CN103502428A - 乙酰辅酶a 衍生出的化合物的生产 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及泛酸盐化合物作为微生物宿主细胞中的异源乙酰辅酶A衍生出的(HACD)化合物的生产的非遗传开关的用途。本发明提供了当在低泛酸盐浓度下储存和最初培养时更稳定的遗传修饰的微生物，具有降低的泛酸盐化合物浓度的细胞培养基，以及使用本发明的细胞培养基和遗传工程改造的微生物生产HACD化合物的方法。

Description

乙酰辅酶A 衍生出的化合物的生产

1.相关申请的交叉引用

本申请要求2011年5月9日提交的美国临时专利申请号61/483,896的优先权，其通过引用并入本文。

2.技术领域

本公开内容涉及泛酸盐(也被称作维生素B5)作为非遗传开关的用途，所述非遗传开关用于调控遗传修饰的宿主细胞的异源乙酰辅酶A衍生出的化合物的生产。

3.背景技术

合成生物学的出现已经带来了用发酵微生物在工业规模和质量从可再生来源生产生物燃料、化学试剂和生物材料的希望。例如，已经在微生物宿主中成功地构建了功能性的非天然的生物途径，用于生产：抗疟疾药青蒿素的前体(参见，例如，Martin等人,Nat Biotechnol21:796-802(2003)；脂肪酸衍生出的燃料和化学试剂(例如，脂肪酸酯类、脂肪醇类和蜡类；参见，例如，Steen等人,Nature463:559-562(2010)；产生胆固醇降低药物的聚酮化合物合酶(参见，例如，Ma等人,Science326:589-592(2009)；和聚酮化合物(参见，例如，Kodumal,Proc Natl Acad Sci USA101:15573-15578(2004)。但是，合成生物学的商业成功较大程度上取决于可再生产物的生产成本是否可以与它们各自的不可再生的相应物的生产成本竞争或胜过后者。

菌株稳定性可以是工业发酵成本的一个重要驱动器，因为它会影响可以生产性地运行连续发酵的时间长度。菌株稳定性通常表示，微生物在长培养时间内维持非分解代谢发酵产物的有利生产特征(即，高收率(克化合物/克底物)和生产力(克/升发酵液/小时))的能力。具体地，遗传稳定性在产物的持续输出中起重要作用，所述遗传稳定性是生产微生物群的与产物生产有关的基因的预期等位基因频率随时间几乎没有至没有改变的倾向。

对于除了生物质以外的产物(作为定义，所述产物会消耗代谢能和碳，所述代谢能和碳否则可用于生产更多的细胞)的非分解代谢发酵而言，不稳定性的基础是双重的：进化突变和选择。首先，生产损失突变自发地和随机地产生。其次，具有降低的产物收率的细胞的生长速率或“适合性”优点会导致低产者的最终群体扫荡，并由此降低总培养物性能。该现象可以被称作“菌株退化”。

长期以来，巴西燃料乙醇发酵会实现从糖至乙醇的极高收率，即，最大理论收率的约90%。这部分地归因于乙醇的生产是分解代谢：它每生产1分子的糖产生2个ATP，且是在没有涉及氧的情况下平衡的氧化还原。突变至不产生乙醇的细胞在发酵罐的低氧条件下不太适合，并且不会扫荡群体。这允许工业乙醇发酵在整个季节中再循环大部分酵母生物质，由此使糖向酵母细胞生物质的转化最小化，并将几乎所有的糖导向乙醇生产。生物质的这种延长的繁殖和再使用会增加乙醇生产效率：因为在每个循环中更少的糖转化成生物质而降低运行支出(即，收率增加)；和因为需要更少的和更小的发酵罐即可建立用于接种的生物质而降低资本支出。

相反，许多乙酰辅酶A衍生出的烃类(例如，类异戊二烯类、脂肪酸类和聚酮化合物类)的生产在性质上通常是非分解代谢；它们通常需要ATP、NADPH和碳的净输入，经常需要大量供氧以帮助平衡该系统的氧化还原。这样的环境会使朝向更低产物、更高生物质生产的基因型的进化更有利，并导致更高的菌株退化速率。

降低生产非分解代谢产物的负选择压力的一种途径是，在不期望产物的阶段，例如在必须产生生物质以使发酵罐生产力最大化的发酵阶段，关闭产物形成。遗传开关是在实践中实现该目的的一种常见方式，但是可能由于下述原因而具有缺点：例如，外源性诱导物的成本，转录和翻译该开关的延迟，并且如果突变发生在遗传开关本身中，也可以是低产者的源头。但是，代谢开关不具有这些缺点。

因而，本领域需要可以在发酵过程中控制乙酰辅酶A衍生出的化合物的生产时机的代谢开关。

4.发明内容

本文提供了一种从遗传修饰的宿主细胞生产异源乙酰辅酶A衍生出的化合物(“HACD化合物”)的发酵方法。在某些实施方案中，所述方法包括2个阶段：建立阶段，其中HACD化合物生产大幅下降(“关闭”阶段)，而积累细胞生物质；和生产阶段。其中开启HACD化合物生产。因而，在不需要生产的发酵阶段中，会减轻与HACD化合物生产有关的负选择压力。不受理论的约束，据信，HACD化合物生产在建立阶段中的减少或消除会导致所述菌株在生产阶段中的稳定性提高，从而导致更持久的HACD化合物生产，由此增加菌株的总收率和/或生产力。发酵培养物中HACD化合物生产的“关闭”和“开启”状态受培养基中的乙酰辅酶A前体泛酸盐的量控制。

乙酰辅酶A是乙酸盐的活化形式，其被用作许多重要的生物分子（包括氨基酸、脂肪酸、类异戊二烯和聚酮化合物）的结构单元。辅因子辅酶A(乙酰辅酶A的辅酶A部分)从3种前体生物合成(图1B)。这些前体中的2种，即L-半胱氨酸和腺苷-5’-三磷酸，可以由大多数活系统有效地合成，且因而不是限制性的。相比而言，第三种前体泛酸盐是限制性的，且仅由大多数活系统以不足的量生产。所以，大多数活系统的最佳生长、健康和生存力需要泛酸盐化合物的外源(例如，在培养基或食品源中)。但是，本文提供的方法部分地基于下述意外发现：当培养经工程改造成生产乙酰辅酶A衍生出的化合物的细胞时，可以以限制性量使用或完全省略泛酸盐。在限制性的泛酸盐浓度下，这些细胞可以维持生长和生存力，且在某些情况下，表现出改善的生长。有利地，这些相同的条件会导致HACD化合物生产的减少。因此，本文提供的方法利用泛酸盐作为非遗传开关，以实现用于生产异源乙酰辅酶A衍生出的化合物的改进发酵方法的“关闭”和“开启”阶段。

因而，在一个方面，本文提供了一种在宿主细胞中生产异源乙酰辅酶A衍生出的(HACD)化合物的方法，所述方法包括：

(a)在包含碳源和限制性量的泛酸盐的培养基中培养能够生产HACD化合物的遗传修饰的宿主细胞群，其中所述限制性量的泛酸盐会限制宿主细胞的HACD化合物生产；随后

(b)在包含碳源和非限制性量的泛酸盐的培养基中培养所述群或其亚群，其中所述泛酸盐的非限制性量是大于所述泛酸盐的限制性量的量，其中所述群或其亚群在有非限制性量的泛酸盐存在下生产更大量的HACD化合物。

在某些实施方案中，通过进行泛酸盐滴定，确定所述泛酸盐的限制性量，其中在包含递增浓度的泛酸盐的生长培养基中培养所述宿主细胞，且在每种泛酸盐浓度确定HACD化合物生产，其中所述泛酸盐滴定包括：使泛酸盐的量饱和，由此使HACD化合物生产处于它的最大值；其中所述泛酸盐的限制性量是使HACD化合物生产小于它的最大值时的任意泛酸盐浓度。

在某些实施方案中，在“建立”阶段(步骤(a))中的HACD化合物生产小于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的50、40、30、20或10%。在某些实施方案中，在“生产”阶段(步骤(b))中的HACD化合物生产大于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的50、60、70、80或90%。

在某些实施方案中，所述步骤(a)的培养持续的时间段足以使所述群达到0.01至400的细胞密度(OD₆₀₀)。在某些实施方案中，所述步骤(b)的培养是持续3-20天的时间段。在某些实施方案中，所述泛酸盐的限制性量是0.2mg/L以下。在某些实施方案中，所述泛酸盐的限制性量是0mg/L。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是0.2mg/L以上。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量至少是使HACD化合物生产处于它的最大值时的最小泛酸盐浓度。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是10mg/L。

在某些实施方案中，步骤(b)包括：将泛酸盐加入包含限制性量的泛酸盐的培养基中，直到所述培养基包含非限制性量的泛酸盐。在某些实施方案中，步骤(b)包括：将步骤(a)的群转移至包含非限制性量的泛酸盐的新培养基。

在某些实施方案中，与不包括在限制性量的泛酸盐中培养细胞的方法得到的生产相比，本文提供的方法会导致遗传修饰的宿主细胞群的HACD化合物生产增加。在某些实施方案中，以收率(每克碳底物产生的HACD化合物克数)或生产力(每升培养基每小时生产的HACD化合物克数)的方式，测量HACD化合物生产。在某些实施方案中，所述方法进一步包括：回收HACD化合物。

在某些实施方案中，所述泛酸盐选自：2-脱氢泛解酸盐、(R)-泛解酸盐、(R)-泛酸盐和它们的任意盐或酯。在某些实施方案中，所述宿主细胞选自：真菌细胞、细菌细胞、植物细胞和动物细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是酵母细胞。在某些实施方案中，所述HACD化合物选自：氨基酸、脂肪酸、类异戊二烯和聚酮化合物。

在某些实施方案中，所述宿主细胞能够生产类异戊二烯，且包含至少一种编码类异戊二烯途径酶的异源核酸，所述类异戊二烯途径酶选自：

a)缩合2个乙酰辅酶A分子以形成乙酰乙酰辅酶A的酶；

b)缩合乙酰乙酰辅酶A与另一个乙酰辅酶A分子以形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)的酶；

c)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶；

d)将甲羟戊酸转化成5-磷酸甲羟戊酸的酶；

e)将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；

f)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成IPP的酶；

g)将IPP转化成DMAPP的酶；

h)聚异戊二烯基合酶，其可以缩合IPP和/或DMAPP分子以形成含有超过5个碳的聚异戊二烯基化合物；

i)将IPP与DMAPP缩合以形成GPP的酶；

j)将2个IPP分子与1个DMAPP分子缩合的酶；

k)将IPP与GPP缩合以形成FPP的酶；

l)将IPP和DMAPP缩合以形成GGPP的酶；和，

m)将IPP和FPP缩合以形成GGPP的酶。

在某些实施方案中，所述宿主细胞进一步包含编码修饰聚异戊二烯基的酶的异源核酸，所述酶选自：香叶醇合酶、芳樟醇合酶、柠檬烯合酶、香叶烯合酶、罗勒烯合酶、α-蒎烯合酶、β-蒎烯合酶、香桧烯合酶、γ-萜品烯合酶、萜品油烯合酶、紫穗槐二烯合酶、α-金合欢烯合酶、β-金合欢烯合酶、法尼醇合酶、橙花叔醇合酶、广藿香醇(patchouliol)合酶、努特卡酮合酶、松香二烯合酶。

在某些实施方案中，所述宿主细胞能够生产聚酮化合物，且包含至少一种编码聚酮化合物合成酶的异源核酸，其中所述聚酮化合物合成酶选自：

a)将乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A中的至少一种与酰基载体蛋白缩合的酶；

b)将选自乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的第一反应物与选自丙二酰辅酶A或甲基丙二酰辅酶A的第二反应物缩合以形成聚酮化合物产物的酶；

c)将聚酮化合物上的β-酮化学基团还原为β-羟基的酶；

d)将聚酮化合物中的烷烃化学基团脱水以产生α-β-不饱和烯烃的酶；

e)将聚酮化合物中的α-β-双键还原为饱和烷烃的酶；和，

f)从酰基载体蛋白水解聚酮化合物的酶。

在某些实施方案中，所述聚酮化合物是具有抗生素活性、抗真菌活性和抗肿瘤活性中的至少一种的脂质。在某些实施方案中，所述聚酮化合物选自：大环内酯、抗生素、抗真菌剂、细胞生长抑制性化合物、抗胆甾醇血化合物、抗寄生虫化合物、球虫生长抑制性的化合物、动物生长促进剂和杀昆虫剂。

在某些实施方案中，所述宿主细胞能够生产脂肪酸，且包含至少一种编码脂肪酸合成酶的异源核酸，其中所述脂肪酸合成酶选自：

a)将乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A中的至少一种与酰基载体蛋白(ACP)共价连接的酶；

b)将乙酰基-ACP和丙二酰基-ACP缩合以形成乙酰乙酰基-ACP的酶；

c)用NADPH还原乙酰乙酰基-ACP中的双键以形成D-3-羟基丁酰基羟化酶-ACP中的羟基；

d)将D-3-羟基丁酰基羟化酶-ACP脱水以产生β-和γ-碳之间的双键从而形成巴豆酰基-ACP的酶；

e)用NADPH还原巴豆酰基ACP以形成丁酰基-ACP的酶；和，

f)从酰基载体蛋白水解C16酰基化合物以形成棕榈酸的酶。

在某些实施方案中，所述脂肪酸选自：棕榈酸盐、棕榈酰辅酶A、棕榈油酸、十六碳烯酸(sapienic acid)、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸。

在另一个方面，本文提供了一种在宿主细胞中生产异源乙酰辅酶A衍生出的(HACD)化合物的方法，所述方法包括：

(a)在包含碳源且缺乏泛酸盐补充的培养基中，培养能够生产HACD化合物的遗传修饰的宿主细胞群；随后

(b)在包含碳源且补充了至少1mg/L泛酸盐的培养基中，培养所述群或其亚群。

在某些实施方案中，所述步骤(a)的培养持续的时间段足以使所述群达到0.01至400的细胞密度(OD₆₀₀)。在某些实施方案中，所述步骤(b)的培养是持续3-20天的时间段。

5.附图说明

图1显示了(A)R-泛酸盐和(B)辅酶A的分子结构，突出显示了辅酶A的源自它的3种前体的3个区段：L-半胱氨酸、(R)-泛酸盐和ATP。

图2显示了在酵母(A)和细菌(B)中的泛酸盐生物合成途径。

图3显示了在有不同量的泛酸盐存在下，用菌株Y4689和Y4352得到的示例性HACD化合物的收率(A)和细胞密度(B)。菌株Y4689和Y4352各自包含异源酶(包括MEV途径的酶：IPP异构酶、FPP合酶和金合欢烯合酶)，且分别能够以15%和13%的收率生产HACD化合物。

图4显示了菌株Y4720、Y5038和Y2205在包含0.4mg/L或0.002mg/L的泛酸盐的琼脂上的细胞生长。菌株Y4720和Y5038各自包含异源酶(包MEV途径的酶：IPP异构酶、FPP合酶和金合欢烯合酶)，且分别能够以14%和6%的收率生产示例性HACD化合物。菌株Y2205是不产生任何HACD化合物的CEN.PK2野生型对照。

图5显示了在有0或10mg/L的泛酸盐存在下，能够生产不同收率的示例性HACD化合物金合欢烯的酵母宿主细胞的细胞生长。指示了每个菌株的近似金合欢烯收率，并且以小于10%的收率生产金合欢烯的菌株的数据点为灰色，而以10%或更大的收率生产金合欢烯的菌株的数据点为黑色。

