CN110656056B - 一种高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌的构建方法 - Google Patents

一种高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌的构建方法，属于微生物技术领域。本发明选取耐高渗透压的产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018转化葡萄糖发酵生产蒎烯。该酵母对蒎烯耐受性可达1g/L，有效克服了蒎烯对宿主生产菌的生长抑制，蒎烯的产量达到0.8mg/L。本发明的制备方法具有操作方便、转化效率高、生产成本低、工业化应用前景广等特点。

Description

一种高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌的构建方法
技术领域
本发明提供了一种高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌的构建方法，属于微生物技术领域。
背景技术
蒎烯(pinene)，分子式C10H16，是一种重要的单萜类天然化合物，有α-和β-蒎烯两种异构体，二者均存在于多种天然精油中，以蒎烯为初始原料合成香料已成为工业合成香料的一个重要组成部分。蒎烯具有特殊的分子结构,是一种供电子体,其可与受电子体等进行自由基交替共聚,形成电荷转移络合物,从而合成性能优异的聚合物,扩大了其聚合物的应用范围。松节油中含有58～65％的α-蒎烯和30％的β-蒎烯，其二聚体具有与战术燃料JP-10相当的高体积能量，可作为现有喷气机燃料(如战术燃料JP-10和降冰片二烯二聚体的混合物RJ-5)的替代燃料。除此之外,蒎烯单体还具抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗抑郁和镇痛等功效，可作为多种药物的主要药理活性物,例如人们常用的治疗支气管炎的桉柠蒎肠溶胶囊。
目前蒎烯主要通过化学法合成，即采用高效精馏塔从脂松节油或粗硫酸盐松节油中进行分离提取。这种方法对设备要求较高，分离提取难度大、成本高，同时造成了大量自然资源的破坏。随着代谢工程和合成生物学的迅速发展，绿色可持续发展的微生物合成技术为先进生物燃料的制造提供了替代策略，即可利用大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等遗传背景清晰、基因操作体系成熟的模式微生物实现目标产品的高效合成。与大肠杆菌相比，酿酒酵母由于拥有更强大的蛋白表达和翻译后修饰系统以及完整的内膜系统，更适于蒎烯合成代谢过程中关键酶细胞色素P450蛋白的表达。但是，现有研究表明，200mg/L蒎烯使得酿酒酵母生物量降低75％，其较差的蒎烯耐受性会严重影响蒎烯的发酵生产。
产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，能在55％葡萄糖或15％NaCl的高渗透压培养基上正常生长繁殖，具有耐高渗和高抗逆性的特点。
发明内容
针对现有的技术难点及存在的问题，本发明提供了一种以耐高渗透压的产甘油假丝酵母为生产菌株生产蒎烯的方法，本发明所选耐高渗透压的产甘油假丝酵母菌株可利用20g/L的葡萄糖在1g/L蒎烯浓度下生成0.8mg/L的蒎烯。
本发明的第一个目的是提供一种高浓度蒎烯耐受性产蒎烯的工程菌。所述工程菌以产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018为宿主，将人工合成的来源于Pinus taeda的蒎烯合酶基因整合到宿主中，构建高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述蒎烯合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述蒎烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌的构建方法，所述方法是将SEQ ID NO.1整合到产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M93018基因组中。
在本发明的一种实施方式中，高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌的构建方法包括如下步骤：
(1)将SEQ ID NO.1采用BamHI和KpnI连接到pURGAPU质粒上构建重组表达载体，采用SacI线性化重组表达载体；
(2)采用醋酸锂转化法将线性化重组表达载体转化到产甘油假丝酵母(Candidaglycerinogenes)CCTCC M 93018基因组中，构建高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌。
本发明的第三个目的是提供一种高浓度蒎烯耐受性工程菌生产蒎烯的方法，是以所述基因工程菌为发酵微生物，利用葡萄糖作为碳源进行发酵，包括如下步骤：
