；所述的橙花叔醇合成的相关基因包括ispA和萜类合酶TPF09930基因，所述的TPF09930基因，其序列如SEQ ID NO：2所示。

5.根据权利要求4所述的生产橙花叔醇的菌株，其特征在于，生产橙花叔醇的菌株为含有质粒pMH1、质粒pFZ81 和质粒pGB136的大肠杆菌；

所述的质粒pMH1 以pBBR1MCS 为骨架载体、启动子为lac 启动子，复制子为p15A，包含atoB、erg13 和thmg1 基因；

所述的质粒pFZ81 以pBBR1MCS-2 为骨架载体、启动子为lac 启动子、复制子为pBBR1MCS 复制子，包含erg12、erg8、mvd1 和idi基因；

所述的质粒pGB286以pET21为骨架载体、启动子为T7、复制子为质粒自带的高拷贝pBR322复制子，包含TPF09930、ispA和idi基因。

6.根据权利要求4或5所述的生产橙花叔醇的菌株，其特征在于，该菌株过表达来源于大肠杆菌XL1-blue的atoB基因或idi基因，合成大量催化底物法尼基焦磷酸FPP。

7.权利要求6所述的生产橙花叔醇的菌株在生产橙花叔醇中的应用。