BR112013028544B1

BR112013028544B1 - método para produzir um composto derivado de acetilcoa heterólogo

Info

Publication number: BR112013028544B1
Application number: BR112013028544-3A
Authority: BR
Inventors: Adam Meadows
Original assignee: Amyris, Inc
Priority date: 2011-05-09
Filing date: 2012-05-09
Publication date: 2020-10-27
Also published as: EP2707475A1; ZA201308393B; BR112013028544A2; AU2012253564A1; MX2013012871A; CN103502428A; JP5989098B2; WO2012154854A1; US20120288891A1; EP2707475B1; US9670518B2; CA2832979A1; JP2014513542A; CA2832979C; DK2707475T3; EP2707475A4

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR UM COMPOSTO DERIVADO DE ACETIL-COA HETERÓLOGO A presente divulgação relata o uso de compostos de pantotenato como um interruptor não genético para a produção de compostos derivados de acetil-CoA heterólogo em células hospedeiras microbianas. A invenção provê microrganismos geneticamente modificados que são mais estáveis quando armazenados e cultivados inicialmente sob concentrações reduzidas de pantotenato, meio de cultura de célula tendo concentrações reduzidas de compostos de pantotenato e métodos para produzir compostos HACD usando o meio de cultura de célula e os microrganismos geneticamente modificados da invenção.

Description

1. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO DE PATENTE RELACIONADO

[001] Este pedido de patente reivindica prioridade pelo Pedido de Patente Provisória dos EUA No. 61/483.896, depositado em 9 de Maio de 2011, o qual é incorporado por referência ao presente documento.

2. CAMPO TÉCNICO

[002] A presente divulgação relata o uso de pantotenato (também conhecido como vitamina B5) como um interruptor não genético para modular a produção de um composto derivado de acetil-CoA heterólogo por uma célula hospedeira geneticamente modificada.

3. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] O advento da biologia sintética trouxe a promessa de produção microbiana fermentativa de biocombustíveis, químicos e biomateriais a partir de fontes renováveis em escala e qualidade industrial. Por exemplo, vias biológicas não nativas funcionais vêm sendo construídas com êxito em hóspedes microbianos para a produção de precursores para a artemisinina de droga antimalária (vide, por exemplo, Martin et al., Nat Biotechnol 21:796- 802 (2003); ácido graxo deriva combustíveis e químicos (por exemplo, ésteres graxos, alcoóis graxos e ceras; vide, por exemplo, Steen et al., Nature 463:559-562 (2010); policetídeo sintases que fazem drogas redutoras do colesterol (vide, por exemplo, Ma et., Science 326:589-592 (2009); e policetídeos (vide, por exemplo, Kodumal, Proc Natl Acad Sei USA 101:15573-15578 (2004). Contudo, o sucesso comercial da biologia sintética dependerá amplamente do fato de o custo de produção de produtos renováveis poder ser feito para competir, ou para concorrer com os custos de produção de suas respectivas contrapartes não renováveis.

[004] Estabilidade de estirpe pode ser um grande impulsionador do custo de fermentações industriais, visto que afeta a duração de tempo que uma fermentação contínua pode ser executada produtivamente. Estabilidade de estirpe se refere, de modo geral, à habilidade de um micróbio em manter características favoráveis de produção (isto é, alto rendimento (gramas de composto por grama de substrato) e produtividade (gramas por litro de caldo de fermentação por hora)) de um produto de fermentação não catabólico ao longo de tempos de cultivo estendidos. Em particular, estabilidade genética, a qual é a propensão da população microbiana de produção em ter pequena ou nenhuma alteração da frequência alélica pretendida de genes relevantes para a produção de produto ao longo do tempo, desempenha um grande papel na produção sustentável de produto.

[005] Para fermentação não catabólica de produtos que não biomassa (cujos produtos, por definição, consomem energia metabólica e carbono que podem, de outra forma, ser usados na produção de mais células), a base de instabilidade é dobrada: mutação evolucionária e seleção. Primeiramente, mutações por perda de produção surgem espontaneamente e aleatoriamente. Segundo, uma taxa de crescimento ou vantagem “conveniente” de células com rendimentos reduzidos de produto leva a uma eventual varredura de população por baixos produtores e, com isso, reduz o desempenho geral de cultura. Esse fenômeno pode ser referido como “degeneração de estirpe”.

[006] Fermentações de combustível etanol brasileiro atingem rendimentos extremamente altos de etanol oriundo do açúcar por longos períodos de tempo, isto é, cerca de 90% de rendimento máximo teórico. Isso se deve, em parte, pelo fato de que a produção de etanol é catabólica: ela gera 2 ATP por molécula de açúcar produzida e é equilibrada em redox sem o envolvimento de oxigênio. Uma célula que sofre mutação para não produzir etanol é menos adequada mediante condições com baixo oxigênio do fermentador e não varrerá a população. Isso permite que fermentações industriais de etanol reciclem a maioria da biomassa de levedura ao longo do período, minimizando, assim, a conversão do açúcar em biomassa de célula de levedura e direcionando quase todo o açúcar para a produção de etanol. Essa propagação estendida e reutilização de biomassa aumentam as eficiências da produção de etanol: gastos operacionais são reduzidos pelo fato de que menos açúcar vai para a biomassa durante cada ciclo (isto é, o rendimento aumenta); e gastos capitais são reduzidos em função de que poucas e menores fermentações são necessárias para formar biomassa para inoculações.

[007] Por outro lado, a produção de vários hidrocarbonos derivados de acetil-CoA (por exemplo, isoprenóides, ácidos graxos e policetídeos) geralmente é não catabólica na natureza: ela normalmente requer uma entrada úmida de ATP, NADPH e carbono, frequentemente com grandes quantidades de oxigênio fornecido para ajudar a equilibrar o redox do sistema. Tal ambiente faz evolução no sentido da menor produção, maior biomassa rendendo genótipos mais favoráveis e leva a uma maior taxa de degeneração de estirpe.

[008] Uma maneira de diminuir a pressão seletiva negativa para produzir produtos não catabólicos é interromper a formação de produto durante períodos onde o produto não é desejado, tal como durante fases da fermentação onde biomassa deve ser gerada a fim de maximizar a produtividade de fermentador. Interruptores genéticos são uma maneira comum de atingir isso na prática, mas podem ter desvantagens, por exemplo, devido ao custo de um indutor exógeno, ao atraso em transcrever e transformar o interruptor e também podem ser uma fonte de baixo produtores, caso ocorram mutações no próprio interruptor. No entanto, um interruptor metabólico não sofre dessas desvantagens. Assim, existe uma necessidade na técnica por interruptores metabólicos que possam controlar o tempo de produção de compostos derivados de acetil-CoA durante fermentação.

4. RESUMO DA INVENÇÃO

[009] No presente documento é provido um processo de fermentação para produção de um composto derivado de acetil-CoA heterólogo (“composto HACD”) a partir de uma célula hospedeira geneticamente modificada. Em algumas modalidades, o processo compreende duas fases: um estágio de formação durante o qual a produção de composto HACD é substancialmente reduzida (o estágio “off’) enquanto biomassa celular é acumulada; e uma fase de produção, durante a qual a produção de composto HACD é ligada. Assim, a pressão seletiva negativa associada à produção de composto HACD é aliviada durante um estágio de fermentação no qual a produção não é necessária. Sem estar ligado à teoria, acredita-se que redução ou eliminação da produção de composto HACD durante o estágio de formação resulta em melhor estabilidade da estirpe durante o estágio de produção, resultando em produção de composto HACD mantida por mais tempo, aumentando, com isso, o rendimento geral e/ou produtividade da estirpe. Os estados “off’ e “on” da produção de composto HACD na cultura de fermentação são controlados pela quantidade de um precursor para o acetil-CoA, pantotenato, no meio de cultura.

[0010] Acetil-CoA é a forma ativada de acetato que é usado como um bloco de formação para várias biomoléculas importantes, incluindo aminoácidos, ácidos graxos, isoprenóides e policetídeos. O cofator, coenzima A (a porção CoA de acetil-CoA), é biossintetizado a partir de três precursores (Figura 1B). Dois desses precursores, a saber, L-cisteína e adenosina-5’- trifosfato, podem ser sintetizados eficientemente pela maioria dos sistemas vivos e, assim, não são limitantes. Por outro lado, o terceiro precursor, pantotenato é limitante e é produzido somente em quantidades insuficientes pela maioria dos sistemas vivos. Como resultado, a maioria dos sistemas vivos requer fontes externas de um composto de pantotenato (por exemplo, no meio de cultura ou uma fonte de alimento) para crescimento ideal, saúde e viabilidade. No entanto, os métodos providos no presente relatório são baseados, em parte, na descoberta de que pantotenato pode ser usado em quantidades limitadas ou inteiramente omitidas quando do cultivo de células modificadas para produzir compostos derivados de acetil-CoA. Essas células podem manter crescimento e viabilidade e, em alguns casos, demonstram crescimento melhorado sob concentrações limitantes de pantotenato. Vantajosamente, essas mesmas condições resultam numa redução na produção do composto HACD. Por conseguinte, os métodos providos no presente relatório utilizam pantotenato como um interruptor não genético para efetuar os estágios “off’ e “on” de um processo melhorado de fermentação para produção de compostos derivados de acetil-CoA heterólogo. Assim, num aspecto, é provido no presente documento um método para produzir um composto derivado de acetil-CoA heterólogo (HACD) numa célula hospedeira compreendendo: (a) cultivar uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas capazes de produzir um composto HACD num meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono e uma quantidade limitante de pantotenato, em que a quantidade limitante de pantotenato limita a produção do composto HACD pela célula hospedeira; seguido por (b) cultivar a referida população ou uma subpopulação daquelas num meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono e uma quantidade não limitante de pantotenato, em que a quantidade não limitante de pantotenato é uma quantidade maior do que a quantidade limitante de pantotenato, em que a referida população ou subpopulação daquelas produz uma quantidade maior do composto HACD na presença da quantidade não limitante de pantotenato.

[0011] Em algumas modalidades, a quantidade limitante de pantotenato é determinada ao se realizar uma titulação de pantotenato, em que as células hospedeiras são cultivadas num meio de crescimento compreendendo concentrações de aumento de pantotenato, e que a produção de composto HACD é determinada a cada concentração de pantotenato, em que a titulação de pantotenato compreende saturar quantidades de pantotenato, com o que a produção de composto HACD fica em seu máximo; em que a quantidade limitante de pantotenato é qualquer concentração de pantotenato, na qual a produção de composto HACD é menor do que seu máximo.

[0012] Em algumas modalidades, produção do composto HACD durante o estágio de “formação” (etapa (a)) é menor do que 50, 40, 30, 20 ou 10% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada. Em algumas modalidades, produção do composto HACD durante o estágio de “produção” (etapa (b)) é maior do que 50, 60, 70, 80 ou 90% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada.

[0013] Em algumas modalidades, a etapa (a) de cultivo é por um período de tempo suficiente para que a referida população alcance uma densidade celular (ODgoo) entre 0,01 e 400. Em algumas modalidades, a etapa (b) de cultivo é por um período de 3 a 20 dias. Em algumas modalidades, a quantidade limitante de pantotenato fica abaixo de 0,2 mg/L. Em algumas modalidades, a quantidade limitante de pantotenato é de 0 mg/L. Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é de pelo menos a concentração mínima de pantotenato na qual a produção de composto HACD fica em seu máximo. Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é de 10 mg/L.

[0014] Em algumas modalidades, etapa (b) compreende adicionar pantotenato ao meio de cultura compreendendo a quantidade limitante de pantotenato até que o meio compreenda uma quantidade não limitante de pantotenato. Em algumas modalidades, etapa (b) compreende transferir a população da etapa (a) para um novo meio de cultura compreendendo uma quantidade não limitante de pantotenato.

[0015] Em algumas modalidades, os métodos providos no presente relatório resultam em produção aumentada do composto HACD pela população de células hospedeiras geneticamente modificadas, comparada à produção resultante de um método não compreendendo cultivar as células numa quantidade limitante de pantotenato. Em algumas modalidades, produção do composto HACD é medida em termos de rendimento (grama de composto HACD produzida por grama de substrato de carbono) ou produtividade (gramas de composto HACD produzidas por litro de meio de cultura por hora). Em algumas modalidades, os métodos compreendem, adicionalmente, recuperar o composto HACD.

[0016] Em algumas modalidades, o pantotenato é selecionado a partir do grupo consistindo de 2-dehidropantoato, (R)-pantoato, (R)-pantotenato e qualquer sal ou éster destes. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo consistindo de uma célula fúngica, célula bacteriana, célula vegetal e uma célula animal. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de levedura. Em algumas modalidades, o composto HACD é selecionado a partir do grupo consistindo de um aminoácido, um ácido graxo, um isoprenóide e um policetídeo.

[0017] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é capaz de produzir um isoprenóide e compreende pelo menos um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima via de isoprenóide selecionada a partir do grupo consistindo de: a) uma enzima que condensa duas moléculas de acetil- coenzima A para formar acetoacetil-CoA; b) uma enzima que condensa acetoacetil-CoA com outra molécula de acetil-CoA para formar 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG- CoA); c) uma enzima que converte HMG-CoA em mevalonato; d) uma enzima que converte mevalonato em mevalonato 5- fosfato; e) uma enzima que converte mevalonato 5-fosfato em mevalonato 5-pirofosfato; f) uma enzima que converte mevalonato 5-pirofosfato em IPP; g) uma enzima que converte IPP em DMAPP; h) uma poliprenil sintase que pode condensar moléculas IPP e/ou DMAPP para formar compostos poliprenil contendo mais do que cinco carbonos; i) uma enzima que condensa IPP com DMAPP para formar GPP; j) uma enzima que condensa duas moléculas de IPP com uma molécula de DMAPP; k) uma enzima que condensa IPP com GPP para formar FPP; l) uma enzima que condensa IPP e DMAPP para formar GGPP; e, m) uma enzima que condensa IPP e FPP para formar GGPP.

[0018] Em algumas modalidades, a célula hospedeira compreende, adicionalmente, um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima que modifica um poliprenil selecionado a partir do grupo consistindo de uma geraniol sintase, uma linalool sintase, uma limoneno sintase, uma mirceno sintase, uma ocimeno sintase, uma a-pineno sintase, B-pineno sintase, uma sabineno sintase, uma y-terpineno sintase, uma terpinoleno sintase, uma amorfadieno sintase, uma a-farneseno sintase, uma B-farneseno sintase, uma farnesol sintase, uma nerolidol sintase, uma patchouliol sintase, uma nootkatona sintase e uma abietadieno sintase.

[0019] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é capaz de produzir um policetídeo e compreende pelo menos um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima de síntese de policetídeo, em que a enzima de síntese de policetídeo é selecionada a partir do grupo consistindo de: a) uma enzima que condensa pelo menos um acetil-CoA e malonil-CoA com uma proteína transportadora de acilo; b) uma enzima que condensa um primeiro reagente selecionado a partir do grupo consistindo de acetil-Coa e malonil-CoA com um segundo reagente selecionado a partir do grupo consistindo de malonil- CoA ou metilmalonil-CoA para formar um produto de policetídeo; c) uma enzima que reduz um grupo químico B-ceto num composto de policetídeo para um grupo B-hidróxi; d) uma enzima que desidrata um grupo químico alcano num composto de policetídeo para produzir um alceno a-B-insaturado; e) uma enzima que reduz um ligação a-B-dupla num composto de policetídeo para um alcano saturado; e f) uma enzima que hidrolisa um composto de policetídeo a partir de uma proteína transportadora de acilo.

[0020] Em algumas modalidades, o polipeptídeo é um lipídio tendo pelo menos uma dentre atividade antibiótica, antifungicida e antitumor. Em algumas modalidades, o policetídeo é selecionado a partir do grupo consistindo de um composto macrolídeo, antibiótico, antifúngico, citotástico, anticolesterolêmico, antiparasítico, coccidiostático, um promotor de crescimento animal e um inseticida.

[0021] Em algumas modalidades, a célula hospedeira é capaz de produzir um ácido graxo e compreende pelo menos um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima de síntese de ácido graxo, em que a enzima de síntese de ácido graxo é selecionada a partir do grupo consistindo de: a) uma enzima que liga de modo covalente pelo menos um dentre acetil-CoA e malonil-CoA a uma proteína transportadora de acilo (ACP); b) uma enzima que condensa acetil-ACP e malonil-ACP para formar acetoacetil-ACP; c) reduzir a ligação dupla em acetoacetil-ACP com NADPH para formar um grupo hidroxila em D-3-hidroxibutiril hidroxilase-ACP; d) uma enzima que desidrata D-3-Hidroxibutiril hidroxilase- ACP para criar uma ligação dupla entre os carbonos beta e gama formando crotonil-ACP; e) uma enzima que reduz crotonil ACP com NADPH para formar butiril-ACP; e f) uma enzima que hidrolisa um composto acilo C16 a partir de uma proteína transportadora de acila para formar palmitato.

[0022] Em algumas modalidades, o ácido graxo é selecionado a partir do grupo consistindo de palmitato, palmitoil CoA, ácido palmitoleico, ácido sapiênico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido a-linoleico, ácido araquidônico, ácido eicosapentaenoico, ácido erúcico e ácido docosahexaenoico.

[0023] Noutro aspecto, é provido no presente relatório um método para produzir um composto derivado de acetil-CoA heterólogo (HACD) numa célula hospedeira compreendendo (a) cultivar uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas capazes de produzir um composto HACD num meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono e carente de suplementação de pantotenato; seguido por (b) cultivar a referida população ou uma subpopulação daquelas num meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono e suplementado com pelo menos 1 mg/L de pantotenato.

[0024] Em algumas modalidades, a etapa (a) de cultivo é por um período de tempo suficiente para que a referida população alcance uma densidade celular (ODeoo) entre 0,01 e 400. Em algumas modalidades, a etapa (b) de cultivo é por um período de 3 a 20 dias.

5. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0025] FIGURA 1 mostra as estruturas moleculares de (A) R- pantotenato e (B) coenzima A, com destaque para os três segmentos de coenzima A que são derivadas a partir de seus três precursores: L-cisteína, (R)-pantotenato e ATP.

