CN112501043B - 一种生产香叶基香叶醇酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公布了一种生产香叶基香叶醇的酿酒酵母工程菌的构建和应用，属于合成生物学技术领域。本发明筛选获得了在酿酒酵母中转化效率较高的香叶基香叶基焦磷酸合成酶PaGGPPs。表达tHMG1、PaGGPPs‑ERG20和PaGGPPs‑DPP1可促进香叶基香叶醇的积累。表达CHK1和IPK1，同时缺损ROX1基因可进一步促进香叶基香叶醇的积累。本发明构建的基因工程菌摇瓶发酵最高能够积累0.77g/L香叶基香叶醇，5L发酵罐120h能够积累4.3g/L香叶基香叶醇。

Description

一种生产香叶基香叶醇酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于合成生物学领域，尤其是涉及一种生产香叶基香叶醇酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

香叶基香叶醇(geranylgeraniol)，香精油香气成分之一，被用作香水生产的佐料，同时被用作生产疏水性维生素和药剂的原材料。微生物因其生长迅速、合成特异性强、底物成本低等优点成为香叶基香叶醇合成研究重点。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是最简单的真核模式微生物，成熟快速的基因操作技术和内源性甲羟戊酸途径的存在使酿酒酵母成为了萜类化合物合成研究的热点。为了提高香叶基香叶醇前体香叶基香叶基焦磷酸的供给，有报道香叶基香叶基焦磷酸合酶的效率是二萜化合物合成的一个限速步骤，过表达BTS1-ERG20和BTS1-DPP1可以促进香叶基香叶醇的积累。同时，也有报道过表达HMG-CoA还原酶活性区域编码基因(tHMG1)可以提高异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)的供给。到目前为止，没有报道同时表达外源香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因和两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因对酿酒酵母香叶基香叶醇合成的影响。

发明内容

本申请针对现有技术的不足，本发明提供了一株生产香叶基香叶醇酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。本发明制备得到酿酒酵母工程菌生产香叶基香叶醇具有较高产率。本发明的技术方案如下：

一种酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌染色体整合表达强化甲羟戊酸途径基因、香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因和两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因，同时缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因；

所述甲羟戊酸途径基因为tHMG1；

所述甲羟戊酸途径基因为双拷贝；

所述香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因为PaGGPPs-ERG20和PaGGPPs-DPP1；

所述两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因为CHK1和IPK1；

所述整合表达均使用GAL启动子；

所述缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因为缺损ROX1基因。

所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母YPH499为宿主。

所述酿酒酵母工程菌以pMD-19T simple为整合表达载体。

所述PaGGPPs-ERG20的核苷酸序列如SEQ NO:1所示；PaGGPPs-DPP1的核苷酸序列为SEQ NO:2。

所述tHMG1的核苷酸序列为SEQ NO:3。

所述IPK1的核苷酸序列如SEQ NO:4所示；所述CHK1的核苷酸序列为SEQNO:5；所述ROX1基因核苷酸序列为SEQ NO:6。

一种酿酒酵母工程菌的构建方法，所述构建方法如下：

通过整合表达强化甲羟戊酸途径基因、香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因和两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因，同时缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因，最终制备得到所述酿酒酵母工程菌。

一种所述的酿酒酵母工程菌在生产香叶基香叶醇的应用。

具体应用方法如下：将所述酿酒酵母工程菌进行活化，接种活化后得到的单菌落置于YPD培养基中进行种子培养，并将所得种子培养液接种至YPD培养基中进行发酵，最终生产得到香叶基香叶醇。

所述发酵条件为发酵温度为28-32℃，转速为200-220rpm。

本发明有益的技术效果在于：

本发明比较了不同香叶基香叶基焦磷酸合酶对香叶基香叶醇合成的影响，同时引入异戊烯基焦磷酸两步合成途径和缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因ROX1，构建了一种香叶基香叶醇高效合成菌株，具有工业化应用前景。过表达甲羟戊酸代谢途径限速步骤编码基因tHMG1，是为了增强甲羟戊酸途径的代谢流，提供充足的前体IPP和DMAPP合成FPP和GGPP；引入两步法合成途径，是为了增加前体IPP合成FPP和DMAPP；缺损转录抑制因子编码基因ROX1，是为了提高甲羟戊酸途径基因的转录水平，进一步增强甲羟戊酸合成IPP和DMAPP的能力；表达外源香叶基香叶基焦磷酸合成酶，是为了促进FPP转化成GGPP，提高香叶基香叶醇的产量，同时弱化甾醇途径(竞争途径)消耗FPP。

