CN117844729B - 一种重组菌株及其制备方法与应用、补身醇的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种重组菌株及其制备方法与应用、补身醇的合成方法,涉及合成生物学技术领域,该重组菌株为含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因、法尼基焦磷酸合成酶基因以及补身醇合成酶或补身醇合成酶截短体基因的重组大肠杆菌;甲羟戊酸途径的七个合成酶基因包括以下基因:atoB、mvaS、mvaA、mvaK1、mvaK2、mvaD和 fni;补身醇合成酶基因包括以下基因中的一种:DrtB、PhDS、VoDS和AsDMS;补身醇合成酶截短体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该重组菌株能够以廉价的甘油为起始原料经过发酵后,实现补身醇的一步合成,操作简单,生产周期短,为合成光学纯的补身醇提供了更高效的策略。
Description
技术领域
本发明涉及合成生物学技术领域,尤其涉及一种重组菌株及其制备方法与应用、补身醇的合成方法。
背景技术
补身烷型倍半萜和杂萜类化合物是萜类天然产物的代表性类群,含有6-6二元并环母核骨架,主要以手性化合物(−)-补身醇()作为关键前体。这类化合物具有重要的生物活性,广泛分布于高等植物、真菌、海洋微生物及苔藓类生物中,且补身烷型天然产物因其广泛的生物活性,被认为是药物或潜在的药物先导化合物的重要源泉。例如,来源于植物水蓼的水蓼二醛(/>)具有抵抗昆虫捕食的活性(Comparative antifeedant activities of polygodial and pyrethrins againstwhiteflies (Bemisia tabaci) and aphids (Myzus persicae),Pest Manag. Sci.2013,70,682-688);红槲皮素A(/>,R=H)和红槲皮素B (/>,R=OAc,即乙酰氧基)对耐受万古霉素的粪肠球菌和耐受甲氧西林金黄色葡萄球菌具有抗菌活性(Hongoquercins A and B,New Sesquiterpenoid Antibiotics: Isolation,Structure Elucidation,and Antibacterial Activity,Antibiot.1998,51,635–639);从海洋微生物海绵中分离的(+)-ent-chromazonarol(/>)具有抗肿瘤活性(Synthesis and Antitumoral Activities of Marine ent-Chromazonarol and RelatedCompounds,Bioorg. Med. Chem. Lett.1999,9,2325–2328)。
萜类天然产物由于其在天然物种中属于次生代谢产物,具有生物占有量低的特性。因此,采用天然来源提取的方式获得萜类天然产物对原材料需求量大、成本高、总收率低,极易造成环境的破环,难以可持续。目前,补身烷型萜类天然产物主要通过化学合成的方式获取,发展出以仿生环化方法和手性池方法的合成策略。但有机合成方法具有合成步骤冗长、立体选择性差、环境不友好的特点。
由于补身烷型倍半萜和杂萜类天然产物的生物合成途径并未被完全解析,无法实现这类天然产物的从头生物合成。因此,从廉价原料出发,设计高效的生物合成策略制备补身烷型萜类骨架((−)-补身醇),再联合化学转化的方法可以实现补身烷型萜类天然产物的简洁、高效、绿色合成,为工业化生产奠定重要基础。
发明内容
基于上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种重组菌株及其制备方法与应用、补身醇的制备方法,旨在提供能够从廉价原料出发,高效合成补身醇的策略。
本发明的技术方案如下:
本发明的第一方面,提供一种重组菌株,其中,所述重组菌株为含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因、法尼基焦磷酸合成酶基因和补身醇合成酶基因的重组大肠杆菌,或所述重组菌株为含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因、法尼基焦磷酸合成酶基因和补身醇合成酶截短体基因的重组大肠杆菌;
所述甲羟戊酸途径的七个合成酶基因包括以下基因:
atoB、mvaS、mvaA、mvaK1、mvaK2、mvaD和fni;
所述补身醇合成酶基因包括以下基因中的一种:
DrtB、PhDS、VoDS和AsDMS;
所述补身醇合成酶截短体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
可选地,所述重组菌株还过表达基因EcIDI和/或基因mvaA。
可选地,所述重组大肠杆菌为重组大肠杆菌BL21或重组大肠杆菌MG1655。
本发明的第二方面,提供一种重组菌株的制备方法,其中,包括步骤:
构建含有法尼基焦磷酸合成酶基因和补身醇合成酶基因的重组质粒A;