[0026] FIGURA 2 mostra a via biossintética de pantotenato em levedura (A) e bactéria (B).

[0027] FIGURA 3 mostra rendimentos de um composto HACD (A) exemplar e densidades celulares (B) obtidas para estirpes Y4689 e Y4352 na presença de várias quantidades de pantotenato. Cada uma das estirpes Y4689 e Y4352 compreendia enzimas heterólogas (incluindo as enzimas da via MEV): IPP isomerase, FPP sintase e farneseno sintase) e foram capazes de produzir composto HACD em rendimentos de 15% e 13%, respectivamente.

[0028] FIGURA 4 mostra crescimento celular em ágar-ágar compreendendo 0,4 mg/L ou 0,002 mg/L de pantotenato de estirpes Y4720, Y5038 e Y2205. Cada uma das estirpes Y4720 e Y5038 compreendia enzimas heterólogas (incluindo as enzimas da via MEV: IPP isomerase, FPP sintase e farneseno sintase) e era capaz de produzir um composto HACD exemplar em rendimentos de 14% e 6%, respectivamente. Estirpe Y2205 foi um controle de tipo selvagem CEN.PK2 que não produziu qualquer composto HACD.

[0029] FIGURA 5 mostra crescimento celular de células hospedeiras de levedura capazes de produzir rendimentos variantes do composto HACD exemplar, farneseno, na presença de 0 ou 10 mg/L de pantotenato. Rendimento aproximado de farneseno de cada estirpe é indicado, e pontos de dados para estirpes que produzem farneseno a um rendimento menor do que 10% são cinzas, tendo em vista que pontos de dados para estirpes que produzem farneseno a um rendimento de 10% ou mais são pretas.

[0030] FIGURA 6 mostra degeneração de estirpe (isto é, declínio de produção de compostos HACD ao longo do tempo) de uma população de células hospedeiras de levedura capazes de produzir um composto HACD, farneseno, na presença de 10 mg/L de pantotenato.

[0031] FIGURA 7 provê uma representação esquemática da via de mevalonato (“MEV”) para a produção de isopentenil difosfato (“IPP”).

[0032] FIGURA 8 provê uma representação esquemática da conversão de IPP e dimetilalil pirofosfato (“DMAPP”) em geranil pirofosfato (“GPP”), farnesil pirofosfato (“FPP”) e geranilgeranil pirofosfato (“GGPP”).

6. DESCRIÇÃO DE MODALIDADES 6.1 Definições

[0033] O termo “composto derivado de acetil-CoA” se refere a uma molécula que é biossintetizada por uma célula hospedeira a partir de um ou mais grupos acetil derivados de acetil-CoA.

[0034] O termo “endógeno” se refere a uma substância ou processo que pode ocorrer naturalmente numa célula hospedeira.

[0035] O termo “geneticamente modificada” denota uma célula hospedeira que compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo.

[0036] O termo “composto HACD” se refere ao composto derivado de acetil-CoA heterólogo que é produzido pelas células hospedeiras geneticamente modificadas. Compostos HACD incluem, porém não estão limitados a, aminoácidos, ácidos graxos, isoprenóides e policetídeos. Em algumas modalidades, o composto HACD é selecionado a partir do grupo consistindo de isoprenóides, ácidos graxos e policetídeos.

[0037] O termo “heterólogo” se refere ao que não é normalmente encontrado na natureza. O termo “composto heterólogo” se refere à produção de um composto por uma célula que normalmente não produz o composto, ou à produção de um composto a um nível no qual ele normalmente não é produzido pela célula.

[0038] O termo “enzima heteróloga” se refere a uma enzima que normalmente não é encontrada numa dada célula na natureza. O termo compreende uma enzima que é: (a) exógena a uma dada célula (isto é, codificada por uma sequência de nucleotídeo que não está presente naturalmente na célula hospedeira ou não está naturalmente presente num dado contexto na célula hospedeira); e (b) naturalmente encontrada na célula hospedeira (isto é, a enzima é codificada por uma sequência de nucleotídeo que é endógena à célula), mas que é produzida numa quantidade não natural (por exemplo, maior ou menor do que aquela encontrada naturalmente) na célula hospedeira.

[0039] O termo “composto de pantotenato” se refere a qualquer composto selecionado a partir do grupo consistindo de 2-dehidropantoato, (R)-pantoato, (R)-pantotenato e qualquer sal ou éster destes.

[0040] O termo “produção” se refere, de modo geral, a uma quantidade de composto HACD produzida por uma célula hospedeira geneticamente modificada provida no presente documento. Em algumas modalidades, produção é expressa como um rendimento do composto HACD pela célula hospedeira. Noutras modalidades, produção é expressa como uma produtividade da célula hospedeira em produzir o composto HACD.

[0041] O termo “produtividade” se refere à produção de um composto HACD por uma célula hospedeira, expressa como a quantidade do composto HACD produzida (em peso) por quantidade de caldo de fermentação no qual a célula hospedeira é cultivada (por volume) ao longo do tempo (por hora). O termo “rendimento” se refere à produção de um composto HACD por uma célula hospedeira, expressa como a quantidade de composto HACD produzida por quantidade de fonte de carbono consumida pela célula hospedeira por peso.

6.2 Uso de Pantotenato como um Interruptor Não Genético para Modular a Produção de Compostos Heterólogos

[0042] Os métodos e composições providos no presente relatório têm como base a descoberta de que, quando pantotenato é limitado ou omitido do meio de cultura no qual células hospedeiras geneticamente modificadas capazes de produzir compostos HACD são cultivadas, a produção de composto HACD é substancialmente reduzida; e quanto pantotenato é provido no meio de cultura, a produção de composto HACD é aumentada. Assim, pantotenato pode atuar como um interruptor não genético para a produção de compostos HACD em células hospedeiras geneticamente modificadas. Em particular, controlar o tempo de produção de composto HACD para que ocorra somente quando a produção é desejada redireciona o fluxo de carbono durante a fase de não produção na manutenção celular e biomassa. Esse uso mais eficiente de carbono reduz grandemente a queima metabólica nas células hospedeiras, aumenta a estabilidade dos genes heterólogos, reduz degeneração de estirpe e contribui para melhor saúde geral e viabilidade das células. Por conseguinte, os métodos providos no presente relatório utilizam pantotenato como um interruptor não genético para efetuar os estágios “off’ e “on” de um processo de fermentação melhorado para produção de compostos derivados de acetil-CoA heterólogo.

[0043] Assim, num aspecto, é provido no presente relatório um método para produzir um composto derivado de acetil-CoA heterólogo (HACD) numa célula hospedeira compreendendo: a) cultivar uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas capazes de produzir um composto HACD num meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono e uma quantidade limitante de pantotenato, em que a quantidade limitante de pantotenato limita a produção do composto HACD pela célula hospedeira; seguido por b) ) cultivar a referida população ou uma subpopulação daquelas num meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono e uma quantidade não limitante de pantotenato, em que a quantidade não limitante de pantotenato é uma quantidade maior do que a quantidade limitante de pantotenato, em que a referida população ou subpopulação daquelas produz uma quantidade maior do composto HACD na presença da quantidade não limitante de pantotenato.

[0044] Na primeira etapa (isto é, estágio de “formação”, etapa (a)), as células hospedeiras geneticamente modificadas são cultivadas num meio de crescimento ou de “formação” no qual pantotenato é limitado ou omitido. Na segunda etapa (isto é, o estágio de “produção”, etapa (b)), um composto de pantotenato é adicionado ao meio de cultura, o qual serve como um interruptor não genético para ampliar substancialmente a produção do composto HACD. O crescimento inicial em baixos níveis ou na ausência de níveis de pantotenato garante que as demandas por energia das células sejam atendidas, ao passo que a biomassa das células aumenta rapidamente. Subsequentemente, interromper para um meio de crescimento contendo um composto de pantotenato permite a síntese do produto HACD.

[0045] Exemplo 5 (abaixo) e Figura 3A ilustram o efeito de concentração de composto de pantotenato no meio de cultura na produção de composto HACD numa célula hospedeira geneticamente modificada tendo um alto fluxo metabólico através da via de biossíntese de acetil-CoA para produzir o isoprenóide farneseno. Em baixos níveis de composto de pantotenato (0,2 mg/L, <1% da concentração máxima testada de composto de pantotenato), não existe virtualmente produção do composto de HACD. Aumentar os níveis de composto de pantotenato se correlaciona com produção aumentada de composto HACD até o efeito de platô. Além disso, aumentos além de 1 mg/L de pantotenato (10% da concentração máxima testada de composto de pantotenato) não resultam em aumentos adicionais na produção de composto HACD.

[0046] Notadamente, o crescimento dessas células mostra a tendência oposta à produção de composto HACD. Figura 3B ilustra o crescimento das mesmas estirpes nos mesmos níveis de concentração de pantotenato que foram testados para produção de composto HACD. Ausência ou baixo nível de um composto de pantotenato resulta, atualmente, em melhor crescimento do que aquele observado quando as estirpes foram cultivadas em níveis de pantotenato que são necessários para produção máxima de composto HACD. Essa resposta a baixos níveis de pantotenato foi mais frequentemente observada entre células hospedeiras modificadas para produzir quantidades maiores de um composto HACD, conforme ilustrado pelos Exemplos 6 e 7 e nas Figuras 4 e 5 abaixo. Assim, em certas estirpes capazes de produzir compostos HACD, um benefício adicional de crescimento aumentado é observado quando cultivado em pouco ou nenhum pantotenato. Crescimento melhorado durante o estágio de “formação” (isto é, quando a produção de composto HACD é interrompida) permite uma formação mais rápida das biomassas celulares necessárias para a fase de produção da fermentação.

[0047] Exemplo 8 e Figura 6 providos abaixo demonstram o fenômeno de degeneração de estirpe, o qual pode ocorrer quando pantotenato é provido ao longo de todos os estágios de um processo de fermentação. Produção robusta do farneseno HACD é mantida transitoriamente no início de fermentação, porém, ao longo do tempo, a produção é reduzida perto de somente 60% da produção máxima previamente observada. Isso resulta numa produção reduzida ao todo (por exemplo, rendimento e/ou produtividade) da população de célula hospedeira. Contudo, conforme descrito no Exemplo 9 e na Tabela 1 abaixo, ao limitar ou omitir pantotenato do meio de cultura durante o estágio de “formação”, a produção de composto HACD pode ser substancialmente aumentada ao longo do curso da fermentação.

6.2.1 Quantidades Limitantes e Não Limitantes de Pantotenato

[0048] Em algumas modalidades dos métodos providos no presente relatório, uma quantidade “limitante” e “não limitante” de pantotenato para uso nos métodos providos aqui pode ser determinada por qualquer célula hospedeira geneticamente modificada capaz de produzir um composto HACD. Em algumas modalidades, uma quantidade não limitante de pantotenato é determinada ao se realizar uma curva de produção de composto HACD na presença de quantidades maiores de pantotenato no meio de cultura, isto é, uma titulação de pantotenato. Uma titulação exemplar de pantotenato é provida no Exemplo 5 e na Figura 3 abaixo.

[0049] Por exemplo, uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas pode ser dividida numa pluralidade de subpopulações e cultivada em paralelo, em que cada subpopulação é cultivada em meio de cultura compreendendo uma quantidade diferente, por exemplo, crescente de pantotenato (incluindo sem pantotenato), produção de composto HACD é ensaiada após um período definido de tempo. Em modalidades preferenciais, a titulação de pantotenato compreende pelo menos duas concentrações de pantotenato, considerando que a produção de composto HACD das células hospedeiras é equilibrada numa quantidade máxima, ou seja, onde nenhum aumento adicional na produção de composto HACD é observada com um aumento na concentração de pantotenato. Em algumas modalidades, uma “quantidade não limitante” de pantotenato é pelo menos a quantidade mínima de pantotenato na qual produção de composto HACD das células hospedeiras é equilibrada em seu máximo. Essa quantidade também pode ser referida como uma quantidade “saturante” ou “ideal” de pantotenato para produção de composto HACD para a célula hospedeira particular, considerando que a quantidade não limita a produção de composto HACD da célula hospedeira, isto é, onde produção de composto HACD não é influenciada negativamente devido a um falta de pantotenato no meio de cultura. Noutras modalidades, a quantidade “não limitante” de pantotenato pode incluir qualquer concentração de pantotenato na qual produção de composto HACD é observada, mesmo onde produção de composto HACD é subideal.

[0050] Uma vez que a quantidade não limitante de pantotenato tenha sido determinada para a célula hospedeira, essa quantidade pode ser usada durante o estágio de produção do processo de fermentação e também pode ser usada durante o estágio de formação. Em algumas modalidades, uma quantidade “limitante” de pantotenato pode ser qualquer quantidade abaixo de uma quantidade não limitante de pantotenato, para uso no estágio de formação da fermentação.

[0051] Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é de pelo menos 0,01 mg/L (pantotenato em peso por volume de meio de cultura). Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é de pelo menos 0.1 mg/L. Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é de pelo menos 1 mg/L. Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é de pelo menos 10 mg/L. Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é uma quantidade de pantotenato entre 0,01 mg/L e 10 mg/L. Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é uma quantidade de pantotenato entre 0,01 mg/L e 1 mg/L. Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é uma quantidade de pantotenato entre 0,01 mg/L e 0.1 mg/L. Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é uma quantidade de pantotenato entre 1 mg/L e 10 mg/L. Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é uma quantidade de pantotenato acima de 0,001 mg/L. Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é uma quantidade de pantotenato acima de 0,01 mg/L. Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é uma quantidade de pantotenato acima de 0,02 mg/L. Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é uma quantidade de pantotenato acima de 0,1 mg/L. Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é uma quantidade de pantotenato acima de 0,2 mg/L. Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é uma quantidade de pantotenato acima de 1 mg/L. Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é uma quantidade de pantotenato acima de 2 mg/L. Em algumas modalidades, a quantidade não limitante de pantotenato é uma quantidade de pantotenato acima de 10 mg/L.

[0052] Em algumas modalidades, a quantidade limite de pantotenato é uma quantidade de pelo menos 2 vezes, 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10.000 vezes ou 100.000 vezes menor do que uma quantidade não limitante, conforme determinado de acordo com os métodos descritos acima. Em algumas modalidades, a quantidade limite de pantotenato é uma quantidade de pelo menos 2 vezes, 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes, 10.000 vezes ou 100.000 vezes menor do que a quantidade saturante de pantotenato, conforme determinado de acordo com os métodos descritos acima. Em algumas modalidades, a quantidade limitante de pantotenato é uma quantidade que é menor do que 50%, menor do que 20%, menor do que 10%, menor do que 1%, menor do que 0,5%, menor do que 0,2%, menor do que 0,1%, menor do que 0,01% ou menor do que 0,001% de uma quantidade não limitante de pantotenato, conforme determinado de acordo com os métodos descritos acima. Em algumas modalidades, a quantidade limitante de pantotenato é uma quantidade que é menor do que 50%, menor do que 20%, menor do que 10%, menor do que 1%, menor do que 0,1%, menor do que 0,01% ou menor do que 0,001% da quantidade saturante de pantotenato, conforme determinado de acordo com os métodos descritos acima. Noutras modalidades específicas, a quantidade limitante de pantotenato é uma quantidade menor do que 10 mg/L, ou menor do que 1 mg/L, ou menor do que 0,2 mg/L, ou menor do que 0,1 mg/L, ou menor do que 0,02 mg/L, ou menor do que 0,01 mg/L, ou menor do que 0,001 mg/L de pantotenato. Numa modalidade específica, a quantidade limitante de pantotenato é 0 mg/L, isto é, sem pantotenato. Assim, nesta modalidade específica, as células hospedeiras são cultivadas durante o estágio de formação num meio de cultura de célula que não compreende fonte externa de pantotenato, e a única fonte de pantotenato disponível às células é VÒITI pantotenato endógeno que é produzido internamente.

[0053] Numa modalidade específica, a quantidade não limitante de pantotenato é a quantidade ideal ou saturante para uma dada célula hospedeira, conforme descrito acima, e a quantidade limitante é sem pantotenato. Noutra modalidade específica, a quantidade não limitante de pantotenato é de pelo menos 0,01 mg/L, e a quantidade limitante é sem pantotenato. Noutra modalidade específica, a quantidade não limitante de pantotenato é uma quantidade de pantotenato de 0,01 a 10 mg/L, e a quantidade limitante é sem pantotenato. Noutra modalidade específica, a quantidade não limitante de pantotenato é de pelo menos 10 mg/L, e a quantidade limitante é sem pantotenato.

[0054] Em algumas modalidades, a produção do composto HACD durante o estágio de formação (etapa (a) do método descrito acima) é menor do que 50, 40, 30, 20 ou 10% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada, isto é, a quantidade de produção de composto HACD quando a célula hospedeira é cultivada em meio compreendendo uma quantidade saturante ou ideal de pantotenato. Em algumas modalidades, a produção do composto HACD durante o estágio de formação é menor do que 50% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a produção do composto HACD durante o estágio de formação é menor do que 40% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a produção do composto HACD durante o estágio de formação é menor do que 30% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a produção do composto HACD durante o estágio de formação é menor do que 20% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a produção do composto HACD durante o estágio de formação é menor do que 10% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a produção do composto HACD durante o estágio de formação é menor do que 5% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a produção do composto HACD durante o estágio de formação é menor do que 1% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada.

[0055] Em algumas modalidades, a produção do composto HACD durante o estágio de produção (etapa (b) do método descrito acima) é maior do que 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ou 90% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a produção do composto HACD durante o estágio de formação é maior do que 50% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a produção do composto HACD durante o estágio de formação é maior do que 60% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a produção do composto HACD durante o estágio de formação é maior do que 70% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a produção do composto HACD durante o estágio de formação é maior do que 80% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a produção do composto HACD durante o estágio de formação é maior do que 90% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a produção do composto HACD durante o estágio de formação é maior do que 95% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada. Em algumas modalidades, a produção do composto HACD durante o estágio de formação é 100% ou mais da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada.

