CN110551645A

CN110551645A - 萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用

Info

Publication number: CN110551645A
Application number: CN201910729886.6A
Authority: CN
Inventors: 张永军; 刘丹凤; 寇俊凤; 黄欣蒸; 张强; 孙佩瑶
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-08-08
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2019-12-10

Abstract

本发明涉及代谢工程领域，具体涉及萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用。同时，本发明还进一步提供了一种重组酵母菌，可以高产量、高纯度地一步合成橙花叔醇，在SC‑Trp培养基中实时产生橙花叔醇可达约57.8μg/h/L，为生物合成生产橙花叔醇提供理论与技术支持。

Description

萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用

技术领域

本发明涉及代谢工程领域，具体涉及萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用。

背景技术

橙花叔醇(nerolidol)是虫害诱导植物挥发物组分萜烯同系物DMNT合成的前体。萜烯同系物不仅是花香气味的主要成分，也是虫害诱导的植物挥发物的重要组分，它既可以吸引传粉昆虫为植物传粉也可以吸引植食性害虫的捕食性或寄生性天敌抵御植食性害虫的为害，在植物与昆虫间的“信息网”交流中发挥着重要作用。然而仅转化直接催化DMNT生成的CYP82L基因的烟草由于缺少合成橙花叔醇的代谢通路而最终不能生成DMNT，但在含有萜烯同系物代谢通路的植物中通过超表达DMNT合成前体橙花叔醇基因可以大大提高DMNT的释放量，比如超表达橙花叔醇合酶基因的水稻，其橙花叔醇和DMNT的释放量均显著升高。另外，蚜虫报警信息素组分(E)-β-法尼烯最简便有效地化学合成方法就是以橙花叔醇为底物通过水解合成的。由此可见，通过合成生物学技术手段生成橙花叔醇具有重要应用前景。

而现有技术中在利用合成生物学技术手段合成橙花叔醇时，往往难以生成高纯度的产物，为后续分离造成很大的难度。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决上述问题，本发明提供了萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用。

(二)技术方案

本发明首先提供萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用，所述萜烯合酶基因GhTPS14的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为优选，所述萜烯合酶基因GhTPS14的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明发现，来源于陆地棉的萜烯合酶基因GhTPS14可以高产量、高纯度地合成橙花叔醇产物。

本发明进一步提供一种重组酵母菌，将萜烯合酶基因GhTPS14构建至酵母菌后制得，所述萜烯合酶基因GhTPS14的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明进一步提供制备所述重组酵母菌的方法，将所述萜烯合酶基因GhTPS14转化至所述酵母菌时，所用的酵母表达载体为pESC-Trp。

作为本发明的一种优选技术方案，所述重组酵母菌为pESC-Trp-GhTPS14-WAT11，将含萜烯合酶基因GhTPS14的重组酵母载体转化至酵母菌WAT11后制得。

作为本发明的一种优选技术方案，所述重组酵母菌为pESC-Trp-GhTPS14-INVSc1，将含萜烯合酶基因GhTPS14的重组酵母载体转化至酵母菌INVSc1后制得。

本发明进一步提供所述重组酵母菌在合成橙花叔醇方面的应用。

作为优选，将所述重组酵母菌在含半乳糖的SC-T诱导培养基中诱导培养。

作为优选，在所述诱导培养前，将所述重组酵母菌在缺失Trp的SC-T液体培养基中，在28～30℃(优选29.5℃)，250～270rpm(优选260rpm)条件下培养至OD₆₀₀为0.9～1.1(约24h)。

作为优选，在所述诱导培养后，取5mL培养产物加入内标癸酸乙酯用于橙花叔醇的检测及精确定量。

(三)有益效果

(1)本发明提供了萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用，在转入酵母菌后，可以一步生成高纯度的橙花叔醇，为生物合成生产橙花叔醇提供理论与技术支持。

