CN115927134A - 一种可合成倍半萜的工程藻株及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可用于制备合成倍半萜的工程藻的藻株，所述藻株通过以PCC6803为底盘藻，并向所述底盘藻中导入法尼基焦磷酸合酶基因表达框、异戊烯焦磷酸异构酶基因表达框和1脱氧‑D‑木酮糖‑5‑磷酸合酶基因表达框得到，还提供了使用该藻株制备具有倍半萜类物质合成能力的工程藻株的方法，并已用该方法制备得到的工程藻株。本发明以PCC6803为底盘藻，向其中转入了三个与倍半萜合成通路相关的基因表达框，并在此基础上转入相应的倍半萜物质合酶，从而得到了可高效合成相应倍半萜类物质的工程藻，尤其是大幅提高了工程藻的法尼烯、瓦伦烯和橙花叔醇的产量，为接下来的商业化生产奠定了坚实的一步。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及生物工程领域，具体涉及可合成倍半萜的工程藻。
背景技术
倍半萜，是一种由3个异戊二烯单体组成的萜类化合物。大多倍半萜均是具有特殊香气的挥发性化合物，如瓦伦烯、橙花叔醇等，因此常用作芳香食品和精油类化妆品中的香料。此外，倍半萜类化合物在医药、能源等领域也展现了巨大的应用潜力和广阔的市场前景。如红没药烯是一种很好的抗氧剂，在制品中能起到抗痒消炎的功能；紫穗槐二烯是青蒿素前体，具有一定药理作用；在化工和能源领域，法尼烯用作橡胶添加剂可赋予橡胶较高的塑性，此外，法尼烯可以通过完全氢化制备法尼烷，而法尼烷是一种能量值高、可与石化柴油和航空煤油混合使用的新型燃料。目前传统的倍半萜生产方式是从花草植物精油中提取，但由于倍半萜分泌量很低，成为制约大规模生产的阻碍，因此通过传统的植物提取法生产倍半萜通常不能满足市场需求。
由于光合蓝细菌能够高效率的捕捉太阳能并具有固定CO2的特性，近年来也作为“光驱动的自养型细胞工厂”进行了生产萜类物质的研究。蓝细菌中萜类物质的合成途径为2-甲基赤藓糖醇4-焦磷酸(MEP)途径，首先将3-磷酸甘油醛与丙酮酸转化为萜类合成前体IPP和DMAPP，两分子IPP和一分子DMAPP进一步生成倍半萜前体法尼基焦磷酸(FPP)。以FPP为底物，通过过表达不同的倍半萜合酶即能生产不同的倍半萜。目前在不同蓝细菌底盘内也已实现了多种倍半萜类物质的高效定向合成，充分证实以蓝细菌为底盘进行倍半萜合成的可行性。在不同报道的研究中，广泛使用的包括多种蓝细菌底盘，如集胞藻PCC6803、聚球藻PCC7002、聚球藻PCC7942等。但是，所报道的工程藻在倍半萜的产量上均不理想，并且现有研究往往都是针对1种倍半萜进行代谢工程改造，最多在后期会选择其它1-2种倍半萜合酶验证底盘的普适性，不具有生产的灵活性。因此，需要更好的改造方案来获得具有商业化生产潜力的工程化藻株。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种可用于制备合成倍半萜的工程藻的藻株，所述藻株通过向底盘蓝细菌中导入法尼基焦磷酸合酶基因表达框、异戊烯焦磷酸异构酶基因表达框和1脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因表达框得到。
在一个具体实施方案中，所述底盘蓝细菌选自聚球藻、集胞藻、鱼腥藻。优选地，所述底盘蓝细菌选自聚球藻PCC7942、集胞藻PCC6803、聚球藻UTEX2973、鱼腥藻PCC7120、聚球藻PCC7002。
在一个具体实施方案中，所述法尼基焦磷酸合酶基因表达框中，法尼基焦磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一个具体实施方案中，所述异戊烯焦磷酸异构酶基因表达框中，异戊烯焦磷酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在一个具体实施方案中，所述1脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因表达框中，1脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在一个具体实施方案中，所述法尼基焦磷酸合酶基因表达框、异戊烯焦磷酸异构酶基因表达框和1脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因表达框整合在所述底盘藻的中性位点上。
本发明得到的上述藻株虽然在倍半萜类物质本身的产量上没有提高，但是该藻株提供了大量合成倍半萜类物质的底物，从而使得，当将相应倍半萜类物质合酶(例如，α-红没药烯合酶、紫穗槐二烯合酶、瓦伦烯合酶1、法尼烯合酶和橙花叔醇合酶)的基因表达框转入到该藻株中后，相应的倍半萜类物质的合成大幅提高。