[0056] Os períodos de tempo durante os quais o estágio de formação e estágio de produção do processo de formação são realizados podem variar e dependerão de fatores como taxa de crescimento da célula hospedeira, por exemplo, com suplementação ou limitação de pantotenato no meio de cultura; taxa intrínseca de crescimento da célula hospedeira; e outras condições de cultura, tais como o pH, temperatura e necessidades por condições aeróbicas, microaeróbicas ou anaeróbicas, dependendo de necessidades específicas da célula hospedeira, da fermentação e do processo. No entanto, espera-se que qualquer duração do estágio de formação resulte em algum benefício em relação à produtividade final da fermentação, desde que alguma quantidade da pressão seletiva negativa associada à produção de composto HACD seja aliviada no estado “off’.

[0057] Em algumas modalidades, o estágio de formação é realizado por um período de tempo suficiente para produzir uma quantidade de biomassa celular que pode dar suporte à produção do composto HACD durante o estágio de produção. Em algumas modalidades, o estágio de formação é realizado por um período de tempo suficiente para que a população presente no momento da inoculação se submeta a uma pluralidade de duplicações até que uma densidade celular desejada seja alcançada. Em algumas modalidades, o estágio de formação é realizado por um período de tempo suficiente para que a população de células alcance a densidade celular (ODeoo) entre 0,01 e 400 no vaso de fermentação ou recipiente no qual o estágio de formação está sendo realizado. Em algumas modalidades, o estágio de formação é realizado até que uma ODÓOO de pelo menos 0,01 seja alcançada. Em algumas modalidades, o estágio de formação é realizado até que uma ODeoo de pelo menos 0,1 seja alcançada. Em algumas modalidades, o estágio de formação é realizado até que uma ODÓOO de pelo menos 1,0 seja alcançada. Em algumas modalidades, o estágio de formação é realizado até que uma ODóoo de pelo menos 10 seja alcançada. Em algumas modalidades, o estágio de formação é realizado até que uma ODÔOO de pelo menos 100 seja alcançada. Em algumas modalidades, o estágio de formação é realizado até que uma ODeoo entre 0,01 e 100 seja alcançada. Em algumas modalidades, o estágio de formação é realizado até que uma ODeoo entre 0,1 e 10 seja alcançada. Em algumas modalidades, o estágio de formação é realizado até que uma ODeoo entre 1 e 100 seja alcançada. Noutras modalidades, o estágio de formação é realizado por um período de pelo menos 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 ou por mais de 96 horas.

[0058] Em algumas modalidades, o estágio de produção é realizado por um período de tempo suficiente para produzir uma quantidade desejada do composto HACD. Em algumas modalidades, o estágio de produção é realizado por um período de pelo menos 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 ou mais do que 96 horas.

[0059] Em algumas modalidades, o estágio de produção é realizado por um período entre 3 e 20 dias. Em algumas modalidades, o estágio de produção é realizado por um período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais do que 20 dias.

[0060] Numa modalidade particular, o método para produzir um composto HACD compreende conduzir a fermentação da célula hospedeira geneticamente modificada num meio compreendendo uma fonte de carbono e uma concentração limitada ou ausente de composto de pantotenato em condições suficientes para permitir crescimento e manutenção da célula hospedeira geneticamente modificada; então, prover, subsequentemente, no meio de cultura, um composto de pantotenato a uma concentração suficiente para induzir produção do composto HACD e manter a concentração do composto de pantotenato ao longo do processo de fermentação.

[0061] Noutra modalidade, o método para produzir um composto HACD compreende cultivar as células hospedeiras em formação separada e meio de cultura de produção. Por exemplo, o método pode compreender cultivar a célula hospedeira geneticamente modificada num estágio de formação em que a célula é cultivada num meio compreendendo uma quantidade limitante de pantotenato (por exemplo, pouco ou nenhum pantotenato) para produzir um inoculo, então transferir o inoculo para um segundo meio de formação compreendendo uma quantidade não limitante de pantotenato e manter condições estáveis de estado no segundo estágio de fermentação para produzir uma cultura de célula contendo um produto HACD.

[0062] Em algumas modalidades, o método provido no presente documento é suficiente para produzir um ou mais compostos HACD numa quantidade maior do que 10 gramas por litro de meio de fermentação. Em modalidades dessa natureza, o composto de derivado HACD é produzido numa quantidade a partir de cerca de 10 a cerca de 50 gramas, mais do que 15 gramas, mais do que cerca de 20 gramas, mais do que cerca de 25 gramas ou mais do que cerca de 30 gramas por litro de cultura de célula.

[0063] Em algumas modalidades, o método provido no presente documento é suficiente para produzir um ou mais compostos HACD numa quantidade maior do que cerca de 50 miligramas por grama de peso celular seco. Em algumas modalidades, o composto HACD produzido de maneira recombinante é produzido numa quantidade a partir de cerca de 50 a cerca de 1500 miligramas, mais do que cerca de 100 miligramas, mais do que cerca de 150 miligramas, mais do que cerca de 200 miligramas, mais do que cerca de 250 miligramas, mais do que cerca de 500 miligramas, mais do que cerca de 750 miligramas ou mais do que cerca de 1000 miligramas por grama de peso celular seco.

[0064] Em algumas modalidades, a prática do método provido no presente documento resulta em produção aumentada do composto HACD pela população de célula hospedeira geneticamente modificada, comparada à produção resultante de um método que não compreende um estágio de formação durante o qual as células hospedeiras são cultivadas numa quantidade limitante de pantotenato. Em algumas modalidades, a prática do método resulta na produção de um ou mais compostos numa quantidade que é de pelo menos cerca de 10%, de pelo menos cerca de 15%, de pelo menos cerca de 20%, de pelo menos cerca de 25%, de pelo menos cerca de 30%, de pelo menos cerca de 35%, de pelo menos cerca de 40%, de pelo menos cerca de 45%, de pelo menos cerca de 50%, de pelo menos cerca de 60%, de pelo menos cerca de 70%, de pelo menos cerca de 80%, de pelo menos cerca de 90%, de pelo menos cerca de 2 vezes, de pelo menos cerca de 2,5 vezes, de pelo menos cerca de 5 vezes, de pelo menos cerca de 10 vezes, de pelo menos cerca de 20 vezes, de pelo menos cerca de 30 vezes, de pelo menos cerca de 40 vezes, de pelo menos cerca de 50 vezes, de pelo menos cerca de 75 vezes, de pelo menos cerca de 100 vezes, de pelo menos cerca de 200 vezes, de pelo menos cerca de 300 vezes, de pelo menos cerca de 400 vezes, de pelo menos cerca de 500 vezes ou de pelo menos cerca de 1000 vezes ou mais maior do que a quantidade de composto HACD produzido por um método compreendendo um estágio de formação durante o qual as células hospedeiras são cultivadas numa quantidade limitante de pantotenato, num volume por unidade de base de cultura de célula.

[0065] Em algumas modalidades, a prática do método resulta na produção de um ou mais compostos numa quantidade que é de pelo menos cerca de 10%, de pelo menos cerca de 15%, de pelo menos cerca de 20%, de pelo menos cerca de 25%, de pelo menos cerca de 30%, de pelo menos cerca de 35%, de pelo menos cerca de 40%, de pelo menos cerca de 45%, de pelo menos cerca de 50%, de pelo menos cerca de 60%, de pelo menos cerca de 70%, de pelo menos cerca de 80%, de pelo menos cerca de 90%, de pelo menos cerca de 2 vezes, de pelo menos cerca de 2,5 vezes, de pelo menos cerca de 5 vezes, de pelo menos cerca de 10 vezes, de pelo menos cerca de 20 vezes, de pelo menos cerca de 30 vezes, de pelo menos cerca de 40 vezes, de pelo menos cerca de 50 vezes, de pelo menos cerca de 75 vezes, de pelo menos cerca de 100 vezes, de pelo menos cerca de 200 vezes, de pelo menos cerca de 300 vezes, de pelo menos cerca de 400 vezes, de pelo menos cerca de 500 vezes ou de pelo menos cerca de 1000 vezes ou mais maior do que a quantidade de composto HACD produzido por um método compreendendo um estágio de formação durante o qual as células hospedeiras são cultivadas numa quantidade limitante de pantotenato numa base de peso celular seco por unidade.

[0066] Em algumas modalidades, a prática do método resulta na produção de um ou mais compostos numa quantidade que é de pelo menos cerca de 10%, de pelo menos cerca de 15%, de pelo menos cerca de 20%, de pelo menos cerca de 25%, de pelo menos cerca de 30%, de pelo menos cerca de 35%, de pelo menos cerca de 40%, de pelo menos cerca de 45%, de pelo menos cerca de 50%, de pelo menos cerca de 60%, de pelo menos cerca de 70%, de pelo menos cerca de 80%, de pelo menos cerca de 90%, de pelo menos cerca de 2 vezes, de pelo menos cerca de 2,5 vezes, de pelo menos cerca de 5 vezes, de pelo menos cerca de 10 vezes, de pelo menos cerca de 20 vezes, de pelo menos cerca de 30 vezes, de pelo menos cerca de 40 vezes, de pelo menos cerca de 50 vezes, de pelo menos cerca de 75 vezes, de pelo menos cerca de 100 vezes, de pelo menos cerca de 200 vezes, de pelo menos cerca de 300 vezes, de pelo menos cerca de 400 vezes, de pelo menos cerca de 500 vezes ou de pelo menos cerca de 1000 vezes ou mais maior do que a quantidade de composto HACD produzido por um método compreendendo um estágio de formação durante o qual as células hospedeiras são cultivadas numa quantidade limitante de pantotenato num volume unitário de cultura de célula por base de unidade de tempo.

[0067] Em algumas modalidades, a prática do método resulta na produção de um ou mais compostos numa quantidade que é de pelo menos cerca de 10%, de pelo menos cerca de 15%, de pelo menos cerca de 20%, de pelo menos cerca de 25%, de pelo menos cerca de 30%, de pelo menos cerca de 35%, de pelo menos cerca de 40%, de pelo menos cerca de 45%, de pelo menos cerca de 50%, de pelo menos cerca de 60%, de pelo menos cerca de 70%, de pelo menos cerca de 80%, de pelo menos cerca de 90%, de pelo menos cerca de 2 vezes, de pelo menos cerca de 2,5 vezes, de pelo menos cerca de 5 vezes, de pelo menos cerca de 10 vezes, de pelo menos cerca de 20 vezes, de pelo menos cerca de 30 vezes, de pelo menos cerca de 40 vezes, de pelo menos cerca de 50 vezes, de pelo menos cerca de 75 vezes, de pelo menos cerca de 100 vezes, de pelo menos cerca de 200 vezes, de pelo menos cerca de 300 vezes, de pelo menos cerca de 400 vezes, de pelo menos cerca de 500 vezes ou de pelo menos cerca de 1000 vezes ou mais maior do que a quantidade de composto HACD produzido por um método compreendendo um estágio de formação durante o qual as células hospedeiras são cultivadas numa quantidade limitante de pantotenato, num peso celular seco por unidade por base de unidade de tempo.

6.2.2 Meio de Cultura e Condições

[0068] Materiais e métodos para a manutenção e o crescimento de culturas microbianas são bem conhecidos por aquelas pessoas versadas na técnica da ciência microbiológica e de fermentação (vide, por exemplo, Bailey et. al., Biochemical Engineering Fundamentals, second edition, McGraw Hill, New York, 1986). Deve-se dar consideração ao meio de cultura apropriado, pH, temperatura e requisitos para condições aeróbicas, microaeróbicas ou anaeróbicas, dependendo dos requisitos específicos da célula hospedeira, da fermentação e do processo.

[0069] Os métodos para produzir compostos HACD providos no presente relatório podem ser realizados num meio de cultura adequado (por exemplo, com ou sem suplementação de pantotenato) num recipiente adequado, incluindo, sem que esteja limitado a, uma placa de cultura de célula, um frasco ou um fermentador. Além disso, os métodos podem ser realizados em qualquer escala de fermentação conhecida na técnica para dar suporte à produção industrial de produtos microbianos. Qualquer fermentador adequado pode ser usado, incluindo um fermentador em tanque agitado, um fermentador de suspensão de ar, um fermentador por bolha ou qualquer combinação destes. Em modalidades particulares usando Saccharomyces cerevisiae como a célula hospedeira, estirpes podem ser cultivadas num fermentador, conforme descrito detalhadamente por Kosaric, et. al., em Ul Im arm's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Sexta Edição, Volume 12, páginas 398-473, Wiley-VCH Verlag GmbH &Co. KDaA, Weinheim, Alemanha.

[0070] Em algumas modalidades, o meio de cultura para uso nos métodos para produzir compostos HACD conforme provido no presente documento inclui qualquer meio de cultura no qual um micro-organismo geneticamente modificado capaz de produzir um composto HACD pode subsistir, isto é, dar suporte e manter crescimento e viabilidade com pouco ou nenhuma suplementação de pantotenato. Em algumas modalidades, o meio de cultura, quando suplementado com pantotenato, também promove a via biossintética necessária para produzir o composto HACD necessário.

[0071] Em algumas modalidades, o meio de cultura é um meio aquoso compreendendo fontes de fosfato, nitrogênio e carbono assimiláveis. Tal meio também pode incluir sais apropriados, minerais, metais e outros nutrientes. Em algumas modalidades, a fonte de carbono e cada um dos nutrientes de célula essenciais que não os compostos de pantotenato, são adicionados de modo incremental ou continuamente ao meio de fermentação, e cada nutriente requerido é mantido no nível essencial mínimo para assimilação eficiente por parte de células de crescimento, por exemplo, de acordo com uma curva de crescimento de célula predeterminada com base na função metabólica ou respiratória das células que convertem a fonte de carbono para uma biomassa.

[0072] Condições adequadas e meios adequados para cultivar microorganismos são bem conhecidos no estado da técnica. Em algumas modalidades, o meio adequado é suplementado com um ou mais agentes adicionais, tais como, por exemplo, um indutor (por exemplo, quanto uma ou mais sequências de nucleotídeo que codificam um produto de gene estão sob controle de um promotor induzível), um repressor (por exemplo, quando uma ou mais sequências de nucleotídeo que codificam um produto de gene estão sob controle de um promotor repressível) ou um agente de seleção (por exemplo, um antibiótico para selecionar microorganismos compreendendo as modificações genéticas).

[0073] Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um monossacarídeo (açúcar simples), um dissacarídeo, um polissacarídeo, uma fonte de carbono não fermentável ou uma ou mais combinações destes. Exemplos não limitantes de monossacarídeos adequados incluem glicose, galactose, manose, frutose, ribose e combinações destes. Exemplos não limitantes de dissacarídeos adequados incluem sucrose, lactose, trealose, celobiose e combinações destes. Exemplos não limitantes de polissacarídeos adequados incluem amido, glicogênio, celulose, quitina e combinações destes. Exemplos não limitantes de fontes de carbono não fermentáveis adequadas incluem acetato e glicerol.

[0074] A concentração de uma fonte de carbono, tal como glicose, no meio de cultura deve promover crescimento celular, porém não é tão alta a ponte de reprimir o crescimento do micro-organismo usado. Normalmente, culturas são conduzidas com uma fonte de carbono, tal como glicose, sendo adicionada a níveis para atingir o nível desejado de crescimento e biomassa, porém a níveis indetectáveis (com limites de detecção estando em torno de <0,1 g/1). Noutras modalidades, a concentração de uma fonte de carbono, tal como glicose, no meio de cultura é maior do que cerca de 1 g/L, preferencialmente maior do que cerca de 2 g/L e, mais preferencialmente, maior do que cerca de 5 g/L. Adicionalmente, a concentração de uma fonte de carbono, tal como glicose, no meio de cultura é normalmente menor do que 100 g/L, preferencialmente menor do que cerca de 50 g/L e, mais preferencialmente, menor do que cerca de 20 g/L. Deve-se notar que referências às concentrações de componente de cultura podem se referir tanto às concentrações de componente em andamento e/ou às concentrações de componente iniciais. Em alguns casos, pode ser desejável permitir que o meio de cultura se torne esgotado de uma fonte de carbono durante cultivo.

[0075] As fontes de nitrogênio assimilável que podem ser usadas num meio de cultura adequado incluem, sem que estejam limitadas a, simples fontes de nitrogênio orgânico, fontes de nitrogênio e fontes de nitrogênio complexas. Tais fontes de nitrogênio incluem amónia anidra, sais de amónio e substâncias de origem animal, vegetal e/ou de origem microbiana. As fontes de nitrogênio adequadas incluem, sem que estejam limitadas a, hidrolisados de proteína, hidrolisados de biomassa microbiana, pep tona, extrato de levedura, sulfato de amónio, ureia e aminoácidos. Tipicamente, a concentração das fontes de nitrogênio para o meio de cultura são maiores do que cerca de 0,1 g/L, preferencialmente maiores do que cerca de 0,25 g/L e, mais preferivelmente, maiores do que cerca de 1,0 g/L. Para além de certas concentrações, no entanto, a adição de uma fonte de nitrogênio para o meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos microrganismos. Como resultado, a concentração das fontes de nitrogênio em relação ao meio de cultura representa menos do que cerca de 20 g/L, preferencialmente menos do que cerca de 10 g/L e, mais preferencialmente menos do que cerca de 5 g/L. Além disso, em alguns casos, pode ser desejável permitir que o meio de cultura esgote as fontes de nitrogênio durante a cultura.

[0076] O meio de cultura eficaz pode conter outros compostos, tais como sais inorgânicos, vitaminas, traços de metais ou promotores de crescimento. Estes outros compostos também podem estar presentes no carbono, nas fontes de nitrogênio e nos meios minerais eficazes ou podem ser adicionados especificamente ao meio.

[0077] O meio de cultura também pode incluir uma fonte de fosfato adequada. Tais fontes de fosfato inorgânico incluem ambos os fosfatos orgânicos. Fontes de fosfato preferenciais incluem, sem que estejam limitadas a, sais de fosfatos, tais como mono ou dibásico de sódio e fosfatos de potássio, fosfato de amónio e suas misturas. Tipicamente, a concentração de fosfato no meio de cultura é maior do que cerca de 1,0 g/L, preferencialmente maior do que a cerca de 2,0 g/L e, mais preferencialmente, maior do que cerca de 5,0 g/L. Para além de certas concentrações, contudo, a adição de fosfato ao meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos microrganismos. Deste modo, a concentração de fosfato no meio de cultura é normalmente inferior a cerca de 20 g/L, preferencialmente menor do que cerca de 15 g/L e, mais preferencialmente, menor do que cerca de 10 g/L.