附图说明

图1是本发明示意图

图2是本发明中质粒Ts-LYS2-tP示意图。

图3是本发明中质粒Ts-TRP1-tP示意图。

图4是本发明中质粒Ts-URA3-101BD示意图。

图5是本发明中质粒Ts-80B20示意图。

图6是本发明中质粒Ts-URA3-101PD示意图。

图7是本发明中质粒Ts-80P20示意图。

图8是本发明中质粒Ts-LEU2-IPC示意图。

图9是本发明中质粒BTS-ROX1示意图。

图10是本发明中不同基因操作对工程菌合成香叶基香叶醇的影响比较。

图11是本发明中工程菌G9 5L发酵罐合成香叶基香叶醇情况。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

本发明中发酵及种子培养基：YPD培养基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖)，发酵时加入10％十二烷(V/V)，使用前115℃灭菌20min。

测定发酵液中香叶基香叶醇浓度的方法：仪器：Thermo Fisher U3000高效液相系统；色谱柱：Waters C18柱；流动相：甲醇、乙腈和水混合物(90:5:5)；检测条件：紫外210nm，流速0.8mL/min，柱温40℃。标准品：香叶基香叶醇(SIGAMA)。

醋酸锂转化的方法：收集4mL菌液，离心收集菌体，用无菌水和0.1M醋酸锂溶液分别洗涤，然后依次加入240μL 50％PEG3350溶液、36μL 1M醋酸锂溶液、50μL鲑鱼精溶液和50μL转化产物，混匀，30℃培养环境静置30min。42℃热激25min，30℃，200rpm后培养1h。

通过从酿酒酵母基因组DNA扩增了相关基因、启动子和终止子构建了过表达的甲羟戊酸途径；经密码子优化和基因合成构建了香叶基香叶醇合成开关。香叶基香叶醇合成工程菌株构建流程见图1。

下述实施例中所用到的菌株如表1所示

表1菌株

实施例中所用到的引物如表2所示

表2引物

实施例1：酿酒酵母香叶基香叶醇合成菌株构建

1.1甲羟戊酸途径强化质粒和BTS1整合表达质粒构建

以酿酒酵母YPH499基因组为模板，用引物P13和P6、P7和P8分别扩增获得tHMG1和P_GAL10-P_GAL1，用引物P13和P8进行融合PCR获得P_GAL10-P_GAL1-tHMG1。以酿酒酵母CICC 31906基因组为模板，用引物P9和P10扩增LYS2基因编码区和编码区前800bp左右区域，连接到pMD-19T simple载体上，引物P11和P12反向PCR产物与P_GAL10-P_GAL1-tHMG1用BamHI和SalI消化后连接获得整合表达质粒Ts-LYS2-tP(图2)。

以酿酒酵母YPH499基因组为模板，用引物P5和P6、P7和P8分别扩增获得tHMG1和P_GAL10-P_GAL1，用引物P5和P8进行融合PCR获得P_GAL10-P_GAL1-tHMG1。以酿酒酵母CICC 31906基因组为模板，用引物P1和P4扩增TRP1基因编码区和编码区前800bp左右区域，连接到pMD-19Tsimple载体上，引物P2和P3反向PCR产物与P_GAL10-P_GAL1-tHMG1用BamHI和AflII消化后连接获得整合表达质粒Ts-TRP1-tP(图3)。

以酿酒酵母YPH499基因组为模板，用引物P14和P15、P16和P17、P18和P19分别扩增获得P_GAL10-P_GAL1、BTS1和DPP1，用引物P14和P19进行融合PCR获得101BD。以酿酒酵母CICC31906基因组为模板，用引物P20和P21扩增URA3基因编码区和编码区前800bp左右区域，连接到pMD-19T simple载体上，引物P22和P23反向PCR产物与101BD用NheI和AflII消化后连接获得整合表达质粒Ts-URA3-101BD(图4)。