本发明还提供了一种制备合成倍半萜的工程藻的方法，包括向上述藻株中导入倍半萜类物质合酶。
在一个具体实施方案中，所述倍半萜类物质合酶为α-红没药烯合酶、紫穗槐二烯合酶、瓦伦烯合酶1、法尼烯合酶和橙花叔醇合酶中的一种或多种组合。
在一个具体实施方案中，所述α-红没药烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述紫穗槐二烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述瓦伦烯合酶1的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述法尼烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，或者，所述橙花叔醇合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
本发明还提供了通过上述方法制备得到的可合成倍半萜的工程藻。
本研究选择了淡水藻株集胞藻PCC6803开展研究和改造，应用代谢工程改造方案开发了适合用于倍半萜生产的光合微生物细胞工厂。首先通过在集胞藻PCC6803基础上转入法尼烯合酶后成功实现了法尼烯的生产，之后通过过表达上游基因构建了一株加强了MEP途径、萜类合成通量的工程菌JS119，并在此基础上转入了法尼烯合酶，较代谢途径优化前能大幅提高法尼烯产量(提升6.3倍)。由于FPP是倍半萜类化合物生物合成的前体物质，因此JS119藻株理论上可以拓展到用于其它倍半萜类似产物的生产上。进一步在JS119藻株基础上分别表达了红没药烯、紫穗槐二烯、瓦伦烯、橙花叔醇合酶，也成功实现了这四类倍半萜的生产。
本发明在同一出发藻株内分别表达了5种倍半萜合酶，并均成功实现相应产物的积累，重要的是，本发明是以蓝细菌为底盘生产橙花叔醇的首次报道，充分证明了蓝细菌倍半萜生产平台极具普适性，可以在转入任何倍半萜合酶基础上实现相应产物的合成。
附图说明
图1为重组质粒pJS54的结构示意图。
图2为重组质粒pJS76、pJS77、pJS78、pJS80、pJS81的结构示意图。
图3为工程藻株在中性位点Slr0168和Slr9394处的扩增产物的电泳照片。
图4为α-红没药烯的标准品和样品的GC-MS峰图。
图5为紫穗槐二烯的标准品和样品的GC-MS峰图。
图6为瓦伦烯的标准品和样品的GC-MS峰图。
图7为法尼烯的标准品和样品的GC-MS峰图。
图8为橙花叔醇的标准品和样品的GC-MS峰图。
图9为各工程藻株生产的相应倍半萜类物质的统计图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.所用到的藻株
本发明所用的底盘藻为集胞藻PCC6803，该藻株常被作为模式菌株进行相关的实验研究。
2.质粒构建
法尼基焦磷酸合酶基因(ispA，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核酸序列如SEQID NO:2所示)来自E.coli MG1655，异戊烯焦磷酸异构酶基因(idi，氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示，核酸序列如SEQ ID NO:4所示)来自S.cerevisiae BY4741，1脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(dxs，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，核酸序列如SEQ ID NO:6所示)来自E.coliMG1655。
将基因idi-ispA串接在启动子PcpcB560的下游构成Idi-IspA表达框，将dxs基因片段接在启动子PrbcL6803的下游构成Dxs表达框，将两个表达框串接在一起，然后插入到中性位点Slr9394的上下游同源臂之间，以卡那霉素抗性为筛选标记，将上述片段插入到pUC19骨架上，得到重组质粒pJS54(图1)。