(2)本发明进一步提供了一种重组酵母菌，可以高产量、高纯度地合成橙花叔醇，在SC-Trp培养基中产生橙花叔醇可达约57.8μg/h/L。

附图说明

图1为GC-MS检测橙花叔醇的释放；其中：A，橙花叔醇(nerolidol)标准品和含不同酵母表达载体的酵母菌株WAT11中橙花叔醇的释放；B，橙花叔醇(nerolidol)标准品和含不同酵母表达载体的酵母菌株INVSc1中橙花叔醇的释放；C，橙花叔醇质谱图。IS，Internalstandard，内标。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。橙花叔醇的检测：气相色谱-质谱联用(GC-MS)检测，仪器：岛津气相色谱-质谱联用仪(GCMS-QP2030)。分析条件：

GC条件：色谱柱为Rtx-5MS(0.25μm×0.25mm×30m)。载气为氦气，不分流进样，进样口流速为3mL/min，柱流量为1mL/min。进样口温度为250℃。升温程序为40℃保持1min，以4℃/min升到130℃，保持5min，以10℃/min升到250℃，保持5min。

MS条件：离子源温度和传输线温度均为250℃，EI 70ev，载气为氦气，质谱扫描速度为1000amu/s，扫描范围为50-650m/z。

内标癸酸乙酯标准品的配制：取10μL癸酸乙酯标准品于90μL正己烷混合均匀得到10^-1癸酸乙酯，按此方法依次稀释得到10^-4癸酸乙酯标准品。取10μL10^-4癸酸乙酯标准品用于试验以进行产物的定量计算。

实施例1

重组酵母菌株pESC-Trp-GhTPS14-WAT11的构建

收集绿盲蝽取食为害的陆地棉叶片，提取RNA，反转录得到cDNA作为PCR扩增目的片段的模板。所用引物为F(序列如SEQ ID NO.3所示)和R(序列如SEQ ID NO.4所示)：

F：ATGCAAATGGGACTTTC

R：CTAGTTTGATCTGATATTTAGAG

胶回收目的片段，将之克隆至大肠杆菌Trans1T1中。以得到的含有目的片段序列的大肠杆菌菌液为模板，以含有载体片段的引物F1(序列如SEQ ID NO.5所示)和R1(序列如SEQ ID NO.6所示)：

F1：ACTATAGGGCCCGGGCGTCGACATGCAAATGGGACTTTC

R1：ATCTTAGCTAGCCGCGGTACCCTAGTTTGATCTGATATTTAGAG

其中划线部分分别为SalI和KpnI酶切位点，进行PCR扩增。胶回收扩增产物，与SalI和KpnI双酶切的pESC-Trp载体胶回收产物进行连接，转化至大肠杆菌Trans1T1培养，得到含目的片段的重组质粒pESC-Trp-GhTPS14。将重组质粒转化至酵母WAT11(Urban,P.,Mignotte,C.,Kazmaier,M.,Delorme,F.and Pompon,D.(1997)Cloning,yeastexpression,and characterization of the coupling of two distantly relatedArabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450reductases withP450CYP73A5.J.Biol.Chem.272,19176–19186.)感受态细胞于缺失Trp的SC-T固体培养基培养，得到含pESC-Trp-GhTPS14的重组酵母WAT11菌株单克隆。

实施例2

重组酵母菌株发酵生产橙花叔醇及其检测

分别接种含pESC-Trp的重组酵母WAT11菌株单克隆和pESC-Trp-GhTPS14的重组酵母WAT11菌株单克隆于2mL缺失Trp的SC-T液体培养基29.5℃，260rpm培养，24h后(OD₆₀₀约1.0)转移至10mL含半乳糖的SC-T诱导培养基诱导培养，24h后转移至20mL进样瓶，并加入10μL10^-4癸酸乙酯标准品继续培养4h，以富集产物。固相微萃取(SPME)1h后，分别得到产物，用于GC-MS分析，结果见图1A和C，对其释放量进行计算后得到表1结果。

由图1和表1可知，本发明中的重组酵母WAT11菌株可高产量、高纯度地合成橙花叔醇。

表1重组酵母菌株橙花叔醇的释放量

实施例3

本实施例与对比例1的区别在于：将重组质粒pESC-Trp-GhTPS14转化至酵母菌株INVSc1，该酵母菌株购自Invitrogen Corporation，空质粒pESC-Trp作为对照。