[0078] Um meio de cultura adequado também pode incluir uma fonte de magnésio, preferencialmente sob a forma de um sal fisiologicamente aceitável, tal como sulfato de magnésio heptahidratado, embora outras fontes de magnésio, em concentrações que conferem quantidades semelhantes ao magnésio, possam ser usadas. Tipicamente, a concentração de magnésio no meio de cultura é maior do que cerca de 0,5 g/L, preferencialmente maior do que cerca de 1,0 g/L e, mais preferencialmente, maior do que cerca de 2,0 g/L. Para além de certas concentrações, no entanto, a adição de magnésio ao meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos microrganismos. Deste modo, a concentração de magnésio no meio de cultura é normalmente inferior a cerca de 10 g/L, preferencialmente inferior a cerca de 5 g/L e, mais preferencialmente, inferior a cerca de 3 g/L. Além disso, em alguns casos, pode ser desejável permitir que o meio de cultura se torne uma fonte de depleção de magnésio durante a cultura. yilTI

[0079] Em algumas modalidades, o meio de cultura também pode incluir um agente de quelação biologicamente aceitável, tal como o di-hidrato de citrato trissódico. Em tais casos, a concentração de um agente quelante no meio de cultura é maior do que cerca de 0,2 g/L, preferencialmente maior do que cerca de 0,5 g/L e, mais preferencialmente, maior do que cerca de 1 g/L. Para além de certas concentrações, no entanto, a adição de um agente quelante ao meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos microrganismos. Deste modo, a concentração de um agente quelante ao meio de cultura é normalmente inferior a cerca de 10 g/L, preferencialmente inferior a cerca de 5 g/L e, mais preferencialmente, inferior a cerca de 2 g/L.

[0080] O meio de cultura também pode incluir inicialmente um ácido biologicamente aceitável ou base para manter o pH desejado do meio de cultura. Ácidos biologicamente aceitáveis incluem, sem que estejam limitados a, ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e suas misturas. Bases biologicamente aceitáveis incluem, sem que estejam limitadas a, hidróxido de amónio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e suas misturas. Em algumas modalidades, a base utilizada é o hidróxido de amónio.

[0081] O meio de cultura também pode incluir uma fonte de cálcio biologicamente aceitável, incluindo, sem que esteja limitado a, cloreto de cálcio. Tipicamente, a concentração da fonte de cálcio, tal como cloreto de cálcio di-hidratado, no meio de cultura está dentro do intervalo de cerca de 5 mg/L a cerca de 2000 mg/L, preferencialmente dentro do intervalo de cerca de 20 mg/L a cerca de 1000 mg/L, e, mais preferencialmente, do intervalo de cerca de 50 mg/L a cerca de 500 mg/L.

[0082] O meio de cultura também pode incluir o cloreto de sódio. Tipicamente, a concentração de cloreto de sódio no meio de cultura está dentro do intervalo de cerca de 0,1 g/L a cerca de 5 g/L, preferencialmente dentro do intervalo de cerca de 1 g/L a cerca de 4 g/L e, mais preferencialmente, do intervalo de cerca de 2 g/L a cerca de 4 g/L.

[0083] Em algumas modalidades, o meio de cultura também pode incluir traços de metais. Tais traços de metais podem ser adicionados ao meio de cultura como uma solução estoque que, por conveniência, pode ser preparada separadamente a partir do resto do meio de cultura. Tipicamente, a quantidade de tal solução de traços de metais adicionada ao meio de cultura foi superior a cerca de 1 ml/L, preferencialmente superior a cerca de 5 ml/L e, mais preferencialmente, superior a cerca de 10 ml/L. Para além de certas concentrações, no entanto, a adição de um traço de metal ao meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos microrganismos. Por conseguinte, a quantidade de tal solução de traços de metais adicionada ao meio de cultura é normalmente inferior a cerca de 100 ml/L, preferencialmente inferior a cerca de 50 ml/L e, mais preferencialmente, inferior a cerca de 30 ml/L. Deve-se notar que, para além da adição de metais em uma solução de estoque, os componentes individuais podem ser adicionados separadamente, cada um de forma independente dentro de intervalos correspondentes aos valores dos componentes ditados pelos intervalos acima da solução de traços de metais.

[0084] Além de pantotenato ou B5, os quais podem estar ausentes ou presentes a partir do meio de cultura, dependendo da fase de fermentação, o meio de cultura pode incluir outras vitaminas, tais como biotina, cálcio, pantotenato, inositol, piridoxina - HC1 e tiamina -HC1. Essas vitaminas podem ser adicionadas ao meio de cultura como uma solução estoque que, por conveniência, pode ser preparada separadamente a partir do resto do meio de cultura. Para além de certas concentrações, no entanto, a adição de vitaminas ao meio de cultura não é vantajosa para o crescimento dos microrganismos.

[0085] Os métodos de fermentação aqui descritos podem ser realizados nos modos de cultura convencionais, que incluem, sem que estejam limitados a, lote, semi-contínuo, reciclo de células contínuo ou semi-contínuo. Em algumas modalidades, a fermentação é realizada em modo semi-contínuo. Em tal caso, alguns dos componentes do meio durante a cultura de pantotenato estão esgotados, incluindo durante a fase de produção da fermentação. Em algumas modalidades, a cultura pode ser suplementada com concentrações relativamente elevadas de tais componentes no início, por exemplo, da fase de produção, de modo que o crescimento e/ou a produção de compostos HACD é suportada por um período de tempo antes que as adições sejam necessárias. As gamas preferidas destes componentes são mantidas ao longo da cultura, fazendo adições conforme os níveis são esgotados pela cultura. Os níveis dos componentes do meio de cultura podem ser monitorados por, por exemplo, amostragem do meio de cultura e ensaio periódico para concentrações. Alternativamente, uma vez que um processo de cultura padrão é desenvolvido, adições podem ser feitas em intervalos de tempo correspondentes a níveis conhecidos, em tempos particulares durante toda a cultura. Como será reconhecido por aqueles versados na técnica, a taxa de consumo de nutrientes aumenta durante a cultura de células, conforme a densidade dos aumentos médios. Além disso, para evitar a introdução de microrganismos estranhos no meio de cultura, a adição é realizada usando métodos assépticos de adição, tal como são conhecidos na técnica. Além disso, uma pequena quantidade de agente anti-espumante pode ser adicionada durante a cultura.

[0086] A temperatura do meio de cultura pode ser qualquer temperatura apropriada para o crescimento das células geneticamente modificadas e/ou para produção de compostos HACD. Por exemplo, antes da inoculação do meio de cultura com um inoculo, o meio de cultura pode ser trazida para e mantida a uma temperatura de intervalo a partir de cerca de 20°C até cerca de 45°C, preferencialmente a uma temperatura de intervalo a partir de cerca de 25°C até cerca de 40°C e, mais preferencialmente, do intervalo de cerca de 28°C até cerca de 32°C.

[0087] O pH do meio de cultura pode ser controlado por meio da adição de ácido ou base ao meio de cultura. Em tais casos, quando a amónia é utilizada para controlar o pH, também serve convenientemente como uma fonte de nitrogênio no meio de cultura. Preferencialmente, o pH é mantido entre cerca de 3,0 a cerca de 8,0, mais preferivelmente entre cerca de 3,5 a cerca de 7,0 e, mais preferencialmente, entre cerca de 4,0 a cerca de 6,5.

[0088] O meio de cultura também pode ser mantido tendo um teor de oxigênio dissolvido durante o curso da cultura para manter o crescimento celular e para manter o metabolismo celular para a produção de compostos HACD. A concentração de oxigênio no meio de cultura pode ser monitorada através de métodos conhecidos, tais como através da utilização de um eletrodo de oxigênio. Oxigênio pode ser adicionado ao meio de cultura utilizando métodos conhecidos na técnica, por meio de agitação e de arejamento do meio de agitação, agitação ou aspersão. Preferencialmente, a concentração de oxigênio no meio de cultura fica no intervalo a partir de cerca de 20% a cerca de 100% do valor de saturação de oxigênio no meio à base sobre a solubilidade do oxigênio no meio de cultura, à pressão atmosférica e a uma temperatura do intervalo de cerca de 20°C até cerca de 40°C. Gotas periódicas na concentração de oxigênio abaixo deste intervalo podem ocorrer durante a cultura, no entanto, sem afetar adversamente a cultura.

[0089] Apesar de arejamento do meio ter sido descrito aqui em relação à utilização de ar, outras fontes de oxigênio podem ser usadas. Particularmente útil é o uso de um gás de gaseificação que contém uma fração de volume de oxigênio maior do que a fração de volume de oxigênio no ar ambiente. Além disso, esses gases de arejamento podem incluir outros gases, os quais não afetam negativamente a cultura.

[0090] Em algumas modalidades, a concentração de fonte de carbono, tais como a concentração de glicose do meio de cultura, é monitorada durante a cultura. A concentração de glicose do meio de cultura pode ser monitorada utilizando técnicas conhecidas, tais como, por exemplo, a utilização do ensaio da enzima glicose-oxidase on a cromatografia líquida de alta pressão, que pode ser utilizada para monitorar a concentração de glicose no sobrenadante, por exemplo, um componente de célula livre do meio de cultura. Como foi referido anteriormente, a concentração de fonte de carbono deve ser mantida abaixo do nível a que a inibição do crescimento celular ocorre. Embora essa concentração possa variar de organismo para organismo, para a glicose como fonte de carbono, a inibição do crescimento celular ocorre em concentrações de glicose superiores a cerca de 60 g/L, e pode ser determinada facilmente por tentativa. Por conseguinte, quando a glicose é utilizada como uma fonte de carbono, a glicose é preferivelmente alimentada ao fermentador e mantida abaixo dos limites de detecção. Alternativamente, a concentração de glicose no meio de cultura é mantida do intervalo de cerca de 1 g/L a cerca de 100 g/L, mais preferencialmente, no intervalo de cerca de 2 g/L a cerca de 50 g/L e, ainda mais preferencialmente, do intervalo de cerca de 5 g/L a cerca de 20 g/L. Embora a concentração de fonte de carbono possa ser mantida dentro dos níveis desejados por adição de, por exemplo, uma solução de glucose substancialmente pura, é aceitável e pode ser preferível manter a concentração de fonte de carbono do meio de cultura por adição de alíquotas do meio original de cultura. A utilização de alíquotas do meio de cultura original pode ser desejável, porque as outras concentrações de nutrientes no meio (por exemplo, as fontes de nitrogênio e de fosfato) podem ser mantidas ao mesmo tempo. Do mesmo modo, as concentrações de traços de metais podem ser mantidas no meio de cultura por adição de alíquotas da solução de traços de metais.

6.2.3 Recuperação de Compostos HACD

[0091] Uma vez que o HACD é produzido pela célula hospedeira, pode ser recuperado ou isolado para utilização subsequente usando qualquer separação adequada e os métodos de purificação conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, uma fase orgânica compreendendo o HACD é separada a partir da fermentação por meio de centrifugação. Noutras modalidades, uma fase orgânica compreendendo o composto HACD se separa espontaneamente a partir da fermentação. Noutras modalidades, uma fase orgânica compreendendo o composto derivado HACD é separada a partir da fermentação pela adição de um desemulsificador e/ou um agente de nucleação para a reação de fermentação. Exemplos ilustrativos de desemulsificadores incluem floculantes e coagulantes. Exemplos ilustrativos de agentes de nucleação incluem gotas do próprio composto HACD e solventes orgânicos, tais como o dodecano, isopropilo miristrato e oleato de metilo.

[0092] O composto HACD produzido nestas células pode estar presente no sobrenadante da cultura e/ou associado com as células hospedeiras. Em modalidades em que o composto HACD é associado com a célula hospedeira, a recuperação do HACD pode compreender um método de permeabilização ou lisar as células. Alternativamente ou simultaneamente, o HACD no meio de cultura pode ser recuperado usando um processo de recuperação, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia, extração, extração de solvente, separação de membrana, eletrodiálise, osmose inversa, destilação, derivatização química e cristalização.

[0093] Em algumas modalidades, o composto HACD é separado de outros produtos que podem estar presentes na fase orgânica. Em algumas modalidades, a separação é conseguida utilizando adsorção, a destilação, a extração de gás-líquido (stripping), a extração líquido-líquido (solvente de extração), ultrafiltração e técnicas cromatográficas padrão.

[0094] Em algumas modalidades, o composto HACD puro é recuperado, por exemplo, pelo menos cerca de 40% puro, pelo menos cerca de 50% puro, pelo menos cerca de 60% puro, pelo menos cerca de 70% puro, pelo menos cerca de 80 % puro, pelo menos cerca de 90% puro, pelo menos cerca de 95% puro, pelo menos cerca de 98% puro ou superior a 98% puro, em que "puro", no contexto de um composto HACD, refere-se a um composto HACD que está livre de outros compostos HACD contaminantes etc.

6.3 Microrganismos Geneticamente Modificados

[0095] São proporcionados aqui microorganismos geneticamente modificados (por exemplo, uma célula de Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada) que produzem composto derivado de acetil-CoA heterólogo (HACD) modificado. Os microrganismos geneticamente modificados produzem maiores quantidades de um ou mais compostos biossintetizados a partir de acetil-CoA em relação a um microrganismo de origem sem as modificações genéticas aqui descritas.

[0096] Os métodos para a modificação genética de micróbios utilizando vetores de expressão ou construções de integração cromossômica, por exemplo, para efetuar a produção aumentada de um ou mais compostos HACD em uma célula hospedeira, são bem conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Sherman, F., et ai, Methods levedura Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (1978),. Guthrie, C, et al. (Eds.) Guia Para Genética e Biologia Molecular de leveduras vol. 194, Academic Press, San Diego (1991), Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque. E Ausubel et al, eds, Current Edição, protocolos atuais em biologia molecular, Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, NY, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência. Além disso, a inibição da expressão do gene, por exemplo, o que resulta em produção aumentada de um ou mais compostos HACD na célula, pode ser conseguida por eliminação, mutação e/ou o rearranjo de genes. Ela também pode ser realizada com o uso de ARN anti-sentido, siRNA, miRNA, ribozimas, ADN de cadeia tripla e transcrição e/ou inibidores de tradução. Além disso, os transpostos podem ser utilizados para interromper a expressão do gene, por exemplo, inserindo-os entre o promotor e a região de codificação, ou entre dois genes adjacentes para inativar um ou ambos os genes.

[0097] Em algumas modalidades, produção aumentada de composto HACD na célula é feita através da utilização de vetores de expressão para expressar uma proteína em particular, por exemplo, uma proteína envolvida numa via biossintética, como descrito acima. Geralmente, os vetores de expressão são moléculas de polinucletídeos recombinantes compreendendo sinais de replicação e sequências de controle de expressão, por exemplo, promotores e terminadores, ligados operacionalmente a uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipéptido. Os vetores de expressão úteis para expressão de sequências de nucleótidos que codificam polipéptido incluem vetores virais (por exemplo, retrovirus, adenovirus e vírus adeno-associados), os vetores de plasmídeo, e cosmídeos. Exemplos ilustrativos de vetores de expressão adequados para utilização em células de levedura incluem, sem que estejam limitados a, CEN/ ARS 2p e plasmídeos. Exemplos ilustrativos de promotores adequados para utilização em células de levedura incluem, sem que estejam limitados a, promotor do gene de K. lactis, promotor do gene de Saccharomyces cerevisiae PGK1, o promotor do gene TDH3 de Saccharomyces cerevisiae, os promotores reprimível TEF1, por exemplo, o promotor do gene CTR3 de Saccharomyces cerevisiae, e promotores induzíveis, por exemplo, promotores indutíveis galactose de Saccharomyces cerevisiae (por exemplo, promotores dos genes GALI, GAL7 e GAL10).

[0098] Vetores de expressão e construtos de integração cromossômica podem ser introduzidos em células microbianas por meio de qualquer método conhecido por uma pessoa versada na técnica sem limitação. Vide, por exemplo, Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1292-3 (1978); Cregg et al., Mol. Cell. Biol.5:3376-3385 (1985); Patente dos EUA No. 5.272.065; Goeddel et al., eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression — A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; and Ausubel et al., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY. Técnicas exemplares incluem, sem que estejam limitadas a, esferoplastia, eletroporação, transformação mediada por PEG 1000 e acetato de lítio ou transformação mediada por cloreto de lítio.

6.3.1 Células Hospedeiras

[0099] Células úteis nos métodos e nas composições providas no presente documento incluem qualquer célula capaz de produzir, de modo natural ou recombinante, um composto HACD, por exemplo, um isoprenóide, um policetídeo, um ácido graxo e semelhantes. Em algumas modalidades, a célula é uma célula procariótica. Em algumas modalidades, a célula é uma célula bacteriana. Em algumas modalidades, é célula é uma célula Escherichia coli. Em algumas modalidades, a célula é uma célula eucariótica. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de ovário de hamster chinês (CHO), uma célula COS-7, uma célula de fibroblasto de rato, uma célula de carcinoma embrionário ou uma célula de pedúnculo embrionário de rato. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de inseto. Em algumas modalidades, a célula é uma célula S2, uma célula de Schneider, uma S12, uma célula 5B1 -4, uma célula Tn5 ou uma célula Sf9. Em algumas modalidades, a célula é uma célula eucariótica de organismo unicelular.

[00100] Em algumas modalidades, a célula é uma célula bacteriana micelial. Em algumas modalidades, a célula bacteriana micelial é da classe actinomicetos. Em modalidades particulares, a célula bacteriana micelial é do gênero Streptomyces, por exemplo, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces avermitilis, Streptomyces azureus, Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces curacoi, Streptomyces erythraeus, Streptomyces fradiae, Streptomyces galilaeus, Streptomyces glaucescens, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces lividans, Streptomyces parvulus, Streptomyces peucetius, Streptomyces rimosus, Streptomyces roseofulvus, Streptomyces thermotolerans, Streptomyces violaceoruber.