构建含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因的重组质粒B;
构建含有法尼基焦磷酸合成酶基因、基因EcIDI和补身醇合成酶基因的重组质粒C;
构建含有基因mvaA和甲羟戊酸途径的七个合成酶基因的重组质粒D;
将重组质粒A、重组质粒C中的一种和重组质粒B、重组质粒D中的一种共转入到大肠杆菌中,得到所述重组菌株;
所述甲羟戊酸途径的七个合成酶基因包括以下基因:
atoB、mvaS、mvaA、mvaK1、mvaK2、mvaD和fni;
所述补身醇合成酶基因包括以下基因中的一种:
DrtB、PhDS、VoDS和AsDMS。
本发明的第三方面,提供另一种重组菌株的制备方法,包括步骤:
构建含有法尼基焦磷酸合成酶基因和补身醇合成酶截短体基因的重组质粒E;
构建含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因的重组质粒B;
构建含有法尼基焦磷酸合成酶基因、基因EcIDI和补身醇合成酶截短体基因的重组质粒F;
构建含有基因mvaA和甲羟戊酸途径的七个合成酶基因的重组质粒D;
将重组质粒E、重组质粒F中的一种和重组质粒B、重组质粒D中的一种共转入到大肠杆菌中,得到所述重组菌株;
所述甲羟戊酸途径的七个合成酶基因包括以下基因:
atoB、mvaS、mvaA、mvaK1、mvaK2、mvaD和fni;
所述补身醇合成酶截短体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
可选地,所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21或大肠杆菌MG1655。
本发明的第四方面,提供本发明如上所述的重组菌株或采用本发明如上所述的制备方法制备得到的重组菌株在制备补身醇中的应用。
本发明的第五方面,提供一种补身醇的制备方法,其中,包括步骤:
将本发明如上所述的重组菌株或采用本发明如上所述的制备方法制备得到的重组菌株进行发酵,得到所述补身醇。
可选地,所述补身醇的制备方法具体包括步骤:
将所述重组菌株接种到含有氯霉素和羧苄青霉素的第一培养基中,培养后,得到菌液;
将所述菌液加入到含有甘油的第二培养基中,然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,诱导培养后,得到所述补身醇。
可选地,所述补身醇的制备方法具体包括步骤:
将所述重组菌株接种到含30-40mg/L氯霉素和40-50mg/L羧苄青霉素的第一培养基中,在37℃、220rpm的摇床中培养,得到菌液;
取600μL菌液接种到含有10-20mg/L氯霉素和80-100mg/L羧苄青霉素的20mL含有甘油的第二培养基中,继续在37℃、220rpm的摇床中培养直至OD600达到0.5-0.6后,放置在4℃的温度下预冷,然后加入工作浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,并加入4mL正十二烷,在25℃、180rpm的摇床中诱导培养72小时,然后离心,得到所述补身醇。
有益效果:本发明提供的重组菌株能够作为补身醇的从头异源合成系统,其以廉价的甘油为起始原料经过发酵后,能够实现补身醇的一步合成。利用所述重组菌株发酵制备补身醇具有操作简单,生产周期短,资源节约,环境友好且绿色可持续等优点,为合成光学纯的(−)-补身醇提供了更高效的策略,也为具有高值补身烷型杂萜类天然产物的合成提供绿色、可持续的底物来源。
附图说明
图1为补身醇的异源合成系统示意图。
图2为实施例2中重组菌株a发酵后产物的GC-MS测试结果图,其中,A为产物的色谱图;B为产物的质谱图;C为补身醇标准质谱图。
图3为实施例2中重组菌株a发酵后产物的核磁共振氢谱图。
图4为实施例2中重组菌株a发酵后产物的核磁共振碳谱图。
图5为实施例3中含不同补身醇合成酶基因的重组菌株发酵后产出的补身醇的滴度结果图。
图6为实施例4中不同重组菌株发酵后产出的补身醇的滴度结果图。
具体实施方式
本发明提供一种重组菌株及其制备方法与应用、补身醇的合成方法,为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确,以下对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的,不是旨在于限制本发明。
本发明实施例提供一种重组菌株,其中,所述重组菌株为含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因、法尼基焦磷酸合成酶基因(即基因ERG20,来源于酿酒酵母)和补身醇合成酶基因的重组大肠杆菌,或所述重组菌株为含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因、基因ERG20和补身醇合成酶截短体基因的重组大肠杆菌;
所述甲羟戊酸途径的七个合成酶基因包括以下基因:
atoB、mvaS、mvaA、mvaK1、mvaK2、mvaD和fni;
所述补身醇合成酶基因包括以下基因中的一种:
DrtB、PhDS、VoDS和AsDMS;
所述补身醇合成酶截短体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本实施方式中,基因DrtB为来源于真菌Aspergillus calidoustus的补身醇合成酶DrtB基因,基因PhDS为来源于植物水蓼的补身醇合成酶PhDS基因;基因VoDS为来源于缬草的补身醇合成酶VoDS基因;基因AsDMS为来源于海洋细菌(Aquimarina spongiae)的补身醇合成酶AsDMS基因。
如图1所示,甲羟戊酸途径的七个合成酶基因(七个合成酶的氨基酸序列为本领域公知)包括乙酰辅酶A转化为甲羟戊酸(MVA)的3个基因(atoB、mvaS和mvaA)和将甲羟戊酸(MVA)转化为异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的4个基因(mvaK1、 mvaK2、mvaD和fni)。其中,
基因atoB即为源于大肠杆菌(Escherichia coli)的乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因;
基因mvaS即为来源于金黄色葡萄球菌的羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因;
基因mvaA即为来源于金黄色葡萄球菌的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因;
基因mvaK1即为来源于肺炎双球菌的甲羟戊酸激酶基因;
基因mvaK2即为来源于肺炎双球菌的磷酸甲羟戊酸激酶基因;
基因mvaD即为来源于肺炎双球菌的二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因;
基因fni即为来源于肺炎双球菌的异戊烯基焦磷酸异构酶基因。
本发明实施例提供的重组菌株通过表达补身醇合成酶,进而催化前体法尼基焦磷酸生成光学纯的(−)-补身醇。本发明提供的重组菌株能够作为补身醇的从头异源合成系统,以廉价的甘油为起始原料经过发酵后,能够实现补身醇的一步合成,实现补身醇的从头异源生物合成。利用所述重组菌株发酵制备补身醇具有操作简单,生产周期短,资源节约,环境友好且绿色可持续等优点,为合成光学纯的(−)-补身醇提供了更高效的策略,也为具有高值补身烷型杂萜类天然产物的合成提供绿色、可持续的底物来源。
在一些实施方式中,所述重组菌株还过表达基因EcIDI(异戊烯基焦磷酸异构酶基因)和/或基因mvaA。也就是说,本实施方式中,含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因、基因ERG20和补身醇合成酶(或补身醇合成酶截短体)基因的重组大肠杆菌还过表达基因EcIDI,或所述含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因、基因ERG20和补身醇合成酶(或补身醇合成酶截短体)基因的重组大肠杆菌还过表达基因mvaA,或含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因、基因ERG20和补身醇合成酶(或补身醇合成酶截短体)基因的重组大肠杆菌过表达基因EcIDI和基因mvaA。
在一些实施方式中,所述重组大肠杆菌为重组大肠杆菌BL21或重组大肠杆菌MG1655。在一些具体的实施方式中,所述重组大肠杆菌为重组大肠杆菌BL21(DE3)或重组大肠杆菌MG1655(DE3)。
本发明实施例还提供一种重组菌株的制备方法,其中,包括步骤:
构建含有基因ERG20和补身醇合成酶基因的重组质粒A;
构建含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因的重组质粒B;
构建含有基因ERG20、基因EcIDI和补身醇合成酶基因的重组质粒C;
构建含有基因mvaA和甲羟戊酸途径的七个合成酶基因的重组质粒D;
将重组质粒A、重组质粒C中的一种和重组质粒B、重组质粒D中的一种共转入到大肠杆菌(大肠杆菌BL21或大肠杆菌MG1655等)中,得到所述重组菌株;
所述甲羟戊酸途径的七个合成酶基因包括以下基因:
atoB、mvaS、mvaA、mvaK1、mvaK2、mvaD和fni;
所述补身醇合成酶基因包括以下基因中的一种:
DrtB、PhDS、VoDS和AsDMS。
本实施例中,可制备得到四种重组菌株:
将重组质粒A和重组质粒B共转入到大肠杆菌中,得到含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因、补身醇合成酶基因和基因ERG20的重组菌株;
将重组质粒A和重组质粒D共转入到大肠杆菌中,得到含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因、补身醇合成酶基因、基因ERG20和基因mvaA的重组菌株;
将重组质粒C和重组质粒B共转入到大肠杆菌中,得到含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因、补身醇合成酶基因、基因ERG20和基因EcIDI的重组菌株;