图6显示了在有10mg/L的泛酸盐存在下，能够生产HACD化合物金合欢烯的酵母宿主细胞群的菌株退化(即，HACD化合物生产随时间的下降)。

图7提供了用于生产异戊烯基二磷酸(“IPP”)的甲羟戊酸(“MEV”)途径的示意图。

图8提供了IPP和二甲基烯丙基焦磷酸(“DMAPP”)向香叶基焦磷酸(“GPP”)、法呢基焦磷酸(“FPP”)和香叶基香叶基焦磷酸(“GGPP”)的转化的示意图。

6.具体实施方式

6.1定义

术语“乙酰辅酶A衍生出的化合物”表示，宿主细胞从一个或多个源自乙酰辅酶A的乙酰基生物合成的分子。

术语“内源”表示，可以在宿主细胞中天然地发生的物质或过程。

术语“遗传修饰”表示，包含异源核苷酸序列的宿主细胞。

术语“HACD化合物”表示，由遗传修饰的宿主细胞生产的异源乙酰辅酶A衍生出的化合物。HACD化合物包括、但不限于氨基酸、脂肪酸、类异戊二烯和聚酮化合物。在某些实施方案中，所述HACD化合物选自：类异戊二烯、脂肪酸和聚酮化合物。

术语“异源”表示，在自然界中通常不存在的物质。术语“异源化合物”表示，通常不产生某种化合物的细胞对所述化合物的生产，或表示细胞对某种化合物的生产水平不是所述细胞通常生产所述化合物的水平。

术语“异源酶”表示，在自然界中在给定细胞中通常不存在的酶。该术语包括这样的酶，所述酶：

(a)对于给定细胞而言是外源性的(即，由这样的核苷酸序列编码：所述核苷酸序列天然地不存在于宿主细胞中，或者天然地不存在于宿主细胞的给定背景中)；和

(b)天然地存在于宿主细胞中(例如，所述酶由细胞的内源核苷酸序列编码)，但是在宿主细胞中以非天然量(例如，大于或小于天然量)生产。

术语“泛酸盐化合物”表示选自2-脱氢泛解酸盐、(R)-泛解酸盐、(R)-泛酸盐和它们的任意盐或酯的任意化合物。

术语“生产”通常表示，由本文中提供的遗传修饰的宿主细胞生产的HACD化合物的量。在某些实施方案中，将生产表示为宿主细胞对HACD化合物的收率。在其它实施方案中，将生产表示为宿主细胞的生产HACD化合物的生产力。

术语“生产力”表示宿主细胞对HACD化合物的生产，表示为单位量的在其中培养宿主细胞的发酵液(按体积计)随时间(每小时)生产的HACD化合物的量(按重量计)。

术语“收率”表示宿主细胞对HACD化合物的生产，表示为单位量的由宿主细胞消耗的碳源(按重量计)所生产的HACD化合物的量。

6.2泛酸盐作为用于调控异源化合物生产的非遗传开关的用途

本文提供的方法和组合物是基于下述发现：当从在其中培养能够生产HACD化合物的遗传修饰的宿主细胞的培养基限制或省略泛酸盐时，HACD化合物生产大幅下降；且当在所述培养基中提供泛酸盐时，会增加HACD化合物生产。因而，泛酸盐可以充当在遗传修饰的宿主细胞中生产HACD化合物的非遗传开关。具体地，控制HACD化合物生产时机仅在期望生产时才发生，会将非生产阶段中的碳通量重新导向细胞维持和生物质。碳的这种更有效利用会极大地减小宿主细胞的代谢负担，增加异源基因的稳定性，减少菌株退化，和促进细胞的更好总体健康和生存力。因此，本文提供的方法利用泛酸盐作为非遗传开关，以实现用于生产异源乙酰辅酶A衍生出的化合物的改进发酵方法的“关闭”和“开启”阶段。

因而，在一个方面，本文提供了一种在宿主细胞中生产异源乙酰辅酶A衍生出的(HACD)化合物的方法，所述方法包括：

(a)在包含碳源和限制性量的泛酸盐的培养基中培养能够生产HACD化合物的遗传修饰的宿主细胞群，其中所述限制性量的泛酸盐会限制宿主细胞的HACD化合物生产；随后

(b)在包含碳源和非限制性量的泛酸盐的培养基中培养所述群或其亚群，其中所述泛酸盐的非限制性量是大于所述泛酸盐的限制性量的量，其中所述群或其亚群在有非限制性量的泛酸盐存在下生产更大量的HACD化合物。

在第一步(即，“建立”阶段，步骤(a))中，在泛酸盐受限或省略的生长或“建立”培养基中，培养遗传修饰的宿主细胞。在第二步(即，“生产”阶段，步骤(b))中，将泛酸盐化合物加入所述培养基中，所述泛酸盐化合物充当非遗传开关，以大幅增强HACD化合物生产。在低或没有泛酸盐水平的初期生长会确保，在细胞的生物质快速增加的同时，满足细胞的能量需求。此后，向含有泛酸盐化合物的生长培养基的切换会实现HACD产物的合成。

实施例5(下面)和图3A解释了培养基中的泛酸盐化合物浓度对遗传修饰的宿主细胞中的HACD化合物生产的影响，所述宿主细胞具有穿过乙酰辅酶A生物合成途径的高代谢通量以生产类异戊二烯金合欢烯。在低泛酸盐化合物水平(0.2mg/L，<试验的最大泛酸盐化合物浓度的1%)，基本上不存在HACD化合物生产。在平顶效应之前，增加泛酸盐化合物水平与增加的HACD化合物生产相关联。超过1mg/L泛酸盐(试验的最大泛酸盐化合物浓度的10%)的进一步增加没有导致HACD化合物生产的进一步增加。

值得注意的是，这些细胞的生长显示出与HACD化合物生产相反的趋势。图3B解释了相同菌株在关于HACD化合物生产所试验的相同泛酸盐浓度水平的生长。与在最大HACD化合物生产所需的泛酸盐水平培养菌株时观察到的生长相比，没有或低水平的泛酸盐化合物实际上导致更好的生长。在经工程改造成生产更高量的HACD化合物的宿主细胞中更频繁地观察到对低泛酸盐水平的这种应答，如下面的实施例6和7和图4和5所示。因而，在某些能够生产HACD化合物的菌株中，当在几乎没有或没有泛酸盐的情况下培养时，观察到改善的生长的另一个益处。在“建立”阶段(即，当HACD化合物生产被关闭时)中改善的生长允许快速地增加发酵生产阶段所需的细胞生物质。

下面提供的实施例8和图6证实了菌株退化现象，当在发酵过程的所有阶段都提供泛酸盐时，可以发生该现象。在发酵开始时，HACD金合欢烯的稳健生产暂时得到维持，但是随着时间推移，生产降低至接近以前观察到的最大生产的仅60%。这会导致宿主细胞群的总生产(例如，收率和/或生产力)的下降。但是，如下面的实施例9和表1所述，通过在“建立”阶段中从培养基中限制或省略泛酸盐，HACD化合物生产可以在发酵过程中大幅增加。

6.2.1泛酸盐的限制性的和非限制性的量

在本文提供的方法的某些实施方案中，可以针对能够生产HACD化合物的任何遗传修饰的宿主细胞，确定用于本文提供的方法中的泛酸盐的“限制性的”和“非限制性的”量。在某些实施方案中，如下确定泛酸盐的非限制性量：在有递增量的泛酸盐存在下，在培养基中执行HACD化合物生产曲线，即，泛酸盐滴定。在下面的实施例5和图3中提供了示例性的泛酸盐滴定。

例如，可以将遗传修饰的宿主细胞群分成多个亚群，并平行地培养，其中在包含不同量（例如递增量）的泛酸盐(包括没有泛酸盐)的培养基中培养每个亚群，并在确定的时间段以后测定HACD化合物生产。在优选实施方案中，所述泛酸盐滴定包括至少2个泛酸盐浓度，由此使宿主细胞的HACD化合物生产在最大量时达到平稳，也就是说，随着泛酸盐浓度的增加，没有观察到HACD化合物生产的进一步增加。在某些实施方案中，泛酸盐的“非限制性量”至少是，使宿主细胞的HACD化合物生产在它的最大值时达到平稳的泛酸盐最小量。该量还可以被称作，用于特定宿主细胞的HACD化合物生产的泛酸盐的“饱和”或“最佳”量，因此所述量不会限制宿主细胞的HACD化合物生产，也就是说，HACD化合物生产不会由于培养基中泛酸盐的缺乏而受到不利影响。在其它实施方案中，泛酸盐的“非限制性的”量可以包括，观察到HACD化合物生产的任意泛酸盐浓度，即时在HACD化合物生产为次优的情况下。

一旦为宿主细胞确定了泛酸盐的非限制性量，该量可以在发酵过程的生产阶段中使用，且也可以用于确定在建立阶段中要使用的泛酸盐的“限制性的”量。在某些实施方案中，泛酸盐的“限制性的”量可以是在发酵的建立阶段中使用的、低于泛酸盐的非限制性量的任意量。

在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是至少0.01mg/L(泛酸盐重量/培养基体积)。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是至少0.1mg/L。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是至少1mg/L。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是至少10mg/L。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是在0.01mg/L至10mg/L之间的泛酸盐量。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是在0.01mg/L至1mg/L之间的泛酸盐量。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是在0.01mg/L至0.1mg/L之间的泛酸盐量。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是在1mg/L至10mg/L之间的泛酸盐量。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是大于0.001mg/L的量。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是大于0.01mg/L的量。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是大于0.02mg/L的量。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是大于0.1mg/L的量。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是大于0.2mg/L的量。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是大于1mg/L的量。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是大于2mg/L的量。在某些实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是大于10mg/L的量。

在某些实施方案中，所述泛酸盐的限制性量是比根据上述方法确定的泛酸盐的非限制性量小至少2倍、10倍、100倍、1000倍、10,000倍或100,000倍的量。在某些实施方案中，所述泛酸盐的限制性量是比根据上述方法确定的泛酸盐饱和量小至少2倍、10倍、100倍、1000倍、10,000倍或100,000倍的量。在某些实施方案中，所述泛酸盐的限制性量是根据上述方法确定的泛酸盐的非限制性量的小于50%、小于20%、小于10%、小于1%、小于0.5%、小于0.2%、小于0.1%、小于0.01%、或小于0.001%的量。在某些实施方案中，所述泛酸盐的限制性量是根据上述方法确定的泛酸盐饱和量的小于50%、小于20%、小于10%、小于1%、小于0.1%、小于0.01%或小于0.001%的量。在其它具体实施方案中，所述泛酸盐的限制性量是小于10mg/L、或小于1mg/L、或小于0.2mg/L、或小于0.1mg/L、或小于0.02mg/L、或小于0.01mg/L、或小于0.001mg/L的泛酸盐的量。在一个具体实施方案中，所述泛酸盐的限制性量是0mg/L、即，没有泛酸盐。因而，在该具体实施方案中，在建立阶段中，在不含有泛酸盐外源的细胞培养基中培养宿主细胞，并且细胞可利用的唯一泛酸盐源是在内部产生的内源泛酸盐。

在一个具体实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是如上所述的给定宿主细胞的最佳量或饱和量，且所述限制性量是没有泛酸盐。在另一个具体实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是至少0.01mg/L，且所述限制性量是没有泛酸盐。在另一个具体实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是0.01-10mg/L的泛酸盐量，且所述限制性量是没有泛酸盐。在另一个具体实施方案中，所述泛酸盐的非限制性量是至少10mg/L，且所述限制性量是没有泛酸盐。

在某些实施方案中，在建立阶段(上述方法的步骤(a))中的HACD化合物生产小于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产（即，当在包含饱和量或最佳量的泛酸盐的培养基中培养宿主细胞时的HACD化合物生产量）的50、40、30、20或10%。在某些实施方案中，在建立阶段中的HACD化合物生产小于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的50%。在某些实施方案中，在建立阶段中的HACD化合物生产小于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的40%。在某些实施方案中，在建立阶段中的HACD化合物生产小于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的30%。在某些实施方案中，在建立阶段中的HACD化合物生产小于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的20%。在某些实施方案中，在建立阶段中的HACD化合物生产小于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的10%。在某些实施方案中，在建立阶段中的HACD化合物生产小于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的5%。在某些实施方案中，在建立阶段中的HACD化合物生产小于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的1%。

在某些实施方案中，在生产阶段(上述方法的步骤(b))中的HACD化合物生产大于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的20、30、40、50、60、70、80或90%。在某些实施方案中，在建立阶段中的HACD化合物生产大于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的50%。在某些实施方案中，在建立阶段中的HACD化合物生产大于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的60%。在某些实施方案中，在建立阶段中的HACD化合物生产大于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的70%。在某些实施方案中，在建立阶段中的HACD化合物生产大于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的80%。在某些实施方案中，在建立阶段中的HACD化合物生产大于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的90%。在某些实施方案中，在建立阶段中的HACD化合物生产大于遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的95%。在某些实施方案中，在建立阶段中的HACD化合物生产是遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的100%或更多。

在其中进行发酵方法的建立阶段和生产阶段的时间段可以变化，且取决于诸如下述因素：宿主细胞的生长速率，例如，在培养基中具有泛酸盐限制或补充；宿主细胞的固有生长速率；和其它培养条件诸如pH、温度以及好氧、微好氧或厌氧条件的要求，取决于宿主细胞、发酵和过程的具体要求。但是，预见到建立阶段的任何持续时间会导致发酵的最终生产力的某些益处，因为在“关闭”状态会减轻与HACD化合物生产有关的一些量的负选择压力。

在某些实施方案中，进行建立阶段足以生产一定量的细胞生物质的时间段，所述细胞生物质可以在生产阶段中支持HACD化合物生产。在某些实施方案中，进行建立阶段足以使在接种时存在的群发生多个倍增直到达到期望的细胞密度的时间段。在某些实施方案中，进行建立阶段足以使发酵罐或容器（在其中进行建立阶段）中的宿主细胞群达到0.01至400的细胞密度(OD₆₀₀)的时间段。在某些实施方案中，进行建立阶段直到达到至少0.01的OD₆₀₀。在某些实施方案中，进行建立阶段直到达到至少0.1的OD₆₀₀。在某些实施方案中，进行建立阶段直到达到至少1.0的OD₆₀₀。在某些实施方案中，进行建立阶段直到达到至少10的OD₆₀₀。在某些实施方案中，进行建立阶段直到达到至少100的OD₆₀₀。在某些实施方案中，进行建立阶段直到达到0.01至100之间的OD₆₀₀。在某些实施方案中，进行建立阶段直到达到0.1至10之间的OD₆₀₀。在某些实施方案中，进行建立阶段直到达到1至100之间的的OD₆₀₀。在其它实施方案中，进行建立阶段至少12、24、36、48、60、72、84、96小时或超过96小时的时间段。

在某些实施方案中，进行生产阶段足以生产期望量的HACD化合物的时间段。在某些实施方案中，进行生产阶段至少12、24、36、48、60、72、84、96小时或超过96小时的时间段。

在某些实施方案中，进行生产阶段3-20天的时间段。在某些实施方案中，进行生产阶段1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或超过20天的时间段。

在一个特定实施方案中，所述生产HACD化合物的方法包括：在足以实现遗传修饰的宿主细胞的生长和维持的条件下，在包含碳源和有限的或缺乏的泛酸盐化合物浓度的培养基中，进行遗传修饰的宿主细胞的发酵；随后以足以诱导HACD化合物生产的浓度，在培养基中提供泛酸盐化合物，和在整个发酵运行中维持所述泛酸盐化合物浓度。