以酿酒酵母YPH499基因组为模板，用引物P32和P33、P34和P35分别扩增获得BTS1和ERG20，用引物P32和P35进行融合PCR获得BTS1-ERG20。以质粒pMGKR为模板，用引物P24和P25扩增获得loxp-KANMX-loxp；以以酿酒酵母YPH499基因组为模板，用引物P26和P27、P28和P29分别扩增获得T_TPI1和P_GAL10-P_GAL1，用引物P24和P29进行融合PCR获得loxp-KANMX-loxp-T_TPI1-P_GAL10-P_GAL1；连接至pMD-19T simple载体上，用引物P30和P31反向PCR产物与BTS1-ERG20用NheI和BamHI消化后连接获得质粒Ts-XTP101B20。以酿酒酵母YPH499基因组为模板，用引物P36和P37扩增获得GAL80，连接至pMD-19T simple载体上，用引物P38和P39反向PCR产物与质粒Ts-XTP101B20用XbaI和AflII消化后连接获得整合表达质粒Ts-80B20(图5)。

1.2整合表达质粒线性化转化酿酒酵母

将整合表达质粒Ts-LYS2-tP用SmaI线性化，整合质粒Ts-TRP1-tP用SacII线性化，醋酸锂转化酿酒酵母YPH499，涂布氨基酸缺陷筛选平板，筛选获得菌株G1。将整合质粒Ts-URA3-101BD用SacII线性化，醋酸锂转化酿酒酵母G1，涂布氨基酸缺陷筛选平板，筛选获得菌株G2。将整合质粒Ts-80B20用SacII线性化，醋酸锂转化酿酒酵母G1，涂布含500μg/mLG418的YPD平板，筛选获得菌株G3。

YPD平板划线活化菌株酿酒酵母YPH499，G1、G2和G3，接种单菌落到20mL YPD液体培养基活化作为种子液，按照初始OD600＝0.1转接到30mL发酵培养基中，30℃，200rpm培养168h，测定香叶基香叶醇的积累。结果如图10所示，YPH499和G1均未检测到香叶基香叶醇的积累，G2和G3发酵液中香叶基香叶醇的浓度分别为155.23±29.93和16.54±2.91mg/L。因此，同时过表达tHMG1和BTS1，酿酒酵母才能分泌和积累香叶基香叶醇。

实施例2：引入外源香叶基香叶基焦磷酸合酶提高工程菌香叶基香叶醇合成能力

2.1外源香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因整合表达质粒构建

通过NCBI获得成团泛菌(PaGGPPs，GenBank:PHP91680.1)来源香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因序列，序列发送至苏州金唯智生物科技有限公司进行密码子优化和基因合成。PaGGPPs由苏州金唯智生物科技有限公司连接至pUC57载体，保存宿主为大肠杆菌DH5α。以质粒pUC57-PaGGPPs为模板，用引物P42和P43扩增获得PaGGPPs；以酿酒酵母YPH499基因组为模板，用引物P40和P41、P44和P19分别扩增获得P_GAL10-P_GAL1和DPP1；用引物P40和P19进行融合PCR获得101PD。以酿酒酵母CICC 31906基因组为模板，用引物P20和P21扩增URA3基因编码区和编码区前800bp左右区域，连接到pMD-19Tsimple载体上，引物P45和P22反向PCR产物与101PD用EcoRI和AflII消化后连接获得整合表达质粒Ts-URA3-101PD(图6)。

以质粒pUC57-PaGGPPs为模板，用引物P46和P47扩增获得PaGGPPs；以酿酒酵母YPH499基因组为模板，用引物P48和P49扩增获得ERG20；用引物P46和P49进行融合PCR获得PaGGPPs-ERG20。以质粒pMGKR为模板，用引物P24和P25扩增获得loxp-KANMX-loxp；以以酿酒酵母YPH499基因组为模板，用引物P26和P27、P28和P29分别扩增获得T_TPI1和P_GAL10-P_GAL1，用引物P24和P29进行融合PCR获得loxp-KANMX-loxp-TTPI1-PGAL10-PGAL1；连接至pMD-19Tsimple载体上，用引物P30和P31反向PCR产物与PaGGPPs-ERG20用NheI和BamI消化后连接获得质粒Ts-XTP101P20。以酿酒酵母YPH499基因组为模板，用引物P50和P51扩增获得GAL80，连接至pMD-19T simple载体上，用引物P38和P39反向PCR产物与质粒Ts-XTP101P20用XbaI和AflII消化后连接获得整合表达质粒Ts-80P20(图7)。