按实施例2中的方法对其进行发酵和检测后，GC-MS分析，结果见图1B和C，对其释放量进行计算后得到表2结果。

由图1B和C和表2可知，本发明中的重组酵母菌株可高产量、高纯度地合成橙花叔醇。

表2重组酵母菌株橙花叔醇的释放量

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用

<130> KHP191113327.8

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2322

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum

<400> 1

atgcaaatgg gactttcaaa ggtctcaaat attgaagctt tagtgaaggg gataaaggaa 60

gagatgttac cggacatcga tccttactct tttgtttcag cttctgctta tgacacagcc 120

tggttagcca tggttcctgc agattccgac cagacatgtc ccttgttcaa ggaatgcttg 180

gagtgggtgg tgaataacca gacaaaagag gggtgctggg gagagtgtgt ggacgccatc 240

gaccctcttt ctgctacttt ggcttgcgtc atagcaatcc acaagtggag tattggagct 300

aataatataa aacgaggatt ggactttgtt caagaaaatg ctgagaagat tcttaggaaa 360

actgaggacc gttttcctcg ttggtttacc atagtcttcc caggaatgat tgaacttgca 420

cgtaaagttg ggatccaact tgccttccct tcccaattaa acgccttctt gttagacatt 480

ttccacaaac gacaactcct ccttgatacc gaggaactta ttggcaatca atgttatcct 540

ccattgatat cgtatcttga agctcttcct ccgtcatatg acgttagtga acgagacata 600

accatgaact tgaatggtga tggttcattg ttccaatctc ctgctgccac agcaagtgct 660

ttcatggcta cgggaaatga acagtctcta tcctatctgc aaacggtagt cggaagatgt 720

gctaatggag ttccaccaac ttttcccatg gatgaagagc tgataaggct ttgtttggtg 780

aatcaactac agaggttggg gctagctgac cattttacac atgaaattga agaaatattg 840

ttccagattt accggaatta caaaactcta gagtggttgg ataaagcaag caataatatt 900

gtaaatgtgg gaatccagtt acacaaagat tctttagcac ttcgactact ccgcatgcat 960

ggttatagca tatcgcctcg tcatttctgt tggttcttaa ataatcaaga agttagagct 1020

catattgaag aaaatcagga atacttcaca atcagcatgc tgaatgttta tagagccacg 1080

gatcttatgt ttccaggaga gaatgaagtt gaggaggcga gatcattttc taggaaagtg 1140

ttagagaaaa ttacattgaa agatagtagc ttagcatcta ccggcctgaa caaaatggtg 1200

gagcatgaac tgacatttcc atggatcgct cgattagatc atttggacca tagagcatgg 1260

attgaagacg tcaataatac caatgtgttg tgggtaggca agacctcctt tcacagattg 1320

tcaaccctgt taaacgagaa gctattgcaa ctcgcggtgg cggattacga gttccgacag 1380

tcaatataca ggaaggagtt ggaggaagtg ataaggtggt ccaagaataa gggtatgagc 1440

gacatgggat ttggtcgaga taaaactaca tattgctact ttgccattgc ttccagcatt 1500

ccactgccat atgactctga agtgaggatg ataattacaa aaagtgcagt tgtgataaca 1560

gttgccgacg atttttatga taccgaagct tctttcgatg aactgaccac cctcactcaa 1620

gctattgcaa gatgggatgc tgagggattg agtggtcaca gtaagactat ctttaatgcc 1680

ttggatgatc tcgtcagcga atttgtagct aaagttcggc atcagcatgg aattgatata 1740

acatattttc ttcagcagat atggtatgaa acgtttaatt catggtttgt ggaggcggag 1800

gcaaagtgga gcatgggtgg gtttgttccg tcaatggaag aataccttgg aaatggagcg 1860

gtgtccattg ctctacacac cattgttctt ccagcttcct atctgttgaa tccaagctta 1920

gcagactaca aaatcaaggc aggggaatac cagactgtta ccaaattggc aatgcttata 1980

cctcgtttac tcaacgatat acagagctat cagaaagaag aacaagaggg gaaactgaac 2040

tacgttttac tgtatctgaa agaaaaccct ggaatagaca tccaagattc gacggcctat 2100

gttcgagata tcatctacaa aaattggcca gagtttctcc aacatgttct catggatgga 2160

ttggcagaag aactgccgaa atcctgcaag tttcttcatt tatcatgcgt caaggcgttt 2220

caaatgttct tccattccag caatagatat gattccaaca cagatatgct tctagacatt 2280

caaaaggcaa tctatatccc tctaaatatc agatcaaact ag 2322

<210> 2

<211> 773

<212> PRT

<213> Gossypium hirsutum

<400> 2

Met Gln Met Gly Leu Ser Lys Val Ser Asn Ile Glu Ala Leu Val Lys

1 5 10 15

Gly Ile Lys Glu Glu Met Leu Pro Asp Ile Asp Pro Tyr Ser Phe Val

20 25 30

Ser Ala Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Trp Leu Ala Met Val Pro Ala Asp