在另一个实施方案中，所述生产HACD化合物的方法包括：在单独的建立和生产培养基中培养宿主细胞。例如，所述方法可以包括：在建立阶段中培养遗传修饰的宿主细胞，其中在包含限制性量的泛酸盐(例如，几乎没有至没有泛酸盐)的培养基中培养细胞以产生接种物，然后将所述接种物转移进包含非限制性量的泛酸盐的第二发酵培养基中，和在第二发酵阶段中维持稳态条件，以生产含有HACD产物的细胞培养物。

在某些实施方案中，本文提供的方法足以以大于约10克/升发酵培养基的量生产一种或多种HACD化合物。在某些这样的实施方案中，以每升细胞培养物约10至约50克、超过约15克、超过约20克、超过约25克或超过约30克的量，生产HACD衍生的化合物。

在某些实施方案中，本文提供的方法足以以大于约50毫克/克细胞干重的量生产一种或多种HACD化合物。在某些实施方案中，以每克细胞干重约50至约1500毫克、超过约100毫克、超过约150毫克、超过约200毫克、超过约250毫克、超过约500毫克、超过约750毫克或超过约1000毫克的量，生产重组生产的HACD化合物。

在某些实施方案中，与不包含建立阶段（在其中在限制性量的泛酸盐中培养宿主细胞）的方法实现的生产相比，本文提供的方法的实践会导致遗传修饰的宿主细胞群的HACD化合物生产增加。在某些实施方案中，所述方法的实践会导致下述量的一种或多种HACD化合物的生产：基于每单位体积的细胞培养物，比不包含建立阶段（在其中在限制性量的泛酸盐中培养宿主细胞）的方法生产的HACD化合物的量高至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1,000倍或更多。

在某些实施方案中，所述方法的实践会导致下述量的一种或多种HACD化合物的生产：基于每单位的细胞干重，比不包含建立阶段（在其中在限制性量的泛酸盐中培养宿主细胞）的方法生产的HACD化合物的量高至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1,000倍或更多。

在某些实施方案中，所述方法的实践会导致下述量的一种或多种HACD化合物的生产：基于每单位体积的细胞培养物每单位时间，比不包含建立阶段（在其中在限制性量的泛酸盐中培养宿主细胞）的方法生产的HACD化合物的量高至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1,000倍或更多。

在某些实施方案中，所述方法的实践会导致下述量的一种或多种HACD化合物的生产：基于每单位细胞干重每单位时间，比不包含建立阶段（在其中在限制性量的泛酸盐中培养宿主细胞）的方法生产的HACD化合物的量高至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约75倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍、或至少约1,000倍或更多。

6.2.2培养基和条件

用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法是微生物学或发酵科学领域技术人员众所周知的(参见，例如，Bailey等人,BiochemicalEngineering Fundamentals,第2版,McGraw Hill,New York,1986)。必须考虑适当的培养基、pH、温度以及好氧、微好氧或厌氧条件的要求，取决于宿主细胞、发酵和过程的具体要求。

本文中提供的生产HACD化合物的方法可以在合适的容器内在合适培养基(例如，具有或没有泛酸盐补充)中进行，包括、但不限于细胞培养板、烧瓶或发酵罐。此外，所述方法可以在本领域已知的支持微生物产物的工业生产的任意发酵规模进行。可以使用任意合适的发酵罐，包括搅拌釜发酵罐、气升式发酵罐、气泡发酵罐或它们的任意组合。在使用酿酒酵母作为宿主细胞的特定实施方案中，可以如在下述文献中所述，在发酵罐中培养菌株：Kosaric,等人,Ullmann's Encyclopedia of IndustrialChemistry,第6版,第12卷,第398-473页,Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KDaA,Weinheim,德国。

在某些实施方案中，用于本文提供的生产HACD化合物的方法中的培养基包括这样的任意培养基：能够生产HACD化合物的遗传修饰的微生物可以在其中存活（即支持和维持生长和生存力），几乎没有或没有泛酸盐补充。在某些实施方案中，当补充泛酸盐时，所述培养基也会促进生产期望的HACD化合物所必需的生物合成途径。

在某些实施方案中，所述培养基是包含可同化的碳源、氮源和磷酸盐源的水性介质。这样的培养基还可以包括适当的盐、矿物质、金属和其它营养物。在某些实施方案中，将碳源和每种必需的细胞营养物（除了泛酸盐化合物以外）递增地或连续地加入发酵培养基中，并将每种需要的营养物基本上维持在培养的细胞的有效同化所需的最低水平，例如，根据预定的细胞生长曲线，所述生长曲线基于将碳源转化成生物质的细胞的代谢或呼吸功能。

用于培养微生物的合适条件和合适培养基是本领域众所周知的。在某些实施方案中，所述合适培养基补充了一种或多种其它试剂，例如，诱导化合物(例如，当一个或多个编码基因产物的核苷酸序列处于诱导型启动子控制下时)、阻遏物(例如，当一个或多个编码基因产物的核苷酸序列处于可抑制型启动子控制下时)、或选择剂(例如，用于选择包含遗传修饰的微生物的抗生素)。

在某些实施方案中，所述碳源是单糖(monosaccharide，simple sugar)、二糖、多糖、不可发酵的碳源、或其中的一种或多种的组合。合适的单糖的非限制性例子包括：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖和它们的组合。合适的二糖的非限制性例子包括：蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖和它们的组合。合适的多糖的非限制性例子包括：淀粉、糖原、纤维素、甲壳质和它们的组合。合适的不可发酵的碳源的非限制性例子包括乙酸盐和甘油。

培养基中碳源（诸如葡萄糖）的浓度应当会促进细胞生长，但是不会高至抑制使用的微生物的生长。通常，用碳源（诸如葡萄糖）进行培养，所述碳源的加入水平会实现期望的生长和生物质水平，但是在不可检测的水平(检测限为约<0.1g/l)。在其它实施方案中，培养基中碳源（诸如葡萄糖）的浓度大于约1g/L，优选地大于约2g/L，和更优选地大于约5g/L。另外，培养基中碳源（诸如葡萄糖）的浓度通常小于约100g/L，优选地小于约50g/L，和更优选地小于约20g/L。应当指出，对培养物组分浓度的提及可以表示最初的和/或进行中的组分浓度。在某些情况下，可能合乎需要的是，允许培养基在培养过程中被耗尽碳源。

可以在合适培养基中使用的可同化氮源包括、但不限于：简单氮源、有机氮源和复杂氮源。这样的氮源包括无水氨、铵盐和动物、植物和/或微生物起源的物质。合适的氮源包括、但不限于：蛋白水解物、微生物生物质水解物、蛋白胨、酵母浸出物、硫酸铵、脲和氨基酸。通常，所述培养基中氮源的浓度大于约0.1g/L，优选地大于约0.25g/L，和更优选地大于约1.0g/L。但是，超过某些浓度，氮源向培养基中的加入对微生物生长而言没有益处。所以，培养基中氮源的浓度小于约20g/L，优选地小于约10g/L和更优选地小于约5g/L。此外，在某些情况下，可能合乎需要的是，允许培养基在培养过程中被耗尽氮源。

有效的培养基可以含有其它化合物诸如无机盐、维生素、痕量金属或生长促进剂。这样的其它化合物还可以存在于有效培养基的碳源、氮源或矿物源中，或者可以专门加入培养基中。

所述培养基还可以含有合适的磷酸盐源。这样的磷酸盐源包括无机和有机磷酸盐源。优选的磷酸盐源包括、但不限于：磷酸盐诸如磷酸一钠或磷酸二钠和磷酸钾、磷酸铵及其混合物。通常，所述培养基中磷酸盐的浓度大于约1.0g/L，优选地大于约2.0g/L和更优选地大于约5.0g/L。但是，超过某些浓度，磷酸盐向培养基中的加入对微生物生长而言没有益处。因此，所述培养基中磷酸盐的浓度通常小于约20g/L，优选地小于约15g/L和更优选地小于约10g/L。

合适培养基还可以包括镁源，优选地以生理上可接受的盐（诸如硫酸镁七水合物）的形式，尽管可以使用贡献类似量的镁的浓度的其它镁源。通常，所述培养基中镁的浓度大于约0.5g/L，优选地大于约1.0g/L，和更优选地大于约2.0g/L。但是，超过某些浓度，镁向培养基中的加入对微生物生长而言没有益处。因此，所述培养基中镁的浓度通常小于约10g/L，优选地小于约5g/L，和更优选地小于约3g/L。此外，在某些情况下，可能合乎需要的是，允许培养基在培养过程中被耗尽镁源。

在某些实施方案中，所述培养基还可以包括生物学上可接受的螯合剂，诸如柠檬酸三钠的二水合物。在这样的情况下，所述培养基中螯合剂的浓度大于约0.2g/L，优选地大于约0.5g/L，和更优选地大于约1g/L。但是，超过某些浓度，螯合剂向培养基中的加入对微生物生长而言没有益处。因此，所述培养基中螯合剂的浓度通常小于约10g/L，优选地小于约5g/L，和更优选地小于约2g/L。

所述培养基还可以最初包括生物学上可接受的酸或碱，以维持培养基的期望的pH。生物学上可接受的酸包括、但不限于：盐酸、硫酸、硝酸、磷酸及其混合物。生物学上可接受的碱包括、但不限于：氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾及其混合物。在某些实施方案中，使用的碱是氢氧化铵。

所述培养基还可以包括生物学上可接受的钙源，包括、但不限于，氯化钙。通常，所述培养基中钙源（诸如氯化钙二水合物）的浓度是在约5mg/L至约2000mg/L的范围内，优选地在约20mg/L至约1000mg/L的范围内，和更优选地在约50mg/L至约500mg/L的范围内。

所述培养基还可以包括氯化钠。通常，所述培养基中氯化钠的浓度是在约0.1g/L至约5g/L的范围内，优选地在约1g/L至约4g/L的范围内，和更优选地在约2g/L至约4g/L的范围内。

在某些实施方案中，所述培养基还可以包括痕量金属。这样的痕量金属可以作为储备溶液加入培养基中，为了方便，所述储备溶液可以与培养基的其它部分分开制备。通常，加入所述培养基中的这样的痕量金属溶液的量是大于约1ml/L，优选地大于约5mL/L，和更优选地大于约10mL/L。但是，超过某些浓度，痕量金属向培养基中的加入对微生物生长而言没有益处。因此，加入所述培养基中的这样的痕量金属溶液的量通常小于约100mL/L，优选地小于约50mL/L，和更优选地小于约30mL/L。应当指出，除了在储备溶液中加入痕量金属以外，可以单独地加入各种组分，各自在与上述痕量金属溶液范围所决定的各种组分的量独立对应的范围内。

除了泛酸盐或B5（其可以在培养基中不存在或存在，取决于发酵阶段）以外，所述培养基可以包括其它维生素，诸如生物素、钙、泛酸盐、肌醇、吡多辛-HCl和硫胺-HCl。这样的维生素可以作为储备溶液加入培养基中，为了方便，所述储备溶液可以与培养基的其它部分分开制备。但是，超过某些浓度，维生素向培养基中的加入对微生物生长而言没有益处。

本文中描述的发酵方法可以以常规培养模式进行，所述常规培养模式包括、但不限于：分批、补料分批、细胞再循环、连续和半连续。在某些实施方案中，以补料分批模式进行发酵。在这样的情况下，在发酵的生产阶段中，所述培养基的一些组分（包括泛酸盐）在培养过程中被耗尽。在某些实施方案中，可以在例如生产阶段开始时给培养物补充相对较高浓度的这样的组分，从而在需要加入之前支持生长和/或HACD化合物生产一段时间。通过随着培养物消耗水平进行添加，在培养过程中维持这些组分的优选范围。可以监测培养基中组分的水平，例如，定期对培养基取样，并测定浓度。可替换地，一旦开发出标准培养规程，可以在培养过程中在与特定时间的已知水平相对应的定时间隔进行添加。本领域技术人员会认识到，在培养过程中，营养物的消耗速率随着培养基的细胞密度增加而增加。此外，为了避免外来微生物向培养基中的引入，使用本领域已知的无菌添加方法进行添加。另外，在培养过程中可以加入少量消泡剂。

所述培养基的温度可以是适合遗传修饰的细胞的生长和/或HACD化合物的生产的任意温度。例如，在给培养基接种接种物之前，可以使培养基达到和维持在约20℃至约45℃范围内的温度，优选在约25℃至约40℃范围内的温度，和更优选地在约28℃至约32℃范围内。

通过向培养基中加入酸或碱，可以控制所述培养基的pH。在这样的情况下，当使用氨来控制pH时，它也方便地充当培养基中的氮源。优选地，维持约3.0至约8.0的pH，更优选约3.5至约7.0，和最优选约4.0至约6.5。

还可以维持培养基以具有这样的溶解氧含量：其在培养过程中维持细胞生长和维持细胞代谢，用于生产HACD化合物。使用已知方法，诸如通过使用氧电极，可以监测培养基的氧浓度。使用本领域已知的方法，通过搅动、摇动或鼓泡进行培养基的搅拌和通气，可以将氧加入培养基中。优选地，基于在常压下和在约20℃至约40℃范围内的温度氧在所述培养基中的溶解度，培养基中的氧浓度是在所述培养基中的氧饱和值的约20%至约100%范围内。在培养过程中，可能发生低于该范围的氧浓度的周期性下降，但是，不会不利地影响培养物。

尽管已经在本文中关于空气的使用来描述了培养基的通气，可以使用其它氧源。特别有用的是，使用这样的通气气体：其含有的氧体积分数大于环境空气中的氧体积分数。另外，这样的通气气体可以包括不会不利地影响培养物的其它气体。

在某些实施方案中，在培养过程中，监测培养基的碳源浓度，诸如葡萄糖浓度。使用已知的技术，例如，使用葡萄糖氧化酶试验或高压液相色谱法（其可以用于检测上清液（例如培养基的无细胞组分）中的葡萄糖浓度），可以监测培养基的葡萄糖浓度。如前所述，碳源浓度应当保持低于发生细胞生长抑制的水平。尽管这样的浓度可以随生物体不同而变化，对于作为碳源的葡萄糖而言，在大于约60g/L的葡萄糖浓度，发生细胞生长抑制，且可以通过试验容易地确定。因此，当使用葡萄糖作为碳源时，优选地将葡萄糖补料给发酵罐，并维持低于检测限。可替换地，将培养基中的葡萄糖浓度维持在约1g/L至约100g/L的范围内，更优选地在约2g/L至约50g/L的范围内，和更优选地在约5g/L至约20g/L的范围内。尽管通过例如添加基本上纯的葡萄糖溶液可以将碳源浓度维持在期望的水平内，可接受的是，且可以优选的是，通过加入原始培养基的等分试样来维持所述培养基的碳源浓度。原始培养基的等分试样的应用可能是合乎需要的，因为可以同时维持培养基中的其它营养物(例如氮和磷酸盐源)的浓度。同样地，通过加入痕量金属溶液的等分试样，可以维持培养基中的痕量金属浓度。

6.2.3HACD化合物的回收

由宿主细胞生产HACD以后，使用本领域已知的任意合适的分离和纯化方法，可以将其回收或分离用于以后使用。在某些实施方案中，通过离心从发酵液中分离出包含HACD的有机相。在其它实施方案中，包含HACD化合物的有机相自发地从发酵液中分离出。在其它实施方案中，通过向发酵反应物中加入破乳剂和/或成核剂，使包含HACD衍生的化合物的有机相从发酵液中分离出。破乳剂的示例性例子包括絮凝剂和促凝剂。成核剂的示例性例子包括HACD化合物自身和有机溶剂（诸如十二烷、肉豆蔻酸异丙酯和油酸甲酯）的微滴。