2.2整合表达质粒线性化转化酿酒酵母

将整合表达质粒Ts-URA3-101PD用SacII线性化，醋酸锂转化酿酒酵母G1，涂布氨基酸缺陷筛选平板，筛选获得菌株G4。将整合质粒Ts-80P20用EcoRI线性化，醋酸锂转化酿酒酵母G1和G4，涂布含500μg/mL G418的YPD平板，筛选获得菌株G5和G6。

YPD平板划线活化菌株酿酒酵母G4、G5和G6，接种单菌落到20mL YPD液体培养基活化作为种子液，按照初始OD600＝0.1转接到30mL发酵培养基中，30℃，200rpm培养168h，测定香叶基香叶醇的积累。结果如图10所示，G4、G5和G6发酵液中香叶基香叶醇的浓度分别为268.31±4.07、164.18±7.05和308.63±3.29mg/L，外源香叶基香叶基焦磷酸合酶(PaGGPPs)的效率明显高于BTS1。与G2相比，PaGGPPs-DPP1和PaGGPPs-ERG20的过表达使香叶基香叶醇的积累提高了98.82％。

实施例3：引入两步法合成异戊烯基焦磷酸提高工程菌香叶基香叶醇合成能力

3.1两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因整合表达质粒构建

通过NCBI获得拟南芥(IPK1，GenBank:NM_102426.6)来源氨基酸激酶编码基因序列，序列发送至苏州金唯智生物科技有限公司进行密码子优化和基因合成。IPK1由苏州金唯智生物科技有限公司连接至pUC57载体，保存宿主为大肠杆菌DH5α。以质粒pUC57-IPK1为模板，用引物P58和P59扩增获得IPK1；以酿酒酵母YPH499基因组为模板，用引物P56和P57、P60和P61、P62和P63分别扩增获得T_TPI1、P_GAL10-P_GAL1和CHK1；用引物P56和P63进行融合PCR获得I101C。以酿酒酵母CICC 31906基因组为模板，用引物P52和P53扩增LEU2基因编码区和编码区前800bp左右区域，连接到pMD-19T simple载体上，引物P54和P55反向PCR产物与I101C用SmaI和NheI消化后连接获得整合表达质粒Ts-LEU2-I101C(图8)。

3.2整合表达质粒线性化转化酿酒酵母

将整合表达质粒Ts-LEU2-I101C用SacII线性化，醋酸锂转化酿酒酵母G6，涂布氨基酸缺陷筛选平板，筛选获得菌株G7。

YPD平板划线活化菌株酿酒酵母G7，接种单菌落到20mL YPD液体培养基活化作为种子液，按照初始OD600＝0.1转接到30mL发酵培养基中，30℃，200rpm培养168h，测定香叶基香叶醇的积累。结果如图10所示，G7发酵液中香叶基香叶醇的浓度为465.59±70.30mg/L，与G6相比，IPK1和CHK1的过表达使香叶基香叶醇的积累提高了50.86％。

实施例4：缺损竞争途径提高工程菌香叶基香叶醇合成能力

4.1基因缺损质粒构建

以质粒BTS为模板，用引物P63和P64扩增获得gRNA，gRNA和质粒BTS用BamHI和BcuI消化后连接获得质粒BTS-ROX1(图9)。

4.2基因缺损质粒转化转化酿酒酵母

质粒pHcas9、BTS-ROX1和引物P66醋酸锂转化酿酒酵母G6和G7，涂布100μg/mL诺尔斯菌素和500μg/mL潮霉素平板，筛选获得菌株G8和G9。

YPD平板划线活化菌株酿酒酵母G8和G9，接种单菌落到20mL YPD液体培养基活化作为种子液，按照初始OD600＝0.1转接到30mL发酵培养基中，30℃，200rpm培养168h，测定香叶基香叶醇的积累。结果如图10所示，G8和G9发酵液中香叶基香叶醇的浓度为608.32±38.38和776.35±48.27mg/L，与G7相比，基因ROX1的缺损使香叶基香叶醇的积累提高了66.75％。