35 40 45

Ser Asp Gln Thr Cys Pro Met Phe Lys Glu Cys Leu Glu Trp Val Val

50 55 60

Asn Asn Gln Thr Lys Glu Gly Cys Trp Gly Glu Cys Val Asp Ala Ile

65 70 75 80

Asp Thr Leu Ser Ala Thr Leu Ala Cys Val Ile Ala Ile His Lys Trp

85 90 95

Ser Ile Gly Ala Asn Asn Ile Lys Arg Gly Leu Asp Phe Val Gln Glu

100 105 110

Asn Ala Glu Lys Ile Leu Arg Lys Thr Glu Asp Arg Phe Pro Arg Trp

115 120 125

Phe Thr Ile Val Phe Pro Gly Met Ile Glu Leu Ala Arg Lys Val Gly

130 135 140

Ile Gln Leu Ala Phe Pro Ser Gln Leu Asn Ala Phe Leu Leu Asp Ile

145 150 155 160

Phe His Lys Arg Gln Leu Leu Leu Asp Thr Glu Glu Leu Ile Gly Asn

165 170 175

Gln Cys Tyr Pro Pro Leu Ile Ser Tyr Leu Glu Ala Leu Pro Pro Ser

180 185 190

Tyr Asp Val Ser Glu Arg Asp Ile Thr Met Asn Leu Asn Gly Asp Gly

195 200 205

Ser Leu Phe Gln Ser Pro Ala Ala Thr Ala Ser Ala Phe Met Ala Thr

210 215 220

Gly Asn Glu Gln Ser Leu Ser Tyr Leu Gln Thr Val Val Gly Arg Cys

225 230 235 240

Ala Asn Gly Val Pro Pro Thr Phe Pro Met Asp Glu Glu Leu Ile Arg

245 250 255

Leu Cys Leu Val Asn Gln Leu Gln Arg Leu Gly Leu Ala Asp His Phe

260 265 270

Thr His Glu Ile Glu Glu Ile Leu Phe Gln Ile Tyr Arg Asn Tyr Lys

275 280 285

Thr Leu Glu Trp Leu Asp Lys Ala Ser Asn Asn Ile Val Asn Val Gly

290 295 300

Ile Gln Leu His Lys Asp Ser Leu Ala Leu Arg Leu Leu Arg Met His

305 310 315 320

Gly Tyr Ser Ile Ser Pro Arg His Phe Cys Trp Phe Leu Asn Asn Gln

325 330 335

Glu Val Arg Ala His Ile Glu Glu Asn Gln Glu Tyr Phe Thr Ile Ser

340 345 350

Met Leu Asn Val Tyr Arg Ala Thr Asp Leu Met Phe Pro Gly Glu Asn

355 360 365

Glu Val Glu Glu Ala Arg Ser Phe Ser Arg Lys Val Leu Glu Lys Ile

370 375 380

Thr Leu Lys Asp Ser Ser Leu Ala Ser Thr Gly Leu Asn Lys Met Val

385 390 395 400

Glu His Glu Leu Thr Phe Pro Trp Ile Ala Arg Leu Asp His Leu Asp

405 410 415

His Arg Ala Trp Ile Glu Asp Val Asn Asn Thr Asn Val Leu Trp Val

420 425 430

Gly Lys Thr Ser Phe His Arg Leu Ser Thr Leu Leu Asn Glu Lys Leu

435 440 445

Leu Gln Leu Ala Val Ala Asp Tyr Glu Phe Arg Gln Ser Ile Tyr Arg

450 455 460

Lys Glu Leu Glu Glu Val Ile Arg Trp Ser Lys Asn Lys Gly Met Ser

465 470 475 480

Asp Met Gly Phe Gly Arg Asp Lys Thr Thr Tyr Cys Tyr Phe Ala Ile

485 490 495

Ala Ser Ser Ile Pro Leu Pro Tyr Asp Ser Glu Val Arg Met Ile Ile