[00101] Noutra modalidade, a célula é uma célula fúngica. Numa modalidade mais particular, a célula é uma célula de levedura. Leveduras úteis nos métodos e composições providas no presente documento incluem leveduras que foram depositadas com depositórios de microorganismos (por exemplo, IFO, ATCC, etc.) e pertencem ao gênero Aciculoconidium, Ambrosiozyma, Arthroascus, Arxiozyma, Ashbya, Babjevia, Bensingtonia, Botryoascus, Botryozyma, Brettanomyces, Bullera, Bulleromyces, Candida, Citeromyces, Clavispora, Cryptococcus, Cystofilobasidium, Debaryomyces, Dekkara, Dipodascopsis, Dipodascus, Eeniella, Endomycopsella, Eremascus, Eremothecium, Erythrobasidium, Fellomyces, Filobasidium, Galactomyces, Geotrichum, Guilliermondella, Hanseniaspora, Hansenula, Hasegawaea, Holtermannia, Hormoascus, Hyphopichia, Issatchenkia, Kloeckera, Kloeckeraspora, Kluyveromyces, Kondoa, Kuraishia, Kurtzmanomyces, Leuc o sporidium, Lipomyces, Lodderomyces, Malassez.ia, Metschnikowia, Mrakia, Myxozyma, Nadsonia, Nakazawaea, Nematospora, Ogataea, Oosporidium, Pachysolen, Phachytichospora, Phaffia, Pichia, Rho do sporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycodes, Saccharomycopsis, Saitoella, Sakaguchia, Saturnospora, Schizoblastosporion, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, Sporidiobolus, Sporobolomyces, Sporopachydermia, Stephanoascus, Sterigmatomyces, Sterigmatosporidium, Symbiotaphrina, Sympodiomyces, Sympodiomycopsis, Torulaspora, Trichosporiella, Trichosporon, Trigonopsis, Tsuchiyaea, Udeniomyces, Waltomyces, Wickerhamia, Wickerhamiella, Williopsis, Yamadazyma, Yarrowia, Zygoascus, Zygosaccharomyces, Zygowilliopsis e Zygozyma, dentre outros.

[00102] Em modalidades particulares, leveduras úteis nos métodos e composições providas no presente documento incluem Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera bruxellensis, Kluyveromyces lactis(anteriormente chadama Saccharomyces lactis), Kluveromyces marxianus, Arxula adeninivorans, ou Hansenula polymorpha (agora conhecida como Pichia angusta). Em algumas modalidades, o micróbio é uma estirpe do gênero Candida,tais como Candida lipolytica, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida pseudotropicalis ou Candida utilis.

[00103] Numa modalidade particular, a célula é uma célula Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, a estirpe da célula Saccharomyces cerevisiaecell é selecionada a partir do grupo consistindo de levedura de Baker, CBS 7959, CBS 7960, CBS 7961, CBS 7962, CBS 7963, CBS 7964, IZ-1904, TA, BG-1, CR-1, SA-1, M-26, Y-904, PE-2, PE-5, VR- 1, BR-1, BR-2, ME-2, VR-2, MA-3, MA-4, CAT-1, CB-1, NR-1, BT-1 e AL- 1. Em algumas modalidades, a estirpe da Saccharomyces cerevisiae é selecionada a partir do grupo consistindo de PE-2, CAT-1, VR-1, BG-1, CR-1 e SA-1. Numa modalidade particular, a estirpe da Saccharomyces cerevisiae é PE-2. Noutra modalidade particular, a estirpe da Saccharomyces cerevisiae é CAT-1. Noutra modalidade particular, a estirpe da Saccharomyces cerevisiae éBG-1.

[00104] Em algumas modalidades, a célula é uma célula microbiana. Noutras modalidades, a célula é uma célula microbiana diploide. Em algumas modalidades, a célula é heterozigota. Noutras modalidades, a célula é homozigoto diferente para seu alelo de tipo acasalamento (isto é, se a célula deve esporular, as quatro células microbianas haploides resultantes seriam geneticamente idênticas, exceto por seu alelo de tipo acasalamento, o qual, em duas das células haploides, seria o alelo de tipo de acasalamento e, nas outras duas células haploides, seria o alfa de tipo acasalamento).

[00105] Em algumas modalidades, a célula é uma célula que é adequada para fermentação industrial, por exemplo, fermentação de bioetanol. Em modalidades particulares, a célula é condicionada a subsistir diante de alta concentração de solvente, alta temperatura, utilização expandida de substrato, limitação de nutriente, estresse osmótico devido à contaminação por bactéria, por sulfeto e por acidez, ou combinações destes, as quais são condições de estresse reconhecidas do ambiente de fermentação industrial.

[00106] São providas abaixo as células exemplares que produzem composto HACD, por exemplo, células que produzem de modo recombinante os isoprenóides, policetídeos e os ácidos graxos, e também os métodos para gerar tais células.

6.4 Produção de Isoprenóides

[00107] Em algumas modalidades, o composto HACD é um isoprenóide. Isoprenóides são derivados de IPP, o qual, em levedura, é biossintetizado por enzimas da via MEV (Figura 6). IPP gerado via MEV pode ser convertido para o seu isômero, DMAPP, condensado e modificado através da ação de várias enzimas adicionais para formar compostos de isoprenóide HACD simples e mais complexos.

[00108] Em algumas modalidades, o microorganismo geneticamente modificado divulgado no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima selecionada a partir do grupo consistindo de enzimas via MEV, IPP isomerase, poliprenil sintase e enzimas que podem modificar um poliprenil para formar um hemiterpeno, um monoterpeno, um sesquiterpeno, um diterpeno, um triterpeno, um tetraterpeno, um politerpeno, um composto esteróide, um carotenóide ou um composto HACD modificado.

[00109] Em algumas modalidades, a célula produzindo isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifuca uma enzima que pode condensar duas moléculas de acetil-coenzama A para formar acetoacetil-CoA, por exemplo, um acetyl-CoA tiolase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam tal enzima incluem, sem que A&ITI estejam limitados a: (NC_000913 REGION: 2324131.2325315; Escherichia coli), (D49362; Paracoccus denitrificans) e (L20428; Saccharomyces cerevisiae).

[00110] Em algumas modalidades, a célula produzindo isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que pode condensar acetoacetil-CoA com outra molécula de acetil- CoA para formar 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA), por exemplo, uma HMG-CoA sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam tal enzima incluem, sem que estejam limitados a: (NC_001145. complemento 19061.20536; Saccharomyces cerevisiae), (X96617; Saccharomyces cerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kitasatospora griseola), (BT007302; Homo sapiens),e (NC_002758, Locus tag SAV2546, GenelD 1122571; Staphylococcus aureus).

[00111] Em algumas modalidades, a célula produzindo isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que pode converter HMG-CoA em mevalonato, por exemplo, uma HMG-CoA redutase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam tal enzima incluem, sem que estejam limitados a: (NM_206548; Drosophila melanogaster), (NC_002758, Locus tag SAV2545, GenelD 1122570; Staphylococcus aureus),(NM_204485; Gallus gallus),(AB015627; Streptomyces sp. KO 3988), (AF542543; Nicotiana atlenuatd), (AB037907; Kitasatospora griseola), (AX128213, provendo a sequência que codifica um HMGR truncado; Saccharomyces cerevisiae) e (NC_001145: complemento (115734.118898; Saccharomyces cerevisiae).

[00112] Em algumas modalidades, a célula produzindo isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que converte mevalonato em mevalonato 5-fosfato, por exemplo, um mevalonato quinase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam tal enzima incluem, sem que estejam limitados a: (L77688; Arabidopsis thaliana) e (X55875; Saccharomyces cerevisiae).

[00113] Em algumas modalidades, a célula produzindo isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que converte mevalonato 5-fosfato em mevalonato 5-pirofosfato, por exemplo, uma quinase fosfomevalonato. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam tal enzima incluem, sem que estejam limitados a: (AF429385; Hevea brasiliensis), (NM_006556; Homo sapiens)e (NC_001145. complement 712315.713670; Saccharomyces cerevisiae).

[00114] Em algumas modalidades, a célula produzindo isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que converte mevalonato 5-pirofosfato em IPP, por exemplo, um mevalonato pirofosfato decarboxilase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam tal enzima incluem, sem que estejam limitados a: (X97557; Saccharomyces cerevisiae), (AF290095; Enterococcus faecium) e (U49260; Homo sapiens).

[00115] Em algumas modalidades, a célula produzindo isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que converte IPP gerado via MEV em DMAPP, por exemplo, uma IPP isomerase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam tal enzima incluem, sem que estejam limitados a: (NC_000913, 3031087..3031635; Escherichia coli) e (AF082326; Haematococcus pluvialis).

[00116] Em algumas modalidades, a célula produzindo isoprenóide compreende, adicionalmente, uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma poliprenil sintase que pode condensar moléculas IPP e/ou DMAPP para formar compostos de poliprenil contendo mais do que cinco carbonos.

[00117] Em algumas modalidades, a célula produzindo isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que condensa uma molécula de IPP com uma molécula de DMAPP para formar uma molécula de geranil pirofosfato (“GPP”), por exemplo, uma GPP sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam tal enzima incluem, sem que estejam limitados a: (AF513111; Abies grandis), (AF513112; Abies grandis), (AF513113; Abies grandis), (AY534686; Antirrhinum majus), (AY534687; Antirrhinum majus), (Y17376; Arabidopsis thaliana), (AE016877, Focus API 1092; Bacillus cereus;ATCC 14579), (AJ243739; Citrus sinensis'), (AY534745; Clarkia breweri), (AY953508; Ips pini), (DQ286930; Lycopersicon esculentum), (AF182828; Mentha x piperita), (AF182827; Mentha x piperita), (MPI249453; Mentha x piperita), (PZE431697, Locus CAD24425; Paracoccus zeaxanthinifaciens), (AY866498; Picrorhiza kurrooa), (AY351862; Vitis vinifera), e (AF203881, Locus AAF12843; Zymomonas mobilis).

[00118] Em algumas modalidades, a célula produzindo isoprenóide compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que condensa duas moléculas de IPP com uma molécula de DMAPP, ou acidiona uma molécula de IPP a uma molécula de GPP, para formar uma molécula de farnesil pirofosfato (“FPP”), por exemplo, uma FPP sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam tal enzima incluem, sem que estejam limitados a: (ATU80605; Arabidopsis thaliana), (ATHFPS2R; Arabidopsis thaliana), (AAU36376; Artemisia annua), (AF461050; Bos taurus), (D00694; Escherichia coli K-12), (AE009951, Locus AAL95523; Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586), (GFFPPSGEN; Gibberella fujikuroi), (CP000009, Locus AAW60034; Gluconobacter oxydans621H), (AF019892; Helianthus annuus), (HUMFAPS; Homo sapiens),(KLPFPSQCR; Kluyveromyces lactis), (LAU15777; Lupinus albus), (LAU20771; Lupinus albus), (AF309508; Mus musculus), (NCFPPSGEN; Neurospora crassa), (PAFPS1; Parthenium argentatum), (PAFPS2; Parthenium argent atum), (RATFAPS; Rattus norvegicus), (YSCFPP; Saccharomyces cerevisiae), (D89104; Schizosaccharomyces pombe), (CP000003, Locus AAT87386; Streptococcus pyogenes), (CP000017, Locus AAZ51849; Streptococcus pyogenes), (NC_008022, Locus YP_598856; Streptococcus pyogenes MGAS 10270), (NC_008023, Locus YP_600845; Streptococcus pyogenes MGAS2096), (NC_008024, Locus YP_602832; Streptococcus pyogenes MGAS 10750), (MZEFPS; Zea mays), (AE000657, Locus AAC06913; Aquifex aeolicus VF5), (NM_202836; Arabidopsis thaliana), (D84432, Locus BAA 12575; Bacillus subtilis), (U12678, Locus AAC28894; Bradyrhizobium japonicum USDA 110), (BACFDPS; Geobacillus stearothermophilus), (NC_002940, Locus NP_873754; Haemophilus ducreyi 35000HP), (L42023, Locus AAC23087; Haemophilus influenzae Rd KW20), (J05262; Homo sapiens), (YP_395294; Lactobacillus sakei subsp. sakei 23K), (NC_005823, Locus YP_000273; Leptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz Ll- 130), (AB003187; Micrococcus luteus), (NC.002946, Locus YP_208768; Neisseria gonorrhoeae FA 1090), (U00090, Locus AAB91752; Rhizobium sp. NGR234), (J05091; Saccharomyces cerevisae), (CP000031, Locus AAV93568; Silicibacter pomeroyi DSS-3), (AE008481, Locus AAK99890; Streptococcus pneumoniae R6), e (NC_004556, Locus NP 779706; Xylella fastidiosaTemeculal).

[00119] Em algumas modalidades, a célula produzindo isoprenóide compreende, adicionalmente, uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que combina IPP e DMAPP ou IPP e FPP para formar geranilgeranil pirofosfato (“GGPP”). Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam uma enzima incluem, sem que estejam limitados a: (ATHGERPYRS; Arabidopsis thaliana), (BT005328; Arabidopsis thaliana), (NM_119845; Arabidopsis thaliana),(NZ_AAJM010003 80, Locus ZP_00743052; Bacillus thuringiensis serovar israelensis, ATCC 35646 sql563), (CRGGPPS; Catharanthus roseus), (NZ_AABF02000074, Locus ZP_00144509; Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii, ATCC 49256), (GFGGPPSGN; Gibberella fujikuroi), (AY371321; Ginkgo biloba), (AB055496; Hevea brasiliensis), (AB017971; Homo sapiens), (MCI276129; Mucor circinelloides f. lusitanicus), (ABO 16044; Mas musculus), (AABXO1000298, Locus NCU01427; Neurospora crassa),(NCU20940; Neurospora crassa),(NZ_AAKL01000008, Locus ZP_00943566; Ralstonia solanacearum UW551), (AB118238; Rattus norvegicus), (SCU31632; Saccharomyces cerevisiae), (AB016095; Synechococcus elongates), (SAGGPS; Sinapis alba), (SSOGDS; Sulfolobus acido caldarius), (NC_007759, Locus YP_461832; Syntrophus aciditrophicus SB), (NC_006840, Locus YP.204095; Vibrio fischeri ESI 14), (NM_112315; Arabidopsis thaliana), (ERWCRTE; Pantoea agglomerans), (D90087, Locus BAA14124; Pantoea ananatis), (X52291, Locus CAA36538; Rhodobacter capsulatus), (AF195122, Locus AAF24294; Rhodobacter sphaeroides) e (NC_004350, Locus NP_721015; Streptococcus mutans UA159).

[00120] Em algumas modalidades, o microorganismo geneticamente modificado divulgado no presente documento compreende, adicionalmente, uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que modifica um poliprenil para formar um hemiterpeno, um monoterpeno, um sesquiterpeno, um diterpeno, um triterpeno, um tetraterpeno, um politerpeno, um composto esteróide, um carotenóide ou um composto HACD modificado.

[00121] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma careno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo adequadas incluem, sem que estejam limitados a: (AF461460, REGION 43..1926; Picea abies) e (AF527416, REGION: 78.. 1871; Salvia stenophylla).

[00122] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica um geraniol sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo adequadas incluem, sem que estejam limitados a: (AJ457070; Cinnamomum tenuipilum), (AY362553; Ocimum basilicum),(DQ234300; Perilla frutescens strain 1864), (DQ234299; Perilla citriodora strain 1861), (DQ234298; Perilla citriodora strain 4935) e (DQ088667; Perilla citriodora').

[00123] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma linalool sintase. Exemplos ilustrativos de uma sequência adequada de nucleotídeo incluem, sem que estejam limitados a: (AF497485; Arabidopsis thaliana), (AC002294, Locus AAB71482; Arabidopsis thaliana), (AY059757; Arabidopsis thaliana), (NM_104793; Arabidopsis thaliana), (AF154124; Artemisia annua),(AF067603; Clarkia breweri), (AF067602; Clarkia concinna), (AF067601; Clarkia breweri), (U58314; Clarkia breweri), (AY840091; Lycopersicon esculentum), (DQ263741; Lavandula angustifolia), (AY083653; Mentha citrate),(AY693647; Ocimum basilicum), (XM_463918; Oryza sativa), (AP004078, Locus BAD07605; Oryza sativa), (XM-463918, Locus XP.463918; Oryza sativa), (AY917193; Perilla citriodora), (AF271259; Perilla frutescens), (AY473623; Picea abies), (DQ195274; Picea sitchensis)e (AF444798; Perilla frutescens var. crispa cultivar No. 79).

[00124] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma limoneno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo adequadas incluem, sem que estejam limitados a: (+)-limoneno sintases (AF514287, REGION: 47.1867; Citrus limon) and (AY055214, REGION: 48.1889; Agastache rugosa) e (-)-limoneno sintases (DQ195275, REGION: 1.1905; Picea sitchensis), (AF006193, REGION: 73.1986; Abies grandis) e (MHC4SLSP, REGION: 29.1828; Mentha spicata).

[00125] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma mirceno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo adequadas incluem, sem que estejam limitados a: (U87908; Abies grandis), (AY195609; Antirrhinum majus), (AY195608; Antirrhinum majus), (NM_127982; Arabidopsis thaliana TPS10), (NM_113485; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (NM_113483; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (AF271259; Perilla frutescens), (AY473626; Picea abies), (AF369919; Picea abies) e (AJ304839; Quercus ilex).

[00126] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma ocimeno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo adequadas incluem, sem que estejam limitados a: (AY 195607; Antirrhinum majus), (AY195609; Antirrhinum majus), (AY195608; Antirrhinum majus), (AK221024; Arabidopsis thaliana), (NM_113485; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (NM_113483; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN), (NM_117775; Arabidopsis thaliana ATTPS03), (NM_001036574; Arabidopsis thaliana ATTPS03), (NM_127982; Arabidopsis thaliana TPS10), (ABI 10642; Citrus unshiuCitMTSL4) e (AY575970; Lotus corniculatus var. japonicus).