实施例5：香叶基香叶醇合成工程菌5L发酵罐实验

YPD平板划线活化菌株酿酒酵母G9，接种单菌落到20mL YPD液体培养基活化作为一级种子液，按照1％的接种量转接到50mL YPD液体培养基活化作为二级种子液，按照5％的接种量接种5L发酵罐，测定香叶基香叶醇的积累。结果如图11所示，发酵120小时，菌株G9可以积累4.3g/L香叶基香叶醇。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种生产香叶基香叶醇酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1977

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgacagtgt gcgcagagca acacgttaac ttcatccact ccgacgctgc gtctcttcta 60

aatgatattg agcaaagact ggaccagttg ttaccagtag aaagtgaaag agacttggta 120

ggcgctgcaa tgcgtgacgg tgcactagca cccggtaaga ggatcaggcc gttgctatta 180

cttctagctg ctagggactt aggctgcaat gcgactccgg ctgggttatt ggacttggcc 240

tgcgcagttg aaatggtcca cgctgcatca ctaattttag acgacatgcc gtgtatggat 300

gatgcacagc tgaggagggg taggcccacc atacattgcc agtacggaga acacgtagct 360

attttggcag ccgtggcgct gttgtcaaag gcattcggcg ttgttgcagc ggctgaaggt 420

ttaactgcca ccgcgagagc tgatgcagta gcggaactta gccacgctgt gggtatgcag 480

ggactggttc aaggtcagtt caaggacttg tccgaaggcg acaaaccaag gagtgccgac 540

gccatactga tgacgaatca ttacaaaact tccaccttat tctgcgcaag cctacagatg 600

gcctcaatcg ttgctgaggc ctctggggag gccagagaac aactgcatag attttctttg 660

aacctgggcc aggccttcca gttgctggac gatttgactg acggtatggc cgacacgggt 720

aaggacgcgc atcaagatga tgggaagtcc actcttgtca acctacttgg ccctcaggca 780

gtggaaacta gactaaggga tcacttgagg tgtgcatccg aacatcttct gtcagcttgt 840

caggacggct atgccaccca ccacttcgtc caggcatggt tcgaaaaaaa gctggcggcg 900

gtttcaggtg gtggttctat ggcttcagaa aaagaaatta ggagagagag attcttgaac 960

gttttcccta aattagtaga ggaattgaac gcatcgcttt tggcttacgg tatgcctaag 1020

gaagcatgtg actggtatgc ccactcattg aactacaaca ctccaggcgg taagctaaat 1080

agaggtttgt ccgttgtgga cacgtatgct attctctcca acaagaccgt tgaacaattg 1140

gggcaagaag aatacgaaaa ggttgccatt ctaggttggt gcattgagtt gttgcaggct 1200

tacttcttgg tcgccgatga tatgatggac aagtccatta ccagaagagg ccaaccatgt 1260

tggtacaagg ttcctgaagt tggggaaatt gccatcaatg acgcattcat gttagaggct 1320

gctatctaca agcttttgaa atctcacttc agaaacgaaa aatactacat agatatcacc 1380

gaattgttcc atgaggtcac cttccaaacc gaattgggcc aattgatgga cttaatcact 1440

gcacctgaag acaaagtcga cttgagtaag ttctccctaa agaagcactc cttcatagtt 1500

actttcaaga ctgcttacta ttctttctac ttgcctgtcg cattggccat gtacgttgcc 1560

ggtatcacgg atgaaaagga tttgaaacaa gccagagatg tcttgattcc attgggtgaa 1620

tacttccaaa ttcaagatga ctacttagac tgcttcggta ccccagaaca gatcggtaag 1680

atcggtacag atatccaaga taacaaatgt tcttgggtaa tcaacaaggc attggaactt 1740

gcttccgcag aacaaagaaa gactttagac gaaaattacg gtaagaagga ctcagtcgca 1800

gaagccaaat gcaaaaagat tttcaatgac ttgaaaattg aacagctata ccacgaatat 1860

gaagagtcta ttgccaagga tttgaaggcc aaaatttctc aggtcgatga gtctcgtggc 1920

ttcaaagctg atgtcttaac tgcgttcttg aacaaagttt acaagagaag caaatag 1977

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<211> 1788

<212> DNA

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<400> 2

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ggcgctgcaa tgcgtgacgg tgcactagca cccggtaaga ggatcaggcc gttgctatta 180

