CN108929884B - 通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法 - Google Patents

通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108929884B
CN108929884B CN201710391001.7A CN201710391001A CN108929884B CN 108929884 B CN108929884 B CN 108929884B CN 201710391001 A CN201710391001 A CN 201710391001A CN 108929884 B CN108929884 B CN 108929884B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
ganoderma
cyp
yeast
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710391001.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108929884A (zh
Inventor
肖晗
王文方
钟建江
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN201710391001.7A priority Critical patent/CN108929884B/zh
Publication of CN108929884A publication Critical patent/CN108929884A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108929884B publication Critical patent/CN108929884B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
    • C12N9/0081—Cholesterol monooxygenase (cytochrome P 450scc)(1.14.15.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/15—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced iron-sulfur protein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.15)
    • C12Y114/15006—Cholesterol monooxygenase (side-chain-cleaving) (1.14.15.6), i.e. cytochrome P450scc

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

一种采用合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法，通过挖掘和灵芝三萜生物合成相关的细胞色素P450酶(CYP)基因，并在酿酒酵母细胞异源表达该基因来进行筛选鉴定，并对酵母工程菌株的发酵产物进行分离纯化、质谱和核磁共振等分析，确定其为3‑hydroxy‑lanosta‑8,24‑dien‑26‑oic‑acid(灵芝酸Z)。本发明包含从灵芝三萜生物合成催化元件的挖掘，发酵表型初筛与元件功能鉴定，到最终获得异源生物合成的灵芝三萜类物质等一系列的设计及验证，也为异源生产其它灵芝三萜类活性物质提供了范例。

Description

通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法
技术领域
本发明涉及的是一种生物工程领域的技术，具体是一种生物合成灵芝三萜类物质的方法。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum)是中国传统的名贵药用高等真菌，对于辅助肿瘤治疗、抗HIV、提高人体免疫力、延缓衰老等具有显著功效(Sliva,2004)。灵芝这些独特的功效和其胞内具有生理活性的次级代谢产物密切相关，尤其是灵芝三萜类物质(Qin et al.,2016)。目前已从灵芝中分离得到了约200种灵芝三萜类物质(Baby et al.,2015)，它们具有不同的生理功能，例如，灵芝酸T和灵芝酸Me具有抗人肺癌细胞转移的作用(Tang etal.,2006；Chen et al.,2008)，灵芝酸GS-2可抑制HIV病毒的复制(Sato et al.,2009)。
栽培灵芝生长周期长、三萜类产物含量不高且易受环境因素影响。目前主要通过液体深层发酵生产灵芝三萜。通过对发酵条件的优化、补料发酵工艺以及对菌株的代谢工程改造有效提高了灵芝酸的产量，但灵芝三萜的产量仍处于毫克每升的水平(Tang etal.,2009)，由于细胞生长较慢，生产效率不高，难以满足大规模临床试验的用量要求(Liet al.,2016)。
合成生物学的发展为利用快速生长的微生物来异源表达植物类次生代谢产物生物合成基因，提供了一种有潜力的生产途径。近年，酿酒酵母已被国内外多个研究小组用于异源合成数种重要的植物天然化合物(Ajikumar et al.,2008；Dai et al.,2014；Yan etal.,2014)。灵芝三萜是通过甲羟戊酸途径(Mevalonate pathway)生物合成的。同位素示踪实验证实羊毛甾醇(Lanosterol)为灵芝三萜的生物合成前体(Yeh et al.,1989)。研究者们推测通过一系列包括细胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP)在内的对羊毛甾醇的羟化等反应(Xiao and Zhong,2016；Yeh et al.,1989)，从而生成不同种类的灵芝三萜，但目前仍未见关于灵芝三萜异源生物合成的报道。
发明内容
本发明针对现有人工栽培灵芝或灵芝深层发酵的宿主生长缓慢之不足，提出一种通过合成生物学手段异源生物合成灵芝三萜类物质的方法，具体来讲是通过挖掘鉴定和灵芝三萜生物合成相关的CYP基因，并在酿酒酵母细胞异源表达，从而实现异源合成灵芝三萜。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法，首先依据筛选原则从灵芝基因组中选择可能参与灵芝酸生物合成的CYP基因，然后分别将其克隆到酵母表达质粒，并将酵母表达质粒分别转化至重组微生物酿酒酵母中进行异源表达，通过对转化后的菌株进行发酵筛选，最终筛选得到用于催化羊毛甾醇生成灵芝三萜的CYP基因CYP5150L8(即GL24883)，从而实现灵芝三萜的异源生物合成。
所述的筛选原则包括：
①通过筛选和灵芝三萜前体物质羊毛甾醇合成酶(lanosterol synthase，LSS)物理位置最靠近的两个CYP基因以及在灵芝的生长过程中和LSS共表达的78个CYP基因(Chenet al.,2012)，以及
②灵芝细胞受到外界环境刺激后伴随灵芝三萜含量提高同时，自身转录水平也提高的CYP基因，具体是指：添加茉莉酸甲酯诱导后灵芝三萜产量提高同时有四个CYP基因转录上调(Ren et al.2010)；在灵芝发酵培养由震荡转为静置灵芝三萜含量提高同时有一个CYP基因转录上调(Xu et al.,2012)。
所述的异源表达具体是指：通过PCR扩增候选的各个CYP表达序列片段，通过同源重组的方法将表达载体pRS426、CYP表达片段、酵母HXT7p启动子和酵母FBA1t终止子重组连接，得到一系列重组表达质粒pRS426HF-CYPs(s代指不同的CYP基因)。
所述的发酵筛选具体是指：通过标准的醋酸锂转化法(Gietz et al.,1991)，将各个表达质粒导入酿酒酵母后，通过YPD培养基、YPD40培养基或YPD40F培养基发酵，随后对发酵产物经乙酸乙酯萃取，随后减压蒸馏除去乙酸乙酯，再用甲醇重悬，最后通过HPLC分析观察是否有新峰产生，从而初步判断所转化的CYP基因是否是所需的目的基因。
所述的YPD培养基成分为酵母粉10g/L，牛肉蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。
所述的YPD40培养基成分为酵母粉10g/L，牛肉蛋白胨20g/L，葡萄糖40g/L。
所述的YPD40F培养基成分为酵母粉10g/L，牛肉蛋白胨20g/L，葡萄糖40g/L，赖氨酸0.173g/L，KH2PO4 0.314g/L，MgSO4.7H2O 0.177g/L，K2SO4 0.121g/L，Na2SO4 0.019g/L。
所述的重组酿酒酵母为基因工程改造后的BY4742菌株YL-T3(BY4742,Δtrp1,δDNA::PPGK1-tHMG1-TADH1-PTEF1-LYS2-TCYC1,TRP::HIS-PPGK1-ERG20-TADH1-PTEF1-ERG9-TCYC1-PTDH3-ERG1-TTPL1)其中BY4742菌株为本领域技术人员常用的一种商品化酵母宿主。在此基础上过表达了羊毛甾醇生物合成途径上游几个基因tHMG1、ERG20、ERG9和ERG1，从而提高了羊毛甾醇合成量。具体构建方法可参考(Dai et al，Science Report，2014)文献获得。
所述的CYP基因CYP5150L8，为灵芝三萜生物合成途径的关键基因(即GL24883)，其核苷酸序列如Seq No.1所示，氨基酸序列如Seq No.2所示。
技术效果
与现有技术相比，本发明通过从灵芝基因组中挖掘到一个参与灵芝三萜合成的CYP5150L8基因(即GL24883)。并利用合成生物学技术构建了酵母工程菌株，实现灵芝三萜类物质的异源生物合成，为取代传统的人工栽培或深层发酵获取灵芝三萜提供了一种潜在的方法，为进一步通过代谢工程改造高效生物合成灵芝三萜奠定基础。
本发明的技术效果包括：
产品质量方面：所生物合成的灵芝三萜与天然的化合物结构完全一致，故可认为具有同等的产品性能和质量。
生产效率方面：由于酿酒酵母生长比灵芝快，其潜在生物合成效率高。
附图说明
图1为本发明表达载体pRS426HF-CYP5150L8示意图；
图2为酵母转化菌株和对照菌株发酵第5天产物HPLC分析图；
图中：A图实线为YL-T3-CYP5150L8发酵产物HPLC分析图；虚线为对照YL-T3-Voidplasmid产物图。B图左侧为产物在正离子模式下质谱图，右侧为产物在负离子模式下质谱图。
图3为表达CYP5150L8的酵母转化株在不同培养基条件下生长曲线及产物图。图中：A为生长曲线图；B为产物(灵芝酸Z，GA-Z)积累图。