[00127] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma a-pineno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo adequadas incluem, sem que estejam limitados a: (+) a-pineno sintase (AF543530, REGION: 1.1887; Pinus taeda), (-)α-pineno sintase (AF543527, REGION: 32.1921; Pinus taeda),and (+)/(-)α-pineno sintase (AGU87909, REGION: 6111892; Abies grandis).

[00128] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma β-pineno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo adequadas incluem, sem que estejam limitados a: (-) β-pineno sintase (AF276072, REGION: 1.1749; Artemisia annua) and (AF514288, REGION: 26.1834; Citrus limon).

[00129] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma sabineno sintase. Um exemplo ilustrativo de uma sequência adequada de nucleotídeo inclui, sem que esteja limitada a, AF051901, REGION: 26.1798 de Salvia officinalis.

[00130] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma y-terpineno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo adequadas incluem, sem que estejam limitados a: (AF514286, REGION: 30.1832 de Citrus limon) e (ABI 10640, REGION 1.1803 de Citrus unshiu).

[00131] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma terpinoleno sintase. Exemplos ilustrativos de uma sequência adequada de nucleotídeo incluem, sem que estejam limitados a: (AY693650 de Oscimum basilicum) e (AY906866, REGION: 10.1887 de Pseudotsuga menziesii).

[00132] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma amorfadieno sintase. Um exemplo ilustrativo de uma sequência adequada de nucleotídeo é SEQ ID NO. 37 da Publicação de Patente dos EUA No. 2004/0005678.

[00133] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma a-farneseno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo adequadas include, sem que estejam limitados a DQ309034 de Pyrus communis cultivar d'Anjou(pera; nome do gene AFS1) e AY182241 de Malus domestica (maçã; gene AFS1). Pechouus et al., Planta 219(1):84-94 (2004).

[00134] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica umaa β-farneseno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo adequadas incluem, sem que estejam limitados a, número de acesso ao banco de genes AF024615 de Mentha x piperita(hortelã-pimenta; gene Tspall), e AY835398 de Artemisia annua. Picaud et al., Phytochemistry 66(9): 961-967 (2005).

[00135] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma farnesol sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo adequadas incluem, sem que estejam limitados a, número de acesso a banco de genes AF529266 de Zea mayse YDR481C de Saccharomyces cerevisiae (gene Pho8). Song, L., Applied Biochemistry and Biotechnology128:149-158 (2006).

[00136] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma nerolidol sintase. Um exemplo ilustrativo de uma sequência adequada de nucleotídeo inclui, sem que esteja limitado a, AF529266 de Zm mays(milho; gene tpsl).

[00137] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma patchouliol sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo adequadas incluem, sem que estejam limitados a, AY508730 REGION: 1.1659 de Pogostemon cablin.

[00138] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma nootcatona sintase. Exemplos ilustrativos de uma sequência adequada de nucleotídeo incluem, sem que estejam limitados a, AF441124 REGION: 1.1647 de Citrus sinensise AY917195 REGION: 1.1653 de Perilla frutescens.

[00139] Em algumas modalidades, o nucleotídeo heterólogo codifica uma abietadieno sintase. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo adequados include, sem que estejam limitados a: (U50768; Abies grandis) e (AY473621; Picea abies).

[00140] Em algumas modalidades, o isoprenóide produzido pela célula é um C5 isoprenóide. Esses compostos são derivados de uma unidade de isopreno e também são chamados de hemiterpenos. Um exemplo ilustrativo de um hemiterpoeno é isopreno. Noutras modalidades, o isoprenóide é um Cio isoprenóide. Esses compostos são derivados de duas unidades de isopreno e também são chamados de monoterpenos. Exemplos ilustrativos de monoterpenos são limoneno, citranelol, geraniol, mentol, perilil álcool, linalool, tujona e mirceno. Noutras modalidades, o isoprenóide é um C15 isoprenóide. Esses compostos são derivados de três unidades de isopreno e também são chamadas sesquiterpenos. Exemplos ilustrativos de sesquiterpenos são periplanona B, gingcolídeo B, amorfadieno, artemisinina, ácido artemisínico, valenceno, nootkatona, epi-cedrol, epi-aristoloqueno, farnesol, gossipol, sanonina, periplanona, forscolina e patchoulol (o qual também é conhecido como patchouli álcool). Noutras modalidades, o isoprenóide é um C20 isoprenóide. Esses compostos são derivados de quatro unidades de isopreno e também são chamados de diterpenos. Exemplos ilustrativos de diterpenos são casbeno, eleuterobina, paclitaxel, prostratina, pseudopterosina e taxadieno. Ainda noutras modalidades, o isoprenóide é um C20+ isoprenóide. Esses compostos são derivados a partir de mais do que quatro unidades de isopreno e incluem: triterpenos (compostos C30 isoprenóide derivados a partir de 6 unidades de isopreno) tais como amburosídeo E, bruceantina, testosterona, progesterona, cortisona, digitoxina e squaleno; tetraterpenos (compostos C40 isoprenóide derivados a partir de 8 isoprenóides), tais como β-caroteno; e politerpenos (compostos C40+ isoprenóide derivados a partir de mais do que 8 unidades de isopreno) tal como poliisopreno. Em algumas modalidades, 0 isoprenóide é selecionado a partir do grupo consistindo de abietadieno, amorfadieno, careno, a-farneseno, β-farneseno, farnesol, geraniol, geranilgeraniol, isopreno, linalool, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, patchoulol, β-pineno, sabineno, y-terpineno, terpinoleno e valenceno. Compostos isoprenóide também incluem, sem que estejam limitados a, carotenóides (tais como licopeno, a- e β-caroteno, α- e β- criptoxantina, bixina, zeaxantina, astaxantina e luteína), compostos esteróides e compostos que são compostos de isoprenóides modificados por outros grupos químicos, tais como alcalóides terpeno misturados e coenzimas Q-10.

6.5 Produção de Policetídeos

[00141] Em algumas modalidades, o composto derivado de acetil é um policetídeo. Policetídeos são sintetizados por reações sequenciais catalizadas por uma coleção de atividades de enzima chamadas de policetídeo sintases (PKSs), as quais são grandes complexos de proteína multi-enzima que contêm um grupo coordenado de locais ativos. Biossíntese de policetídeo procede passo a passo, partindo de blocos simples de formação de 2-, 3-, 4-carbonos, tais como acetil-CoA, propionil CoA, butiril-CoA e seus derivados ativados, malonil-, metilmalonil- e etilmalonil-CoA, primeiramente através de condensação decarboxilativa de unidades derivadas de malonil-CoA via reações de condensação Claisen. Os genes PKS são usualmente organizados num operão em aglomerados de bactéria e gene em eucariontes. Três tipos de policetídeo sintases foram caracterizados: policetídeo sintases do tipo I são proteínas grandes, altamente modulares, subdivididas em duas classes: 1) PKSs interativas, as quais reutilizam domínios numa maneira cíclica e 2) PKSs modulares, as quais contêm uma sequência de módulos separados e não repetem domínios. Policetídeo sintases tipo II são agregados de proteínas monofuncionais e policetídeo sintases tipo III não utilizam domínios de proteína veículo acil.

[00142] Biossínteses diferentes de ácido graxo, nas quais cada etapa de alongamento de cadeia sucessiva é seguida por uma sequência fixa de cetoredução, desidratação e enol, redução, conforme descrito abaixo, os intermediários de alongamento de cadeia individual de biossíntese de policetídeos submente todas, algumas ou nenhuma modificação de grupo funcional, resultando num largo número de produtos quimicamente diversos. Graus adicionais de complexidade surgem do uso de unidades de inicialização diferentes e de unidades de alongamento de cadeia, assim como de geração de novos estereo-isômeros.

[00143] A ordem completa da síntese de policetídeo visto que direcionada por uma policetídeo sintase segue (na ordem de terminal N para o terminal C): iniciar ou carregar os blocos iniciais de formação de carbono numa proteína veículo acil, módulos de alongamento, os quais catalisam a extensão da cadeia de crescimento de macrolídeo e módulos de terminação que catalizam a liberação do macrolídeo sinstetizado. Domínios ativos de componente de funcionalidade de enzima separada nessa biossíntese incluem acil-transferases para o carregamento de unidades acil de inicializador, extensor e intermediário; proteínas veículo acil, as quais mantêm o crescimento do macrolídeo como um tiol éster; β-ceto-acil sintases, as quais catalizam extensão de cadeia; β-ceto reductases, responsáveis pela primeira redução para uma funcionalidade álcool; dehidratases, as quais eliminam água para render um tioléster insaturado; enoil redutases, as quais catalizam a redução final para saturação completa; e tiolesterases, as quais catalizam liberação de macrlídeo e ciclização.

[00144] Em algumas modalidades, o microorganismo geneticamente modificado divulgado no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que condensa pelo menos um dentre acetil-CoA e malonil-CoA com uma proteína veículo de acil, por exemplo, uma acil-transferase.

[00145] Em algumas modalidades, o microorganismo geneticamente modificado divulgado no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que condensa um primeiro reagente selecionado a partir do grupo consistindo de acetil-CoA e malonil- CoA com um segundo reagente selecionado a partir do grupo consistindo de malonil-CoA ou metilmalonil-CoA para formar um produto policetídeo, por exemplo, uma β-ceto-acil sintase.

[00146] Em algumas modalidades, o microorganismo geneticamente modificado divulgado no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que reduz um grupo químico β-ceto num composto policetídeo para um grupo β-hidroxi, por exemplo, uma β-ceto redutase.

[00147] Em algumas modalidades, o microorganismo geneticamente modificado divulgado no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que desidrata um grupo químico alcano num composto policetídeo para produzir um alcano α-β- insaturado, por exemplo, uma dehidratase.

[00148] Em algumas modalidades, o microorganismo geneticamente modificado divulgado no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que reduz uma ligação α-β- dupla num composto polipeptídeo para um alcano saturado, por exemplo, uma enoil-redutase.

[00149] Em algumas modalidades, o microorganismo geneticamente modificado divulgado no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que hidrolisa um composto de policetídeo a partir de uma proteína veículo, por exemplo, uma tioesterase.

[00150] Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica KS. Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica AT. Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende mais do que uma sequência de nucleotídeo heterólgo que codifica uma enzima compreendendo uma região catalítica AT. Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica CLF. Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma atividade ACP. Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende mais do que uma sequência de nucleotídeo heterólgo que codifica uma enzima compreendendo uma atividade ACP.

[00151] Numa modalidade particular, a célula produzindo policetídeo compreende um sistem PKS aromático mínimo, por exemplo, sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica KS, uma enzima compreendendo uma região catalítica AT, uma enzima compreendendo uma região catalítica CLF e uma enzima compreendendo uma atividade ACP, respectivamente. Numa modalidade particular, a célula produzindo policetídeo compreende um sistema OKS modular mínimo, por exemplo, sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica KS, uma enzima compreendendo uma região catalítica AT e uma enzima compreendendo uma atividade ACP, respectivamente. Ainda noutra modalidade particular, a célula produzindo policetídeo compreende um sistema aromático modular PKS para a síntese de policetídeo, por exemplo, sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica KS, uma ou mais enzimas compreendendo uma região catalítica AT e uma ou mais enzimas compreendendo uma atividade ACP, respectivamente.

[00152] Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreendendo um sistema PKS mímino, por exemplo, um sistema PKS aromático mínimo ou sistema PKS modular mínimo, compreende, adicionalmente, atividades catalíticas adicionais que podem contribuir para produção do policetídeo de produto final. Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica de ciclase (CYC), a qual facilita a ciclização da coluna nascente de policetídeo. Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica de cetoreductase (KR). Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica de aromatase (ARO). Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica de enoilreductase (ER). Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma região catalítica de tioesterase (TE). Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende, adicionalmente, uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma atividade holo sintase ACP, a qual afeta panteteinilação da ACP.

[00153] Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende, adicionalmente, uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo conferindo uma atividade que modifica pós-síntese de policetídeo. Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende, adicionalmente, uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma atividade glicosilase, a qual afeta modificações pós-síntese de policetídeos, por exemplo, onde policetídeos tendo atividade antibiótica são desejados. Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende, adicionalmente, uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma atividade hidroxilase. Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende, adicionalmente, uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma atividade epoxidase. Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende, adicionalmente, uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima compreendendo uma atividade metilase.

[00154] Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende, adicionalmente, uma ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam uma enzima biossintética incluindo, porém não limitada a, pelo menos uma enzima de via de síntese de policetídeo e enzimas que podem modificar um composto acetil-CoA para formar um produto policetídeo, tal como um composto macrolídeo, um antibiótico, um antifúngico, um composto citostático, um composto anticolesterolêmico, um composto antiparasítico, um composto coccidiostático, um promotor de crescimento animal ou um inseticida. Em algumas modalidades, o composto HACD é um polieno. Em algumas modalidades, o composto HACD é uma lactona cíclica. Em algumas modalidades, o composto HACD compreende um anel de lactona com 14, 15 ou 16-membros. Em algumas modalidades, o composto HACD é um policetídeo selecionado a partir do grupo consistindo de um policetídeo macrolídeo, antibiótico, antifúngico, citostático, anticolesterolêmico, antiparasítico, um coccidiostático, promotor de crescimento animal e inseticida.

[00155] Em algumas modalidades, a célula produzindo policetídeo compreende sequências de nucleotídeo heterólogo, por exemplo, sequências que codificam enzimas PKS e enzimas de modificação de policetídeo capazes de produzir um policetídeo selecionado a partir dos, sem que esteja limitado a, seguinte policetídeos: Avermectin (veide, por exemplo, Patente dos EUA No. 5.252.474; Patente dos EUA No. 4.703.009; Publicação EP No. 118.367; MacNeil et al., 1993, “Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics”; Baltz, Hegeman, & Skatrud, eds. (ASM), pp. 245-256, “A Comparison of the Genes Encoding the Policetídeo Sintases for Avermectin, Erythromycin, and Nemadectin”; MacNeil et al., 1992, Gene 115: 119-125; and Ikeda and Omura, 1997, Chem. Res. 97: 2599-2609); Candicidin (FR008) (vide, por exemplo, Hu et al., 1994, Mol. Microbiol. 14: 163-172); Carbomycin, Curamycin (vide, por exemplo, Bergh et al., Biotechnol Appl Biochem. 1992 Feb; 15(1):80-9); Daunorubicin (vide, por exemplo, J Bacteriol. 1994 Oct; 176(20):6270-80); Epothilone (vide, por exemplo, PublicaçãoPCT No. 99/66028; e Publicação PCT No. 00/031247); Eritromicina (vide, por exemplo, Publicação PCT No. 93/13663; Patente dos EUA No. 6,004,787; Patente dos EUA No. 5,824,513; Donadio et al., 1991, Science 252:675-9; e Cortes et al.,Nov. 8, 1990, Nature348:176-8); FK-506 (vide e.g., Motamedi et al., 1998; Eur. J Biochem. 256: 528-534; e Motamedi et al., 1997, Eur. J Biochem. 244: 74-80); FK-520 (vide e.g., Publicação PCT No. 00/020601; e Nielsen et al., 1991, Biochem. 30:5789-96); Griseusin (vide, por exemplo, Yu et al., J Bacterial.1994 May;176(9):2627-34); Lovastatin (vide, por exemplo, Patente dos EUA No. 5,744,350); Frenolycin (vide, por exemplo, Khosla et al., Bacteriol. 1993 Apr;175(8):2197-204; e Bibb et al., Gene 1994 May 3; 142(1):31-9); Granaticin (vide, por exemplo, Sherman et al., EMBO J. 1989 Sep;8(9):2717-25; e Bechtold et al., Mol Gen Genet.1995 Sep 20;248(5):610-20); Medermycin (vide, por exemplo, Ichinose et al., Microbiology2003 Jul;149(Pt 7): 1633-45); Monensin (vide, por exemplo, Arrowsmith et al., Mol Gen Genet.1992 Aug;234(2):254-64); Nonactin (vide, por exemplo, FEMS Microbiol Lett.2000 Feb 1 ;183(1): 171-5); Nanaomycin (vide e.g., Kitao et al., J Antibiot (Tokyo). 1980 Jul;33(7):711-6); Nemadectin (vide e.g., MacNeil et al., 1993, supra); Niddamycin (veide, por exemplo, Publicação PCT No. 98/51695; and Kakavas et al., 1997, J. Bacteriol. 179: 7515-7522); Oleandomycin (see e.g., Swan et al., 1994, Mol. Gen. Genet. 2A2: 358-362; Publicação PCT No. 00/026349; Olano et al., 1998, Mol. Gen. Genet. 259(3): 299-308; and PCT Pat. App. Pub. No. WO 99/05283); Oxytetracycline (vide, por exemplo, Kim et al., Gene. 1994 Apr 8;141(1): 141-2); Picromycin (vide, por exemplo, Publicação PCT No. 99/61599; Publicação PCT No. 00/00620; Xue et al., 1998, Chemistry & Biology 5(11): 661-667; Xue et al., October 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12111 12116); Platenolide (vide, por exemplo, EP Pub. No. 791,656; e Patente dos EUA No. 5,945,320); Rapamycin (vide,por exemplo, Schwecke et al., August 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7839-7843; e Aparicio et al., 1996, Gene 169: 9-16); Rifamycin (vide, por exemplo, Publicação PCT No. WO 98/07868; e August et al., Feb. 13, 1998, Chemistry & Biology, 5(2): 69-79); Sorangium (vide, por exemplo, Patente dos EUA No. 6,090,601); Soraphen (vide e.g.,Patente dos EUA No. 5,716,849; Schupp et αl., 1995, J. Bacteriology 177: 3673-3679); Spinocyn (vide, por exemplo, Publicação PCT No. 99/46387); Spiramycin (vide, por exemplo, Patente dos EUA No. 5,098,837); Tetracenomicina (vide, por exemplo,Summers et al., J Bacterial. 1992 Mar; 174(6): 1810-20; e Shen et al., J Bacterial. 1992 Jun;174(l 1):3818- 21); Tetracycline (vide e.g., J Am Chem Soc. 2009 Dec 9; 131 (48): 17677-89); Tilosina (vide, por exemplo, Patente dos EUA No. 5.876.991; Patente dos EUA No. 5.672.497; Patente dos EUA No. 5.149.638; Publicação EP No. 791.655; Publicação EP No. 238.323; Kuhstoss et al., 1996, Gene 183:231-6; e Merson-Davies and Cundliffe, 1994, Mol. Microbiol. 13: 349-355); e ácido 6-metilsalicilico (vide, por exemplo, Richardson et al., Metab Eng. 1999 Apr; 1(2): 180-7; e Shao et al., Biochem Biophys Res Commun. 2006 Jun 23 ;345(1): 133-9).