cttctagctg ctagggactt aggctgcaat gcgactccgg ctgggttatt ggacttggcc 240

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ttaagtagtg gaaatacaaa acaattgaag aacaaagagg tcgctgcctt ggttattcac 300

ggtaagttac ctttgtacgc tttggagaaa aaattaggtg atactacgag agcggttgcg 360

gtacgtagga aggctctttc aattttggca gaagctcctg tattagcatc tgatcgttta 420

ccatataaaa attatgacta cgaccgcgta tttggcgctt gttgtgaaaa tgttataggt 480

tacatgcctt tgcccgttgg tgttataggc cccttggtta tcgatggtac atcttatcat 540

ataccaatgg caactacaga gggttgtttg gtagcttctg ccatgcgtgg ctgtaaggca 600

atcaatgctg gcggtggtgc aacaactgtt ttaactaagg atggtatgac aagaggccca 660

gtagtccgtt tcccaacttt gaaaagatct ggtgcctgta agatatggtt agactcagaa 720

gagggacaaa acgcaattaa aaaagctttt aactctacat caagatttgc acgtctgcaa 780

catattcaaa cttgtctagc aggagattta ctcttcatga gatttagaac aactactggt 840

gacgcaatgg gtatgaatat gatttctaaa ggtgtcgaat actcattaaa gcaaatggta 900

gaagagtatg gctgggaaga tatggaggtt gtctccgttt ctggtaacta ctgtaccgac 960

aaaaaaccag ctgccatcaa ctggatcgaa ggtcgtggta agagtgtcgt cgcagaagct 1020

actattcctg gtgatgttgt cagaaaagtg ttaaaaagtg atgtttccgc attggttgag 1080

ttgaacattg ctaagaattt ggttggatct gcaatggctg ggtctgttgg tggatttaac 1140

gcacatgcag ctaatttagt gacagctgtt ttcttggcat taggacaaga tcctgcacaa 1200

aatgttgaaa gttccaactg tataacattg atgaaagaag tggacggtga tttgagaatt 1260

tccgtatcca tgccatccat cgaagtaggt accatcggtg gtggtactgt tctagaacca 1320

caaggtgcca tgttggactt attaggtgta agaggcccgc atgctaccgc tcctggtacc 1380

aacgcacgtc aattagcaag aatagttgcc tgtgccgtct tggcaggtga attatcctta 1440

tgtgctgccc tagcagccgg ccatttggtt caaagtcata tgacccacaa caggaaacct 1500

gctgaaccaa caaaacctaa caatttggac gccactgata taaatcgttt gaaagatggg 1560

tccgtcacct gcattaaatc ctaaacttag tcatacgtca ttggtattct cttgaaaaag 1620

aagcacaaca gcaccatgtg ttacgtaaaa tatttacttt atagtttgta cgtcataatt 1680

tcttccatat tacaagttcg tgcatatata gaaagaattc tgttgttgta attgtcataa 1740

cta 1743

<210> 4

<211> 999

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggaattga atatttctga atcaagatca agaagtatac gatgtattgt taaattgggt 60