空心圆圈为YL-T3-Void plasmid菌株在YPD中发酵，实心圆圈为菌株YL-T3-CYP5150L8在YPD中发酵，实心三角为YL-T3-CYP5150L8在YPD40培养基中发酵，实心方块为YL-T3-CYP5150L8在YPD40F培养基中发酵。
图4为实施例产物GA-Z的1H NMR谱图；
图5为实施例产物GA-Z的13C NMR谱图；
图6为GA-Z的DEPT谱图；
图7为GA-Z的HMBC谱图；
图8为GA-Z的HMQC谱图；
图9为GA-Z的COSY谱图；
图10为本发明技术路线图。
具体实施方式
实施例1
酵母转化株的构建
构建表达CYP基因的酵母菌株包括：
以灵芝cDNA文库为模板，PCR扩增得到各个候选基因的编码区序列(CDS)片段；
随后将各个CDS片段重组至表达载体pRS426，并测序验证。得到一系列重组质粒pRS426HF-CYPs(s表示不同的CYP基因)；
将各个重组质粒分别转化到酵母细胞YL-T3，从而获得一系列表达不同候选CYP基因的酵母菌株YL-T3-CYPs。
所述的用于扩增灵芝CYP基因cDNA片段的引物如序列表1所示：
表1：扩增灵芝CYP基因所用引物序列表
Figure BDA0001307510260000041
Figure BDA0001307510260000051
Figure BDA0001307510260000061
Figure BDA0001307510260000071
Figure BDA0001307510260000081
F和R分别表示正向和反向引物；小写字母为同源臂序列，大写字母为对应的各个基因的特异性扩增序列。
所述的重组质粒pRS426HF-CYPs，具体通过以下方式得到：
i)通过SmaI线性化pRS426质粒，随后在其两端引入酵母内源的HXT7p启动子和FBA1t终止子。
所述的HXT7p启动子和FBA1t终止子片段以酵母基因组为模板，并分别采用引物HXT7p-F/R，FBA1t-F/R PCR获得，引物具体序列如序列表2所示：
表2：扩增酵母启动子终止子引物序列表
Figure BDA0001307510260000082
ii)将线性化的pRS426质粒、HXT7p启动子和FBA1t终止子通过重组酶连接，得到包含启动子和终止子的pRS426HF质粒，随后通过Pme1酶切线性化，然后和上述得到的各个CYP基因CDS片段重组连接，具体步骤如下：
a)连接体系：载体50ng、CYP基因片段50～200ng、CE II Buffer 4μL、ExnaseII 2μL、蒸馏水补至20μL。混匀，37℃反应连接30min，冰浴5min。
b)连接产物转移至50μL DH5α感受态细胞、冰上放置20min，42℃热激90S，加入800μL预冷LB，37℃孵育30～50min。随后涂含100ug/mL的Amp抗性的LB平板，37℃培养箱过夜培养。
c)挑选阳性克隆接含100ug/mL Amp抗性的LB试管，37℃220rpm过夜培养。
d)对上述试管培养的大肠杆菌细胞抽质粒后测序。比对测序结果，得到正确的重组质粒pRS426HF-CYPs。
将上述得到的一系列测序正确的重组质粒通过醋酸锂法(RD Gietz et al.,Yeast,1991)转化至酵母感受态。转化后的酵母涂布在SC-His-Leu-Ura(SC-HLU)固体培养基(去氨基酸酵母氮源6.7g/L；葡萄糖，20g/L；Do-Supplement-His-Leu-Ura3，0.65g/L；琼脂粉，2％)进行筛选。30℃培养箱3～5天。至转化子出现，挑选阳性转化子。
实施例2
候选CYP基因的确定以及利用酵母转化株的发酵来进行功能鉴定
如前所述，我们依据两个原则，选择了灵芝总共219个CYP基因中的82个候选基因，并完成了其中76基因的初步筛选。这些基因的Gene ID(基因编号)分别为：GL17567，GL17743，GL23374，GL21030，GL19267，GL23303，GL29510，GL15605，GL31771，GL31772，GL23109，GL20660，GL22911，GL19231，GL22909，GL31761，GL20623，GL23338，GL30772，GL22480，GL24022，GL31754，GL24426，GL31403，GL23174，GL28081，GL29831，GL22657，GL31713，GL24902，GL17382，GL23363，GL24917，GL24889，GL21993，GL22087，GL21992，GL22088，GL24898，GL24883，GL24896，GL24382，GL24198，GL26139，GL21131，GL21663，GL31753，GL31777，GL15091，GL26850，GL31726，GL21057，GL29946，GL20766，GL20706，GL31717，GL31719，GL31723，GL23851，GL16778，GL23557，GL23927，GL23926，GL31718，GL31721，GL31722，GL28603，GL17412，GL31729，GL21090，GL31780，GL22978，GL21701，GL30595，GL30444，GL31768。
酵母转化株的发酵：2.1)将构建好的各个包含不同CYP基因的酵母转化子进行YPD发酵(1％酵母粉，2％牛肉蛋白胨，2％葡萄糖)，并以不含CYP基因的空质粒菌株作为对照。通过比较其代谢产物的差异，从而初步筛选可能和灵芝三萜生物合成相关的CYP基因，具体操作如下：
2.1.1)转化子的发酵培养。将阳性转化子接种至4mL SC-HLU种子培养试管，30℃，220rpm培养30h，吸取1mL培养的种子，转接至50mL的YPD培养基中，30℃、220rpm发酵培养。
2.1.2)发酵培养第5天，取出培养瓶，加50mL乙酸乙酯剧烈震荡30min，3000rpm，5min离心并吸取上层有机相，重复一次，合并上清。上层有机相转移至旋蒸瓶，旋转蒸发仪40℃，-0.09Mpa旋干，加400μL甲醇重悬，0.22um有机滤膜过滤，12000rpm离心10min，取上清得重组菌株发酵粗提物，HPLC分析发酵产物。
利用实施例1中构建的酿酒酵母工程菌株，表达上述候选基因，通过观察发酵产物的HPLC图谱中有无新峰出现，结果初步判定CYP5150L8具有催化羊毛甾醇合成灵芝三萜类产物的功能。
实施例3
酵母转化株的发酵产物测定与动态积累过程
3.1.1)发酵产物的高效液相色谱分析方法：
仪器：安捷伦1200分析型HPLC；色谱柱：安捷伦ZORBAX SB C18反相色谱柱(5um，4.6x250mm)
柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：20μl；
A相：甲醇(含0.1％乙酸)，B相：纯水；
梯度洗脱程序：起始A相80％，B相20％；0-30min，80％-100％A相；30-50min，100％A相。检测波长210nm。
3.1.2)通过和空质粒对照菌株发酵产物HPLC峰图对比，观察发现当在酵母中导入了包含CYP5150L8的重组质粒后，该重组菌株在23.38min和对照有明显不同(图2)。
3.2)包含CYP5150L8的转化菌株YL-T3-CYP5150L8在不同培养基中的发酵
3.2.1)YL-T3-CYP5150L8菌株和空质粒对照菌株YL-T3-Void plasmid的YPD发酵采用和实施例2.1相同方式进行。
3.2.2)YL-T3-CYP5150菌株在YPD40培养基(酵母粉10g/L，牛肉蛋白胨20g/L，葡萄糖40g/L)中发酵，除去采用YPD40培养基外，其它采用和实施例2.1相同方式进行。
3.2.3)YL-T3-CYP5150L8菌株在YPD40F培养基(酵母粉10g/L，牛肉蛋白胨20g/L，葡萄糖40g/L，赖氨酸0.173g/L，KH2PO4 0.314g/L，MgSO4.7H2O 0.177g/L，K2SO4 0.121g/L，Na2SO4 0.019g/L)中发酵，除去采用YPD40F培养基外，其它采用和实施例2.1相同方式进行。
3.2.4)不同培养基条件下生长(OD600)及产物积累动态过程如图3所示。在正常的YPD培养基中，YL-T3-CYP5150L8菌株(实心圆圈)和空质粒对照菌株YL-T3-Void plasmid(空心圆圈)的生长状况相差不大(图3A)，但目标产物(如实施例4所鉴定结果为灵芝酸Z，GA-Z)在前者有动态积累，而后者则没有产生(图3B)。YL-T3-CYP5150L8菌株在YPD40培养基(实心三角)和YPD40F培养基(实心方块)中的生长相差不大，但比YPD培养基中最终细胞密度(OD600)高25％左右(图3A)；有关产物积累，YPD40培养基和YPD40F培养基中的产物最高量相差不大、为14.5mg/L左右，但积累的动态过程有所区别，它们均比YPD培养基中高40％以上(图3B)。
实施例4
过表达CYP5150L8菌株产物分离纯化及鉴定
4.1)挑取过表达CYP5150L8的酵母转化菌株，接种至5mL SC-HLU试管，30℃、220rpm培养30h；
4.2)转接至500mL SC-HLU摇瓶，30℃、220rpm培养36h；
4.3)吸取16mL至800mL YPD培养基，30℃、220rpm培养约5天。采用2.5L大摇瓶，装液量800mL，共25瓶20L培养基发酵。
4.4)以1∶1比例加入乙酸乙酯发酵产物，重复3次，每次磁力搅拌1h～2h，静置分层，合并上清40℃、-0.09Mpa减压旋蒸浓缩。最终得到约20mL棕色粘稠油状液体。
4.5)过sephadex凝胶柱，使用100％甲醇洗脱，约4mL更换一根新的接液管。共得到近200管，经HPLC分析测定发现目标产物主要集中在第30至第90管之间，合并各管浓缩至约20mL。
4.6)半制备液相制备
浓缩后的粗品通过半制备液相按照如下程序进一步纯化：
0-80min：80-90％乙腈(0.1％TFA)，流速：2mL/min，进液量：1mL，依利特C18反相制备柱。
手动截取目标位置的峰(约67～70min)，出现目标峰后，每1mL接一个EP管，随后通过HPLC分析检测，将没有前后杂质的管合并共计约60mL。
4.7)旋蒸仪浓缩至约10mL，转移至一干净离心管冷冻干燥。得约10mg白色粉状固体。
4.8)取纯化物质进行UPLC-ESI-MS分析其在阳离子模式下以m/z为439.3578(C30H47O2，理论值439.3676)的脱水加氢峰[M-H2O+H]+的形式为主，这暗示产物保留了羊毛甾醇本身3位的羟基，没有再进一步的脱水，说明产物只具有一个羟基。而在负离子模式下以m/z为455.3520(C30H47O，理论值455.3525)脱氢峰[M-H]-为主，暗示产物具有一个易于电离的质子。根据产物上述的质谱信息，产物的分子式可以确定为C30H48O3相比于底物羊毛甾醇，产物多出两个氧原子，少掉两个氢原子，这暗示很有可能是羊毛甾醇的某一个甲基发生氧化变为了羧基，但尚不能确定具体在第几位碳原子发生氧化。