6.6 Produção de Ácidos Graxos

[00156] Em algumas modalidades, o composto HACD é um ácido graxo. Os ácidos graxos são sintetizados através de uma série de reações de condensação de Claisen decarboxilativo a partir do acetil-CoA e de um malonil-CoA catalisados por sintases de ácidos graxos. Semelhante a sintases de policetídeo, sintases de ácidos graxos não são uma única enzima, mas um sistema enzimático constituído por polipeptídeo multifuncional 272 kDa, em que os substratos são transmitidos a partir de um domínio funcional para a próxima. Duas classes principais de sintases de ácidos graxos têm sido caracterizadas: sintases de ácidos graxos tipo I são polipeptídeos multifuncionais individuais comuns aos mamíferos e fungos (embora o arranjo estrutural de sintases de fungos e de mamíferos sejam diferentes) e o grupo de bactérias CMN (Corinebactéria, micobactérias e Nocardia). Sintases tipo II, encontradas em archaeabacteria e eubactérias, são uma série de enzimas discretas, monofuncionais, que participam na síntese de ácidos graxos. Os mecanismos de alongamento de ácidos graxos e de redução são os mesmos nas duas classes de sintases, como a enzima responsável por estes domínios catalíticos é amplamente homóloga entre as duas classes.

[00157] No seguimento de cada alongamento da cadeia do ácido graxo decarboxilativo nas reações de condensação de Claisen, o grupo β-ceto é reduzido a uma cadeia de carbono totalmente saturada pela ação sequencial de uma cetorredutase, uma desidratase e uma enol-redutase. O ácido graxo de cadeia em crescimento se move entre estes sítios ativos ligado a uma proteína transportadora de acil e, em última análise, é libertado pela ação de uma tioesterase ao atingir um comprimento de cadeia de 16 carbonos (ácido palmitídico).

[00158] Em algumas modalidades, o microorganismo geneticamente modificado divulgado no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima biossintética incluindo, sem que esteja limitada a, pelo menos uma via de enzima de síntese de ácidos graxos e enzimas que podem modificar um composto acetil- CoA para formar um produto de ácido graxo, tais como o palmitato, palmitoil -CoA, ácido palmitoléico, ácido sapiênico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido a- linolénico, ácido araquidônico, ácido eicosapentaenóico, ácido erúcico e ácido docosahexaenóico. Em algumas modalidades, o composto HACD é um ácido graxo selecionado a partir do grupo que consiste em palmitato de palmitoil- CoA, ácido palmitoléico, ácido sapiênico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido a-linolénico, ácido araquidônico, ácido eicosapentaenóico, ácido erúcico e ácido docosahexaenóico.

[00159] Em algumas modalidades, o microorganismo geneticamente modificado divulgado no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que liga de modo covalente pelo menos um acetil-CoA e amalonil -CoA com uma proteína transportadora de acil, por exemplo, uma acil- transferase.

[00160] Em algumas modalidades, o microorganismo geneticamente modificado divulgado no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que condensa a porção química acetil e uma porção química malonil, cada uma ligada a uma proteína transportadora acil (ACP) para formar acetoacetil -ACP, por exemplo, uma β- cetoacil sintase -ACP.

[00161] Em algumas modalidades, o microorganismo geneticamente modificado divulgado no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzim para reduzir a ligação dupla em acetoacetil-ACP com NADPH para formar um grupo hidroxila em D-3- hidroxilase, hidroxibutiril -ACP, por exemplo, uma β-cetoacil redutase -ACP.

[00162] Em algumas modalidades, o microorganismo geneticamente modificado divulgado no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que desidrata D-3- hidroxilase, hidroxibutiril-ACP para criar uma ligação dupla entre os carbonos beta e gama, formando crotonil -ACP, por exemplo, uma β- hidroxiacil dehidrase - ACP.

[00163] Em algumas modalidades, o microorganismo geneticamente modificado divulgado no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que reduz crotonil ACP com NADPH para formar butiril- ACP, por exemplo, uma enoil redutase ACP.

[00164] Em algumas modalidades, o microorganismo geneticamente modificado divulgado no presente documento compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que hidrolisa um composto Cl6 acil de uma proteína transportadora para formar acil palmitato, por exemplo, uma tioesterase.

[00165] Em algumas modalidades, a célula produtora de ácido graxo compreende um ou mais sequências de nucleotídeo heterólogo que codificam acetil -CoA- sintase e/ou malonil -CoA- sintase, para efetuar a produção aumentada de um ou mais ácidos graxos, em comparação com uma célula parental não modificada geneticamente.

[00166] Por exemplo, para aumentar a produção de acetil-CoA, um ou mais dos seguintes genes podem ser expressos na célula: PDH, Pank, aceEF (codificando o componente desidrogenase EIP e o componente aciltransferase dihidrolipoamido E2P do piruvato e de complexos de desidrogenase 2- oxoglutarato), fabH, FABD, fabG, Acpp e fabF. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam essas enzimas incluem, sem que estejam limitados a: PDH (BAB34380, AAC73227, AAC73226), Pank (também conhecido como coaA, AAC76952), aceEF (AAC73227, AAC73226), fabH (AAC74175), FABD (AAC74176), fabG (AAC74177), Acpp (AAC74178), fabF (AAC74179).

[00167] Em algumas modalidades, aumento dos níveis de ácidos graxos pode ser realizado na célula por meio da atenuação ou vazamento para fora dos genes que codificam para proteínas envolvidas na degradação dos ácidos graxos. Por exemplo, os níveis de expressão de desaparecimento, GPSA, IDHA, pflB, adhE, pta, poxB, Acka, e/ou ACKB podem ser atenuados ou interrompidos numa célula hospedeira geneticamente modificada utilizando técnicas conhecidas na técnica. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo que codificam estas proteínas incluem, sem que estejam limitados a: Fade (AAC73325), GSpa (AAC76632), IDHA (AAC74462), pflB (AAC73989), adhE (AAC74323), pta (AAC75357), poxB (AAC73958), ACKA (AAC75356) e ACKB (BAB81430). As células hospedeiras resultantes terão os níveis de produção de acetil- CoA aumentado quando cultivadas num ambiente apropriado.

[00168] Em algumas modalidades, a célula produtora de ácido graxo compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma enzima que converte acetil-CoA em malonil- CoA, por exemplo, a proteína de múltiplas subunidades AccABCD. Um exemplo ilustrativo de uma sequência adequada de nucleotídeo que codifica AccABCD inclui, sem que esteja limitado a, número de acesso AAC73296, EC 6.4.1.2.

[00169] Em algumas modalidades, o ácido graxo que produz célula compreende uma sequência de nucleotídeo heterólogo que codifica uma lipase. Exemplos ilustrativos de sequências adequadas de nucleotídeo que codificam uma lipase incluem, sem que estejam limitados a, números de adesão CAA89087 e CAA98876.

[00170] Em algumas modalidades, aumento dos níveis de ácidos graxos pode ser realizado na célula por inibidor PLSB, o qual pode levar a um aumento dos níveis de cadeia longa de acil ACP, os quais inibem os primeiros passos na biossíntese de ácidos graxos (por exemplo, accABCD, fabH e fabl). O nível de expressão PLSB pode ser atenuado ou interrompido numa célula hospedeira utilizando técnicas conhecidas na técnica. Um exemplo ilustrativo de uma sequência adequada de nucleotídeo que codifica PLSB inclui, sem que esteja limitado a, número de acesso AAC77011. Em modalidades particulares, a mutação PLSB D31 IE pode ser utilizada para aumentar a quantidade disponível de acil- CoA na célula.

[00171] Em algumas modalidades, produção aumentada de ácidos graxos monoinsaturados pode ser efetuada na célula ao se super-expressar um gene sfa, o que resultaria em supressão de fabA. Um exemplo ilustrativo de uma sequência de nucleotídeo adequada que codifica sfa inclui, porém não está limitado a, número de acesso AAN79592.

[00172] Em algumas modalidades, níveis aumentados de ácido graxo podem ser efetuados na célula ao se modular a expressão de uma enzima que controla o comprimento de cadeia de um substrato de ácido graxo, por exemplo, de uma tioesterase. Em algumas modalidades, a célula produzindo ácido graxo foi modificada para super exprimir um gene tes ou fat.Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo tes incluem, sem que estejam limitados a, números de acesso: (tesA: AAC73596, de E. Coli, capaz de produzir ácidos graxos Cisa) e (tesB\ AAC73555, de E. Coli). Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo fatincluem, sem que estejam limitadas a: (fatB: Q41635 e AAA34215, de Umbellularia California,capazes de produzir ácidos graxos Ci2:o), (fatB2\ Q39513 e AAC49269, de Cuphea hookeriana, capazes de produzir ácidos graxos Cs:o - Cio:o), (fatB3: AAC49269 e AAC72881, de Cuphea hookeriana, capazes de produzir ácidos graxos Ci4:o - Ci6:o), (fatB'. Q39473 e AAC49151, de Cinnamonum camphorum, capazes de produzir ácidos graxos Ci4:o), (fatB [M141T]: CAA85388, de mArabidopsis thaliana, capaz de produzir ácidos graxos Ci6:i), (fatA: NP 189147 e NP 193041, de Arabidopsis thaliana, capazes de produzir ácidos graxos Cisa), (fatA: CAC39106, de Bradvrhiizobium japonicum, capaz de produzir, preferencialmente, ácidos graxos Cisa), (fatA: AAC72883, de Cuphea hookeriana, capaz de produzir ácidos graxos Cisa) e (fatAl, AAL79361 de Helianthus annus).

[00173] Em algumas modalidades, níveis aumentados de ácidos graxos Cio podem ser efetuados na célula ao se atenuar a expressão ou atividade de tioesterase Cis usando técnicas conhecidas no estado da técnica. Exemplos ilustrativos de sequências de nucleotídeo adequado que codificam tioesterase Cis incluem, sem que estejam limitados a, números de acesso AAC73596 e P0ADA1. Noutras modalidades, níveis aumentados de ácidos graxos Cio podem ser efetuados na célula ao se aumentar a expressão ou atividade da tioesterase Cio usando técnicas conhecidas no estado da técnica. Um exemplo ilustrativo de uma sequência de nucleotídeo adequado que codifica tioesterase inclui Cio, sem que esteja limitada a, número de acesso Q39513.

[00174] Em algumas modalidades, níveis aumentados de ácidos graxos Cu podem ser efetuados na célula ao se atenuar a expressão ou atividade de tioesterases endógenas que produzem ácidos graxos não Cn, usando técnicas conhecidas no estado da técnica. Noutras modalidades, níveis aumentados de ácidos graxos Cu podem ser efetuados na célula ao se aumentar a expressão ou atividade das tioesterases que usam o substrato CH-ACP, usando técnicas conhecidas no estado da técnica. Um exemplo ilustrativo de uma sequência de nucleotídeo adequado que codifica tal tioesterase inclui, sem que esteja limitada a, número de acesso Q39473.

[00175] Em algumas modalidades, níveis aumentados de ácidos graxos Ci2 podem ser efetuados na célula ao se atenuar a expressão ou atividade de tioesterases endógenas que produzem ácidos graxos não C12, usando técnicas conhecidas no estado da técnica. Noutras modalidades, níveis aumentados de ácidos graxos C12 podem ser efetuados na célula ao se aumentar a expressão ou atividade das tioesterases que usam o substrato C12-ACP, usando técnicas conhecidas no estado da técnica. Um exemplo ilustrativo de uma sequência de nucleotídeo adequado que codifica tal tioesterase inclui, sem que esteja limitada a, número de acesso Q41635.

6.7 Métodos para armazenar células

[00176] Em algumas modalidades, as células hospedeiras geneticamente modificadas capazes de produzir um composto HACD são mais viáveis e saudáveis quando armazenadas num meio que baixo ou ausente em compostos de pantotenato. Em particular, tais células crescem melhor após inoculação num meio de crescimento adequado após inoculação num meio de crescimento adequado e produzem mais composto HACD durante o estágio de produção num meio de baixa concentração de pantotenato ou num meio livre de composto de pantotenato.

[00177] Assim, noutro aspecto, é provido no presente documento um método para armazenar uma célula hospedeira geneticamente modificada capaz de produzir um composto HACD, o método compreendendo preparar uma composição compreendendo a célula hospedeira geneticamente modificada e um meio de armazenamento compreendendo uma fonte de carbono, nitrogênio e fosfato assimiláveis e entre 0 pmol/litro and 10 pmol/litro de um composto de pantotenato; e congelai' a composição. Numa modalidade específica, o meio de armazenamento não contém composto de pantotenato detectável. Noutra modalidade específica, o meio de armazenamento compreende glicerol numa quantidade variando entre 1 parte de glicerol: 3 partes de meio de cultura, até 3 partes de glicerol: 1 parte de meio de cultura. Noutra modalidade específica, o meio de armazenamento é congelado a -80°C.

[00178] Noutro aspecto, é provido no presente documento um meio de armazenamento que contém uma fonte de carbono, nitrogênio e fosfato assimiláveis e entre 0 pmol/litro e 10 pmol/litro de um composto de pantotenato. Numa modalidade específica, o meio de armazenamento não contém nenhum composto pantotenato detectável. Noutra modalidade específica, o meio de armazenamento compreende glicerol em uma quantidade que varia entre 1 parte de glicerol: 3 partes de meio de cultura, até 3 partes de glicerol: 1 parte de meio de cultura. Noutra modalidade específica, o meio de armazenamento é congelado a -80°C. Noutra modalidade específica, o meio de armazenamento compreende uma célula hospedeira geneticamente modificada capaz de produzir um composto HACD.

7. EXEMPLOS 7.1 Exemplo 1

[00179] Este exemplo descreve um método exemplar para determinar a densidade celular (ODeoo) de uma cultura de célula de levedura.

[00180] Uma amostra de 8 pL de uma cultura de célula foi combinada com 92 pL de Diluente OD Triton (20 g/L de Triton X-114, 200 mL/L de PEG 200, 200 mL/L de etanol 100%, água restante) numa placa limpa com 96 poços. A solução foi agitada a 1000 RPM por 6 minutos, e a OD foi determinada ao se medir a absorvência a 600 nm num espectofotômetro M5 (Dispositivo Molecular, Sunnyvale, CA).

7.2 Exemplo 2

[00181] Este exemplo descreve um método exemplar com base em Vermelho Nilo útil para determinar a titulação de farneseno de culturas de células de levedura. Uma amostra de 98 pL de uma cultura de célula foi transferida para uma placa de ensaio de fundo plano, feita de poliestireno, preta e com 96 poços, e 2 pL de Vermelho Nilo (Invitrogen, Carlsbad, CA), dissolvidos a 100 pg/rnL em DMSO, foram adicionados a cada poço. Níveis de fluorescência foram medidos imediatamente num espectrofotômetro M5 com excitação a 500 nm e emissão a 550 nm.

7.3 Exemplo 3

[00182] Este exemplo descreve um método exemplar à base de cromatografia a gás (GC) útil para determinar a titulação de farneseno de culturas de célula de levedura.

[00183] Amostra foi extraída com metanol-heptano (1:1 v/v), e a mistura foi centrifugada para se remover material celular. Uma alíquota do extrato metanol-heptano foi diluída em n-heptano com 0,001% de t- cariohileno (o qual serviu como um marcador de tempo de retenção para monitorar injeção exitosa e eluição durante o perfil de forno de GC específica), e então injetado numa fase estacionária de metil silicone usando uma injeção com divisão pulsada. O farneseno foi separado por ponto de ebulição usando GC com detecção de chama de ionização (FID).

7.4 Exemplo 4

[00184] Este exemplo ilustra o uso de um composto de pantotenato como um interruptor não genético para melhorar a formação de biomassa numa primeira cultura de semente, seguida por produção melhorada de composto HACD no estágio de produção do processo de fermentação.

a) Preparação de uma Cultura de Semente

[00185] Um meio de semente foi preparado contendo 2% de BSM sacarose (meio de formação de biomassa) e 0 mg/L de D-pantotenato de cálcio. O pH do meio de semente foi ajustado a pH 7.0 com uma solução de NaOH. O meio (250 mL) foi esterilizado e inoculado com uma via de semente de células hospedeiras geneticamente modificadas e incubadas a 34°C por 24-36 horas sob condições aeróbicas.

b) Processo Principal de Fermentação

[00186] Um fermentador agitado com um vaso no tamanho de 20 litros foi cheio com um meio de cultura de célula de produção estéril contendo 2% de sacarose e 10 mg/L de D-pantotenato de cálcio. A fermentação foi realizado a 34°C por 6 dias sob condições aeróbicas para maximizar a produção do produto HACD.

7.5 Exemplo 5

[00187] Este exemplo demonstra que em culturas de células de levedura geneticamente modificadas para produzir níveis mais altos de um metabólito exemplar secundário de HACD heterólogo, rendimento de biomassa pode ser aumentado e a produção do metabólito secundário heterólogo pode ser reduzida ao se reduzir a quantidade de (R-) pantotenato provido exogenamente.

[00188] Cada uma das estirpes de levedura Y4689 e Y4352 compreende enzimas heterólogas, incluindo as enzimas a seguir da via MEV: IPP isomerase, FPP sintase e farneseno sintase. Essas estirpes são capazes de produzir um metabólito exemplar secundário de HACD heterólogo (farneseno) a rendimentos de 15% e 13%, respectivamente.