ggtgctgcta ttacttgtaa aaatgaattg gaaaaaattc atgatgaaaa tttggaagtt 120

gttgcttgtc aattgagaca agctatgttg gaaggttctg ctccatctaa agttattggt 180

atggattggt ctaaaagacc tggttcttct gaaatttctt gtgatgttga tgatattggt 240

gatcaaaaat cttctgaatt ttctaaattt gttgttgttc atggtgctgg ttcttttggt 300

cattttcaag cttctagatc tggtgttcat aaaggtggtt tggaaaaacc aatcgttaaa 360

gctggttttg ttgctactag aatttctgtt actaatttga atttggaaat tgttagagct 420

ttggctagag aaggtattcc aactattggt atgtctccat tttcttgtgg ttggtctact 480

tctaaaagag atgttgcttc tgctgatttg gctactgttg ctaaaactat tgattctggt 540

tttgttcctg ttttgcatgg tgatgcggtt ttggataata ttttgggttg tactattttg 600

tctggtgatg ttattattag acatttggct gatcatttga aacctgaata tgttgttttt 660

ttgactgatg ttttgggtgt ttatgataga ccaccatctc catctgaacc tgatgctgtt 720

ttgttgaaag aaattgctgt tggtgaagat ggttcttgga aagttgttaa tccattgttg 780

gaacatactg ataaaaaagt tgattattct gttgctgctc atgatactac tggtggtatg 840

gaaactaaaa tttctgaagc tgctatgatt gctaaattgg gtgttgatgt ttatatagtt 900

aaagctgcta ctactcattc tcaaagagct ttgaatggtg atttgagaga ttctgttcct 960

gaagattggt tgggtactat tattagattt tctaaataa 999

<210> 5

<211> 1584

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgagtctct cgcaggtgtc acctttaccc catatcaagg atgttgtttt aggagataca 60

gtaggccaag gcgcattcgc ctgcgttaaa aatgctcatc ttcaaatgga tccctccatt 120

attctagctg ttaaattcat tcatgttccc acttgcaaaa aaatgggact cagtgacaag 180

gatatcacaa aagaggttgt tttgcaatcg aagtgttcta agcatcctaa tgttttgaga 240

cttatcgatt gtaatgtctc taaagaatat atgtggataa ttctggagat ggcagatggt 300

ggtgatctat ttgataagat tgagcctgac gttggagttg attccgacgt ggcccaattt 360

tactttcaac agctcgttag tgctattaat tatctgcatg tagaatgtgg agttgctcac 420

agagacatca agcctgaaaa catcttactc gataagaacg gaaatctgaa gctagctgat 480

tttgggctcg cctctcaatt taggaggaaa gatggtacat tacgtgtatc catggatcaa 540

aggggttctc caccctacat ggctcctgaa gtattatatt ctgaagaggg ttattacgca 600

gatcgaacag atatatggtc tattggcatc ctcttgttcg tattgttgac tggtcaaacg 660

ccttgggaat taccttcatt agagaacgaa gatttcgtct tttttattga aaatgatgga 720

aatttaaact ggggaccctg gtcaaagata gaatttactc acttgaacct actccgaaaa 780

attttacaac ctgacccaaa taagagggtg acattgaagg ctttaaagtt acatccttgg 840

gtattacgtc gagcttcatt ttctggggat gatggtctct gtaatgaccc tgaactcttg 900

gctaagaaac tgttttctca cttaaaagtc tcactgagta acgaaaatta tttgaaattc 960

actcaagata caaactctaa taataggtac atttctactc agccaattgg taacgaattg 1020

gctgagcttg aacacgactc aatgcatttc cagacagttt cgaatacaca acgtgcattt 1080

acctcgtatg attcaaatac gaactataat agcggaacag gtatgacaca agaggctaag 1140

tggacgcaat tcataagcta tgatatcgct gccttacagt ttcattctga tgaaaatgat 1200

tgtaatgaat tagtaaaacg acatttacaa tttaatccga ataaacttac caagttctac 1260

acgttgcaac ctatggatgt tttgttaccg attttggaga aagccttgaa tttatcacaa 1320

attagagtaa aacccgacct ttttgcgaat tttgaaagat tgtgcgaatt attgggttat 1380

gataacgttt tcccacttat tataaatatt aaaaccaaaa gtaatggggg ttatcaatta 1440

tgcggtagca tttccatcat aaagattgaa gaagagttga aaagtgtcgg atttgaaaga 1500

aaaactggtg atcctttaga atggagaaga ttgttcaaga aaatttcaac tatctgtagg 1560

gatattatcc taattcccaa ctga 1584

<210> 6

<211> 1107

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaatccta aatcctctac acctaagatt ccaagaccca agaacgcatt tattctgttc 60