4.9)通过NMR数据确定其发生氧化的具体位置。其碳谱和氢谱数据和已经报道的灵芝酸Z数据一致(表3)。二维关系的HMBC、HMQC，COSY的数据进一步确认其为Lanosta-8,24-dien-3-hydroxy-26-oic-acid(灵芝酸Z)。一维碳谱和氢谱数据如表3所示，1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HMBC、HMQC、COSY谱图分别参见图4至图9所示。
表3 灵芝酸Z(GA-Z)的13C-NMR和1HNMR数据：
Figure BDA0001307510260000111
Figure BDA0001307510260000121
实验表明，通过灵芝基因组的挖掘，得到一个可以催化前体羊毛甾醇生成灵芝酸Z的细胞色素氧化酶基因CYP5150L8，并通过将其在酵母中异源表达，实现了灵芝酸Z的异源合成。由于酿酒酵母细胞生长快速，比灵芝真菌易于发酵，并且酿酒酵母的遗传操作有成熟的平台，今后通过代谢工程结合发酵工程技术，有望大幅度提升灵芝酸的发酵产量，故本发明是一种有工业化前景的灵芝酸生物合成技术。
上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。
序 列 表
<110> 上海交通大学
<120> 通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法
<160> 134
<170> PatentIn version 3.5.1
<210> 1
<211> 1638
<212> DNA
<213> CYP5150L8
<400> 1
atgcccgact cttctctcgt cctcgtggcc atcgccggag cggcgtacat cttttggctg 60
gtgttccatc gttatctcgt gcggtcacct ttggacaacc tcccaagccc gcctagctct 120
ccattcctgg gaaaccttcc cgacattatc catcgccaaa gccacctctg gtggaggcat 180
gtgtccaaca cctacggtcc cgcaaccaag ttgactgcgt ttttcggcat acaaatgcta 240
tacacattcg accccaaagc gatgtacagc attctcgtca aggacacgga gctatacccg 300
aagaagaccg ccgccgactt cactctgttc atcgggcccg gccttctctt cgccgagggc 360
gcgcaacatc gccggcaacg caagtggctc aaccccgtct tttctgtcgc ccagctgcgc 420
gatgtctcgc acgtcttcta cggcgtcgca tacaagcttg aggaggcgat ccgaaaccgc 480
gtcggcgccc aatcccaaaa cctagatgtg aacggctgga tggcgcgtac gacgttggag 540
atgctcggcc aggcgggcct cggatactcg ttcgacaagt tcacggagga ctcgacggat 600
tcgtacggag aggccctcaa gtcgttcttt cccgttatca accacgttcc cttgctaaac 660
ctcttcgtca tgaccctcgc caaccacatc ccgaagtggc tcatgcgccg agtccttcgg 720
ctagccgttc cgttccccca tgtccttcgc ctcctaagga tctcagagac catgcagaag 780
cgttcgtcgg agatcatcca gcagaagaag actgccttgc aaaagggcga caaggcactc 840
atacatcaag tcggcgaggg gaaagacatc atgagcgtcc tgttaaaatc gaacatgaac 900
gcccccagcg actcggaaaa gcttcctgac gaggagcttc tcgcacagat gtccacattc 960
atcctcgccg ggatggacac cacatcgaac gccctgtcgc gcatcctcca cctcctcgcg 1020
gagcacccgg acgtgcaaga gaagctgcgg cacgagctct cggaggcgcg cgagatcgtc 1080
gggaacggca aggacgtccc ctacgacgac ctcgtcaagc tcccgtacct cgacgccgtc 1140
tgccgcgaga ccctgcggct ccacccgccg ctcaacctga tcggccggag ggcagcgaag 1200
gacatggtcg tgccgctgtc gtccccggtg cgcggcaggg acgggacgct cgtcaacgag 1260
gtcacgctcc cgaaggacac gttcgtcctc ctcgggctgc aggcgtgcaa cacgaacaag 1320
aagctgtggg gcgaggacgc gtacgagtgg aagccggagc gctggctgca gccgctccct 1380
tccatgctcg aggaggcacg ggtgcctggg gtgtattcga acttgatgtc cttcagtggc 1440
ggggtccgtt cgtgcatcgg gttcaaattc tcccaactcg agatgaaggt cctgttgacc 1500
atcctcttgc cggcgttttc gttcgagttg acggagaagc ccatcttctg gaacaccagc 1560
gccgtttcgt atcctaccat ggacaaagac agcacgcggc cggagatgtt gttgaaggtc 1620
aaggcgttgg cttgctga 1638
<210> 2
<211> 545
<212> PRT
<213> CYP5150L8
<400> 2
Met Pro Asp Ser Ser Leu Val Leu Val Ala Ile Ala Gly Ala Ala Tyr
5 10 15
Ile Phe Trp Leu Val Phe His Arg Tyr Leu Val Arg Ser Pro Leu Asp
20 25 30
Asn Leu Pro Ser Pro Pro Ser Ser Pro Phe Leu Gly Asn Leu Pro Asp
35 40 45
Ile Ile His Arg Gln Ser His Leu Trp Trp Arg His Val Ser Asn Thr
50 55 60
Tyr Gly Pro Ala Thr Lys Leu Thr Ala Phe Phe Gly Ile Gln Met Leu
65 70 75 80
Tyr Thr Phe Asp Pro Lys Ala Met Tyr Ser Ile Leu Val Lys Asp Thr
85 90 95
Glu Leu Tyr Pro Lys Lys Thr Ala Ala Asp Phe Thr Leu Phe Ile Gly
100 105 110
Pro Gly Leu Leu Phe Ala Glu Gly Ala Gln His Arg Arg Gln Arg Lys
115 120 125
Trp Leu Asn Pro Val Phe Ser Val Ala Gln Leu Arg Asp Val Ser His
130 135 140
Val Phe Tyr Gly Val Ala Tyr Lys Leu Glu Glu Ala Ile Arg Asn Arg
145 150 155 160
Val Gly Ala Gln Ser Gln Asn Leu Asp Val Asn Gly Trp Met Ala Arg
165 170 175
Thr Thr Leu Glu Met Leu Gly Gln Ala Gly Leu Gly Tyr Ser Phe Asp
180 185 190
Lys Phe Thr Glu Asp Ser Thr Asp Ser Tyr Gly Glu Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Phe Phe Pro Val Ile Asn His Val Pro Leu Leu Asn Leu Phe Val Met
210 215 220
Thr Leu Ala Asn His Ile Pro Lys Trp Leu Met Arg Arg Val Leu Arg
225 230 235 240
Leu Ala Val Pro Phe Pro His Val Leu Arg Leu Leu Arg Ile Ser Glu
245 250 255
Thr Met Gln Lys Arg Ser Ser Glu Ile Ile Gln Gln Lys Lys Thr Ala
260 265 270
Leu Gln Lys Gly Asp Lys Ala Leu Ile His Gln Val Gly Glu Gly Lys
275 280 285
Asp Ile Met Ser Val Leu Leu Lys Ser Asn Met Asn Ala Pro Ser Asp
290 295 300
Ser Glu Lys Leu Pro Asp Glu Glu Leu Leu Ala Gln Met Ser Thr Phe
305 310 315 320
Ile Leu Ala Gly Met Asp Thr Thr Ser Asn Ala Leu Ser Arg Ile Leu
325 330 335
His Leu Leu Ala Glu His Pro Asp Val Gln Glu Lys Leu Arg His Glu
340 345 350
Leu Ser Glu Ala Arg Glu Ile Val Gly Asn Gly Lys Asp Val Pro Tyr
355 360 365
Asp Asp Leu Val Lys Leu Pro Tyr Leu Asp Ala Val Cys Arg Glu Thr
370 375 380