α-红没药烯合酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，核酸序列如SEQ ID NO:8所示)来自Abies grandis，紫穗槐二烯合酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，核酸序列如SEQ IDNO:10所示)来自Artemisia annua，瓦伦烯合酶1(氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，核酸序列如SEQ ID NO:12所示)来自Callitropsis nootkatensis，法尼烯合酶(氨基酸序列如SEQID NO:13所示，核酸序列如SEQ ID NO:14所示)来自Malus xdomestica，橙花叔醇合酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，核酸序列如SEQ ID NO:16所示)来自Glycine max。
将上述合酶的编码框分别连接在启动子PcpcB560下游，构成合酶表达框，然后将合酶表达框插入到中性位点Slr0168的上下游同源臂之间，并插入到pUC19的骨架上，以壮观霉素抗性为筛选标记，构成重组质粒(pJS76、pJS77、pJS78、pJS80、pJS81，图2)。
3.转基因藻株的构建
1)藻株JS143的构建
取1mL对数生长期(OD730约为1)的PCC6803培养物，5000g离心5min收集细胞，并用新鲜的BG11培养基清洗细胞2次，弃上清，细胞沉淀重悬于250μL BG11溶液中；向上述重悬后的藻液中加入20μL的质粒pJS80(质粒浓度为200μg/mL)；将加入质粒后的EP管用锡箔纸包住，30℃摇床孵育20小时；将孵育后的转化产物涂布在具有相应抗性的BG11平板(壮观霉素：50μg/mL)，30℃，100μmol photons m-2s-1条件下培养，4-5天便会有转化子长出，挑取转化子于新鲜的BG11平板(壮观霉素：50μg/mL)划线；通过筛选得到分离完全的藻株JS143。
2)藻株JS119的构建
取1mL对数生长期(OD730约为1)的PCC6803培养物，5000g离心5min收集细胞，并用新鲜的BG11培养基清洗细胞2次，弃上清，细胞沉淀重悬于250μL BG11溶液中；向上述重悬后的藻液中加入20μL的质粒pJS54(质粒浓度为200μg/mL)；将加入质粒后的EP管用锡箔纸包住，30℃摇床孵育20小时；将孵育后的转化产物涂布在具有相应抗性的BG11平板(卡那霉素：50μg/mL)，30℃，100μmol photons m-2s-1条件下培养，4-5天便会有转化子长出，挑取转化子于新鲜的BG11平板(卡那霉素：50μg/mL)划线；通过筛选得到分离完全的藻株JS119。
3)藻株JS145、JS138、JS133、JS134、JS135的构建
取1mL对数生长期的(OD730约为1)的JS119培养物，5000g离心5min收集细胞，并用新鲜的BG11培养基清洗细胞2次，弃上清，细胞沉淀重悬于250μL BG11培养基中；向上述重悬后的藻液中分别加入20μL的质粒pJS76、77、78、80、81(质粒浓度为200μg/mL)；将加入质粒后的EP管用锡箔纸包住，30℃摇床孵育20小时；将孵育后的转化产物涂布在具有相应抗性的BG11平板(卡那霉素，20μg/mL；壮观霉素，30μg/mL)，30℃，100μmol photons m-2s-1条件下培养，5-7天便会有转化子长出，挑取转化子于新鲜的BG11平板(卡那霉素，20μg/mL；壮观霉素，30μg/mL)划线；通过筛选得到分离完全的藻株JS145、JS138、JS133、JS134、JS135。
对上述藻株进行PCR检测，结果如图3所示，JS119的Slr9394位点被插入了Idi-IspA表达框和Dxs基因表达框，藻株JS143、JS145、JS138、JS133、JS134、JS135的Slr0168位点也插入了相应的合酶表达框。
4.工程藻株的培养
使用柱式光反应器，为直径3cm的普通玻璃材质的圆底玻璃管，反应器总装液量可达150mL，实验过程中装液100mL，并添加10％(v/v)的十二烷覆盖在液面上对产物进行回收。种子液为处于对数生长期的BG11培养物(补充有相应抗生素)，初始接种浓度OD730为1，在30℃，150μmol photons m-2s-1，通入混合气(3％CO2+97％空气)条件下进行培养3天。
5.倍半萜含量测定
取1mL培养过程中覆盖在藻液上的十二烷，利用GC-MS测定十二烷相中倍半萜的含量。GC-MS检测通过Agilent 7890进行，配有Agilent 5977质谱检测器以及HP-INNOWax(30m×0.32mm×0.25μm)色谱柱。超高纯度氦气以3mL/min的恒定流速用作载气，柱箱温度最初在60℃保持5分钟，然后以10℃/min的速度升至260℃，并在260℃保持10分钟。质谱采用SIM模式，将本发明的工程菌合成出的产品(样品)与标准品识别特定的荷质比M/Z的离子峰。图4-8为不同的倍半萜样品的GC-MS图，横坐标为保留时间(min)，纵坐标为色谱响应值峰高。