将重组质粒C和重组质粒D共转入到大肠杆菌中,得到含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因、补身醇合成酶基因、基因ERG20、基因EcIDI和基因mvaA的重组菌株。
本发明实施例中,以大肠杆菌为底盘细胞,导入编码补身醇合成酶的基因和上游甲羟戊酸途径以及编码法尼基焦磷酸合成酶的基因,构建了补身醇从头异源合成系统,从而可实现补身醇的制备。
本发明实施例还提供一种重组菌株的制备方法,其中,包括步骤:
构建含有基因ERG20和补身醇合成酶截短体基因的重组质粒E;
构建含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因的重组质粒B;
构建含有基因ERG20、基因EcIDI和补身醇合成酶截短体基因的重组质粒F;
构建含有基因mvaA和甲羟戊酸途径的七个合成酶基因的重组质粒D;
将重组质粒E、重组质粒F中的一种和重组质粒B、重组质粒D中的一种共转入到大肠杆菌(大肠杆菌BL21或大肠杆菌MG1655等)中,得到所述重组菌株;
所述补身醇合成酶截短体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
同理,本实施例也可制备得到四种重组菌株。本发明实施例中,以大肠杆菌为底盘细胞,导入编码补身醇合成酶截短体的基因和上游甲羟戊酸途径以及编码法尼基焦磷酸合成酶的基因,构建了补身醇从头异源合成系统,从而可实现补身醇的制备。
本发明实施例还提供了本发明实施例如上所述的重组菌株或采用本发明实施例如上所述的制备方法制备得到的重组菌株在制备补身醇中的应用。所述重组菌株包括含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因、补身醇合成酶基因和基因ERG20,发酵过程中,通过甲羟戊酸途径产生异戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸,然后通过法尼基焦磷酸合成酶产生法尼基焦磷酸,通过补身醇合成酶催化法尼基焦磷酸,产出补身醇。
本发明实施还提供一种补身醇的制备方法,其中,包括步骤:
将本发明实施例如上所述的重组菌株进行发酵,得到所述补身醇。
本实施例提供了一种高效制备补身醇的异源生物合成方法,实现(−)-补身醇的一步合成,并可达到克级生产规模。本发明为合成光学纯的(−)-补身醇提供了更高效的策略,也为具有高值补身烷型杂萜类天然产物的合成提供绿色、可持续的底物来源。
在一些实施方式中,所述补身醇的制备方法具体包括步骤:
将所述重组菌株接种到含有氯霉素和羧苄青霉素的第一培养基中,培养后,得到菌液;
将所述菌液加入到含有甘油的第二培养基中,然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,诱导培养后,得到所述补身醇。
在一些实施方式,所述补身醇的制备方法具体包括步骤:
将所述重组菌株接种到含30-40mg/L氯霉素和40-50mg/L羧苄青霉素的第一培养基中,在37℃、220rpm的摇床中培养,得到菌液;
取600μL菌液接种到含有10-20mg/L氯霉素和80-100mg/L羧苄青霉素的20mL含有甘油的第二培养基中,继续在37℃、220rpm的摇床中培养直至OD600达到0.5-0.6后,放置在4℃的温度下预冷,然后加入工作浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(即向其中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,并使得异丙基-β-D-硫代半乳糖苷在培养基中的最终浓度为0.1mM),并加入4mL正十二烷,在25℃、180rpm的摇床中诱导培养72小时,然后离心,得到所述补身醇。
下面通过具体的实施例对本发明作进一步地说明。
以下实施例中部分符号的含义:
OD600:某种溶液在600nm波长处的吸光值,利用细菌的吸光值来测量细菌培养液的浓度;
图1中部分符号的含义:
AAS表示:乙酰乙酰辅酶A硫解酶;
HMGS表示:羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)合成酶;
HMGR表示:羟甲基戊二酰辅酶A还原酶;
MK表示:甲羟戊酸激酶;
PMK表示:磷酸甲羟戊酸激酶;
PMD表示:二磷酸甲羟戊酸脱羧酶;
IDI表示:异戊烯基焦磷酸异构酶;
FPPS表示:法尼基焦磷酸合成酶;
OP为磷酸基团的缩写;
OPP为焦磷酸基团的缩写。
本发明基于来源于真菌Aspergillus calidoustus的补身醇合成酶DrtB,可催化前体法尼基焦磷酸生成光学纯的(−)-补身醇。进而,本发明利用合成生物学手段,以大肠杆菌为底盘细胞,整合经优化的补身醇生物合成途径,将基因DrtB、基因ERG20以及甲羟戊酸途径导入大肠杆菌,实现补身醇的高效异源生物合成。