Leu Arg Leu His Pro Pro Leu Asn Leu Ile Gly Arg Arg Ala Ala Lys
385 390 395 400
Asp Met Val Val Pro Leu Ser Ser Pro Val Arg Gly Arg Asp Gly Thr
405 410 415
Leu Val Asn Glu Val Thr Leu Pro Lys Asp Thr Phe Val Leu Leu Gly
420 425 430
Leu Gln Ala Cys Asn Thr Asn Lys Lys Leu Trp Gly Glu Asp Ala Tyr
435 440
Glu Trp Lys Pro Glu Arg Trp Leu Gln Pro Leu Pro Ser Met Leu Glu
450 455 460
Glu Ala Arg Val Pro Gly Val Tyr Ser Asn Leu Met Ser Phe Ser Gly
465 470 475 480
Gly Val Arg Ser Cys Ile Gly Phe Lys Phe Ser Gln Leu Glu Met Lys
485 490 495
Val Leu Leu Thr Ile Leu Leu Pro Ala Phe Ser Phe Glu Leu Thr Glu
500 505 510
Lys Pro Ile Phe Trp Asn Thr Ser Ala Val Ser Tyr Pro Thr Met Asp
515 520
Lys Asp Ser Thr Arg Pro Glu Met Leu Leu Lys Val Lys Ala Leu Ala
530 535 540
Cys
545
<210>3
<211>40
<212>DNA
<213>GL15091-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGCCTTTCC ACACAGCGAC 40
<210>4
<211>40
<212>DNA
<213>GL15091-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCACATCGGC TCTATCATGA 40
<210>5
<211>40
<212>DNA
<213>GL15605-R
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGAGGATG CACAGACTCT 40
<210>6
<211>40
<212>DNA
<213>GL15605-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGGCCGTC ACTCTGCGCT 40
<210>7
<211>40
<212>DNA
<213>GL15671-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTTCTTGC ACTCTTTCAC 40
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>GL15671-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCATGTGGAA CCCGCGTCCA 40
<210>9
<211>40
<212>DNA
<213>GL16069-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGCTCTCT GGTCGCACCT 40
<210>10
<211>40
<212>DNA
<213>GL16069-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGGCAGTG ACAATGTTGA 40
<210>11
<211>40
<212>DNA
<213>GL16778-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGATTGTCT CCATTTTATT 40
<210>12
<211>40
<212>DNA
<213>GL16778-R
<400>
attaatttga attaacgttt TTACGCTTGG GCCTGGCGTC 40
<210>13
<211>40
<212>DNA
<213>GL17382-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGCTCATG ATCAACTACT 40
<210>14
<211>40
<212>DNA
<213>GL17382-R
<400>
attaatttga attaacgttt TTACATGCAC GCGTGGCCGC 40
<210>15
<211>40
<212>DNA
<213>GL17412-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGAGGCCG TCCCTTCGTT 40
<210>16
<211>40
<212>DNA
<213>GL17412-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAATGAAGT GGTTGCGCTT 40
<210>17
<211>40
<212>DNA
<213>GL17567-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGCGCTGC CCGTATTCCT 40
<210>18
<211>40
<212>DNA
<213>GL17567-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCACAACCTG GACGCCACTT 40
<210>19
<211>40
<212>DNA
<213>GL17743-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGACGTGA AATTGCCCAT 40
<210>20
<211>40
<212>DNA
<213>GL17743-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGCCCCTC GCGCGCGTCT 40
<210>21
<211>40
<212>DNA
<213>GL18357-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGCTCGAGA GCGGGCAAAT 40
<210>22
<211>40
<212>DNA
<213>GL18357-R
<400>
attaatttga attaacgttt CACCGTCAAG CTGTGCACGC 40
<210>23
<211>40
<212>DNA
<213>GL19231-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGCAACTGG AAGGCCCGCA 40
<210>24
<211>40
<212>DNA
<213>GL19231-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCACACAGTG GCAGATGCTT 40
<210>25
<211>40
<212>DNA
<213>GL19267-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGACCACTC CCATCCCCAG 40
<210>26
<211>40
<212>DNA
<213>GL19267-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGTCGAAG ATATCCGTGG 40
<210>27
<211>40
<212>DNA
<213>GL20623-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTCTGTCT CAGCACAGTA 40
<210>28
<211>40
<212>DNA
<213>GL20623-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCACGCCTGC GCAGACGTCG 40
<210>29
<211>40
<212>DNA
<213>GL20660-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGCCGACG CCGACGCGGG 40
<210>30
<211>40
<212>DNA
<213>GL20660-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGCTCGGC CCGGGCCCAC 40
<210>31
<211>40
<212>DNA
<213>GL20706-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGCTCACAT CCAATCCGAT 40
<210>32
<211>40
<212>DNA
<213>GL20706-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAATGAGCT TGTCGAATCA 40
<210>33
<211>40
<212>DNA
<213>GL20766-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGCTGAATC TTAGCCTTGA 40
<210>34
<211>40
<212>DNA
<213>GL20766-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCATTGCCGC GTGGCTTCTG 40
<210>35
<211>40
<212>DNA
<213>GL21030-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGGAGAGC TACGCTTCTT 40
<210>36
<211>40
<212>DNA
<213>GL21030-R
<400>
attaatttga attaacgttt CTAGTGCTGG TCATTACGCA 40
<210>37
<211>40
<212>DNA
<213>GL21057-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGCTGCCC ATATCTTCCC 40