在这些细胞中生产的HACD化合物可以存在于培养物上清液中和/或与宿主细胞结合。在HACD化合物与宿主细胞结合的实施方案中，HACD的回收可以包括透化或裂解细胞的方法。可替换地或同时地，使用回收方法可以回收培养基中的HACD，所述回收方法包括、但不限于，色谱法、萃取、溶剂萃取、膜分离、电渗析、反渗透、蒸馏、化学衍生化和结晶。

在某些实施方案中，使HACD化合物与可能存在于有机相中的其它产物分离。在某些实施方案中，使用吸附、蒸馏、气液萃取(汽提)、液-液萃取(溶剂萃取)、超滤和标准色谱技术实现分离。

在某些实施方案中，回收的HACD化合物是纯的，例如，至少约40%纯、至少约50%纯、至少约60%纯、至少约70%纯、至少约80%纯、至少约90%纯、至少约95%纯、至少约98%纯或超过98%纯，其中在HACD化合物的背景下使用的“纯的”表示不含有其它HACD化合物、污染物等的HACD化合物。

6.3遗传修饰的微生物

本文提供了生产异源乙酰辅酶A衍生出的(HACD)化合物的遗传修饰的微生物(例如，遗传修饰的酿酒酵母细胞)。与本文中描述的缺少遗传修饰的亲本微生物相比，所述遗传修饰的微生物生产更大量的从乙酰辅酶A生物合成的一种或多种化合物。

使用表达载体或染色体整合构建体遗传修饰微生物的方法（例如，以实现一种或多种HACD化合物在宿主细胞中的增加生产）是本领域众所周知的。参见，例如，Sherman,F.,等人,Methods Yeast Genetics,Cold SpringHarbor Laboratory,N.Y.(1978);Guthrie,C.,等人(编)Guide To YeastGenetics and Molecular Biology第194卷,Academic Press,San Diego(1991);Sambrook等人,2001,Molecular Cloning--A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY；和Ausubel等人,编,最近版,Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience,NY.；它们的公开内容通过引用并入本文。另外，通过缺失、突变和/或基因重排，可以实现基因表达的抑制，例如，其会导致细胞中一种或多种HACD化合物的生产增加。它还可以利用反义RNA、siRNA、miRNA、核酶、三链DNA和转录和/或翻译抑制剂来实现。另外，可以采用转座子来破坏基因表达，例如，通过将其插入在启动子和编码区之间，或插入在2个邻近基因之间以灭活一个或两个基因。

在某些实施方案中，通过使用表达载体来表达特定蛋白（例如，在如上所述的生物合成途径中涉及的蛋白），实现细胞中HACD化合物的生产增加。通常，表达载体是包含复制信号和表达控制序列（例如，启动子和终止子）的重组多核苷酸分子，所述表达控制序列可操作地连接到编码多肽的核苷酸序列。可用于表达编码多肽的核苷酸序列的表达载体包括病毒载体(例如，逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)、质粒载体和粘粒。适合用于酵母细胞中的表达载体的示例性例子包括、但不限于：CEN/ARS和2μ质粒。适合用于酵母细胞中的启动子的示例性例子包括、但不限于：乳酸克鲁维酵母的TEF1基因的启动子，酿酒酵母的PGK1基因的启动子，酿酒酵母的TDH3基因的启动子，阻抑型启动子，例如，酿酒酵母的CTR3基因的启动子，和诱导型启动子，例如，酿酒酵母的半乳糖诱导型启动子(例如，GAL1、GAL7和GAL10基因的启动子)。

通过本领域技术人员已知的任意方法，但不限于此，可以将表达载体和染色体整合构建体引入微生物细胞中。参见，例如，Hinnen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1292-3(1978)；Cregg等人,Mol.Cell.Biol.5:3376-3385(1985)；美国专利号5,272,065;Goeddel等人,编,1990,Methods in Enzymology,第185卷,Academic Press,Inc.,CA;Krieger,1990,Gene Transfer and Expression--A Laboratory Manual,Stockton Press,NY;Sambrook等人,1989,Molecular Cloning--A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,NY；和Ausubel等人,编,最近版,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and WileyInterscience,NY。示例性的技术包括、但不限于：原生质球技术、电穿孔、PEG1000介导的转化、和醋酸锂或氯化锂介导的转化。

6.3.1宿主细胞

可用于本文提供的方法和组合物中的细胞包括，能够天然地或重组地生产HACD化合物（例如，类异戊二烯、聚酮化合物、脂肪酸等）的任意细胞。在某些实施方案中，所述细胞是原核细胞。在某些实施方案中，所述细胞是细菌细胞。在某些实施方案中，所述细胞是大肠杆菌细胞。在某些实施方案中，所述细胞是真核细胞。在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS-7细胞、小鼠成纤维细胞细胞、小鼠胚胎性癌细胞或小鼠胚胎干细胞。在某些实施方案中，所述细胞是昆虫细胞。在某些实施方案中，所述细胞是S2细胞、Schneider细胞、S12细胞、5B1-4细胞、Tn5细胞或Sf9细胞。在某些实施方案中，所述细胞是单细胞的真核生物细胞。

在某些实施方案中，所述细胞是菌丝细菌细胞。在某些实施方案中，所述菌丝细菌细胞属于放线菌纲。在特定实施方案中，所述菌丝细菌细胞属于链霉菌属，例如，生二素链霉菌（Streptomyces ambofaciens）、除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis）、远青链霉菌（Streptomyces azureus）、肉桂地链霉菌（Streptomyces cinnamonensis）、天蓝色链霉菌（Streptomycescoelicolor）、古腊科链霉菌（Streptomyces curacoi）、红霉素链霉菌（Streptomyces erythraeus）、弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）、加利利链霉菌（Streptomyces galilaeus）、淡青链霉菌（Streptomyces glaucescens）、吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）、浅青紫链霉菌（Streptomyceslividans）、Streptomyces parvulus、波赛链霉菌（Streptomyces peucetius）、龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）、玫瑰暗黄链霉菌（Streptomycesroseofulvus）、耐热链霉菌（Streptomyces thermotolerans）、紫红链霉菌（Streptomyces violaceoruber）。

在另一个实施方案中，所述细胞是真菌细胞。在一个更具体的实施方案中，所述细胞是酵母细胞。可用于本文提供的方法和组合物中的酵母包括已经在微生物保藏机构(例如IFO、ATCC等)保藏且属于下述属的酵母：芽孢酵母属（Aciculoconidium）、神食酵母属（Ambrosiozyma）、节束酵母属（Arthroascus）、阿斯霉属（Arxiozyma）、阿叔囊霉属（Ashbya）、Babjevia、本森顿酵母属（Bensingtonia）、葡状子囊菌属（Botryoascus）、Botryozyma、酒香酵母属（Brettanomyces）、布勒掷孢酵母属（Bullera）、布勒担孢酵母属（Bulleromyces）、假丝酵母属（Candida）、固囊酵母属（Citeromyces）、棒孢酵母属（Clavispora）、隐球菌属（Cryptococcus）、Cystofilobasidium、德巴利酵母属（Debaryomyces）、德克酵母属（Dekkara）、拟双足囊菌属（Dipodascopsis）、双足囊菌属（Dipodascus）、Eeniella、Endomycopsella、Eremascus、假囊酵母属（Eremothecium）、担孢酵母属（Erythrobasidium）、Fellomyces、Filobasidium、Galactomyces、地丝菌属（Geotrichum）、季氏酵母属（Guilliermondella）、有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）、汉逊酵母属（Hansenula）、Hasegawaea、Holtermannia、Hormoascus、生丝毕赤酵母属（Hyphopichia）、伊萨酵母属（Issatchenkia）、克勒克酵母属（Kloeckera）、有孢克勒克酵母属（Kloeckeraspora）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、Kondoa、Kuraishia、克氏担孢酵母属（Kurtzmanomyces）、白冬孢酵母属（Leucosporidium）、油脂酵母属（Lipomyces）、娄德酵母属（Lodderomyces）、马拉色霉菌属（Malassezia）、梅奇酵母属（Metschnikowia）、木拉克酵母属（Mrakia）、Myxozyma、拿逊酵母属（Nadsonia）、Nakazawaea、针孢酵母属（Nematospora）、Ogataea、卵孢酵母属（Oosporidium）、管囊酵母属（Pachysolen）、Phachytichospora、法夫酵母属（Phaffia）、毕赤酵母属（Pichia）、红冬孢酵母属（Rhodosporidium）、红酵母属（Rhodotorula）、酵母属（Saccharomyces）、类酵母属（Saccharomycodes）、覆膜孢酵母属（Saccharomycopsis）、齐藤酵母属（Saitoella）、Sakaguchia、Saturnospora、裂芽酵母属（Schizoblastosporion）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、许旺酵母属（Schwanniomyces）、锁掷酵母属（Sporidiobolus）、掷孢酵母属（Sporobolomyces）、原孢酵母属（Sporopachydermia）、冠孢酵母属（Stephanoascus）、梗孢酵母属（Sterigmatomyces）、Sterigmatosporidium、Symbiotaphrina、合轴酵母属（Sympodiomyces）、Sympodiomycopsis、有孢圆酵母属（Torulaspora）、丝孢酵母属（Trichosporiella）、毛孢子菌属（Trichosporon）、三角酵母属（Trigonopsis）、Tsuchiyaea、Udeniomyces、Waltomyces、威克酵母属（Wickerhamia）、拟威克酵母属（Wickerhamiella）、拟威尔酵母属（Williopsis）、Yamadazyma、子囊菌酵母属（Yarrowia）、接合囊酵母属（Zygoascus）、接合酵母属（Zygosaccharomyces）、Zygowilliopsis和配合酵母属（Zygozyma）以及其它。

在特定实施方案中，在本文提供的方法和组合物中有用的酵母包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、布鲁塞尔德克酵母（Dekkerabruxellensis）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）（以前被称作乳酸酵母（Saccharomyces lactis））、马克斯克鲁维酵母（Kluveromycesmarxianus）、Arxula adeninivorans或多形汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）（现在被称作安格斯毕赤酵母（Pichia angusta））。在某些实施方案中，所述微生物是假丝酵母属的菌株，诸如解脂假丝酵母（Candidalipolytica）、季也蒙假丝酵母（Candida guilliermondii）、克鲁斯假丝酵母（Candida krusei）、伪热带假丝酵母（Candida pseudotropicalis）或实用假性酵母（Candida utilis）。

在一个特定实施方案中，所述细胞是酿酒酵母细胞。在某些实施方案中，所述酿酒酵母细胞的菌株选自：面包酵母、CBS7959、CBS7960、CBS7961、CBS7962、CBS7963、CBS7964、IZ-1904、TA、BG-1、CR-1、SA-1、M-26、Y-904、PE-2、PE-5、VR-1、BR-1、BR-2、ME-2、VR-2、MA-3、MA-4、CAT-1、CB-1、NR-1、BT-1和AL-1。在某些实施方案中，所述酿酒酵母的菌株选自PE-2、CAT-1、VR-1、BG-1、CR-1和SA-1。在一个特定实施方案中，所述酿酒酵母的菌株是PE-2。在另一个特定实施方案中，酿酒酵母菌株是CAT-1。在另一个特定实施方案中，酿酒酵母菌株是BG-1。

在某些实施方案中，所述细胞是单倍体微生物细胞。在其它实施方案中，所述细胞是二倍体微生物细胞。在某些实施方案中，所述细胞是杂合的。在其它实施方案中，所述细胞除了它的交配型等位基因以外是纯合的(即，如果细胞将生成孢子，得到的4个单倍体微生物细胞除了它们的交配型等位基因以外在遗传上是相同的，所述交配型等位基因在2个单倍体细胞中是交配型a，且在其它2个单倍体细胞中是交配型α)。

在某些实施方案中，所述细胞是适合工业发酵（例如，生物乙醇发酵）的细胞。在特定实施方案中，所述细胞会在下述条件下存活：高溶剂浓度、高温、扩大的底物利用、营养物限制、适当的渗透胁迫、酸度、亚硫酸盐和细菌污染或它们的组合，所述条件被视作工业发酵环境的胁迫条件。

下面提供了示例性的生产HACD化合物的细胞（例如，重组地生产类异戊二烯、聚酮化合物和脂肪酸的细胞），和用于制备这样的细胞的方法。

6.4类异戊二烯的生产

在某些实施方案中，所述HACD化合物是类异戊二烯。类异戊二烯源自IPP，所述IPP在酵母中由MEV途径酶生物合成(图6)。经由MEV途径产生的IPP可以转化成它的异构体DMAPP，缩合，并通过各种其它酶的作用进行修饰，以形成简单的和更复杂的HACD类异戊二烯化合物(图7)。

在某些实施方案中，本文中公开的遗传修饰的微生物包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶选自：MEV途径酶、IPP异构酶、聚异戊二烯基合酶、和可以修饰聚异戊二烯基以形成半萜、单萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜、多萜、类固醇化合物、类胡萝卜素或经修饰的HACD化合物的酶。

在某些实施方案中，所述类异戊二烯生产细胞包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以缩合2个乙酰辅酶A分子以形成乙酰乙酰辅酶A，例如，乙酰辅酶A硫解酶。编码这样的酶的核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(NC_000913区域：2324131.2325315；大肠杆菌)、(D49362；脱氮副球菌)和(L20428；酿酒酵母)。

在某些实施方案中，所述类异戊二烯生产细胞包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将乙酰乙酰辅酶A与另一个乙酰辅酶A分子缩合以形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)，例如，HMG-CoA合酶。编码这样的酶的核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(NC_001145.补体19061.20536；酿酒酵母)、(X96617；酿酒酵母)、(X83882；拟南芥)、(AB037907；浅灰北里孢菌)、(BT007302；智人)和(NC_002758，基因座标签SAV2546，GeneID1122571；金黄色葡萄球菌)。

在某些实施方案中，所述类异戊二烯生产细胞包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将HMG-CoA转化成甲羟戊酸，例如，HMG-CoA还原酶。编码这样的酶的核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(NM_206548；黑腹果蝇)、(NC_002758，基因座标签SAV2545,GeneID1122570；金黄色葡萄球菌)、(NM_204485；原鸡)、(AB015627；链霉菌属KO3988)、(AF542543；渐尖烟草)、(AB037907；浅灰北里孢菌)、(AX128213，提供编码截短的HMGR的序列；酿酒酵母)和(NC_001145：补体(115734.118898；酿酒酵母)。

在某些实施方案中，所述类异戊二烯生产细胞包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将甲羟戊酸转化成5-磷酸甲羟戊酸，例如，甲羟戊酸激酶。编码这样的酶的核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(L77688；拟南芥)和(X55875；酿酒酵母)。

在某些实施方案中，所述类异戊二烯生产细胞包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸，例如，磷酸甲羟戊酸激酶。编码这样的酶的核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(AF429385；巴西橡胶树)、(NM_006556；智人)和(NC_001145.补体712315.713670；酿酒酵母)。

在某些实施方案中，所述类异戊二烯生产细胞包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成IPP，例如，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶。编码这样的酶的核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(X97557；酿酒酵母)、(AF290095；屎肠球菌)和(U49260；智人)。

在某些实施方案中，所述类异戊二烯生产细胞包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将经由MEV途径产生的IPP转化成DMAPP，例如，IPP异构酶。编码这样的酶的核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(NC_000913,3031087..3031635；大肠杆菌)和(AF082326；雨生红球藻)。