红没药烯，特定识别荷质比M/Z为93的离子峰，标品在11.482min出峰，样品在11.275min出峰；紫穗槐二烯，特定识别荷质比M/Z为119的离子峰，标品在10.841min出峰，样品在10.835min出峰；瓦伦烯，特定识别荷质比M/Z为161的离子峰，标品在11.207min出峰，样品在11.212min出峰；用β-法尼烯标品进行定量，特定识别荷质比M/Z为69的离子峰，β-法尼烯标品在10.812min出峰，α-法尼烯样品在11.464min出峰；橙花叔醇，特定识别荷质比M/Z为69的离子峰，标品在13.879min出峰，样品在13.925min出峰。
倍半萜含量测定结果如图9所示，培养72h后JS143的法尼烯产量为0.35mg/L/Day，突变株JS134的法尼烯产量为2.22mg/L/Day，成功将产量提升6倍。这些实验证据证明，通过过表达上游基因能够有效加强倍半萜合成途径通量，尤其是，通过将上游基因表达框与法尼烯合酶、瓦伦烯合酶和橙花叔醇合酶基因表达框结合后，均实现了相应的倍半萜类物质的产生并得到较高的产量。
使用其他底盘藻，例如所述底盘蓝细菌选自聚球藻PCC7942、聚球藻UTEX2973、鱼腥藻PCC7120、聚球藻PCC7002，也能取得类似效果。
本发明的实施例中出于举例说明的目的，列举了一些特定的启动子和特定的蛋白和核酸编码序列，但是，这些特定的启动子、蛋白和核酸编码序列不应当作为本发明限制。本领域技术人员在阅读本申请并领会其精神的情况下，可以自行设计已有的或将有的启动子和具有相同或相似功能的蛋白或核酸编码序列，形成所需要的基因表达框，转入到相应的蓝细菌中，以得到能够合成倍半萜类物质的工程化藻株，这样的启动子和蛋白及核酸编码序列，也应覆盖在本发明的保护范围之下。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种可用于制备合成倍半萜的工程藻的藻株，其特征在于，所述藻株通过向底盘蓝细菌中导入法尼基焦磷酸合酶基因表达框、异戊烯焦磷酸异构酶基因表达框和1脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因表达框得到。
2.根据权利要求1所述的藻株，其特征在于，所述底盘蓝细菌选自选自聚球藻、集胞藻、鱼腥藻。
3.根据权利要求1所述的藻株，其特征在于，所述法尼基焦磷酸合酶基因表达框中，法尼基焦磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1所述的藻株，其特征在于，所述异戊烯焦磷酸异构酶基因表达框中，异戊烯焦磷酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求1所述的藻株，其特征在于，所述1脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因表达框中，1脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的藻株，其特征在于，所述法尼基焦磷酸合酶基因表达框、异戊烯焦磷酸异构酶基因表达框和1脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因表达框整合在所述底盘藻的中性位点上。
7.一种制备可合成倍半萜的工程藻的方法，其特征在于，向权利要求1-6中任一项所述的藻株中导入倍半萜类物质合酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述倍半萜类物质合酶为α-红没药烯合酶、紫穗槐二烯合酶、瓦伦烯合酶1、法尼烯合酶和橙花叔醇合酶中的一种或多种组合。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述α-红没药烯合酶的氨基酸序列如SEQID NO:7所示，所述紫穗槐二烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述瓦伦烯合酶1的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述法尼烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，或者，所述橙花叔醇合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
10.一种合成倍半萜的工程藻，其特征在于，通过权利要求7-9中任一项所述的方法制备得到。
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