<210>38
<211>40
<212>DNA
<213>GL21057-R
<400>
attaatttga attaacgttt CTAATCGGAT TGAGAGAGGC 40
<210>39
<211>40
<212>DNA
<213>GL21090-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGTAGATG CGACCCCTCT 40
<210>40
<211>40
<212>DNA
<213>GL21090-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGTCTGAG ATCCCCGACT 40
<210>41
<211>40
<212>DNA
<213>GL21131-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGACATCA TCAAGTTTGC 40
<210>42
<211>40
<212>DNA
<213>GL21131-R
<400>
attaatttga attaacgttt TTACGAGACG AGCCCCGTTG 40
<210>43
<211>40
<212>DNA
<213>GL21663-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTTCACAG CGGTTATATG 40
<210>44
<211>40
<212>DNA
<213>GL21663-R
<400>
attaatttga attaacgttt TTAGATCGAC ACGTTCACAG 40
<210>45
<211>40
<212>DNA
<213>GL21701-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGATGTCCA ATCTTTCTTT 40
<210>46
<211>40
<212>DNA
<213>GL21701-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGAGGGGC GTGAATGTCG 40
<210>47
<211>40
<212>DNA
<213>GL21992-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTCGACGT ACCTCCCGTT 40
<210>48
<211>40
<212>DNA
<213>GL21992-R
<400>
attaatttga attaacgttt CTACAGCGCC CTCACTTTCA 40
<210>49
<211>40
<212>DNA
<213>GL21993-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGGAATCG TGCTTCTGGC 40
<210>50
<211>40
<212>DNA
<213>GL21993-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCACAACGCC CTCACCCTCA 40
<210>51
<211>40
<212>DNA
<213>GL22087-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGACGTTC GGCTTATCGT 40
<210>52
<211>40
<212>DNA
<213>GL22087-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCACAACGCC CGGACTTTCA 40
<210>53
<211>40
<212>DNA
<213>GL22088-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGTGGCCT ACCTCCTCCT 40
<210>54
<211>40
<212>DNA
<213>GL22088-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAACTCGAA GGTGAAACCT 40
<210>55
<211>40
<212>DNA
<213>GL22480-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGTGGAGG ACCCGCAGGC 40
<210>56
<211>40
<212>DNA
<213>GL22480-R
<400>
attaatttga attaacgttt CTACAGGTCC TGACGTGCCC 40
<210>57
<211>40
<212>DNA
<213>GL22657-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGTCAGCA CCCCTCTCCA 40
<210>58
<211>40
<212>DNA
<213>GL22657-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGTTAGGC TTGACCAGTC 40
<210>59
<211>40
<212>DNA
<213>GL22909-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGACGACT ACCAGGCGGT 40
<210>60
<211>40
<212>DNA
<213>GL22909-F
<400>
attaatttga attaacgttt TCAAACGGAC GCCTCGCGCT 40
<210>61
<211>40
<212>DNA
<213>GL22911-R
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGACGACA TCCAGCCCCT 40
<210>62
<211>40
<212>DNA
<213>GL22911-R
<400>
attaatttga attaacgttt TTAGGCAGCC CGTTTCTTGA 40
<210>63
<211>40
<212>DNA
<213>GL22978-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTTCGAAT CGCTCGTCGT 40
<210>64
<211>40
<212>DNA
<213>GL22978-R
<400>
attaatttga attaacgttt CTACTCAACG TCCCATCGTA 40
<210>65
<211>40
<212>DNA
<213>GL23109-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGACGAGG TCCAATTTCC 40
<210>66
<211>40
<212>DNA
<213>GL23109-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCATGCAGAG CTCGGCACAG 40
<210>67
<211>40
<212>DNA
<213>GL23174-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGCCTCTC TCGCCCAGGT 40
<210>68
<211>40
<212>DNA
<213>GL23174-R
<400>
attaatttga attaacgttt CTACATTTGC TTCAGTAGCG 40
<210>69
<211>40
<212>DNA
<213>GL23303-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTGCCCAG CCCCGGCCGC 40
<210>70
<211>40
<212>DNA
<213>GL23303-R
<400>
attaatttga attaacgttt CTAAGAAAGA GTTTCCCTAG 40
<210>71
<211>40
<212>DNA
<213>GL23338-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGCGGACG ACCAAGCCGT 40
<210>72
<211>40
<212>DNA
<213>GL23338-R
<400>
attaatttga attaacgttt TTAGGCGAGG GTTGCGCGCT 40
<210>73
<211>40
<212>DNA
<213>GL23363-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGCGCAAC TTGTGGTGCC 40
<210>74
<211>40
<212>DNA
<213>GL23363-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGTGAGAC GCGAGACTGA 40
<210>75
<211>40
<212>DNA
<213>GL23374-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTTCTCTT TCCAGATACC 40
<210>76
<211>40
<212>DNA
<213>GL23374-R
<400>
attaatttga attaacgttt TACCATCTAG GGGTCAGAGT 40
<210>77
<211>40
<212>DNA
<213>GL23557-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTATACGT TCTCCCCATC 40
<210>78
<211>40
<212>DNA
<213>GL23557-R
<400>
attaatttga attaacgttt TTACCGCGTC CCCGGAAGCT 40
<210>79
<211>40
<212>DNA
<213>GL23851-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGCTAGGAC CTCAAAATGT 40
<210>80
<211>40
<212>DNA
<213>GL23851-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGTTGGAC ACGGCAGCGT 40
<210>81
<211>40