在某些实施方案中，所述类异戊二烯生产细胞进一步包含编码聚异戊二烯基合酶的异源核苷酸序列，所述聚异戊二烯基合酶可以缩合IPP和/或DMAPP分子以形成含有超过5个碳的聚异戊二烯基化合物。

在某些实施方案中，所述类异戊二烯生产细胞包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将1个IPP分子与1个DMAPP分子缩合以形成1个香叶基焦磷酸(“GPP”)分子，例如，GPP合酶。编码这样的酶的核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(AF513111；北美冷杉)、(AF513112；北美冷杉)、(AF513113；北美冷杉)、(AY534686；金鱼草)、(AY534687；金鱼草)、(Y17376；拟南芥)、(AE016877，基因座AP11092；蜡状芽孢杆菌;ATCC14579)、(AJ243739；甜橙)、(AY534745；伯惠绣衣)、(AY953508；美松齿小蠹)、(DQ286930；番茄)、(AF182828；胡椒薄荷)、(AF182827；胡椒薄荷)、(MPI249453；胡椒薄荷)、(PZE431697，基因座CAD24425;Paracoccus玉米黄素ifaciens)、(AY866498；库洛胡黄连)、(AY351862；葡萄)和(AF203881，基因座AAF12843；运动发酵单胞菌)。

在某些实施方案中，所述类异戊二烯生产细胞包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将2个IPP分子与1个DMAPP分子缩合，或将1个IPP分子添加至1个GPP分子，以形成1个法呢基焦磷酸(“FPP”)分子，例如，FPP合酶。编码这样的酶的核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(ATU80605；拟南芥)、(ATHFPS2R；拟南芥)、(AAU36376；黄花蒿)、(AF461050；欧洲牛)、(D00694；大肠杆菌K-12)、(AE009951，基因座AAL95523；具核梭杆菌具核亚种ATCC25586)、(GFFPPSGEN；藤仓赤霉菌)、(CP000009，基因座AAW60034；氧化葡糖杆菌621H)、(AF019892；向日葵)、(HUMFAPS；智人)、(KLPFPSQCR；乳酸克鲁维酵母)、(LAU15777；白羽扇豆)、(LAU20771；白羽扇豆)、(AF309508；小家鼠)、(NCFPPSGEN；粗糙链孢霉)、(PAFPS1；银胶菊)、(PAFPS2；银胶菊)、(RATFAPS；褐家鼠)、(YSCFPP；酿酒酵母)、(D89104；粟酒裂殖酵母)、(CP000003，基因座AAT87386；酿脓链球菌)、(CP000017，基因座AAZ51849；酿脓链球菌)、(NC_008022，基因座YP_598856；酿脓链球菌MGAS10270)、(NC_008023，基因座YP_600845；酿脓链球菌MGAS2096)、(NC_008024，基因座YP_602832；酿脓链球菌MGAS10750)、(MZEFPS；玉米)、(AE000657，基因座AAC06913；风产液菌VF5)、(NM_202836；拟南芥)、(D84432，基因座BAA12575；枯草芽孢杆菌)、(U12678，基因座AAC28894；大豆慢生根瘤菌USDA110)、(BACFDPS；嗜热脂肪土芽孢杆菌)、(NC_002940，基因座NP_873754；杜克雷嗜血杆菌35000HP)、(L42023，基因座AAC23087；流感嗜血杆菌Rd KW20)、(J05262；智人)、(YP_395294；清酒乳杆菌清酒亚种23K)、(NC_005823，基因座YP_000273；问号钩端螺旋体哥本哈根血清变型Fiocruz株L1-130)、(AB003187；藤黄微球菌)、(NC_002946，基因座YP_208768；淋病奈瑟球菌FA1090)、(U00090，基因座AAB91752；根瘤菌属NGR234)、(J05091；酿酒酵母)、(CP000031，基因座AAV93568；波氏硅杆菌DSS-3)、(AE008481，基因座AAK99890；肺炎链球菌R6)和(NC_004556，基因座NP779706；蒂梅丘拉苛养木杆菌1)。

在某些实施方案中，所述类异戊二烯生产细胞进一步包含a编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将IPP和DMAPP化合或者将IPP和FPP化合以形成香叶基香叶基焦磷酸(“GGPP”)。编码这样的酶的核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(ATHGERPYRS；拟南芥)、(BT005328；拟南芥)、(NM_119845；拟南芥)、(NZ_AAJM01000380，基因座ZP_00743052；苏云金芽孢杆菌以色列血清变型,ATCC35646sq1563)、(CRGGPPS；长春花)、(NZ_AABF02000074，基因座ZP_00144509；具核梭杆菌文氏亚种,ATCC49256)、(GFGGPPSGN；藤仓赤霉菌)、(AY371321；银杏树)、(AB055496；巴西橡胶树)、(AB017971；智人)、(MCI276129；葡萄牙卷枝毛霉)、(AB016044；小家鼠)、(AABX01000298，基因座NCU01427；粗糙链孢霉)、(NCU20940；粗糙链孢霉)、(NZ_AAKL01000008，基因座ZP_00943566；茄科青枯菌UW551)、(AB118238；褐家鼠)、(SCU31632；酿酒酵母)、(AB016095；细长聚球藻)、(SAGGPS；白芥)、(SSOGDS；嗜酸热硫化叶菌)、(NC_007759，基因座YP_461832；酸养互营菌SB)、(NC_006840，基因座YP_204095；费希尔弧菌ES114)、(NM_112315；拟南芥)、(ERWCRTE；成团泛菌)、(D90087，基因座BAA14124；菠萝泛菌)、(X52291，基因座CAA36538；荚膜红杆菌)、(AF195122，基因座AAF24294；球形红杆菌)和(NC_004350，基因座NP_721015；变异链球菌UA159)。

在某些实施方案中，本文中公开的遗传修饰的微生物进一步包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以修饰聚异戊二烯基以形成半萜、单萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜、多萜、类固醇化合物、类胡萝卜素或经修饰的HACD化合物。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码蒈烯合酶。合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(AF461460，区域43..1926；欧洲云杉)和(AF527416，区域：78..1871；狭叶鼠尾草)。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码香叶醇合酶。合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(AJ457070；细毛樟)、(AY362553；罗勒)、(DQ234300；紫苏品系1864)、(DQ234299；柠檬紫苏品系1861)、(DQ234298；柠檬紫苏品系4935)和(DQ088667；柠檬紫苏)。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码芳樟醇合酶。合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(AF497485；拟南芥)、(AC002294，基因座AAB71482；拟南芥)、(AY059757；拟南芥)、(NM_104793；拟南芥)、(AF154124；黄花蒿)、(AF067603；伯惠绣衣)、(AF067602；矮古代稀)、(AF067601；伯惠绣衣)、(U58314；伯惠绣衣)、(AY840091；番茄)、(DQ263741；薰衣草)、(AY083653；柠檬薄荷)、(AY693647；罗勒)、(XM_463918；水稻)、(AP004078，基因座BAD07605；水稻)、(XM_463918，基因座XP_463918；水稻)、(AY917193；柠檬紫苏)、(AF271259；紫苏)、(AY473623；欧洲云杉)、(DQ195274；西加云杉)和(AF444798；回回苏品种号79)。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码柠檬烯合酶。合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(+)-柠檬烯合酶(AF514287，区域：47.1867；柠檬)和(AY055214，区域：48.1889；藿香)和(-)-柠檬烯合酶(DQ195275，区域：1.1905；西加云杉)、(AF006193，区域：73.1986；北美冷杉)和(MHC4SLSP，区域：29.1828；留兰香)。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码香叶烯合酶。合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(U87908；北美冷杉)、(AY195609；金鱼草)、(AY195608；金鱼草)、(NM_127982；拟南芥TPS10)、(NM_113485；拟南芥ATTPS-CIN)、(NM_113483；拟南芥ATTPS-CIN)、(AF271259；紫苏)、(AY473626；欧洲云杉)、(AF369919；欧洲云杉)和(AJ304839；冬青栎)。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码罗勒烯合酶。合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(AY195607；金鱼草)、(AY195609；金鱼草)、(AY195608；金鱼草)、(AK221024；拟南芥)、(NM_113485；拟南芥ATTPS-CIN)、(NM_113483；拟南芥ATTPS-CIN)、(NM_117775；拟南芥ATTPS03)、(NM_001036574；拟南芥ATTPS03)、(NM_127982；拟南芥TPS10)、(AB110642；温州蜜柑CitMTSL4)和(AY575970；百脉根日本变种)。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码α-蒎烯合酶。合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(+)α-蒎烯合酶(AF543530，区域：1.1887；火炬松)、(-)α-蒎烯合酶(AF543527，区域：32.1921；火炬松)和(+)/(-)α-蒎烯合酶(AGU87909，区域：6111892；北美冷杉)。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码β-蒎烯合酶。合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(-)β-蒎烯合酶(AF276072，区域：1.1749；黄花蒿)和(AF514288，区域：26.1834；柠檬)。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码香桧烯合酶。合适核苷酸序列的一个示例性例子包括但不限于来自药鼠尾草的AF051901，区域：26.1798。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码γ-萜品烯合酶。合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(来自柠檬的AF514286，区域：30.1832)和(来自温州蜜柑的AB110640，区域1.1803)。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码萜品油烯合酶。合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(来自罗勒的AY693650)和(来自花旗松的AY906866，区域：10.1887)。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码紫穗槐二烯合酶。合适核苷酸序列的一个示例性例子是美国专利公开号2004/0005678的SEQ ID NO.37。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码α-金合欢烯合酶。合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：来自西洋梨品种安久梨(Pyrus communis cultivar d′Anjou)的DQ309034(梨；基因名AFS1)和来自苹果(Malus domestica)的AY182241(苹果；基因AFS1)。Pechouus等人,Planta219(1):84-94(2004)。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码β-金合欢烯合酶。合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：来自胡椒薄荷的GenBank登录号AF024615(薄荷；基因Tspa11)和来自黄花蒿的AY835398。Picaud等人,Phytochemistry66(9)：961-967(2005)。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码法尼醇合酶。合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：来自玉米的GenBank登录号AF529266和来自酿酒酵母的YDR481C(基因Pho8)。Song,L.,Applied Biochemistryand Biotechnology128:149-158(2006)。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码橙花叔醇合酶。合适核苷酸序列的一个示例性例子包括、但不限于来自玉米的AF529266(玉米；基因tps1)。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码广藿香醇合酶。合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：来自广藿香的AY508730区域：1.1659。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码努特卡酮合酶。合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：来自甜橙的AF441124区域：1.1647和来自紫苏的AY917195区域：1.1653。

在某些实施方案中，所述异源核苷酸编码松香二烯合酶。合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(U50768；北美冷杉)和(AY473621；欧洲云杉)。

在某些实施方案中，由所述细胞生产的类异戊二烯是C₅类异戊二烯。这些化合物源自一个异戊二烯单元，且也被称为半萜。半萜的一个示例性例子是异戊二烯。在其它实施方案中，所述类异戊二烯是C₁₀类异戊二烯。这些化合物源自2个异戊二烯单元，且也被称为单萜。单萜的示例性例子是柠檬烯、香茅醇、香叶醇、薄荷醇、紫苏子醇、芳樟醇、侧柏酮和香叶烯。在其它实施方案中，所述类异戊二烯是C₁₅类异戊二烯。这些化合物源自3个异戊二烯单元，且也被称为倍半萜。倍半萜的示例性例子是蜚蠊酮B、银杏内酯B、紫穗槐二烯、青蒿素、青蒿酸、瓦伦烯、努特卡酮、表-雪松醇、表-马兜铃烯、法尼醇、棉酚、蛔蒿素、蜚蠊酮、福司柯林和广藿香醇(其也被称作绿叶醇)。在其它实施方案中，所述类异戊二烯是C₂₀类异戊二烯。这些化合物源自4个异戊二烯单元，且也被称为二萜。二萜的示例性例子是蓖麻烯、软珊瑚醇、紫杉醇、prostratin、伪蕨素和紫杉二烯。在其它例子中，所述类异戊二烯是C₂₀₊类异戊二烯。这些化合物源自超过4个异戊二烯单元，且包括：三萜(源自6个异戊二烯单元的C₃₀类异戊二烯化合物)诸如arbruside E、鸦胆丁、睾酮、黄体酮、可的松、洋地黄毒苷和角鲨烯；四萜(源自8个类异戊二烯的C₄₀类异戊二烯化合物)诸如β-胡萝卜素；和多萜(源自超过8个异戊二烯单元的C₄₀₊类异戊二烯化合物)诸如聚异戊二烯。在某些实施方案中，所述类异戊二烯选自：松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、α-金合欢烯、β-金合欢烯、法尼醇、香叶醇、香叶基香叶醇、异戊二烯、芳樟醇、柠檬烯、香叶烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β-蒎烯、香桧烯、γ-萜品烯、萜品油烯和瓦伦烯。类异戊二烯化合物也包括、但不限于：类胡萝卜素(诸如番茄红素、α-和β-胡萝卜素、α-和β-隐黄质、胭脂树橙、玉米黄素、虾青素和叶黄素)、类固醇化合物以及由被其它化学基团修饰的类异戊二烯组成的化合物，诸如混合的萜烯-生物碱和辅酶Q-10。

6.5聚酮化合物的生产

在某些实施方案中，所述乙酰基-衍生的化合物是聚酮化合物。聚酮化合物通过被称作聚酮化合物合酶(PKS)的酶活性集合所催化的连续反应合成，所述聚酮化合物合酶是含有活性部位的配位基团的大型多酶蛋白复合物。聚酮化合物生物合成从简单的2-、3-、4-碳结构单元（诸如乙酰辅酶A、丙酰辅酶A、丁酰辅酶A）和它们的活化的衍生物（丙二酰基-、甲基丙二酰基-和乙基丙二酰基-辅酶A）逐步进行，主要是通过丙二酰辅酶A-衍生的单元的脱羧缩合（经由Claisen缩合反应）。所述PKS基因在细菌中通常组构成一个操纵子，在真核生物中通常组构成基因簇。已经表征了3类聚酮化合物合酶：I型聚酮化合物合酶是较大的、高度模块化的蛋白，细分为2类：1)重复的PKS，其以循环方式重复使用结构域，和2)模块化的PKS，其含有一连串的单独模块，且不重复结构域。II型聚酮化合物合酶是单功能蛋白的聚集体，且III型聚酮化合物合酶不使用酰基载体蛋白结构域。

不同于脂肪酸生物合成（其中每个连续的链延长步骤继之以如下所述的酮还原、脱水和烯酰基固定顺序）聚酮化合物生物合成的各个链延长中间体发生全部、一些或没有官能团修饰，从而产生大量化学上不同的产物。额外的复杂性程度源自不同的起始单元和链延长单元的应用以及新立体异构体的产生。

由聚酮化合物合酶指导的完整聚酮化合物合成的次序如下(以N-端至C-端的次序)：将最初的碳结构单元启动或加载在酰基载体蛋白、催化增长中的大环内酯链的延伸的延长模块、和催化合成的大环内酯的释放的终止模块上。在该生物合成中有活性的组分结构域或单独的酶功能性包括：用于加载起始酰基单元、延长酰基单元和中间酰基单元的酰基转移酶；保持增长中的大环内酯作为硫醇酯的酰基载体蛋白；催化链延伸的β-酮-酰基合酶；负责首先还原为醇官能团的β-酮还原酶；消除水以产生不饱和硫羟酸酯的脱水酶；催化最终还原为完全饱和的烯酰还原酶；和催化大环内酯释放和环化的硫羟酸酯酶。