[00189] Células oriundas de estirpes de levedura Y4689 e Y4352 foram obtidas a partir de culturas de crescimento exponencial, lavadas três vezes com água e então ressuspensas em 2% de BSM sacarose compreendendo 0 mg/L de D-pantotenato de cálcio. 15 pL tirados de cada suspensão de célula foram adicionados às culturas de formação de biomassa, consistindo de poços de uma placa com 96 poços contendo 360 pL de 2% de BSM sacarose, compreendendo, ou 10 mg/L (100%), 1 mg/L (10%), 0,2 mg/L (2%), 0,1 mg/L (1%), 0,02 mg/L (0,2%), 0,01 mg/L (0,1%), 0,001 mg/L (0,01%) ou 0 mg/L de D-pantotenato. As culturas de formação de biomassa foram incubadas por 48 horas num agitador ATR a 1000 rpm e 80% de umidade, e 34°C, em cujo tempo as culturas alcançaram sua ODÓOO máxima. As culturas de formação de biomassa foram então diluídas 1:25 nas culturas de produção consistindo de poços de uma segunda placa de 96 poços contendo o mesmo meio e layoutde placa como o da placa de 96 poços. As culturas de produção foram incubadas por 48 horas num agitador ATR a 1000 rpm, 80% de umidade e 34°C, em cujo tempo amostras foram tomadas de cada poço para medição da biomassa final (isto é, densidade final de célula) e a titulação de farneseno, conforme descrita nos Exemplos 1 e 2 acima, respectivamente.

[00190] Figuras 3A e 3B mostram que ambas as estirpes foram severamente reduzidas em sua capacidade de produzir farneseno quando níveis de pantotenato foram reduzidos na formação de biomassa e culturas de produção, e que esta redução na produção do (farneseno) de HACD exemplar foi acompanhada por um aumento na biomassa final de célula. Esses resultados demonstram que pantotenato pode ser limitado ou omitido a partir do meio de cultura para reduzir de modo eficiente a produção de composto HACD e pode ser adicionado ao meio de cultura para induzir ou aumentar a produção de composto HACD.

7.6 Exemplo 6

[00191] Este exemplo ilustra que estirpes de levedura que são capazes de fazer quantidades comerciais de um composto HACD mostram o comportamento inesperado de melhor crescimento na ausência de um composto de pantotenato fornecido externamente. Em contraste, leveduras do tipo selvagem e estirpes de levedura fazendo quantidades menores de compostos HACD exibem o comportamento esperado de melhor crescimento na presença de composto de pantotenato fornecido externamente do que em sua ausência.

[00192] Cada uma das estirpes de levedura Y4720 e Y5038 compreende enzimas heterólogas, incluindo as seguintes enzimas da via MEV: IPP isomerase, FPP sintase e farneseno sintase. Estirpe Y4720 é capaz de produzir farneseno em rendimentos de 14%, enquanto estirpe Y5038 é capaz de fazer menos da metade, quando muito 6% de farneseno. Estirpe Y2205 é um controle de tipo selvagem CEN.PK2 que não produz qualquer farneseno.

[00193] Culturas de crescimento exponencial de Y4720, Y5038 e Y2205 foram diluídas em PBS estéril a uma ODeoo de 1, e 20 pL de cada diluição foi transferida para um poço em coluna 1 de uma placa de 96 poços contendo 180 pL de PBS estéril por poço. Usando uma pipeta com multicanais, 20 pL da coluna 1 foram transferidos para a coluna 2 e assim por diante, resultando em diluições seriais de 1:10 através da placa. Por fim, uma ferramenta esterilizada de fixação de 48 pontas foi usada para marcar as culturas oriundas da placa com 96 poços para as placas com ágar-ágar CSM compreendendo 0,4 mg/L ou 0,002 mg/L de D-pantotenato de cálcio. As placas de ágar-ágar foram incubadas a 30°C por 112 horas, e o crescimento da colônia foi monitorado.

[00194] Conforme mostrado na Figura 4, colônias de Y4720 eram menores do que colônias das outras duas estirpes na presença de 0,4 mg/L de D-pantotenato de cálcio, porém mais largas na presença de 0,002 mg/L de D- pantotenato de cálcio, sugerindo que, comparadas às estirpes Y5038 e Y2205, estirpe Y4720 tinha uma taxa de crescimento maior no ágar-ágar compreendendo a concentração mais baixa de (R)-pantotenato. Resultados similares foram obtidos ao se usar placas ágar-ágar completamente sem D- pantotenato de cálcio.

7.7 Exemplo 7

[00195] Esse exemplo demonstra que omitir (R)-pantotenato aumenta a taxa de crescimento de células de levedura geneticamente modificadas para produzir níveis maiores de um metabólito secundário de HACD heterólogo e diminui a taxa de crescimento de células de levedura geneticamente TSITl modificadas para produzir níveis menores do metabólito secundário heterólogo.

[00196] Para colônias individuais de um número de estirpes de levedura compreendendo enzimas heterólogas incluindo as enzimas de via MEV: IPP isomerase, FPP sintase e farneseno sintase, e capazes de produzir um composto HACD exemplar (farneseno) foram inoculados em culturas de formação de biomassa consistindo de poços de placas com 96 poços contendo 360 pL de 20% de sacarose BSM compreendendo ou 10 mg/L ou 0 mg/L de D-pantotenato de cálcio. As culturas de formação de biomassa foram cultivadas por 72 horas a 34°C num agitador ATR a 1000 rpm e 80% de umidade, por meio do que pontos de culturas alcançaram sua ODeoo máxima. As culturas de formação de biomassa foram então diluídas a 1:25 em culturas de produção consistindo de poços de um segundo conjunto de placas com 96 poços contendo 360 pL de 4% de sacarose BSM compreendendo 10 mg/L de D-pantotenato de cálcio. As culturas de produção foram incubadas por 48 horas num agitador ATR a 1000 rpm, 80% de umidade e 34°C, em cujo ponto amostras foram tiradas de cada poço para se medir a biomassa final (densidade final de célula) e titulação de farneseno, conforme descrito nos Exemplos 1 e 3 acima, respectivamente. Conforme mostrado na Figura 5, estirpes que produziram farneseno a um rendimento maior do que 12% tiveram rendimento de biomassa maior em baixas concentrações de (R)-pantotenato do que em concentrações mais altas de (R)-pantotenato. O oposto foi verdadeiro para estirpes que produziram farneseno a um rendimento menor do que 12%.

7.8 Exemplo 8

[00197] Este exemplo demonstra o fenômeno de degeneração de estirpe, o qual ocorre quanto pantotenato está presente no meio de cultura, e assim a produção de composto HACD fica “on” tanto durante o estágio de formação como o de produção de um processo de fermentação.

[00198] Um frasco pequeno de 1 ml de suspensão de célula congelada de uma estirpe de levedura compreendendo enzimas heterólogas incluindo as enzimas de via MEV: IPP isomerase, FPP sintase e farneseno sintase, e capaz de produzir um composto HACD exemplar (farneseno), foi descongelado, transferido para um frasco tamponado de 250 mL contendo 50 mL de BSM 2.0 contendo 2% de sacarose e 10 mg/L de D-pantotenato de cálcio, e cultivadas num agitador a 34°C, 200 RPM por 24 horas. Toda a cultura foi então transferida para um frasco Fernbach de 2,8 L contendo 850 ml de BSM 2.0, contendo 2,0% de sacarose e 10 mg/L de D-pantotenato de cálcio, e cultivada num agitador a 34°C, 250 RPM por 24 horas. Toda a cultura foi então transferida para um fermentador de 2L. O nutriente dado para o fermentador era um meio de xarope de cana brasileira não definida, compreendendo 10 mg/L de D-pantotenato de cálcio, entregue com pulsos inicias equivalentes a 14 g/L/h de açúcar. A taxa de alimentação é então auto- ajustada, com base na demanda do fermentador por carbono, conforme indicado pelo aumento no oxigênio dissolvido. A fermentação é realizada de maneira micro-aeróbica a uma temperatura constante de 34°C, um pH de 4,5 (controlado por adições de hidróxido de sódio), e uma taxa inicial de transferência de oxigênio de 200 mmol CF/L/h, até que o oxigênio dissolvido alcançou 0%, e então se reduziu para 100 mmol de CF/L/h para o restante da fermentação. A cada três dias, o volume do tanque é reduzido a cerca de 0,9 L para impedir extravasamento. Traços de metal e vitaminas perdidas na alimentação de xarope de cana são reabastecidos naquele tempo. A quantidade de farneseno produzida e o total consumido pelas células são monitorados diariamente e a razão desses dois valores (isto é, o rendimento de produto fora de açúcar) é determinada a cada período de 72 horas e esboçado conforme mostrado na Figura 6. O rendimento de produto da cultura declina a partir de seu pico nos 6 dias para <65% daquele pico por 21 dias.

7.9 Exemplo 9

[00199] Este exemplo demonstra que omitir (R)-pantotenato durante cultivo e armazenamento de células de levedura geneticamente modificadas para produzir um composto HACD exemplar aumenta a produção do metabólito secundário heterólogo pelas células de levedura.

[00200] Estirpe de levedura Y4954 compreende enzimas heterólogas, incluindo as seguintes enzimas da via MEV: IPP isomerase, FPP sintase e farneseno sintase. Essa estirpe de levedura é capaz de produzir farneseno a um rendimento de 13,6%.

[00201] Dois conjuntos de vias de semente foram preparados ao se inocular metade de uma colônia individual de células Y4954 num frasco para agitação de 125 mL contendo 15 mL de 2% de sacarose BSM (meio frasco pequeno de semente) compreendendo 10 mg/L de D-pantotenato de cálcio (meio de frasco pequeno, “+”), e a outra metade num frasco de agitação de 125 mL contendo 15 mL de 2% de sacarose BSM (meio frasco pequeno de semente) compreendendo 0 mg/L de D-pantotenato de cálcio (meio frasco pequeno de semente, “-“). As células foram cultivadas a 30°C num agitador a 200 rpm até que uma ODeoo entre 4 e 9 foi alcançada e até que sacarose residual estivesse em torno de 3-6 g/L. Duas soluções de glicerol com 50% de partes estéreis foram adicionadas às três partes de caldo celular, a suspensão foi aliquotada em frascos pequenos de semente e os frascos pequenos de semente foram lentamente congelados a -80°C a uma taxa de aproximadamente -l°C/min.

[00202] Formação de biomassa foi acompanhada ao se descongelar um frasco pequeno de semente num frasco de agitação de 250 mL contendo 50 mL de 2% de sacarose BSM (meio de formação de biomassa) compreendendo ou 10 mg/L de D-pantotenato de cálcio (meio de formação de biomassa, “+”) ou 0 mg/L de D-pantotenato de cálcio (meio de formação de biomassa, “-“), e ao se cultivar a cultura por 24 horas a 34°C e 20 RPM. A cultura foi então transferida para um frasco de 1L contendo 800 mL do mesmo meio e cultivada por 48 horas adicionais.

[00203] Para produção do composto HACD exemplar (farneseno), a cultura de formação de semente foi transferida para um fermentador de bancada de 2 L contendo meio de produção compreendendo 10 mg/L de D- pantotenato de cálcio (meio de produção, “+”), e a cultura foi incubada por 6 dias, seguindo um protocolo de alimentação que maximizou o rendimento de farneseno.

[00204] Conforme mostrado na Tabela 1, células Y4954 produziram um rendimento maior de farneseno quando (R)-pantotenato foi omitido do meio frasco pequeno de semente. Elas produziram um rendimento até mesmo maior de farneseno quando (R)-pantotenato também foi omitido do meio de formação de biomassa.

[00205] Tabela 1 também mostra que omitir (R)-pantotenato no frasco pequeno de semente e no meio de formação de biomassa não comprometeu de modo irreversível a capacidade das células hospedeiras em produzir farneseno quando providos com (R)-pantotenato durante a fase de produção. De fato, o uso de um meio de semente e meio de formação de biomassa tendo ausência ou redução em (R)-pantotenato, seguidos por cultura de fase de produção num meio de produção contendo (R)-pantotenato, resulta na melhor produção dos compostos HACD heterólogos. Tabela 1 - Produção de Farneseno Heterólogo por células Y4954 armazenadas e cultivadas na Ausência ou Presença de D-pantotenato de Cálcio

[00206] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados na presente especificação estão incorporadas ao presente documento por meio de referência, visto que cada publicação individual ou pedido de patente foi indicado específica e individualmente como sendo incorporado por referência. Várias modificações e variações da presente divulgação se tornarão aparentes para aquelas pessoas versadas na técnica, sem que se afastem do escopo e do espírito da divulgação. Embora a divulgação tenha sido descrita detalhadamente a título de ilustração e de exemplo para fins de clareza de compreensão, tornar-se-á prontamente aparente para aquele versado na técnica, sob a luz dos ensinos providos no presente documento, que certas alterações e modificações podem ser feitas nela, sem se afastar do espírito ou escopo das reivindicações anexas, e que as reivindicações não devem ser limitadas indevidamente àquelas modalidades específicas. Na verdade, várias modificações dos modos descritos para realização da divulgação, os quais são entendidos por aqueles versados na técnica, destinam-se a estar dentro do escopo das reivindicações.

Claims

1. Método para produzir um composto derivado de acetil-CoA heterólogo (HACD) em uma célula hospedeira, caracterizadopelo fato de que compreende: (a) cultivar uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas capazes de produzir um composto HACD selecionado do grupo consistindo de um isoprenóide, um ácido graxo e policetídeo, que são biossintetizados pelas células hospedeiras utilizando acetil-CoA como um precursor, em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono e uma quantidade limitante de pantotenato, em que a quantidade limitante de pantotenato limita a produção do composto HACD pela célula hospedeira; seguido por (b) cultivar a referida população ou uma subpopulação daquelas em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono e uma quantidade não limitante de pantotenato, em que a quantidade não limitante de pantotenato é uma quantidade maior do que a quantidade limitante de pantotenato, em que a referida população ou subpopulação da mesma produz uma quantidade maior do composto HACD na presença da quantidade não limitante de pantotenato.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade limitante de pantotenato é determinada ao se realizar uma titulação de pantotenato, as células hospedeiras são cultivadas em um meio de crescimento compreendendo concentrações crescentes de pantotenato, a produção de composto HACD é determinada a cada concentração de pantotenato, a titulação de pantotenato compreende quantidades saturantes de pantotenato, por meio da qual a produção de composto HACD fica em seu máximo; e a quantidade limitante de pantotenato é qualquer concentração de pantotenato, na qual a produção de composto HACD é menor do que seu máximo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que a produção do composto HACD durante a etapa (a) é menor do que 50% da produção máxima de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada e a produção do composto HACD durante a etapa (b) é maior do que 50% do máximo da produção de composto HACD da célula hospedeira geneticamente modificada.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadopelo fato de que o referido cultivo da etapa (a) é por um período de pelo menos 12 horas, e o referido cultivo da etapa (b) é por um período de tempo suficiente para que a referida população alcance uma densidade celular (ODÓOO) entre 0,01 e 400.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadopelo fato de que o referido cultivo da etapa (b) é por um período de 3 a 20 dias.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadopelo fato de que a quantidade limitante de pantotenato fica abaixo de 0,2 mg/L.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizadopelo fato de que a quantidade não limitante de pantotenato fica acima de 0,2 mg/L ou é pelo menos a concentração mínima de pantotenato na qual a produção de composto HACD fica em seu máximo ou é de pelo menos 1 mg/L.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizadopelo fato de que a etapa (b) compreende adicionar pantotenato ao meio de cultura compreendendo a quantidade limitante de pantotenato até que o meio compreenda uma quantidade não limitante de pantotenato.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizadopelo fato de que a etapa (b) compreende transferir a população da etapa (a) para um novo meio de cultura compreendendo uma quantidade não limitante de pantotenato.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizadopelo fato de que o referido método resulta em produção aumentada do composto HACD pela população de células hospedeiras geneticamente modificadas, comparada à produção resultante de um método não compreendendo cultivar as células numa quantidade limitante de pantotenato; e a produção do composto HACD é medida em termos de rendimento (grama de HACD produzido por grama de substrato de carbono) ou produtividade (gramas de composto HACD produzidas por litro de meio de cultura por hora).

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizadopelo fato de que o pantotenato é selecionado a partir do grupo consistindo de 2-dehidropantoato, (R)-pantotenato e qualquer sal ou éster dos mesmos.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 all, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo consistindo de uma célula fúngica, célula bacteriana, célula vegetal, célula animal e uma célula de levedura.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizadopelo fato de que a célula hospedeira é capaz de produzir um isoprenóide e compreende pelo menos um ácido nucleico heterólogo que codifica uma enzima via de isoprenóide selecionada a partir do grupo consistindo de: a) uma enzima que condensa duas moléculas de acetil- coenzima A para formar acetoacetil-CoA; b) uma enzima que condensa acetoacetil-CoA com outra molécula de acetil-CoA para formar 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG- CoA); c) uma enzima que converte HMG-CoA em mevalonato; d) uma enzima que converte mevalonato em mevalonato 5- fosfato; e) uma enzima que converte mevalonato 5-fosfato em mevalonato 5-pirofosfato; f) uma enzima que converte mevalonato 5-pirofosfato em IPP; g) uma enzima que converte IPP em DMAPP; h) uma poliprenil sintase que pode condensar moléculas IPP e/ou DMAPP para formar compostos poliprenil contendo mais do que cinco carbonos; i) uma enzima que condensa IPP com DMAPP para formar GPP; j) uma enzima que condensa duas moléculas de IPP com uma molécula de DMAPP; k) uma enzima que condensa IPP com GPP para formar FPP; l) uma enzima que condensa IPP e DMAPP para formar GGPP; e, m) uma enzima que condensa IPP e FPP para formar GGPP.

14. Método para produzir um composto derivado de acetil- CoA heterólogo (HACD) em uma célula hospedeira, caracterizadopelo fato de que compreende: (a) cultivar uma população de células hospedeiras geneticamente modificadas capazes de produzir um composto HACD selecionado do grupo consistindo de um isoprenóide, um ácido graxo e um policetídeo, que são biossintetizados por uma célula hospedeira utilizando acetil-CoA como um precursor, em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono e carente de suplementação de pantotenato; seguido por (b) cultivar a referida população ou uma subpopulação daquelas em um meio de cultura compreendendo uma fonte de carbono e suplementado com pelo menos 1 mg/L de pantotenato.