agacagcact accacaggat cttaatagac gaatggaccg ctcaaggtgt ggaaataccc 120

cataattcaa acatttctaa aattattggt acgaagtgga agggcttaca accggaagat 180

aaggcacact gggaaaatct agcggagaag gagaaactag aacatgaaag gaagtatcct 240

gaatacaaat acaagccggt aagaaagtct aagaagaagc aactactttt gaaggaaatc 300

gagcaacagc agcagcaaca acagaaagaa cagcagcagc agaaacagtc acaaccgcaa 360

ttacaacagc cctttaacaa caatatagtt cttatgaaaa gagcacattc tctttcacca 420

tcttcctcgg tgtcaagctc gaacagctat cagttccaat tgaacaatga tcttaagagg 480

ttgcctattc cttctgttaa tacttctaac tatatggtct ccagatcttt aagtggacta 540

cctttgacgc atgataagac ggcaagagac ctaccacagc tgtcatctca actaaattct 600

attccatatt actcagctcc acacgaccct tcaacgagac atcattacct caacgtcgct 660

caagctcaac caagggctaa ctcgacccct caattgccct ttatttcatc cattatcaac 720

aacagcagtc aaacaccggt aactacaact accacatcca caacaactgc gacatcttct 780

cctgggaaat tctcctcttc tccgaactcc tctgtactgg agaacaacag attaaacagt 840

atcaacaatt caaatcaata tttacctccc cctctattac cttctctgca agattttcaa 900

ctggatcagt accagcagct aaagcagatg ggaccaactt atattgtcaa accactgtct 960

cacaccagga acaatctatt gtccacaact acccctacgc atcatcacat tcctcatata 1020

ccaaaccaaa acattcctct acatcaaatt ataaactcaa gcaacactga ggtcaccgct 1080

aaaactagcc tagtttctcc gaaatga 1107

Claims (7)

1.一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌染色体整合表达强化甲羟戊酸途径基因、香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因和两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因，同时缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因；

所述甲羟戊酸途径基因为tHMG1；

所述甲羟戊酸途径基因为双拷贝；

所述香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因为PaGGPPs-ERG20和PaGGPPs-DPP1；

所述两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因为CHK1和IPK1；

所述整合表达均使用GAL启动子；

所述缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因为缺损ROX1基因；

所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母YPH499为宿主；

所述PaGGPPs-ERG20的核苷酸序列如SEQ NO:1所示；PaGGPPs-DPP1的核苷酸序列为SEQNO:2；

所述IPK1的核苷酸序列如SEQ NO:4所示；所述CHK1的核苷酸序列为SEQ NO:5；所述ROX1基因核苷酸序列为SEQ NO:6。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌以pMD- 19T simple为整合表达载体。

3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述tHMG1的核苷酸序列为SEQNO:3。

4.一种如权利要求1-3中任一项所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法如下：

通过整合表达强化甲羟戊酸途径基因tHMG1、香叶基香叶基焦磷酸合酶编码基因PaGGPPs-ERG20和两步法合成异戊烯基焦磷酸编码基因CHK1和IPK1，同时缺损甲羟戊酸途径和甾醇合成途径转录抑制因子编码基因ROX1，最终制备得到所述酿酒酵母工程菌；

所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母YPH499为宿主；

所述PaGGPPs-ERG20的核苷酸序列如SEQ NO:1所示；PaGGPPs-DPP1的核苷酸序列为SEQNO:2；

所述IPK1的核苷酸序列如SEQ NO:4所示；所述CHK1的核苷酸序列为SEQ NO:5；所述ROX1基因核苷酸序列为SEQ NO:6。

5.一种如权利要求1-3中任一项所述的酿酒酵母工程菌在生产香叶基香叶醇的应用。

6.根据权利要求5所述的酿酒酵母工程菌在生产香叶基香叶醇的应用，其特征在于，具体应用方法如下：将所述酿酒酵母工程菌进行活化，接种活化后得到的单菌落置于YPD培养基中进行种子培养，并将所得种子培养液接种至YPD培养基中进行发酵，最终生产得到香叶基香叶醇。

7.根据权利要求5所述的酿酒酵母工程菌在生产香叶基香叶醇的应用，其特征在于，所述发酵条件为发酵温度为28-32 ℃，转速为200-220 rpm。

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