在某些实施方案中，本文中公开的遗传修饰的微生物包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A中的至少一种与酰基载体蛋白缩合，例如酰基转移酶。

在某些实施方案中，本文中公开的遗传修饰的微生物包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将选自乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的第一反应物与选自丙二酰辅酶A或甲基丙二酰辅酶A的第二反应物缩合以形成聚酮化合物产物，例如β-酮-酰基合酶。

在某些实施方案中，本文中公开的遗传修饰的微生物包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将聚酮化合物上的β-酮化学基团还原为β-羟基，例如β-酮还原酶。

在某些实施方案中，本文中公开的遗传修饰的微生物包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将聚酮化合物中的烷烃化学基团脱水，以产生α-β-不饱和烯烃，例如脱水酶。

在某些实施方案中，本文中公开的遗传修饰的微生物包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将聚酮化合物中的α-β-双键还原为饱和烷烃，例如烯酰还原酶。

在某些实施方案中，本文中公开的遗传修饰的微生物包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以从酰基载体蛋白水解聚酮化合物，例如硫酯酶。

在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞包含一个或多个编码酶的异源核苷酸序列，所述酶包含KS催化区域。在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞包含一个或多个编码酶的异源核苷酸序列，所述酶包含AT催化区域。在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞包含超过一个编码酶的异源核苷酸序列，所述酶包含AT催化区域。在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞包含一个或多个编码酶的异源核苷酸序列，所述酶包含CLF催化区域。在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞包含一个或多个编码酶的异源核苷酸序列，所述酶包含ACP活性。在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞包含超过一个编码酶的异源核苷酸序列，所述酶包含ACP活性。

在一个特定实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞包含最小芳族PKS系统，例如，分别编码下述酶的异源核苷酸序列：包含KS催化区域的酶，包含AT催化区域的酶，包含CLF催化区域的酶，和包含ACP活性的酶。在一个特定实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞包含最小模块PKS系统，例如，分别编码下述酶的异源核苷酸序列：包含KS催化区域的酶，包含AT催化区域的酶，和包含ACP活性的酶。在另一个特定实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞包含用于从头合成聚酮化合物的模块芳族PKS系统，例如，分别编码下述酶的异源核苷酸序列：包含KS催化区域的酶，一种或多种包含AT催化区域的酶，和一种或多种包含ACP活性的酶。

在某些实施方案中，所述包含最小PKS系统（例如，最小芳族PKS系统或最小模块PKS系统）的聚酮化合物生产细胞进一步包含额外的催化活性，所述催化活性可以促进最终产物聚酮化合物的生产。在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞包含一个或多个编码酶的异源核苷酸序列，所述酶包含会促进新生的聚酮化合物主链的环化的环化酶(CYC)催化区域。在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞包含一个或多个编码酶的异源核苷酸序列，所述酶包含酮还原酶(KR)催化区域。在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞包含一个或多个编码酶的异源核苷酸序列，所述酶包含芳香酶(ARO)催化区域。在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞包含一个或多个编码酶的异源核苷酸序列，所述酶包含烯酰还原酶(ER)催化区域。在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞包含一个或多个编码酶的异源核苷酸序列，所述酶包含硫酯酶(TE)催化区域。在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞进一步包含一个或多个编码酶的异源核苷酸序列，所述酶包含会实现ACP的泛酰巯基乙胺化的完全ACP合酶活性。

在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞进一步包含一个或多个赋予合成后聚酮化合物修饰活性的异源核苷酸序列。在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞进一步包含一个或多个编码酶的异源核苷酸序列，所述酶包含会实现聚酮化合物的合成后修饰的糖基化酶活性，例如，在期望具有抗生素活性的聚酮化合物时。在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞进一步包含一个或多个编码酶的异源核苷酸序列，所述酶包含羟化酶活性。在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞进一步包含一个或多个编码酶的异源核苷酸序列，所述酶包含环氧化酶活性。在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞进一步包含一个或多个编码酶的异源核苷酸序列，所述酶包含甲基酶活性。

在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞进一步包含一个或多个编码生物合成酶的异源核苷酸序列，所述生物合成酶包括、但不限于，至少一种聚酮化合物合成途径酶，和可以修饰乙酰辅酶A化合物以形成聚酮化合物产物（诸如大环内酯、抗生素、抗真菌剂、细胞生长抑制性的化合物、抗胆甾醇血化合物、抗寄生虫化合物、球虫生长抑制性的化合物、动物生长促进剂或杀昆虫剂）的酶。在某些实施方案中，所述HACD化合物是多烯。在某些实施方案中，所述HACD化合物是环状内酯。在某些实施方案中，所述HACD化合物包含14、15或16-元内酯环。在某些实施方案中，所述HACD化合物是选自下述的聚酮化合物：聚酮化合物大环内酯、抗生素、抗真菌剂、细胞生长抑制剂、抗胆甾醇血药、抗寄生虫药、球虫生长抑制剂、动物生长促进剂和杀昆虫剂。

在某些实施方案中，所述聚酮化合物生产细胞包含能够生产聚酮化合物的异源核苷酸序列（例如编码PKS酶和聚酮化合物修饰酶的序列），所述聚酮化合物选自、但不限于下述聚酮化合物：阿维菌素(参见，例如，美国专利号5,252,474；美国专利号4,703,009;EP公开号118,367;MacNeil等人,1993,“Industrial Microorganisms:Basic and Applied MolecularGenetics”;Baltz,Hegeman,&Skatrud,编(ASM),第245-256页,“AComparison of the Genes Encoding the Polyketide Synthases forAvermectin,Erythromycin,and Nemadectin”;MacNeil等人,1992,Gene115:119-125；和Ikeda和Omura,1997,Chem.Res.97:2599-2609)；克念菌素(FR008)(参见，例如，Hu等人,1994,Mol.Microbiol.14:163-172)；卡波霉素、居拉霉素(参见，例如，Bergh等人,Biotechnol Appl Biochem.1992年2月;15(1):80-9)；柔红霉素(参见，例如，J Bacteriol.1994年10月;176(20):6270-80)；埃博霉素(参见，例如，PCT公开号99/66028；和PCT公开号00/031247)；红霉素(参见，例如，PCT公开号93/13663；美国专利号6,004,787；美国专利号5,824,513;Donadio等人,1991,Science252:675-9；和Cortes等人,1990年11月8日,Nature348:176-8)；FK-506(参见，例如，Motamedi等人,1998;Eur.J Biochem.256:528-534；和Motamedi等人,1997,Eur.J Biochem.244:74-80)；FK-520(参见，例如，PCT公开号00/020601；和Nielsen等人,1991,Biochem.30:5789-96)；灰色菌素(参见，例如，Yu等人,J Bacteriol.1994年5月；176(9):2627-34)；洛伐他汀(参见，例如，美国专利号5,744,350)；富伦菌素(参见，例如，Khosla等人,Bacteriol.1993年4月;175(8):2197-204；和Bibb等人,Gene1994年5月3;142(1):31-9)；榴菌素(参见，例如，Sherman等人,EMBO J.1989年9月;8(9):2717-25；和Bechtold等人,Mol Gen Genet.1995年9月20日;248(5):610-20)；曼得尔霉素(参见，例如，Ichinose等人,Microbiology2003年7月；149(Pt7):1633-45)；莫能星(参见，例如，Arrowsmith等人,Mol Gen Genet.1992年8月；234(2):254-64)；无活菌素(参见，例如，FEMS Microbiol Lett.2000年2月1日;183(1):171-5)；七尾霉素(参见，例如，Kitao等人,J Antibiot(Tokyo)。1980年7月；33(7):711-6)；奈马克丁(参见，例如，MacNeil等人,1993,出处同上)；尼达霉素(参见，例如，PCT公开号98/51695；和Kakavas等人,1997,J.Bacteriol.179:7515-7522)；竹桃霉素(参见例如，Swan等人,1994,Mol.Gen.Genet.242:358-362;PCT公开号00/026349;Olano等人,1998,Mol.Gen.Genet.259(3)：299-308；和PCT专利申请公开号WO99/05283)；土霉素(参见，例如，Kim等人,Gene.1994年4月8日;141(1):141-2)；苦味霉素(参见，例如，PCT公开号99/61599;PCT公开号00/00620;Xue等人,1998,Chemistry&Biology5(11)：661-667;Xue等人,1998年10月,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:1211112116)；Platenolide(参见，例如，EP公开号791,656；和美国专利号5,945,320)；雷帕霉素(参见，例如，Schwecke等人,1995年8月,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7839-7843；和Aparicio等人,1996,Gene169:9-16)；利福霉素(参见，例如，PCT公开号WO98/07868；和August等人,1998年2月13日,Chemistry&Biology,5(2)：69-79)；Sorangium(参见，例如，美国专利号6,090,601)；Soraphen(参见，例如，美国专利号5,716,849;Schupp等人,1995,J.Bacteriology177:3673-3679)；Spinocyn(参见，例如，PCT公开号99/46387)；螺旋霉素(参见，例如，美国专利号5,098,837)；特曲霉素(参见，例如，Summers等人,J Bacteriol.1992年3月;174(6):1810-20；和Shen等人,JBacteriol.1992年6月;174(11):3818-21)；四环素(参见，例如，J Am ChemSoc.2009年12月9日;131(48):17677-89)；泰洛星(参见，例如，美国专利号5,876,991；美国专利号5,672,497；美国专利号5,149,638;EP公开号791,655;EP公开号238,323;Kuhstoss等人,1996,Gene183:231-6；和Merson-Davies和Cundliffe,1994,Mol.Microbiol.13:349-355)；和6-甲基水杨酸(参见，例如，Richardson等人,Metab Eng.1999年4月;1(2):180-7；和Shao等人,Biochem Biophys Res Commun.2006年6月23日;345(1):133-9)。

6.6脂肪酸的生产

在某些实施方案中，所述HACD化合物是脂肪酸。脂肪酸由被脂肪酸合酶催化的一系列脱羧Claisen缩合反应从乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成。类似于聚酮化合物合酶，脂肪酸合酶不是单个酶，而是由272kDa多功能多肽组成的酶系统，其中底物从一个功能结构域传递至下一个功能结构域。已经表征了2大类脂肪酸合酶：I型脂肪酸合酶是哺乳动物和真菌(尽管真菌和哺乳动物合酶的结构排列不同)和CMN群细菌(棒杆菌属、分枝杆菌属和诺卡氏菌属)共有的单个多功能多肽。在古细菌属和真细菌属中发现的II型合酶是参与脂肪酸合成的一系列分散的单功能酶。脂肪酸延长和还原的机制在所述2类合酶中是相同的，因为负责这些催化事件的酶结构域在所述2类中是在很大程度上同源的。

在脱羧Claisen缩合反应中的每个脂肪酸链延长循环以后，通过酮还原酶、脱水酶和烯醇还原酶的连续作用，将β-酮基还原为完全饱和的碳链。增长中的脂肪酸链在这些附着于酰基载体蛋白的活性部位之间移动，且最终在达到16的碳链长度(棕榈酸)以后通过硫酯酶的作用而释放。

在某些实施方案中，本文中公开的遗传修饰的微生物包含编码生物合成酶的异源核苷酸序列，所述生物合成酶包括、但不限于，至少一种脂肪酸合成途径酶、和可以修饰乙酰辅酶A化合物以形成脂肪酸产物（诸如棕榈酸盐、棕榈酰辅酶A、棕榈油酸、十六碳烯酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸）的酶。在某些实施方案中，所述HACD化合物是选自下述的脂肪酸：棕榈酸盐、棕榈酰辅酶A、棕榈油酸、十六碳烯酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸。

在某些实施方案中，本文中公开的遗传修饰的微生物包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A中的至少一种与酰基载体蛋白共价地连接，例如酰基转移酶。

在某些实施方案中，本文中公开的遗传修饰的微生物包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以缩合各自与酰基载体蛋白(ACP)结合的乙酰基化学部分和丙二酰基化学部分以形成乙酰乙酰基-ACP，例如β-酮酰基-ACP合酶。

在某些实施方案中，本文中公开的遗传修饰的微生物包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以用NADPH还原乙酰乙酰基-ACP中的双键以形成D-3-羟基丁酰基羟化酶-ACP中的羟基，例如β-酮酰基-ACP还原酶。

在某些实施方案中，本文中公开的遗传修饰的微生物包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将D-3-羟基丁酰基羟化酶-ACP脱水以产生β-和γ-碳之间的双键从而形成巴豆酰基-ACP，例如β-羟基酰基-ACP脱水酶。

在某些实施方案中，本文中公开的遗传修饰的微生物包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以用NADPH还原巴豆酰基ACP以形成丁酰基-ACP，例如烯酰ACP还原酶。

在某些实施方案中，本文中公开的遗传修饰的微生物包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以从酰基载体蛋白水解C16酰基化合物以形成棕榈酸盐，例如硫酯酶。

在某些实施方案中，所述脂肪酸生产细胞包含一个或多个编码乙酰辅酶A合酶和/或丙二酰辅酶A合酶的异源核苷酸序列，以实现与遗传上未修饰的母代细胞相比增加的一种或多种脂肪酸生产。

例如，为了增加乙酰辅酶A生产，可以在细胞中表达下述基因中的一个或多个：pdh、panK、aceEF(编码丙酮酸和2-氧代戊二酸脱氢酶复合物的EIp脱氢酶组分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组分)、fabH、fabD、fabG、acpP和fabF。编码这样的酶的核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：pdh(BAB34380、AAC73227、AAC73226)、panK(也被称作coaA、AAC76952)、aceEF(AAC73227、AAC73226)、fabH(AAC74175)、fabD(AAC74176)、fabG(AAC74177)、acpP(AAC74178)、fabF(AAC74179)。

在某些实施方案中，通过减弱或敲除编码在脂肪酸降解中涉及的蛋白的基因，可以在细胞中实现增加的脂肪酸水平。例如，使用本领域已知的技术，可以在经工程改造的宿主细胞中减弱或敲除fadE、gpsA、idhA、pflb、adhE、pta、poxB、ackA和/或ackB的表达水平。编码这样的蛋白的核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：fadE(AAC73325)、gspA(AAC76632)、IdhA(AAC74462)、pflb(AAC73989)、adhE(AAC74323)、pta(AAC75357)、poxB(AAC73958)、ackA(AAC75356)和ackB(BAB81430)。当在适当的环境中培养时，得到的宿主细胞将具有增加的乙酰辅酶A生产水平。

在某些实施方案中，所述脂肪酸生产细胞包含编码酶的异源核苷酸序列，所述酶可以将乙酰辅酶A转化成丙二酰辅酶A，例如，多亚基AccABCD蛋白。编码AccABCD的合适核苷酸序列的一个示例性例子包括但不限于登录号AAC73296、EC6.4.1.2。

在某些实施方案中，所述脂肪酸生产细胞包含编码脂肪酶的异源核苷酸序列。编码脂肪酶的合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：登录号CAA89087和CAA98876。

在某些实施方案中，通过抑制PlsB，可以在细胞中实现增加的脂肪酸水平，所述PlsB可以导致增加的长链酰基-ACP水平，所述长链酰基-ACP会抑制脂肪酸生物合成途径中的早期步骤(例如，accABCD、fabH和fabl)。使用本领域已知的技术，可以在经工程改造的宿主细胞中减弱或敲除PlsB的表达水平。编码PlsB的合适核苷酸序列的一个示例性例子包括但不限于登录号AAC77011。在特定实施方案中，可以使用plsB D31IE突变来增加细胞中可利用的酰辅酶A的量。