具体地,如图1所示,在大肠杆菌中导入从乙酰辅酶A至(−)-补身醇的生物合成途径。该途径一分为二构建在两种质粒上:其中,重组质粒pACYCDuet-T1B1包含甲羟戊酸(MVA)途径的7个合成酶(AAS,HMGS,HMGR,MK,PMK,PMD,IDI)的基因(atoB,mvaS,mvaA,mvaK1,mvaK2,mvaD和fni);重组质粒pETDuet-ERG20-DrtB包含法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)和补身醇合成酶(DrtB)的基因(ERG20和DrtB)。重组菌株可以利用简单廉价的甘油作为原料经发酵培养一步实现(−)-补身醇的异源生物合成。
实施例1
(1)构建重组质粒pETDuet-ERG20-DrtB,具体包括如下步骤:
从蛋白数据库(Uniprot)获取来源于真菌Aspergillus calidoustus的补身醇合成酶DrtB的氨基酸序列(如SEQ ID NO:2所示,528aa)。为获取能在大肠杆菌中适宜表达的核苷酸序列,由南京金斯瑞生物科技有限公司对其进行密码子优化并合成,优化后的基因DrtB的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示(1587bp)。将基因DrtB与来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的法尼基焦磷酸合成酶基因ERG20分别克隆到质粒pETDuet-1的多克隆位点MCS2和多克隆位点MCS1中,获得含有基因DrtB和基因ERG20的重组质粒pETDuet-ERG20-DrtB。
(2)构建重组质粒pACYCDuet-T1B1,具体包括如下步骤:
将甲羟戊酸(MVA)途径的基因分为两个合成操纵子(T1B1),第一个合成操纵子(T1)包括将乙酰辅酶A转化为甲羟戊酸(MVA)的3个基因,即atoB、mvaS和mvaA。第二个合成操纵子(B1)包括将甲羟戊酸(MVA)转化为异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的4个基因,即mvaK1、mvaK2、mvaD和fni。两个合成操纵子均由南京金斯瑞生物科技有限公司进行密码子优化并合成(优化后的第一个合成操纵子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示,优化后的第二个合成操纵子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示),然后将优化后的两个合成操纵子分别克隆到pACYCDuet-1的两个多克隆位点(MCS1和MCS2)上,即获得含有甲羟戊酸途径的重组质粒pACYCDuet-T1B1。
(3)构建合成补身醇的重组菌株,具体包括如下步骤:
将重组质粒pACYCDuet-T1B1和重组质粒pETDuet-ERG20-DrtB共同转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中。具体过程为:将两种重组质粒等摩尔比混合置于干净的1.5mL离心管中,并放置冰上预冷,并从-80℃冰箱中取出大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞置于冰上,待感受态细胞刚融化时,取50μL感受态细胞加入到含有两种重组质粒的1.5mL离心管中,冰浴30min,然后置于42℃水浴锅中热激45s,再冰浴2min。在无菌条件下加入LB液体培养基(700μL),在37℃、200rpm的摇床中培养50min使细菌复苏,然后离心1min(10000rpm),弃上清,用残余的上清液重悬菌体,并均匀涂布到含有34mg/L氯霉素和100mg/L氨苄青霉素的双抗平板的LB固体培养基上,平板于37℃培养箱中倒置培养过夜。筛选得到的阳性转化子即为合成补身醇的重组菌株a。
实施例2
本实施例如下采用的AM培养基的制备方法包括如下步骤:
(1)将酵母提取物5g/L、甘油30g/L、硫酸铵2.0g/L、柠檬酸1.7g/L、磷酸二氢钾4.2g/L、三水合磷酸氢二钾15.7g/L和乙二胺四乙酸 8.4mg/L溶解于蒸馏水中,121℃高压蒸汽灭菌20分钟,得到第一混合液;
(2)将七水合硫酸镁加入到蒸馏水中,混合后,0.22µm滤膜无菌过滤,配制得到浓度为1mol/L的母液1;
(3)将盐酸硫胺素加入到蒸馏水中,混合后,0.22µm滤膜无菌过滤,配制得到浓度为4.5g/L的母液2;
(4)将六水合氯化钴0.25g/L、四水合氯化锰1.5g/L、二水合氯化铜0.15g/L、硼酸0.3g/L、二水合钼酸钠0.25g/L、二水合醋酸锌1.3g/L、柠檬酸铁10g/L和1 mol/L盐酸加入到蒸馏水中,混合后,121℃高压蒸汽灭菌20分钟,配制得到微量金属元素溶液;
(5)将第一混合液、母液1、母液2和微量金属元素溶液按照1L:5mL:1mL:10mL的比例进行混合后,用10mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.0,得到AM培养基。
将实施例1中得到的合成补身醇的重组菌株a进行发酵培养制备补身醇,包括如下步骤:
将重组菌株a接种到含34mg/L氯霉素和50mg/L羧苄青霉素的1mL LB液体培养基中,在37℃、220rpm的摇床中培养过夜,得到菌液;
从所述菌液中取600μL接种到含有17mg/L氯霉素和100mg/L羧苄青霉素的AM培养基(20mL)中,继续在37℃、220rpm的摇床中培养直至OD600达到0.5-0.6后,放置在4℃的温度下预冷,然后加入工作浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPIG)诱导,并加入4mL正十二烷作为覆盖相,在25℃、180rpm的摇床中诱导培养72小时。
发酵培养结束后,菌液离心(4℃,20000rpm,10min),分离得到清澈的上层正十二烷覆盖相,并取其中的50µL,然后用正十二烷稀释100倍后用于气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测。结果如图2所示,在保留时间为9.99分钟处检测到了明显的单一信号峰(图2中A),其质谱结果(图2中B)与美国国家标准与技术研究院(NIST)标准参考数据库(图2中C)比对,初步确定产物为补身醇。
其中,本实施例采用GC-MS检测产物(补身醇),使用的是日本Shimadzu公司生产的GCMS-QP2020NX(其中GC体系采用GC-2030系列),气相色谱仪中装备型号为SH-I-5SilMS(30m×0.25mm×0.25μm)的色谱柱。以高纯度氦气作为载气,采用恒线速度模式(40cm/s)和不分流进样模式,进样体积为1μL,进样口温度为250℃。升温程序:起始温度设为80℃,以20℃/min的升温速度升温至170℃,保持2min;以8℃/min的升温速度升温至210℃;最后,以15℃/min的升温速度升温至300℃,保持2min。
为了进一步确定补身醇的绝对构型,将上述发酵培养后的菌液离心,将上层的正十二烷覆盖相(含有大部分产物)全部收集,同时用乙酸乙酯萃取培养基水相(含有少量的产物)三次,经无水硫酸钠除水,减压浓缩后,将得到的粗产物和正十二烷覆盖相合并,经硅胶柱层析分离纯化,洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯(体积比为20:1)的混合物,得到23mg白色粉末。经核磁共振氢谱和碳谱分析以及比旋光度测定,确定补身醇的绝对构型为(−)-补身醇()。其中,
核磁共振氢谱数据为1H NMR(400MHz,CDCl3) δ5.54(m,1H),3.86(dd,J=11.3,3.4Hz,1H),3.74(dd,J=11.3,4.9Hz,1H),1.93–2.05(m,2H),1.83–1.92(m,2H),1.77–1.79(m,3H),1.55(m,1H),1.39–1.49(m,2H),1.13–1.22(m,2H),1.07(td,J=13.1,3.9Hz,1H),0.89(s,3H),0.86(s,3H),0.86(s,3H)。核磁共振氢谱图如图3所示。
核磁共振碳谱数据为13C NMR(151MHz,CDCl3)δ133.0,124.2,61.0,57.4,50.0,42.36,40.0,36.2,33.5,33.0,23.7,22.2,22.1,18.9,15.0。核磁共振碳谱图如图4所示。
薄层色谱(TLC)数据为Rf(比移值)=0.52(己烷与乙酸乙酯体积比为5:1,磷钼酸显色)。
比旋光度[α]23 D= −43.30(c=1.0,CHCl3)。
可见,本发明实施例提供的重组菌株a通过发酵可合成(−)-补身醇。
实施例3
本实施例将经过密码子优化后的三种补身醇合成酶基因PhDS,VoDS和AsDMS(经过密码子优化后的基因PhDS的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示,经密码子优化的基因VoDS的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示,经密码子优化后的基因AsDMS的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)分别构建到含有基因ERG20的重组质粒pETDuet-ERG20(由将来源于酿酒酵母的法尼基焦磷酸合成酶基因ERG20克隆到质粒pETDuet-1多克隆位点MCS1中构建得到)的多克隆位点MCS2上,分别得到重组质粒pETDuet-ERG20-PhDS、pETDuet-ERG20-VoDS和pETDuet-ERG20-AsDMS。
此外,也构建了含有补身醇合成酶DrtB氨基酸序列C端删除53个氨基酸残基的跨膜区的截短体(DrtB-CD53)基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)的重组质粒pETDuet-ERG20-DrtB-CD53。
将4种质粒分别与实施例1中构建得到的重组质粒pACYCDuet-T1B1共同转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中,经过含氯霉素和氨苄青霉素的双抗平板筛选,得到另外四种重组菌株,即分别含有基因PhDS、VoDS、AsDMS的重组菌株和含有DrtB-CD53基因的重组菌株(发酵后的结果分别对应图5中的PhDS、VoDS、AsDMS和DrtB-CD53)。
将实施例1提供的重组菌株a与这四种重组菌株进行发酵培养(方法同实施例2),利用GC-MS分析其发酵产物的滴度水平(含发酵产物的正十二烷覆盖相样品稀释400倍后经GC-MS检测)。
对发酵产物(即补身醇)的滴度水平用外标法进行定量分析(选取5个不同浓度的补身醇标准品进行GC-MS分析,并作标准曲线)。如图5所示,本实施例提供的4种重组菌株及实施例1提供的重组菌株a均可合成补身醇,但实施例1提供的重组菌株a是最优的产补身醇菌株,滴度达1.5g/L(对应图5中DrtB)。另外,据文献报道,补身醇合成酶DrtB的全长氨基酸序列在大肠杆菌异源表达无酶活性,仅C端删除53个氨基酸残基的截短补身醇合成酶DrtB(DrtB-CD53)具有补身醇合成酶活性,与之结果不同的是,本发明涉及的在大肠杆菌异源表达的全长氨基酸序列的补身醇合成酶DrtB不仅具有(−)-补身醇合成酶的活性,并且(−)-补身醇的产量比DrtB-CD53更优。
实施例4 合成补身醇的重组菌株的优化
利用过表达关键限速酶(HMGR和IDI)的代谢工程策略以及筛选大肠杆菌表达菌株来优化补身醇从头异源合成的重组菌株。具体地,将来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的异戊烯基焦磷酸异构酶基因(EcIDI)构建到实施例1中重组质粒pETDuet-ERG20-DrtB的多克隆位点MCS1上,得到基因EcIDI过表达的含有基因ERG20和DrtB的重组质粒pETDuet-ERG20-EcIDI-DrtB。
将基因mvaA构建到实施例1中含甲羟戊酸途径的重组质粒pACYCDuet-T1B1的MCS1上,得到过表达基因mvaA的含有甲羟戊酸途径的重组质粒pACYCDuet-T1-mvaA-B1。
分别将pACYCDuet-T1B1(实施例1中构建得到)和pETDuet-ERG20-EcIDI-DrtB共转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中,经过含氯霉素和氨苄青霉素的双抗平板筛选(方法同实施例1),得到重组菌株b(异戊烯基焦磷酸异构酶的表达量增高);
将pACYCDuet-T1-mvaA-B1和pETDuet-ERG20-DrtB(实施例1中构建得到)共转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中,经过含氯霉素和氨苄青霉素的双抗平板筛选(方法同实施例1),得到重组菌株c(羟甲基戊二酰辅酶A还原酶表达量增高);
将pACYCDuet-T1-mvaA-B1和pETDuet-ERG20-EcIDI-DrtB共转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中,经过含氯霉素和氨苄青霉素的双抗平板筛选(方法同是实施例1),得到重组菌株d(异戊烯基焦磷酸异构酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的表达量同时增高);
对三种重组菌株进行如实施例2所述的发酵培养和GC-MS测试分析,结果如图6所示,重组菌株a发酵培养的结果对应图6中左侧的DrtB,重组菌株b发酵培养的结果对应图6中左侧的EcIDI,重组菌株c发酵培养的结果对应图6中左侧的mvaA,重组菌株d发酵培养的结果对应图6中左侧的EcIDI&mvaA,由结果可知,异戊烯基焦磷酸异构酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶表达量同时增加的重组菌株d产出补身醇的性能更优。
进一步地,将实施例1中的pACYCDuet-T1B1和pETDuet-ERG20-DrtB共转化到大肠杆菌MG1655(DE3)表达菌株中,经过含氯霉素和氨苄青霉素的双抗平板筛选(方法同实施例1),得到重组菌株e;
将pACYCDuet-T1-mvaA-B1和pETDuet-ERG20-EcIDI-DrtB共转化到大肠杆菌MG1655(DE3)表达菌株中,经过含氯霉素和氨苄青霉素的双抗平板筛选(方法同实施例1),得到重组菌株f(异戊烯基焦磷酸异构酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的表达量同时增高)。
对重组菌株e和重组菌株f进行如实施例2所述的发酵培养和GC-MS测试分析,结果如图6所示,重组菌株e发酵培养的结果对应图6中右侧的DrtB,重组菌株f发酵培养的结果对应图6中右侧的EcIDI&mvaA,重组菌株e为最优产补身醇的重组菌株,补身醇滴度达2.1g/L。相比于大肠杆菌BL21(DE3),当表达宿主为大肠杆菌MG1655(DE3)具有更优的效果。可见,本发明实施例通过代谢工程策略(过表达关键限速酶HMGR和IDI)和关键的大肠杆菌表达菌株(MG1655(DE3))筛选,获得(−)-补身醇产量进一步提升的优势重组菌株,最终(−)-补身醇的滴度达到2.1g/L,实现克级生产规模,也为具有高值补身烷型杂萜类天然产物的合成提供绿色、可持续的底物来源。
应当理解的是,本发明的应用不限于上述的举例,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种重组菌株,其特征在于,所述重组菌株为含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因、法尼基焦磷酸合成酶基因和补身醇合成酶基因的重组大肠杆菌,或所述重组菌株为含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因、法尼基焦磷酸合成酶基因和补身醇合成酶截短体基因的重组大肠杆菌;
所述甲羟戊酸途径的七个合成酶基因包括以下基因:
atoB、mvaS、mvaA、mvaK1、mvaK2、mvaD和fni;
所述补身醇合成酶基因为经过密码子优化的DrtB;
所述经过密码子优化的DrtB的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;
所述补身醇合成酶截短体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
所述重组大肠杆菌为重组大肠杆菌BL21或重组大肠杆菌MG1655。
2.根据权利要求1所述的重组菌株,其特征在于,所述重组菌株还过表达基因EcIDI和/或基因mvaA。
3.一种重组菌株的制备方法,其特征在于,包括步骤:
构建含有法尼基焦磷酸合成酶基因和补身醇合成酶基因的重组质粒A;
构建含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因的重组质粒B;
构建含有法尼基焦磷酸合成酶基因、基因EcIDI和补身醇合成酶基因的重组质粒C;
构建含有基因mvaA和甲羟戊酸途径的七个合成酶基因的重组质粒D;
将重组质粒A、重组质粒C中的一种和重组质粒B、重组质粒D中的一种共转入到大肠杆菌中,得到所述重组菌株;
所述甲羟戊酸途径的七个合成酶基因包括以下基因:
atoB、mvaS、mvaA、mvaK1、mvaK2、mvaD和fni;
所述补身醇合成酶基因为经过密码子优化的DrtB;所述经过密码子优化的DrtB的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21或大肠杆菌MG1655。
4.一种重组菌株的制备方法,其特征在于,包括步骤:
构建含有法尼基焦磷酸合成酶基因和补身醇合成酶截短体基因的重组质粒E;
构建含有甲羟戊酸途径的七个合成酶基因的重组质粒B;
构建含有法尼基焦磷酸合成酶基因、基因EcIDI和补身醇合成酶截短体基因的重组质粒F;
构建含有基因mvaA和甲羟戊酸途径的七个合成酶基因的重组质粒D;
将重组质粒E、重组质粒F中的一种和重组质粒B、重组质粒D中的一种共转入到大肠杆菌中,得到所述重组菌株;
所述甲羟戊酸途径的七个合成酶基因包括以下基因:
atoB、mvaS、mvaA、mvaK1、mvaK2、mvaD和fni;
所述补身醇合成酶截短体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21或大肠杆菌MG1655。
5.权利要求1-2任一项所述的重组菌株或采用权利要求3-4任一项所述的制备方法制备得到的重组菌株在制备补身醇中的应用;所述补身醇的绝对构型为(−)-补身醇,(−)-补身醇的结构式为。
6.一种补身醇的制备方法,其特征在于,包括步骤:
将权利要求1-2任一项所述的重组菌株或采用权利要求3-4任一项所述的制备方法制备得到的重组菌株进行发酵,得到所述补身醇;所述补身醇的绝对构型为(−)-补身醇,(−)-补身醇的结构式为。
7.根据权利要求6所述的补身醇的制备方法,其特征在于,所述补身醇的制备方法具体包括步骤:
将所述重组菌株接种到含有氯霉素和羧苄青霉素的第一培养基中,培养后,得到菌液;
将所述菌液加入到含有甘油的第二培养基中,然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,诱导培养后,得到所述补身醇。
8.根据权利要求7所述的补身醇的制备方法,其特征在于,所述补身醇的制备方法具体包括步骤:
将所述重组菌株接种到含30-40mg/L氯霉素和40-50mg/L羧苄青霉素的第一培养基中,在37℃、220rpm的摇床中培养,得到菌液;
取600μL菌液接种到含有10-20mg/L氯霉素和80-100mg/L羧苄青霉素的20mL含有甘油的第二培养基中,继续在37℃、220rpm的摇床中培养直至OD600达到0.5-0.6后,放置在4℃的温度下预冷,然后加入工作浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,并加入4mL正十二烷,在25℃、180rpm的摇床中诱导培养72小时,然后离心,得到所述补身醇。
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