500 505 510

Thr Lys Ser Ala Val Val Ile Thr Val Ala Asp Asp Phe Tyr Asp Thr

515 520 525

Glu Ala Ser Phe Asp Glu Leu Thr Thr Leu Thr Gln Ala Ile Ala Arg

530 535 540

Trp Asp Ala Glu Gly Leu Ser Gly His Ser Lys Thr Ile Phe Asn Ala

545 550 555 560

Leu Asp Asp Leu Val Ser Glu Phe Val Ala Lys Val Arg His Gln His

565 570 575

Gly Ile Asp Ile Thr Tyr Phe Leu Gln Gln Ile Trp Tyr Glu Thr Phe

580 585 590

Asn Ser Trp Phe Val Glu Ala Glu Ala Lys Trp Ser Met Gly Gly Phe

595 600 605

Val Pro Ser Met Glu Glu Tyr Leu Gly Asn Gly Ala Val Ser Ile Ala

610 615 620

Leu His Thr Ile Val Leu Pro Ala Ser Tyr Leu Leu Asn Pro Ser Leu

625 630 635 640

Ala Asp Tyr Lys Ile Lys Ala Gly Glu Tyr Gln Thr Val Thr Lys Leu

645 650 655

Ala Met Leu Ile Pro Arg Leu Leu Asn Asp Ile Gln Ser Tyr Gln Lys

660 665 670

Glu Glu Gln Glu Gly Lys Leu Asn Tyr Val Leu Leu Tyr Leu Lys Glu

675 680 685

Asn Pro Gly Ile Asp Ile Gln Asp Ser Thr Ala Tyr Val Arg Asp Ile

690 695 700

Ile Tyr Lys Asn Trp Pro Glu Phe Leu Gln His Val Leu Met Asp Gly

705 710 715 720

Leu Ala Glu Glu Leu Pro Lys Ser Cys Lys Phe Leu His Leu Ser Cys

725 730 735

Val Lys Ala Phe Gln Met Phe Phe His Ser Ser Asn Arg Tyr Asp Ser

740 745 750

Asn Thr Asp Met Leu Leu Asp Ile Gln Lys Ala Ile Tyr Ile Pro Leu

755 760 765

Asn Ile Arg Ser Asn

770

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgcaaatgg gactttc 17

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctagtttgat ctgatattta gag 23

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actatagggc ccgggcgtcg acatgcaaat gggactttc 39

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atcttagcta gccgcggtac cctagtttga tctgatattt agag 44

Claims

1.萜烯合酶基因GhTPS14在合成橙花叔醇方面的应用，所述萜烯合酶基因GhTPS14的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述萜烯合酶基因GhTPS14的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组酵母菌，其特征在于，将萜烯合酶基因GhTPS14构建至酵母菌后制得，所述萜烯合酶基因GhTPS14的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.制备权利要求3所述的重组酵母菌的方法，其特征在于，将所述萜烯合酶基因GhTPS14转化至所述酵母菌时，所用的酵母表达载体为pESC-Trp。

5.权利要求3所述的重组酵母菌在合成橙花叔醇方面的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将所述重组酵母菌在含半乳糖的SC-T诱导培养基中诱导培养。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在所述诱导培养前，将所述重组酵母菌在缺失Trp的SC-T液体培养基中，在28～30℃，250～270rpm条件下培养至OD₆₀₀为0.9～1.1。