在某些实施方案中，通过过表达sfa基因，可以在细胞中实现增加的单不饱和脂肪酸生产，所述sfa基因会导致fabA的抑制。编码sfa的合适核苷酸序列的一个示例性例子包括但不限于登录号AAN79592。

在某些实施方案中，通过调控控制脂肪酸底物的链长度的酶（例如，硫酯酶）的表达，可以在细胞中实现增加的脂肪酸水平。在某些实施方案中，所述脂肪酸生产细胞已经被修饰为过表达tes或fat基因。合适的tes核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：登录号(tesA：来自大肠杆菌的AAC73596，其能够生产C_18:1脂肪酸)和(tesB：来自大肠杆菌的AAC73555)。合适的fat核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：(fatB：来自加利福尼亚桂树的Q41635和AAA34215，其能够生产C_12:0脂肪酸)、(fatB2：来自萼距花的Q39513和AAC49269，其能够生产C_8:0-C_10:0脂肪酸)、(fatB3：来自萼距花的AAC49269和AAC72881，其能够生产C_14:0-C_16:0脂肪酸)、(fatB：来自樟树的Q39473和AAC49151，其能够生产C_14:0脂肪酸)、(fatB[M141T]：来自m拟南芥的CAA85388，其能够生产C_16:1脂肪酸)、(fatA：来自拟南芥的NP189147和NP193041，其能够生产C_18:1脂肪酸)、(fatA：来自大豆慢生根瘤菌的CAC39106，其能够优先生产C_18:1脂肪酸)、(fatA：来自萼距花的AAC72883，其能够生产C_18:1脂肪酸)和(fatA1，来自向日葵的AAL79361)。

在某些实施方案中，通过使用本领域已知的技术减弱硫酯酶C₁₈的表达或活性，可以在细胞中实现增加的C₁₀脂肪酸水平。编码硫酯酶C₁₈的合适核苷酸序列的示例性例子包括、但不限于：登录号AAC73596和P0ADA1。在其它实施方案中，通过使用本领域已知的技术增加硫酯酶C₁₀的表达或活性，可以在细胞中实现增加的C₁₀脂肪酸水平。编码硫酯酶C₁₀的合适核苷酸序列的一个示例性例子包括、但不限于登录号Q39513。

在某些实施方案中，通过使用本领域已知的技术减弱生产非-C₁₄脂肪酸的内源硫酯酶的表达或活性，可以在细胞中实现增加的C₁₄脂肪酸水平。在其它实施方案中，通过使用本领域已知的技术增加利用底物C₁₄-ACP的硫酯酶的表达或活性，可以在细胞中实现增加的C₁₄脂肪酸水平。编码这样的硫酯酶的合适核苷酸序列的一个示例性例子包括、但不限于登录号Q39473。

在某些实施方案中，通过使用本领域已知的技术减弱生产非-C₁₂脂肪酸的内源硫酯酶的表达或活性，可以在细胞中实现增加的C₁₂脂肪酸水平。在其它实施方案中，通过使用本领域已知的技术增加利用底物C₁₂-ACP的硫酯酶的表达或活性，可以在细胞中实现增加的C₁₂脂肪酸水平。编码这样的硫酯酶的合适核苷酸序列的一个示例性例子包括、但不限于登录号Q41635。

6.7储存细胞的方法

在某些实施方案中，当在不含或含有少量泛酸盐化合物的培养基中储存时，所述能够生产HACD化合物的遗传修饰的宿主细胞更有活力和更健康。具体地，当在不含泛酸盐化合物的培养基或低泛酸盐浓度培养基中储存时，这样的细胞在接种进合适的生长培养基中以后会更好地生长，并在生产阶段中生产更多的HACD化合物。

因而，在另一个方面，本文提供了一种储存能够生产HACD化合物的遗传修饰的宿主细胞的方法，所述方法包括：制备组合物，所述组合物包含所述遗传修饰的宿主细胞和储存培养基，所述储存培养基包含可同化的碳、氮和磷酸盐源以及在0μmol/升至10μmol/升之间的泛酸盐化合物；和冷冻所述组合物。在一个具体实施方案中，所述储存培养基不含有可检测的泛酸盐化合物。在另一个具体实施方案中，所述储存培养基包含在下述范围内的量的甘油：1份甘油：3份培养基，至3份甘油：1份培养基。在另一个具体实施方案中，在-80℃冷冻所述储存培养基。

在另一个方面，本文提供了一种储存培养基，其含有可同化的碳、氮和磷酸盐源和在0μmol/升至10μmol/升之间的泛酸盐化合物。在一个具体实施方案中，所述储存培养基不含有可检测的泛酸盐化合物。在另一个具体实施方案中，所述储存培养基包含在下述范围内的量的甘油：1份甘油：3份培养基，至3份甘油：1份培养基。在另一个具体实施方案中，在-80℃冷冻所述储存培养基。在另一个具体实施方案中，所述储存培养基包含能够生产HACD化合物的遗传修饰的宿主细胞。

7.实施例

7.1实施例1

本实施例描述了一种用于确定酵母细胞培养物的细胞密度(OD₆₀₀)的示例性方法。

在干净的96-孔板中混合8μL细胞培养物样品和92μL Triton OD稀释剂(20g/L Triton X-114,200mL/L PEG200,200mL/L100%乙醇,余量水)，将溶液在1,000RPM搅拌6分钟，并通过在M5分光光度计(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)上在600nm测量吸光度，确定OD₆₀₀。

7.2实施例2

本实施例描述了一种示例性的基于尼罗红的方法，其可用于确定酵母细胞培养物的金合欢烯滴度。

将98μL细胞培养物样品转移进96-孔黑色聚苯乙烯平底测定板中，并将2μL以100μg/mL溶解在DMSO中的尼罗红(Invitrogen,Carlsbad,CA)加入每个孔中。立即以在500nm的激发和在550nm的发射，在M5分光光度计上测量荧光水平。

7.3实施例3

本实施例描述了一种示例性的基于气相色谱法(GC)的方法，其可用于确定酵母细胞培养物的金合欢烯滴度。

用甲醇-庚烷(1:1v/v)萃取样品，并将混合物离心以除去细胞物质。将甲醇-庚烷提取物的等分试样稀释进含有0.001%t-石竹烯(其充当在指定的GC保温箱曲线中用于监测成功注射和洗脱的保留时间标志物)的正庚烷中，然后使用脉冲分流注射注射到甲基硅酮固定相上。使用配有火焰离子化检测(FID)的GC，通过沸点来分离金合欢烯。

7.4实施例4

本实施例解释了泛酸盐化合物作为非遗传开关用于增强第一种子培养物中的生物质建立、随后增强发酵方法的生产阶段中的HACD化合物生产的用途。

a)种子培养物的制备

制备含有2%蔗糖BSM(生物质建立培养基)和0mg/L D-泛酸钙的种子培养基。用NaOH溶液，将种子培养基的pH调节至pH7.0。将所述培养基(250mL)灭菌，并接种1种子瓶的遗传修饰的宿主细胞，并在好氧条件下在34℃温育24-36小时。

b)主发酵方法

给具有2升容器大小的搅拌式发酵罐装入含有2%蔗糖和10mg/L D-泛酸钙的无菌生产细胞培养基。在好氧条件下在34℃进行发酵6天，以使HACD产物生产最大化。

7.5实施例5

本实施例证实，在被遗传工程改造成生产更高水平的示例性异源HACD次级代谢物的酵母细胞培养物中，通过减少外源性地提供的(R)-泛酸盐的量，可以增加生物质产量和降低异源次级代谢物的生产。

酵母菌株Y4689和Y4352各自包含异源酶，包括下述MEV途径的酶：IPP异构酶、FPP合酶和金合欢烯合酶。这些菌株能够分别以15%和13%的收率生产示例性的异源HACD次级代谢物(金合欢烯)。

从指数生长的培养物得到酵母菌株Y4689和Y4352的细胞，用水洗涤3次，然后再悬浮于包含0mg/L D-泛酸钙的2%蔗糖BSM中。将取自每份细胞混悬液的15μL加入生物质建立培养物中，所述生物质建立培养物由含有360μL2%蔗糖BSM的96-孔板的孔组成，所述蔗糖BSM包含10mg/L(100%)、1mg/L(10%)、0.2mg/L(2%)、0.1mg/L(1%)、0.02mg/L(0.2%)、0.01mg/L(0.1%)、0.001mg/L(0.01%)或0mg/L的D-泛酸盐。将所述生物质建立培养物在ATR振荡器中在1,000rpm、80%湿度、和34℃温育48小时，在此时，所述培养物已经达到它们的最大OD₆₀₀。然后将所述生物质建立培养物以1:25稀释进生产培养物中，所述生产培养物由含有与第一个96-孔板相同的培养基和板布局的第二个96-孔板的孔组成。将所述生产培养物在ATR振荡器中在1,000rpm、80%湿度、和34℃温育48小时，在此时，从每个孔取出样品，以测量最终的生物质(即，最终的细胞密度)和金合欢烯滴度，分别如上面的实施例1和2中所述。

图3A和3B表明，当降低生物质建立和生产培养物中的泛酸盐水平时，两种菌株的生产金合欢烯的能力大幅减弱，并且示例性HACD(金合欢烯)的生产的这种减少伴随着最终的细胞生物质的增加。这些结果证实，可以从所述培养基中限制或省略泛酸盐以有效地减少HACD化合物生产，且可以加入培养基中以诱导或增加HACD化合物生产。

7.6实施例6

本实施例表明，在没有外部供给的泛酸盐化合物存在下，能够生产商业量的HACD化合物的酵母菌株表现出意外的更好生长行为。相比而言，生产更小量的HACD化合物的野生型酵母和酵母菌株在有外部供给的泛酸盐化合物存在下表现出预期的比没有所述化合物时更好生长行为。

酵母菌株Y4720和Y5038各自包含异源酶，包括下述MEV途径的酶：IPP异构酶、FPP合酶和金合欢烯合酶。菌株Y4720能够以14%的收率生产金合欢烯，而菌株5038能够以6%生产小于一半的金合欢烯。菌株Y2205是不生产任何金合欢烯的CEN.PK2野生型对照。

在无菌PBS中，将Y4720、Y5038和Y2205的指数生长培养物稀释至1的OD₆₀₀，并将20μL每种稀释物转移至含有180μL无菌PBS/孔的96-孔板的第1列的孔中。使用多通道移液器，将20μL第1列转移至第2列，以此类推，从而产生遍布于平板的1:10系列稀释物。最后，使用灭菌的48-齿钉扎工具将培养物从96孔板压印在包含0.4mg/L或0.002mg/L D-泛酸钙的CSM琼脂平板上。将琼脂平板在30℃温育112小时，并监测菌落生长。

如图4所示，在有0.4mg/L D-泛酸钙存在下，Y4720的菌落小于其它2种菌株的菌落，但是在有0.002mg/L D-泛酸钙存在下却更大，这提示，与菌株Y5038和Y2205相比，菌株Y4720在包含更低(R)-泛酸盐浓度的琼脂上具有更高的生长速率。使用完全缺乏D-泛酸钙的琼脂平板，得到了类似的结果。

7.7实施例7

本实施例证实，省略(R)-泛酸盐会增加被遗传工程改造成生产更高水平的异源HACD次级代谢物的酵母细胞的生长速率，并降低被遗传工程改造成生产更低水平的异源次级代谢物的酵母细胞的生长速率。

将许多包含异源酶且能够生产一种示例性HACD化合物(金合欢烯)的酵母菌株的4个单个菌落接种在生物质建立培养物中，所述异源酶包括MEV途径酶：IPP异构酶、FPP合酶和金合欢烯合酶，所述生物质建立培养物由含有360μL2%蔗糖BSM的96-孔平板的孔组成，所述蔗糖BSM包含10mg/L或0mg/L D-泛酸钙。在ATR振荡器中在1,000rpm和80%湿度在34℃培养生物质建立培养物72小时，到此时刻，所述培养物已经达到它们的最大OD₆₀₀。然后将生物质建立培养物以1:25稀释进生产培养物中，所述生产培养物由含有360μL4%蔗糖BSM（包含10mg/L D-泛酸钙）的第二组96-孔板的孔组成。将所述生产培养物在ATR振荡器中在1,000rpm、80%湿度、和34℃温育48小时，在此时，从每个孔取出样品，以测量最终的生物质(最终的细胞密度)和金合欢烯滴度，分别如上面的实施例1和3中所述。

如图5所示，与较高的(R)-泛酸盐浓度相比，以大于12%的收率生产金合欢烯的菌株在较低的(R)-泛酸盐浓度具有更大的生物质产量。对于以小于12%的收率生产金合欢烯的菌株而言，则是相反。

7.8实施例8

本实施例证实了菌株退化现象，在发酵方法的建立和生产阶段中，当在培养基中存在泛酸盐且因而HACD化合物生产被“开启”时，发生该现象。

融化1ml瓶的冷冻的酵母菌株细胞混悬液，所述细胞包含异源酶且能够生产一种示例性HACD化合物(金合欢烯)，所述异源酶包括MEV途径酶：IPP异构酶、FPP合酶和金合欢烯合酶，将所述混悬液转移进带有挡板的250-ml烧瓶中，所述烧瓶装有50ml含有2%蔗糖和10mg/L D-泛酸钙的BSM2.0，并在振荡器中在34℃、200RPM培养24小时。然后将全部培养物转移进2.8L Fernbach烧瓶中，所述Fernbach烧瓶装有850ml含有2.0%蔗糖和10mg/L D-泛酸钙的BSM2.0，并在振荡器中在34℃、250RPM培养24小时。然后将全部培养物转移进2L发酵罐。给发酵罐补料的营养物是包含10mg/L D-泛酸钙的成分不确定的巴西甘蔗浆培养基，以相当于14g/L/h糖的最初脉冲进行递送。然后基于发酵罐对碳的需求（如溶解氧的升高所指示），自调节补料速率。在34℃的恒定温度、4.5的恒定pH(通过加入氢氧化钠进行控制)和200mmol O₂/L/h的最初氧传递速率，微好氧性地进行发酵，直到溶解氧达到0%，然后在发酵的其它部分降低至100mmol O₂/L/h。每3天，将罐的体积减小至约0.9L以防止溢流。在此时，补充在甘蔗浆补料中缺少的痕量金属和维生素。每天监测细胞生产的和总消耗的金合欢烯的量，并针对每个72小时时间段确定这2个值的比率(即，糖的产物收率)，并绘图如图6所示。在21天时，培养物的产物收率从第6天的峰值下降至低于该峰值的65%。

7.9实施例9

本实施例证实，在遗传工程改造成生产一种示例性HACD化合物的酵母细胞的生长和贮存期间，省略(R)-泛酸盐会增加酵母细胞的异源次级代谢物生产。

酵母菌株Y4954包含异源酶，包括下述MEV途径酶：IPP异构酶、FPP合酶和金合欢烯合酶。该酵母菌株能够以13.6%的收率生产金合欢烯。

如下制备2组种子管形瓶：将Y4954细胞的单个菌落的一半接种进装有15mL2%蔗糖BSM(种子瓶培养基)的125mL摇瓶中，所述蔗糖BSM包含10mg/L D-泛酸钙(种子瓶培养基,“+”)，并将另一半接种进装有15mL2%蔗糖BSM(种子瓶培养基)的125mL摇瓶中，所述蔗糖BSM包含0mg/L D-泛酸钙(种子瓶培养基,“-”)。在振荡器中在200rpm在30℃培养细胞，直到达到4-9之间的OD₆₀₀，并且直到残余蔗糖为约3-6g/L。将2份无菌的50%甘油溶液加入3份细胞液体培养基中，并将混悬液等分进种子管形瓶中，以大约-1℃/min的速率，将种子管形瓶缓慢地冷冻至-80℃。