<212>DNA
<213>GL23926-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGCCGTCCT TTTATCCTCA 40
<210>82
<211>40
<212>DNA
<213>GL23926-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGGTTTGC GAGTTTAATA 40
<210>83
<211>40
<212>DNA
<213>GL23927-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGCGGAGTC CGAACCAGTA 40
<210>84
<211>40
<212>DNA
<213>GL23927-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAATGGGAT CCATATATCA 40
<210>85
<211>40
<212>DNA
<213>GL24022-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGCTGAGC TCGTCCAACT 40
<210>86
<211>40
<212>DNA
<213>GL24022-R
<400>
attaatttga attaacgttt TTACTCCTCG TCGCGCGGCG 40
<210>87
<211>40
<212>DNA
<213>GL24198-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGAGTCCT TACCTGCACT 40
<210>88
<211>40
<212>DNA
<213>GL24198-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGGCTGAC GACTCCGCGG 40
<210>89
<211>40
<212>DNA
<213>GL24382-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGAGAATA TCAGCATTCT 40
<210>90
<211>40
<212>DNA
<213>GL24382-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGGCTGAC GGGCGCAGCG 40
<210>91
<211>40
<212>DNA
<213>GL24426-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTCGGCCC TCGTCTTTGT 40
<210>92
<211>40
<212>DNA
<213>GL24426-R
<400>
attaatttga attaacgttt CCGCCCGTAG GGACGGAGGA 40
<210>93
<211>40
<212>DNA
<213>GL24883-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGCCCGACT CTTCTCTCGT 40
<210>94
<211>40
<212>DNA
<213>GL24883-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGCAAGCC AACGCCTTGA 40
<210>95
<211>40
<212>DNA
<213>GL24889-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGAACCCGC CAGCGTCCCT 40
<210>96
<211>40
<212>DNA
<213>GL24889-R
<400>
attaatttga attaacgttt TAAGTTCGAG CTGCGCGTAC 40
<210>97
<211>40
<212>DNA
<213>GL24896-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGTTCTCT CGCTTGCGCT 40
<210>98
<211>40
<212>DNA
<213>GL24896-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCACAAACAC TTTACTCGAA 40
<210>99
<211>40
<212>DNA
<213>GL24898-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTTTCTCC TCGCCACTCT 40
<210>100
<211>40
<212>DNA
<213>GL24898-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGTATAGA GCCTTGACTC 40
<210>101
<211>40
<212>DNA
<213>GL24902-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTCGTTCT CATTGCCGCT 40
<210>102
<211>40
<212>DNA
<213>GL24902-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGGATGCG AGGCTGACGT 40
<210>103
<211>40
<212>DNA
<213>GL24917-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGAACCTGC CAGCGTCCCT 40
<210>104
<211>40
<212>DNA
<213>GL24917-R
<400>
attaatttga attaacgttt TTAGGACCGT ATCACAGAGA 40
<210>105
<211>40
<212>DNA
<213>GL26139-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTCGTCCA ACGCGACGTT 40
<210>106
<211>40
<212>DNA
<213>GL26139-R
<400>
attaatttga attaacgttt GTCGAACTTC CTGCGGCGGT 40
<210>107
<211>40
<212>DNA
<213>GL26850-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGCCGCGGT CAAGCTTTGG 40
<210>108
<211>40
<212>DNA
<213>GL26850-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCACGACGCT TGCATCCCTT 40
<210>109
<211>40
<212>DNA
<213>GL28081-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGACCTGG GAGTCGGATG 40
<210>110
<211>40
<212>DNA
<213>GL28081-R
<400>
attaatttga attaacgttt CTATAACCCC AGGATACTAG 40
<210>111
<211>40
<212>DNA
<213>GL28603-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGATGTGC TGCTCCTTGG 40
<210>112
<211>40
<212>DNA
<213>GL28603-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGTGAAAC AATTGCGCTT 40
<210>113
<211>40
<212>DNA
<213>GL28943-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTCGCTCC ATTTGCTCGC 40
<210>114
<211>40
<212>DNA
<213>GL28943-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCACGTGGCG AGCGAGACGC 40
<210>115
<211>40
<212>DNA
<213>GL29510-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGACGGTCG AGGACCCTCA 40
<210>116
<211>40
<212>DNA
<213>GL29510-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCACGCCTCG AAGACCGTCT 40
<210>117
<211>40
<212>DNA
<213>GL29831-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTTTTCAG TGCTTCTTCA 40
<210>118
<211>40
<212>DNA
<213>GL29831-R
<400>
attaatttga attaacgttt CTACTGGAGC ATAGTGACCT 40
<210>119
<211>40
<212>DNA
<213>GL29946-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGTCGACA TCACCTCATC 40
<210>120
<211>40
<212>DNA
<213>GL29946-R
<400>
attaatttga attaacgttt TTACAGCCTA CAGGCACGGA 40
<210>121
<211>40
<212>DNA
<213>GL30444-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGCGTCCG CGTTCAGAGA 40
<210>122
<211>40
<212>DNA
<213>GL30444-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCATGAGCGC GCACGGGGGC 40
<210>123
<211>40
<212>DNA