(1)挑取1环产蒎烯工程菌接入种子培养基中，在30℃，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子；
(2)将步骤(2)得到的液态种子按5％(v/v)的接种量接入发酵培养基中，控制发酵温度为30～37℃，转速为150～200r/min，待OD值达到0.8～1.2时，加入正十二烷，发酵时间为48～96h；
(3)取发酵72h的发酵液上层正十二烷层进行气相色谱检测。
在本发明的一种实施方式中，在发酵培养基OD值达到1时，加入正十二烷，发酵时间为72h。
本发明还要求保护所述菌株在蒎烯工业生产、国防军事、药物制备中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的产甘油假丝酵母菌株蒎烯耐受性高，可达1g/L，克服了蒎烯在发酵过程中对菌株的毒害作用，有利于该菌株在蒎烯工业生产、国防军事、药物制备中的应用；本发明的产甘油假丝酵母菌株具有蒎烯产量高，转化率高的特点，经检测，该菌株可利用20g/L的葡萄糖生成0.8mg/L的蒎烯。
附图说明
图1 Candida glycerinogenes在含不同浓度蒎烯的YPD培养基中的生长情况；
图2重组载体酶切电泳图；
图3产甘油假丝酵母菌株产蒎烯的气相色谱-质谱联用图谱。a:气相色谱图；b:质谱图；
图4蒎烯浓度标准曲线。
具体实施方式
YPD培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，定容到1L。
MM固体培养基：YNB(无氨基酵母氮源)6.7g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，定容到1L。
下面通过实施例对本发明进一步详细描述。
实施例1
挑取1环产甘油假丝酵母CCTCC M 93018接入YPD培养基中，在30℃，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子。将得到的液态种子按10％(v/v)的接种量接入含有不同蒎烯浓度的YPD培养基中，蒎烯的浓度分别为0mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、500mg/L、1g/L。装液量为50mL/250mL，控制培养温度为30℃，转速为200r/min，分别在第12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h取样测定酵母在600nm波长下的OD值。
从图1中可以看出，在蒎烯浓度为0mg/L、10mg/L、50mg/L、100mg/L、500mg/L和1g/L时，培养60h的酵母的OD值依次为18.5、18.2、18.2、17.3、13.7、8.5。60h后继续培养，蒎烯浓度为0mg/L、10mg/L、50mg/L的酵母的OD值继续增长，而蒎烯浓度为100mg/L、500mg/L和1g/L的酵母的OD值开始下降，产甘油假丝酵母菌株蒎烯耐受性最高可达1g/L。
实施例2
线性化载体准备：合成的SEQ ID NO.1通过BamHI和KpnI连接到pURGAPU质粒上构建重组表达载体，采用双酶切和琼脂糖凝胶电泳验证重组载体构建成功(图2)。采用SacI将重组表达载体单酶切为线性化DNA片段。
醋酸锂法转化酵母细胞：接种活化的产甘油假丝酵母细胞于10mL YPD培养基中30℃过夜培养。按1％接种量接种50mL YPD培养基，培养至OD 600为1左右。6000r/min离心3min收集菌体，加入1mL无菌水轻柔悬浮洗涤，离心弃去上清液，重复两次。加入44μL无菌水轻柔悬浮菌体，再分别加入240μl 50％聚乙二醇溶液(PEG)，36μl 1M醋酸锂(LiAc)，20μlssDNA(鲑鱼精DNA，预先沸水浴10min，然后冰上冷却1min)，500ng线性化DNA片段。充分轻柔地吹吸混匀，置于42℃水浴锅中热激1h。10000r/min离心收集菌体，弃去上清液，加入1mLYPD培养基，30℃培养2h。培养后的菌体6000r/min离心收集，用无菌水洗涤两次。涂布于MM固体培养基上，30℃培养3d，获得产蒎烯工程菌。
实施例3
标准曲线绘制：利用50mg/L的蒎烯标准品确定蒎烯的保留时间，重复进样3针。由图3(a)可以看出，第5.53min为α蒎烯的保留时间。配制50mg/L、100mg/L、200mg/L、500mg/L、1g/L不同浓度的蒎烯标准品溶液，根据所得峰的面积绘制蒎烯浓度标准曲线为y＝104.05x-877.31(图4)。
挑取1环产蒎烯工程菌接入种子培养基中，在30℃，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子。将液态种子按5％(v/v)的接种量接入50ml发酵培养基中，控制发酵温度为30℃，转速为500r/min，待OD值达到1时，加入10mL正十二烷，发酵时间为72h。产物确认采用GC-MS检测，将发酵72h的样品取上层正十二烷用无水硫酸钠除水4～5h过膜进行GC-MS检测。