如下完成生物质建立：将1种子瓶融化进装有50mL2%蔗糖BSM(生物质建立培养基)的250mL摇瓶中，所述蔗糖BSM包含10mg/L D-泛酸钙(生物质建立培养基,“+”)或0mg/L D-泛酸钙(生物质建立培养基,“-”)，并将培养物在34℃和200RPM培养24小时。然后将培养物转移至装有800mL相同培养基的1L烧瓶，并培养另外48小时。

为了生产示例性HACD化合物(金合欢烯)，将种子建立培养物转移至2L台式发酵罐，所述发酵罐装有包含10mg/L D-泛酸钙的生产培养基(生产培养基,“+”)，并按照使金合欢烯收率最大化的补料方案，将培养物温育6天。

如表1所示，当从种子瓶培养基省略(R)-泛酸盐时，Y4954细胞生产了更高的金合欢烯收率。当也从生物质建立培养基省略(R)-泛酸盐时，它们生产了甚至更高的金合欢烯收率。

表1还表明，在种子瓶和生物质建立培养基中省略(R)-泛酸盐不会不可逆地损害宿主细胞当被提供(R)-泛酸盐时在生产阶段中生产金合欢烯的能力。实际上，具有减少的(R)-泛酸盐或缺乏(R)-泛酸盐的种子培养基和生物质建立培养基的应用，以及随后在含有(R)-泛酸盐的生产培养基中的生产阶段培养，会导致最佳的异源HACD化合物生产。

在本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物或专利申请通过引用并入。本领域技术人员会明白本公开内容的不同改进和变化，而不脱离本公开内容的范围和精神。尽管为了理解清楚的目的已经通过举例说明和实施例非常详细地描述了本公开内容，但是本领域普通技术人员考虑到本文中提供的教导会容易地明白，可以对其做出某些变化和修改，而不脱离所附权利要求的精神或范围，并且所述权利要求不应当不适当地限于这样的具体实施方案。实际上，本领域技术人员理解的、用于实现本公开内容的所述模式的不同改进意图落入权利要求的范围内。

Claims (49)

1.一种在宿主细胞中生产异源乙酰辅酶A衍生出的(HACD)化合物的方法，所述方法包括：

(a)在包含碳源和限制性量的泛酸盐的培养基中培养能够生产HACD化合物的遗传修饰的宿主细胞群，其中所述限制性量的泛酸盐会限制所述宿主细胞的HACD化合物生产；随后

(b)在包含碳源和非限制性量的泛酸盐的培养基中培养所述群或其亚群，其中所述泛酸盐的非限制性量是大于所述泛酸盐的限制性量的量，其中所述群或其亚群在有所述非限制性量的泛酸盐存在下生产更大量的所述HACD化合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中通过进行泛酸盐滴定，确定所述泛酸盐的限制性量，其中在包含递增浓度的泛酸盐的生长培养基中培养所述宿主细胞，且在每种泛酸盐浓度确定HACD化合物生产，其中所述泛酸盐滴定包括：使泛酸盐的量饱和，由此使HACD化合物生产处于它的最大值；

其中所述泛酸盐的限制性量是使HACD化合物生产小于它的最大值时的任意泛酸盐浓度。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在步骤(a)期间的所述HACD化合物生产小于所述遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的50、40、30、20或10%。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中在步骤(b)期间的所述HACD化合物生产大于所述遗传修饰的宿主细胞的最大HACD化合物生产的50、60、70、80或90%。

5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中所述步骤(a)的培养持续至少12、24、36、48、60、72、84、96小时或超过96小时的时间段。

6.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中所述步骤(a)的培养持续的时间段足以使所述群达到0.01至400的细胞密度(OD₆₀₀)。

7.根据权利要求1-6中的任一项所述的方法，其中所述步骤(b)的培养持续3-20天的时间段。

8.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中所述限制性量的泛酸盐是0.2mg/L以下。

9.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中所述限制性量的泛酸盐是0mg/L。

10.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中所述非限制性量的泛酸盐是0.2mg/L以上。

11.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中所述非限制性量的泛酸盐至少是使HACD化合物生产处于它的最大值时的最小泛酸盐浓度。

12.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中所述泛酸盐的非限制性量是至少1mg/L。

13.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中所述泛酸盐的非限制性量是10mg/L。

14.根据权利要求1-13中的任一项所述的方法，其中步骤(b)包括：将泛酸盐加入包含所述限制性量的泛酸盐的培养基中，直到所述培养基包含非限制性量的泛酸盐。

15.根据权利要求1-13中的任一项所述的方法，其中步骤(b)包括：将步骤(a)的群转移至包含非限制性量的泛酸盐的新培养基。

16.根据权利要求1-15中的任一项所述的方法，其中与不包括在限制性量的泛酸盐中培养细胞的方法得到的生产相比，所述方法会导致所述遗传修饰的宿主细胞群的HACD化合物生产增加。

17.根据权利要求1-16中的任一项所述的方法，其中以收率(每克碳底物产生的HACD克数)或生产力(每升培养基每小时生产的HACD化合物克数)的方式，测量所述HACD化合物生产。

18.根据权利要求1-17中的任一项所述的方法，所述方法进一步包括：回收所述HACD化合物。

19.根据权利要求1-18中的任一项所述的方法，其中所述泛酸盐选自：2-脱氢泛解酸盐、(R)-泛解酸盐、(R)-泛酸盐和它们的任意盐或酯。

20.根据权利要求1-19中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞选自：真菌细胞、细菌细胞、植物细胞和动物细胞。

21.根据权利要求1-19中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。

22.根据权利要求1-21中的任一项所述的方法，其中所述HACD化合物选自：氨基酸、脂肪酸、类异戊二烯和聚酮化合物。

23.根据权利要求1-21中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞能够生产类异戊二烯，且包含至少一种编码类异戊二烯途径酶的异源核酸，所述类异戊二烯途径酶选自：

n)缩合2个乙酰辅酶A分子以形成乙酰乙酰辅酶A的酶；

o)缩合乙酰乙酰辅酶A与另一个乙酰辅酶A分子以形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)的酶；

p)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶；

q)将甲羟戊酸转化成5-磷酸甲羟戊酸的酶；

r)将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；

s)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成IPP的酶；

t)将IPP转化成DMAPP的酶；

u)聚异戊二烯基合酶，其能够缩合IPP和/或DMAPP分子以形成含有超过5个碳的聚异戊二烯基化合物；

v)将IPP与DMAPP缩合以形成GPP的酶；

w)将2个IPP分子与1个DMAPP分子缩合的酶；

x)将IPP与GPP缩合以形成FPP的酶；

y)将IPP和DMAPP缩合以形成GGPP的酶；和，

z)将IPP和FPP缩合以形成GGPP的酶。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述宿主细胞进一步包含编码修饰聚异戊二烯基的酶的异源核酸，所述酶选自：香叶醇合酶、芳樟醇合酶、柠檬烯合酶、香叶烯合酶、罗勒烯合酶、α-蒎烯合酶、β-蒎烯合酶、香桧烯合酶、γ-萜品烯合酶、萜品油烯合酶、紫穗槐二烯合酶、α-金合欢烯合酶、β-金合欢烯合酶、法尼醇合酶、橙花叔醇合酶、广藿香醇合酶、努特卡酮合酶、松香二烯合酶。

25.根据权利要求1-21中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞能够生产聚酮化合物，且包含至少一种编码聚酮化合物合成酶的异源核酸，其中所述聚酮化合物合成酶选自：

g)将乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A中的至少一种与酰基载体蛋白缩合的酶；

h)将选自乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的第一反应物与选自丙二酰辅酶A或甲基丙二酰辅酶A的第二反应物缩合以形成聚酮化合物产物的酶；

i)将聚酮化合物上的β-酮化学基团还原为β-羟基的酶；

j)将聚酮化合物中的烷烃化学基团脱水以产生α-β-不饱和烯烃的酶；

k)将聚酮化合物中的α-β-双键还原为饱和烷烃的酶；和，

l)从酰基载体蛋白水解聚酮化合物的酶。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述聚酮化合物是具有抗生素活性、抗真菌活性和抗肿瘤活性中的至少一种的脂质。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述聚酮化合物选自：大环内酯、抗生素、抗真菌剂、细胞生长抑制性化合物、抗胆甾醇血化合物、抗寄生虫化合物、球虫生长抑制性的化合物、动物生长促进剂和杀昆虫剂。

28.根据权利要求1-21中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞能够生产脂肪酸，且包含至少一种编码脂肪酸合成酶的异源核酸，其中所述脂肪酸合成酶选自：

g)将乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A中的至少一种与酰基载体蛋白(ACP)共价连接的酶；

h)将乙酰基-ACP和丙二酰基-ACP缩合以形成乙酰乙酰基-ACP的酶；

i)用NADPH还原乙酰乙酰基-ACP中的双键以形成D-3-羟基丁酰基羟化酶-ACP中的羟基；

j)将D-3-羟基丁酰基羟化酶-ACP脱水以产生β-和γ-碳之间的双键从而形成巴豆酰基-ACP的酶；

k)用NADPH还原巴豆酰基ACP以形成丁酰基-ACP的酶；和，

l)从酰基载体蛋白水解C16酰基化合物以形成棕榈酸的酶。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述脂肪酸选自：棕榈酸盐、棕榈酰辅酶A、棕榈油酸、十六碳烯酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸。

30.一种在宿主细胞中生产异源乙酰辅酶A衍生出的(HACD)化合物的方法，所述方法包括：

(a)在包含碳源且缺乏泛酸盐补充的培养基中培养能够生产HACD化合物的遗传修饰的宿主细胞群；随后

(b)在包含碳源且补充了至少1mg/L泛酸盐的培养基中培养所述群或其亚群。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述步骤(a)的培养持续至少12、24、36、48、60、72、84、96小时或超过96小时的时间段。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述步骤(a)的培养持续的时间段足以使所述群达到0.01至400的细胞密度(OD₆₀₀)。

33.根据权利要求30-32中的任一项所述的方法，其中所述步骤(b)的培养持续3-20天的时间段。

34.根据权利要求30-33中的任一项所述的方法，其中步骤(b)包括：将泛酸盐加入步骤(a)的培养基中，直到所述培养基包含至少1mg/L的泛酸盐。

35.根据权利要求30-33中的任一项所述的方法，其中步骤(b)包括：将步骤(a)的群转移至包含至少1mg/L的泛酸盐的新培养基。

36.根据权利要求30-35中的任一项所述的方法，其中与不包括在限制性量的泛酸盐中培养细胞的方法得到的生产相比，所述方法会导致所述遗传修饰的宿主细胞群的HACD化合物生产增加。

37.根据权利要求30-36中的任一项所述的方法，其中以收率(每克碳底物产生的HACD克数)或生产力(每升培养基每小时生产的HACD化合物克数)的方式，测量所述HACD化合物生产。

38.根据权利要求30-37中的任一项所述的方法，所述方法进一步包括：回收所述HACD化合物。

39.根据权利要求30-38中的任一项所述的方法，其中所述泛酸盐选自：2-脱氢泛解酸盐、(R)-泛解酸盐、(R)-泛酸盐和它们的任意盐或酯。

40.根据权利要求30-39中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞选自：真菌细胞、细菌细胞、植物细胞和动物细胞。

41.根据权利要求30-39中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。

42.根据权利要求30-41中的任一项所述的方法，其中所述HACD化合物选自：氨基酸、脂肪酸、类异戊二烯和聚酮化合物。

43.根据权利要求30-41中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞能够生产类异戊二烯，且包含至少一种编码类异戊二烯途径酶的异源核酸，所述类异戊二烯途径酶选自：

aa)缩合2个乙酰辅酶A分子以形成乙酰乙酰辅酶A的酶；

bb)缩合乙酰乙酰辅酶A与另一个乙酰辅酶A分子以形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)的酶；

cc)将HMG-CoA转化成甲羟戊酸的酶；

dd)将甲羟戊酸转化成5-磷酸甲羟戊酸的酶；

ee)将5-磷酸甲羟戊酸转化成5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；

ff)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化成IPP的酶；

gg)将IPP转化成DMAPP的酶；

hh)聚异戊二烯基合酶，其能够缩合IPP和/或DMAPP分子以形成含有超过5个碳的聚异戊二烯基化合物；

ii)将IPP与DMAPP缩合以形成GPP的酶；

jj)将2个IPP分子与1个DMAPP分子缩合的酶；

kk)将IPP与GPP缩合以形成FPP的酶；

ll)将IPP和DMAPP缩合以形成GGPP的酶；和，

mm)将IPP和FPP缩合以形成GGPP的酶。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述宿主细胞进一步包含编码修饰聚异戊二烯基的酶的异源核酸，所述酶选自：香叶醇合酶、芳樟醇合酶、柠檬烯合酶、香叶烯合酶、罗勒烯合酶、α-蒎烯合酶、β-蒎烯合酶、香桧烯合酶、γ-萜品烯合酶、萜品油烯合酶、紫穗槐二烯合酶、α-金合欢烯合酶、β-金合欢烯合酶、法尼醇合酶、橙花叔醇合酶、广藿香醇合酶、努特卡酮合酶、松香二烯合酶。

45.根据权利要求30-41中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞能够生产聚酮化合物，且包含至少一种编码聚酮化合物合成酶的异源核酸，其中所述聚酮化合物合成酶选自：

m)将乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A中的至少一种与酰基载体蛋白缩合的酶；

n)将选自乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的第一反应物与选自丙二酰辅酶A或甲基丙二酰辅酶A的第二反应物缩合以形成聚酮化合物产物的酶；

o)将聚酮化合物上的β-酮化学基团还原为β-羟基的酶；

p)将聚酮化合物中的烷烃化学基团脱水以产生α-β-不饱和烯烃的酶；

q)将聚酮化合物中的α-β-双键还原为饱和烷烃的酶；和，

r)从酰基载体蛋白水解聚酮化合物的酶。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述聚酮化合物是具有抗生素活性、抗真菌活性和抗肿瘤活性中的至少一种的脂质。

47.根据权利要求45所述的方法，其中所述聚酮化合物选自：大环内酯、抗生素、抗真菌剂、细胞生长抑制性的化合物、抗胆甾醇血化合物、抗寄生虫化合物、球虫生长抑制剂化合物、动物生长促进剂和杀昆虫剂。

48.根据权利要求30-41中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞能够生产脂肪酸，且包含至少一种编码脂肪酸合成酶的异源核酸，其中所述脂肪酸合成酶选自：

m)将乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A中的至少一种与酰基载体蛋白(ACP)共价连接的酶；

n)将乙酰基-ACP和丙二酰基-ACP缩合以形成乙酰乙酰基-ACP的酶；

o)用NADPH还原乙酰乙酰基-ACP中的双键以形成D-3-羟基丁酰基羟化酶-ACP中的羟基；

p)将D-3-羟基丁酰基羟化酶-ACP脱水以产生β-和γ-碳之间的双键从而形成巴豆酰基-ACP的酶；

q)用NADPH还原巴豆酰基ACP以形成丁酰基-ACP的酶；和，

r)从酰基载体蛋白水解C16酰基化合物以形成棕榈酸的酶。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述脂肪酸选自：棕榈酸盐、棕榈酰辅酶A、棕榈油酸、十六碳烯酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸。

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