<213>GL30595-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTCTGCAG AAGACGTTGT 40
<210>124
<211>40
<212>DNA
<213>GL30595-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCATCGCCAT GTGCCTACGA 40
<210>125
<211>40
<212>DNA
<213>GL30772-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGACTCCT CCCTGTGGGT 40
<210>126
<211>40
<212>DNA
<213>GL30772-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCACCCTGGC AACAACGTCA 40
<210>127
<211>40
<212>DNA
<213>GL31403-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTCCAGTT CGCCCTCTCT 40
<210>128
<211>40
<212>DNA
<213>GL31403-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAACACTCT CGAGGGGTGA 40
<210>129
<211>40
<212>DNA
<213>GL31713-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGCCGGAC TAATCCTCTT 40
<210>130
<211>40
<212>DNA
<213>GL31713-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAAGGAGCG AGGCTGACTT 40
<210>131
<211>40
<212>DNA
<213>GL31717-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGGTTCTT TCCCCAGCCT 40
<210>132
<211>40
<212>DNA
<213>GL31717-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAACCACTT GCACTCAACT 40
<210>133
<211>40
<212>DNA
<213>GL31718-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGTGCCTA TCGCCTCTGC 40
<210>134
<211>40
<212>DNA
<213>GL31718-R
<400>
attaatttga attaacgttt CTAGCGCATT CCTGCAAGTT 40
<210>135
<211>40
<212>DNA
<213>GL31719-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGTGATTT TTCTCAAGAT 40
<210>136
<211>40
<212>DNA
<213>GL31719-R
<400>
attaatttga attaacgttt CTGCGCTCAA GTCAACCGCG 40
<210>137
<211>40
<212>DNA
<213>GL31721-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGCCGATC CCTTGGATCC 40
<210>138
<211>40
<212>DNA
<213>GL31721-R
<400>
attaatttga attaacgttt CTCATTGGAT AGTCCCCTCG 40
<210>139
<211>40
<212>DNA
<213>GL31722-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGAACTGGA CTGGCACTGA 40
<210>140
<211>40
<212>DNA
<213>GL31722-R
<400>
attaatttga attaacgttt TTAGGCTAAT GCATCTCCGC 40
<210>141
<211>40
<212>DNA
<213>GL31723-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTTGTCGA CACTCTTGCT 40
<210>142
<211>40
<212>DNA
<213>GL31723-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAAGCCGAA CTTGTGGAGC 40
<210>143
<211>40
<212>DNA
<213>GL31726-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGACATCGC CCGCAACGGC 40
<210>144
<211>40
<212>DNA
<213>GL31726-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAACAGCTA TCGATCTCTC 40
<210>145
<211>40
<212>DNA
<213>GL31729-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGAGATCA CAGCCCCTCT 40
<210>146
<211>40
<212>DNA
<213>GL31729-R
<400>
attaatttga attaacgttt CTGCGCTTCG TGGATCAGAC 40
<210>147
<211>40
<212>DNA
<213>GL31753-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGCAGATCC CACTCCCTCC 40
<210>148
<211>40
<212>DNA
<213>GL31753-R
<400>
attaatttga attaacgttt CGTCTTTCCC AGCTCCTCGG 40
<210>149
<211>40
<212>DNA
<213>GL31754 -F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGCTATGT CCCTCGTGGT 40
<210>150
<211>40
<212>DNA
<213>GL31754 -R
<400>
attaatttga attaacgttt TCACTCGCGC TTGTACGGCT 40
<210>151
<211>40
<212>DNA
<213>GL31761-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGTTGGCCC TGATGGACGA 40
<210>152
<211>40
<212>DNA
<213>GL31761-R
<400>
attaatttga attaacgttt CTATCCCGTC GTAGTAGTCG 40
<210>153
<211>40
<212>DNA
<213>GL31768-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGCTTCGGA AACTACCTCC 40
<210>154
<211>40
<212>DNA
<213>GL31768-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCACTCGTTC GTCGCCTCAG 40
<210>155
<211>40
<212>DNA
<213>GL31771-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGACAGTGG AGGATCCTCA 40
<210>156
<211>40
<212>DNA
<213>GL31771-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCACTCGGGC ACCCCCTTGC 40
<210>157
<211>40
<212>DNA
<213>GL31772-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGCGTTGG AAGATCCTCT 40
<210>158
<211>40
<212>DNA
<213>GL31772-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAAGGAGAT GCAATCTGGC 40
<210>159
<211>40
<212>DNA
<213>GL31777-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGGCGACTC TGCCCGGAGG 40
<210>160
<211>40
<212>DNA
<213>GL31777-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCACACAACA TTGTGATGAG 40
<210>161
<211>40
<212>DNA
<213>GL31780-F
<400>
taattttaat caaaaagttt ATGATCGCAA CGGTTGCGAC 40
<210>162
<211>40
<212>DNA
<213>GL31780-R
<400>
attaatttga attaacgttt TCAGTCCCTC GATTTGAAAC 40
<210>163
<211>43
<212>DNA
<213>HXT7p-F
<400>
ATATCGAATT CCTGCAGCCC ACTTCTCGTA GGAACAATTT CGG 43
<210>164
<211>29
<212>DNA
<213>HXT7p-R
<400>
TTTTTGATTA AAATTAAAAA AACTTTTTG 29
<210>165
<211>50
<212>DNA
<213>FBA1t-F
<400>
TTTAATTTTA ATCAAAAAGT TTAAACGTTA ATTCAAATTA ATTGATATAG 50
<210>166
<211>45