气相色谱-质谱(GC-MS)仪(Broker SCION SQ,USA)，色谱柱HP-5ms(30m×0.25μm×0.25mm)硅胶毛细管色谱柱，进样量1μL，载气为氮气，流速0.8mL/min，进样口温度为260℃，柱温箱起始温度为60℃，保留2min，以5℃/min程序升温至160℃，再以120℃/min升到260℃。氢焰检测器温度为300℃，质量扫描范围33-400m/z，电离电压70eV。使用Nist98谱库进行图谱检索。结果如图3(b)所示，根据蒎烯浓度标准曲线计算可得蒎烯产量为0.8mg/L。
实施例4：
具体实施方式同实施例3，区别在于，将正十二烷的添加量替换为5mL和3mL，测定蒎烯产量为0.78mg/L和0.75mg/L，与10mL正十二烷的添加量相比，蒎烯产量没有明显变化。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种高浓度蒎烯耐受性产蒎烯工程菌的构建方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1884
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggctttgg tttctgctgt cccacttaat agtaaattgt gtttgaggag gacccttttt 60
ggattttctc acgaattgaa ggccatccac agtaccgtcc caaatcttgg tatgtgtaga 120
ggaggtaagt ctatcgcccc ttctatgtct atgtctagta ccaccagtgt cagtaatgag 180
gacggagttc caaggagaat cgccggtcac cattctaacc tttgggacga cgattctatc 240
gccagtctta gtacctctta cgaggcccca agttatagga agagggccga caagttgatc 300
ggtgaggtca agaacatctt cgaccttatg tctgtcgagg atggagtctt caccagtcca 360
cttagtgacc ttcaccatag gttgtggatg gttgatagtg tcgaaaggct tggaatcgat 420
agacatttta aagacgagat caattctgcc cttgaccacg tctacagtta ttggaccgag 480
aagggaatcg gaaggggtag ggaatctggt gttaccgact tgaacagtac tgcccttgga 540
ttgaggaccc ttaggttgca cggatacacc gtctctagtc acgtcttgga ccacttcaag 600
aacgagaagg gtcagttcac ttgttctgct atccaaaccg aaggtgagat tagagacgtc 660
ttgaacttgt ttagagcttc tcttatcgcc ttccccggtg agaagattat ggaggccgcc 720
gagatcttca gtactatgta cttgaaggac gcccttcaaa agatccctcc ttctggtttg 780
agtcaagaaa ttgaatacct tttggagttt ggttggcata ccaaccttcc tagaatggag 840
actagaatgt atattgatgt cttcggagaa gacaccacct tcgagactcc atatttgatt 900
agagaaaaat tgcttgagct tgctaagttg gaatttaaca tcttccatag tttggtcaaa 960
agagaattgc aaagtctttc tagatggtgg aaggactacg gattcccaga gattaccttc 1020
agtaggcata gacacgttga gtactacacc ttggctgctt gtatcgccaa cgaccctaag 1080
cactctgcct ttaggttggg attcggaaaa atcagtcaca tgattaccat tcttgatgat 1140
atttacgaca ctttcggtac tatggaggaa cttaaattgc ttactgccgc cttcaagagg 1200
tgggacccat ctagtatcga gtgccttcca gattacatga agggtgtcta catggccgtc 1260
tacgacaaca ttaacgagat ggctagagag gctcagaaga tccaaggttg ggacaccgtc 1320
tcttacgcta gaaaatcttg ggaggccttt atcggtgcct acatccaaga agccaagtgg 1380
atcagtagtg gttatttgcc aacttttgac gaatacttgg aaaatggaaa agtcagtttc 1440
ggaagtagga tcaccacttt ggagccaatg ttgaccttgg gtttcccatt gcctccaagg 1500
atcttgcaag aaattgattt cccatctaaa tttaacgacc ttatctgtgc catcttgaga 1560
cttaagggag acacccagtg ctacaaggcc gacagagcta gaggtgagga ggcttctgcc 1620
gtcagttgct acatgaagga tcatcccggt atcaccgagg aagacgccgt caatcaagtt 1680
aatgccatgg ttgataactt gaccaaggag cttaactggg agcttcttag gccagacagt 1740
ggtgtcccta tctcttacaa gaaagtcgcc ttcgacattt gtagagtttt ccattacgga 1800
tataagtata gagacggttt ctctgtcgcc tctattgaga ttaagaacct tgtcactaga 1860
accgtcgttg aaactgtccc actt 1884
<210> 2
<211> 628
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ala Leu Val Ser Ala Val Pro Leu Asn Ser Lys Leu Cys Leu Arg
1 5 10 15
Arg Thr Leu Phe Gly Phe Ser His Glu Leu Lys Ala Ile His Ser Thr
20 25 30
Val Pro Asn Leu Gly Met Cys Arg Gly Gly Lys Ser Ile Ala Pro Ser
35 40 45
Met Ser Met Ser Ser Thr Thr Ser Val Ser Asn Glu Asp Gly Val Pro
50 55 60
Arg Arg Ile Ala Gly His His Ser Asn Leu Trp Asp Asp Asp Ser Ile
65 70 75 80
Ala Ser Leu Ser Thr Ser Tyr Glu Ala Pro Ser Tyr Arg Lys Arg Ala
85 90 95
Asp Lys Leu Ile Gly Glu Val Lys Asn Ile Phe Asp Leu Met Ser Val
100 105 110
Glu Asp Gly Val Phe Thr Ser Pro Leu Ser Asp Leu His His Arg Leu
115 120 125
Trp Met Val Asp Ser Val Glu Arg Leu Gly Ile Asp Arg His Phe Lys
130 135 140
Asp Glu Ile Asn Ser Ala Leu Asp His Val Tyr Ser Tyr Trp Thr Glu
145 150 155 160
Lys Gly Ile Gly Arg Gly Arg Glu Ser Gly Val Thr Asp Leu Asn Ser
165 170 175
Thr Ala Leu Gly Leu Arg Thr Leu Arg Leu His Gly Tyr Thr Val Ser
180 185 190
Ser His Val Leu Asp His Phe Lys Asn Glu Lys Gly Gln Phe Thr Cys
195 200 205
Ser Ala Ile Gln Thr Glu Gly Glu Ile Arg Asp Val Leu Asn Leu Phe
210 215 220
Arg Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Gly Glu Lys Ile Met Glu Ala Ala
225 230 235 240
Glu Ile Phe Ser Thr Met Tyr Leu Lys Asp Ala Leu Gln Lys Ile Pro
245 250 255
Pro Ser Gly Leu Ser Gln Glu Ile Glu Tyr Leu Leu Glu Phe Gly Trp
260 265 270
His Thr Asn Leu Pro Arg Met Glu Thr Arg Met Tyr Ile Asp Val Phe
275 280 285
Gly Glu Asp Thr Thr Phe Glu Thr Pro Tyr Leu Ile Arg Glu Lys Leu
290 295 300
Leu Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn Ile Phe His Ser Leu Val Lys
305 310 315 320
Arg Glu Leu Gln Ser Leu Ser Arg Trp Trp Lys Asp Tyr Gly Phe Pro
325 330 335
Glu Ile Thr Phe Ser Arg His Arg His Val Glu Tyr Tyr Thr Leu Ala
340 345 350
Ala Cys Ile Ala Asn Asp Pro Lys His Ser Ala Phe Arg Leu Gly Phe
355 360 365
Gly Lys Ile Ser His Met Ile Thr Ile Leu Asp Asp Ile Tyr Asp Thr
370 375 380
Phe Gly Thr Met Glu Glu Leu Lys Leu Leu Thr Ala Ala Phe Lys Arg
385 390 395 400
Trp Asp Pro Ser Ser Ile Glu Cys Leu Pro Asp Tyr Met Lys Gly Val
405 410 415
Tyr Met Ala Val Tyr Asp Asn Ile Asn Glu Met Ala Arg Glu Ala Gln
420 425 430
Lys Ile Gln Gly Trp Asp Thr Val Ser Tyr Ala Arg Lys Ser Trp Glu
435 440 445
Ala Phe Ile Gly Ala Tyr Ile Gln Glu Ala Lys Trp Ile Ser Ser Gly
450 455 460
Tyr Leu Pro Thr Phe Asp Glu Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Val Ser Phe
465 470 475 480
Gly Ser Arg Ile Thr Thr Leu Glu Pro Met Leu Thr Leu Gly Phe Pro
485 490 495
Leu Pro Pro Arg Ile Leu Gln Glu Ile Asp Phe Pro Ser Lys Phe Asn
500 505 510
Asp Leu Ile Cys Ala Ile Leu Arg Leu Lys Gly Asp Thr Gln Cys Tyr
515 520 525
Lys Ala Asp Arg Ala Arg Gly Glu Glu Ala Ser Ala Val Ser Cys Tyr
530 535 540
Met Lys Asp His Pro Gly Ile Thr Glu Glu Asp Ala Val Asn Gln Val
545 550 555 560
Asn Ala Met Val Asp Asn Leu Thr Lys Glu Leu Asn Trp Glu Leu Leu
565 570 575
Arg Pro Asp Ser Gly Val Pro Ile Ser Tyr Lys Lys Val Ala Phe Asp
580 585 590
Ile Cys Arg Val Phe His Tyr Gly Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Phe Ser
595 600 605
Val Ala Ser Ile Glu Ile Lys Asn Leu Val Thr Arg Thr Val Val Glu
610 615 620
Thr Val Pro Leu
625

Claims (7)

1.一种基因工程菌，以产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes) CCTCC M 93018为宿主，其特征在于，表达来源于Pinus taeda的蒎烯合酶，所述蒎烯合酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
2.一种构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，将编码蒎烯合酶如SEQ IDNO.1所示的基因整合到产甘油假丝酵母CCTCC M 93018的基因组中。
3.根据权利要求2所述的一种方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将SEQ ID NO.1连接到pURGAPU质粒上构建重组表达载体；
（2）线性化重组表达载体；
（3）采用醋酸锂转化法将线性化重组表达载体转化到产甘油假丝酵母CCTCC M 93018基因组中。
4.一种生产蒎烯的方法，其特征在于，是以权利要求1所述基因工程菌为发酵微生物，以葡萄糖作为碳源进行发酵。
5.根据权利要求4所述的一种方法，其特征在于，在发酵过程中需要加入正十二烷。
6.根据权利要求5所述的一种方法，其特征在于，在发酵培养基OD值达到0.8~1.2时加入正十二烷，发酵时间为48~96h。
7.权利要求1所述的基因工程菌在蒎烯工业生产中的应用。
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