<212>DNA
<213>FBA1t-R
<400>
CTAGAACTAG TGGATCCCCC AAAGATGAGC TAGGCTTTTG TAAAA 45

Claims (4)

1.一种通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法，其特征在于，首先依据筛选原则从灵芝基因组中选择可能参与灵芝酸生物合成的CYP基因，然后分别将其克隆到酵母表达质粒，并将酵母表达质粒分别转化至重组微生物酿酒酵母中进行异源表达，通过对转化后的菌株进行发酵筛选，最终得到用于催化羊毛甾醇生成灵芝三萜的CYP基因CYP5150L8，即GL24883，其核苷酸序列如Seq No.1所示，氨基酸序列如Seq No.2所示，从而实现灵芝三萜的异源生物合成；
所述的筛选原则包括：
①通过筛选和灵芝三萜前体物质羊毛甾醇合成酶物理位置最靠近的两个CYP基因以及在灵芝的生长过程中和LSS共表达的78个CYP基因，以及
②灵芝细胞受到外界环境刺激后伴随灵芝三萜含量提高同时，自身转录水平也提高的CYP基因，具体是指：添加茉莉酸甲酯诱导后灵芝三萜产量提高同时有四个CYP基因转录上调；在灵芝发酵培养由震荡转为静置灵芝三萜含量提高同时有一个CYP基因转录上调。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的异源表达具体是指：通过PCR扩增候选的各个CYP表达序列片段，通过同源重组的方法将表达载体pRS426、CYP表达片段、酵母HXT7p启动子和酵母FBA1t终止子重组连接，得到一系列重组表达质粒pRS426HF-CYPs。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的发酵筛选具体是指：通过标准的醋酸锂转化法，将各个表达质粒导入酿酒酵母后，通过YPD培养基、YPD40培养基或YPD40F培养基发酵，随后对发酵产物经乙酸乙酯萃取，随后减压蒸馏除去乙酸乙酯，再用甲醇重悬，最后通过HPLC分析观察是否有新峰产生，从而初步判断所转化的CYP基因是否是所需的目的基因；
所述的YPD培养基成分为酵母粉10g/L，牛肉蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；
所述的YPD40培养基成分为酵母粉10g/L，牛肉蛋白胨20g/L，葡萄糖40g/L；
所述的YPD40F培养基成分为酵母粉10g/L，牛肉蛋白胨20g/L，葡萄糖40g/L，赖氨酸0.173g/L，KH2PO4 0.314g/L，MgSO4·7H2O 0.177g/L，K2SO4 0.121g/L，Na2SO4 0.019g/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的重组酿酒酵母为基因工程改造后的BY4742菌株。
CN201710391001.7A 2017-05-27 2017-05-27 通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法 Active CN108929884B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710391001.7A CN108929884B (zh) 2017-05-27 2017-05-27 通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710391001.7A CN108929884B (zh) 2017-05-27 2017-05-27 通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108929884A CN108929884A (zh) 2018-12-04
CN108929884B true CN108929884B (zh) 2021-07-16

Family

ID=64451453

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710391001.7A Active CN108929884B (zh) 2017-05-27 2017-05-27 通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108929884B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111321154B (zh) * 2018-12-13 2022-07-26 上海交通大学 基于高等真菌灵芝功能基因编辑的调节灵芝酸产量的方法
CN111363753B (zh) * 2018-12-26 2022-08-09 上海交通大学 异源生产线性三萜的方法
CN113444737B (zh) * 2020-03-24 2023-01-17 中国科学院天津工业生物技术研究所 细胞色素p450酶及其在合成灵芝三萜类化合物中的应用
CN115772507B (zh) * 2021-09-08 2024-06-07 中国科学院天津工业生物技术研究所 细胞色素p450酶在合成灵芝三萜中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008068602A3 (en) * 2006-12-08 2008-12-04 Garces Lucia Atehortua A method to generate fungal biomass from a culture of differentiated mycelium
CN106434820A (zh) * 2016-08-31 2017-02-22 华中农业大学 一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法
CN106497802A (zh) * 2016-12-20 2017-03-15 华中农业大学 一种高胞内灵芝三萜含量的灵芝菌丝体发酵工艺

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008068602A3 (en) * 2006-12-08 2008-12-04 Garces Lucia Atehortua A method to generate fungal biomass from a culture of differentiated mycelium
CN106434820A (zh) * 2016-08-31 2017-02-22 华中农业大学 一种提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量的方法
CN106497802A (zh) * 2016-12-20 2017-03-15 华中农业大学 一种高胞内灵芝三萜含量的灵芝菌丝体发酵工艺

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum;Chen等;《NATURE COMMUNICATIONS》;20120522;第3卷;摘要，补充材料第7-8页图6 *
灵芝三萜合成关键元件GLCYP450及其还原酶GLNADPH的基因克隆及共表达载体构建;郭溆等;《药学学报》;20131231;第48卷(第2期);第206-210页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108929884A (zh) 2018-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108929884B (zh) 通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法
CN115161208A (zh) 酿酒酵母基因工程菌及其生产葫芦素中间体的应用
CN110713941A (zh) 高表达细胞色素p450单加氧酶赭曲霉菌株及其构建方法与应用
CN111363753B (zh) 异源生产线性三萜的方法
CN115873836B (zh) 一种橙花叔醇合成酶及应用
CN114717124B (zh) 一株高产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株、构建方法及应用
CN114736918B (zh) 一种整合表达生产红景天苷的重组大肠杆菌及其应用
CN114517161B (zh) 高产赤霉素ga3的基因工程菌、构建方法及应用
CN113444737B (zh) 细胞色素p450酶及其在合成灵芝三萜类化合物中的应用
CN115927436A (zh) 一种合成24-表麦角固醇真菌的构建方法与应用
CN111548946B (zh) 一种生产次丹参酮二烯的重组酵母工程菌
CN109609522B (zh) 博落回二氢苯并菲啶氧化酶基因优化序列及其应用
CN107903227B (zh) 琥珀酸酐类化合物、与其相关的基因和蛋白及其制备方法
CN115772507B (zh) 细胞色素p450酶在合成灵芝三萜中的应用
CN114196689B (zh) 一种高产α-蛇麻烯的酵母重组菌株的构建方法及其应用
CN117327715B (zh) 一种假马齿苋P450酶基因BmCYP068及其应用
CN116515872B (zh) 一种青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因及在制备β-香树脂醇中的应用
CN114410604B (zh) 环氧化物水解酶及其编码基因和应用
CN114196641B (zh) 一种甾体C14α羟化酶、表达载体和工程菌及其应用
CN109777745B (zh) 一种合成桧烯的基因工程菌及其构建方法与应用
Li et al. Inactivation of MrPigH in Monascus ruber M7 results in its Monascus pigments increase and citrinin decrease with mrpyrG selection marker
CN115725633A (zh) 细胞色素p450功能研究及在灵芝三萜合成中的应用
WO2016106988A1 (zh) 一种产紫杉二烯的重组真核菌株及利用该重组真核菌株制备紫杉二烯的方法
CN117866932A (zh) 氧化鲨烯环化酶NiOSC6和其编码基因在生物合成中的应用
CN114774443A (zh) 生产小白菊内酯的重组酿酒酵母菌株及其构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant