MX2013012871A

MX2013012871A - Produccion de compuestos derivados de acetil-coenzima a.

Info

Publication number: MX2013012871A
Application number: MX2013012871A
Authority: MX
Inventors: Adam Meadows
Original assignee: Amyris Inc
Priority date: 2011-05-09
Filing date: 2012-05-09
Publication date: 2014-02-17
Also published as: EP2707475A1; ZA201308393B; BR112013028544A2; BR112013028544B1; AU2012253564A1; CN103502428A; JP5989098B2; WO2012154854A1; US20120288891A1; EP2707475B1; US9670518B2; CA2832979A1; JP2014513542A; CA2832979C; DK2707475T3; EP2707475A4

Abstract

La presente descripción se refiere al uso de compuestos de pantotenato como un interruptor no genético para la producción de compuestos derivados de acetil-CoA heterólogos (HACD) en células huéspedes microbianas. La invención proporciona microorganismos genéticamente modificados que son más estables cuando se almacenan e inicialmente son cultivadas bajo concentraciones reducidas de pantotenato, medios de cultivo celular que tienen concentraciones reducidas de compuestos de pantotenato, y métodos de producción de compuestos HACD utilizando los medios de cultivo celular y los microorganismos genéticamente modificados de la invención.

Description

PRODUCCION DE COMPUESTOS DERIVADOS DE ACETIL-COENZIMA A CAMPO DE LA INVENCION La presente descripción se refiere al uso ! de pantotenato (también conocido como vitamina B5) cpmo un interruptor no genético para modular la producción de compuestos derivados de acetil-CoA heterologos por una ¡célula huésped genéticamente modificada. " ' ANTECEDENTES DE LA INVENCION El advenimiento de la biología sintética ha ; traído consigo la promesa de la producción microbiana fermeritativa de biocombustibles , productos químicos y biomateíriáles a partir de fuentes renovables a escala y i ; calidad industrial. Por ejemplo, las trayectorias biológicas , no nativas funcionales se han construido con éxito en ^huéspedes microbianos para la producción de precursores al fármaco antipalúdico artemisinina (ver, por ejemplo, Mkrlin ; et al, . Nat. Biotechnol 21:796-802 (2003); combust Iibles y productos químicos derivados de ácidos grasos (por, e emplo, ésteres grasos, alcoholes grasos y ceras; ver, por ejemplo, Steen et al,. Nature 463:559-562 (2010); policétido sintásas que producen fármacos que disminuyen el colesterol (ver, por ejemplo, Ma et al,. Science 326:589-592 (2009), y policétidos (ver, por ejemplo, Kodumal, Proc Nati Acad Sci USA 101:15573-15578 (2004) . Sin embargo, el éxito comercial de la biología Ref j. : $44271 sintética dependerá en gran medida de si el costo de producción de los productos renovables se puede hacer para competir con, o dejar fuera de competencia, los costos, de producción de sus respectivas contrapartes no renovables.

La estabilidad de la cepa puede ser un importante factor del costo de las fermentaciones industriales, ya que afecta a la longitud de tiempo en la que una fermentación continua se puede ejecutar de manera productiva^ La estabilidad de la cepa generalmente se refiere a la capacidad de un microbio para mantener las características de producción favorables (es decir, alto rendimiento (gramos de compuesto por gramo de sustrato) y productividad (gramos -por litro de caldo de fermentación por hora) ) de un producto de fermentación no catabólico durante tiempos d : cultivo prolongados. En particular, la estabilidad genétic^, ; q e es la propensión de la población microbiana productora para tener poca o ninguna alteración de la frecuencia ¡alélica prevista de genes relevantes para la producción de productos con el tiempo, juega un papel importante en la producción sostenida de producto. ' Para la fermentación no catabólica de productos distintos de la biomasa (que productos, por definición, consumen energía metabólica y carbono que de otra manera podrían ser utilizados en la producción de más células) , la base de la inestabilidad es doble: selección y mutación evolutiva. En primer lugar, las mutaciones de pérdida de producción surgen de manera espontánea y aleatoriamente.' En segundo lugar, una tasa de crecimiento o ventaja de "estado físico" de células con rendimientos de productos reducidos conduce a un eventual barrido de población por bajos productores, y por lo tanto disminuye el rendimiento general del cultivo. Este fenómeno puede ser referido como "degeneración de cepa" . , , . ¦ Las fermentaciones brasileñas de combustible etanol logran rendimientos muy altos de etanol a partir de , azúcar durante largos períodos de tiempo, es decir, aproximadamente 90% del rendimiento teórico máximo. Esto es en parte, debido a que la producción de etanol es catabólica: genera 2 ÁTÍ? por molécula de azúcar producido y es redox equilibrada ism la implicación de oxígeno. Una célula que muta para noj pjrodücir etanol es menos apta bajo las condiciones de bajo oxígeno del fermentador y no barrerá la población. Esto permití qué las fermentaciones industriales de etanol reciclen la mayoría de la biomasa de levadura durante toda la temporada, minimizando la conversión de azúcar en la biomasa celular de levadura y dirigiendo casi todo el azúcar para la producción de etanol. Esta propagación extendida y reutilización de la biomasa aumenta las eficiencias de la producción dé etanol: los gastos de operación se reducen debido a que menos azúcar va a la biomasa durante cada ciclo (es decir, el rendimiento aumenta) , y los gastos de capital se reducen debido a que menos y más pequeños termentadores son necesario^ para construir la biomasa para las inoculaciones.

Por el contrario, la producción dei muqhos hidrocarburos derivados acetil-CoA (por ejemplo, isoprenoides , ácidos grasos, y policétidos) son generalmente de naturaleza no catabólica; usualmente requieren una éntrada neta de ATP, NADPH, y carbono, a menudo con; grandes ' * i ¦ ! cantidades de oxígeno suministrado para ayudar a equilibrar la redox del sistema. Este entorno produce evolución hacia producto inferior, mayor biomasa que produce genotipos más favorable, y conduce a una mayor tasa de degeneración cepa.

Una forma de disminuir la presión selectiva negativa de productos no catabólicos productores es apagar la formación de producto durante periodos donde el producto no se desea, tal como durante las fases de la fermentación donde la biomasa debe ser generada con el fin de maximizar la productividad del termentador. Los interruptores genéticos son una forma común de lograr esto en la práctica^, pero pueden tener desventajas debido a, por ejemplo, el costo de un inductor exógeno, el retraso en la transcripción 'y la traducción del interruptor, y puede también ser una fuente de productores bajos si ocurren mutaciones en el interruptor genético por sí mismo. Sin embargo, un interruptor metabólico no sufre de estas desventajas. ,; , Por lo tanto, hay una necesidad en la técriica de - interruptores metabólicos que pueden controlar la sincronización de la producción de compuestos derivados de acetil-CoA durante la fermentación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION En la presente se proporciona un proceso de fermentación para la producción de un compuesto derivado de acetil-CoA heterólogo ("compuesto HACD") a partijf ide una célula huésped genéticamente modificada. En algunas modalidades, el proceso comprende dos fases: una etíapa de construcción durante la cual se reduce sustancialmente: la producción de compuesto HACD (la etapa de "apagado") mientras que la biomasa celular se acumula, y una fase de producción, durante la cual la producción de compuesto HACD está encendida. Por lo tanto, la presión selectiva ' negativa asociada con la producción de compuesto HACD se alivia durante una etapa de fermentación en la cual no se; necesita la producción. Sin estar ligado por la teoría, se cifeej <¾ue la reducción o eliminación de la producción de compuesto HACD durante la etapa de construcción da como resultado la estabilidad mejorada de la cepa durante la etapa de producción, lo que resulta en la producción de compuesto HACD sostenida más larga, aumentando el rendimiento general y/o la productividad de la cepa. Los estados "apagado" y "encendido" de producción de compuesto HACD en el cultivo de feíímeíntación se controlan por la cantidad de un precursor a acetil-CoA, pantotenato, en el medio de cultivo.

La acetil-CoA es la forma activada de acetato que se utiliza como un bloque de construcción para muchas biomoléculas importantes, incluyendo aminoácidos, ácidos grasos, isoprenoides , y policétidos. El cofactor, coenzima A (la porción CoA de acetil-CoA) se biosintetiza a partir de tres precursores (Figura IB). Dos de estos precursores , principalmente L-cisteína y adenosina-5 ' -trifosfato, sé puede sintetizar de manera eficiente por la mayoría de los sistemas vivos y por lo tanto no son limitantes. En contraste,; el tercer precursor, pantotenato es limitante y sólo se produce por la mayoría de los sistemas vivos en cantidades insuficientes. Como resultado, la mayoría de los sistemas vivos requieren fuentes externas de un compuesto de pantotenato (por ejemplo, en el medio de cultivo o una fuente de alimento) para óptimo crecimiento, salud y viabilidad. Sin embargo, los métodos proporcionados en la presente;; S basan en parte en el descubrimiento inesperado de qué el pantotenato se puede utilizar en cantidades limitadas u omitir por completo cuando las células de cultivo se diseñan para producir compuestos derivados de acetil-GoA. Estas células pueden mantener el crecimiento y viabilidad, y en algunos casos, demuestran crecimiento mejorado, bajo concentraciones limitantes de pantotenato. Ventajosamente, estas mismas condiciones dan como resultado una reducción en la producción del compuesto HACD. En consecuencia, los métodos proporcionados en la presente utilizan pantotenato como interruptor no genético para efectuar las etapas de "apagado" y "encendido" de un proceso de fermentación mejorado para la producción de compuestos derivados de acetil-CoA heterologos. ; Por lo tanto, en un aspecto, en la presente se proporciona un método para producir un compuesto derivado de acetil-CoA heterólogo (HACD) en una célula huésped que comprende: (a) cultivar una población de células huéspedes genéticamente modificadas capaces de producir un compuesto HACD en un medio de cultivo que comprende una fuente de carbono y una cantidad limitante de pantotenato, eni; d<¡Dndé la cantidad limitante de pantotenato limita la producción ¡del compuesto HACD por la célula huésped; seguido por | ; (b) cultivar la población o una subpoblación¦ de la misma en un medio de cultivo que comprende una fuente de carbono y una cantidad no limitante de pantotenato,' en donde la cantidad no limitante de pantotenato es una cantidad mayor que la cantidad limitante de pantotenato, en donde la población o subpoblación de la misma produce una: cantidad mayor del compuesto HACD en la presencia de la cantidad no limitante de pantotenato.

En algunas modalidades, la cantidad limitante de pantotenato se determina realizando una titulación de pantotenato, en donde las células huéspedes se cultivan en un medio de crecimiento que comprende concentraciones aumentadas de pantotenato, y la producción del compuesto HÁCD , se determina en cada concentración de pantotenato, en dónde la titulación de pantotenato comprende cantidades de saturación de pantotenato por lo cual la producción del compuesto HACD es en su máximo; en donde la cantidad limitante de pantotenato es cualquier concentración de pantotenató a la cual la producción del compuesto HACD es menor <gu a: su máximo.

En algunas modalidades, la producción del compuesto HACD durante la etapa de "construcción" (etapa (a)): es menos de 50, 40, 30, 20 o 10% de la producción máxima de compuesto HACD de la célula huésped genéticamente modificada; En algunas modalidades, la producción del compuesto HACD durante la etapa de "producción" (etapa (b) ) es mayor que 50, 60, 70, 80 o 90% de la producción máxima de compuesto HA'CDj de la célula huésped genéticamente modificada.

En algunas modalidades, el cultivo de la etapa (a) es por un período de tiempo suficiente para que la ¡población alcance una densidad celular (OD6oo) de entre 0.01 y ;400. En algunas modalidades, el cultivo de la etapa (b) es por un periodo de 3 a 20 días. En algunas modalidades, la: cantidad limitante de pantotenato está por debajo de 0.2 mg/L. En algunas modalidades, la cantidad limitante de pantotenato es O mg/L. En algunas modalidades, la cantidad no limitante¡ de pantotenato está arriba de 0.2 mg/L. En algunas modalidades, la cantidad no limitante de pantotenato es al menos la concentración mínima de pantotenato a la cual la producdión de compuesto HACD es en su máximo. En algunas modalidades, la cantidad no limitante de pantotenato es 10 mg/L.

En algunas modalidades, la etapa (b) comprende agregar pantotenato al medio de cultivo que comprende la i! I 11 cantidad limitante de pantotenato hasta que él medio comprenda una cantidad no limitante de pantotenato.! En algunas modalidades, la etapa (b) comprende transferir la '! '¦ I población de la etapa (a) a un nuevo medio de cultivo que comprende una cantidad no limitante de pantotenato. 1 1 ¡ En algunas modalidades, los métodos proporcionados en la presente dan como resultado la producción aumentada del compuesto HACD por la población de células -huéspedes genéticamente modificadas, en comparación con la producción que resulta de un método que no comprende cultivar las células en una cantidad limitante de pantotenato. Efr algunas modalidades, la producción del compuesto HACD se mide en términos de rendimiento (gramo de compuesto HACD 'producido por gramo de sustrato de carbono) o productividad (gr&mps de compuesto HACD producido por litro de medio de cultivo por hora). En algunas modalidades, los métodos adiciorialménte comprenden recuperar el compuesto HACD. , En algunas modalidades, el pantotenato se selecciona del grupo que consiste de 2-deshidropanto tó, (R) -pantoato, (R) -pantotenato, y cualquier sal o éster de los mismos. En algunas modalidades, la célula huésped , se selecciona del grupo que consiste de una célula füngiCa, una célula bacteriana, una célula de planta, y una ¡ célula animal. En algunas modalidades, la célula huésped es una célula de levadura. En algunas modalidades, el compuesto HACD i i ¦ ' se selecciona del grupo que consiste de un aminoácido, un ácido graso, un isoprenoide, y un policétido. ; , : En algunas modalidades, la célula huésped es capaz de producir un isoprenoide y comprende al menos un ácido ? l ; nucleico heterologo que codifica una enzima de la trayectória de isoprenoide seleccionado del grupo que consiste de: a) una enzima que condensa dos moléculas dé acettil-coenzima A para formar acetoacetil-CoA; l! I i b) una enzima que condensa acetoacetil -CoA 1 con otra molécula de acetil-CoA para formar 3 -hidroxi -3 -metilglutaril -CoA (HMG-CoA) ; ! " c) una enzima que convierte HMG-CoA en mevaloíiato; d) una enzima que convierte mevalonato en mevalonato 5-fosfato; e) una enzima que convierte mevalonato 5- fosfató en mevalonato 5-pirofosfato; f) una enzima que convierte mevalonato 5-pi.roíOsfato en IPP; g) una enzima que convierte el IPP en DMAPP; h) una poliprenil sintasa que puede condensar moléculas de IPP y/o DMAPP para formar compuestos de poliprenilo que contienen más de cinco carbonos ; i) una enzima que condensa IPP con DMAPP pata ! formar GPP; j) una enzima que condensa dos moléculas del IPP con una molécula de DMAPP; k) una enzima que condensa IPP con GPP para , formar FPP; 1) una enzima que condensa IPP y DMAPP para formar GGPP; y, ; m) una enzima que condensa IPP y FPP para formar GGPP. En algunas modalidades, la célula huésped adicionalmente comprende un ácido nucleico heteroldgo ¡que codifica una enzima que modifica un poliprenilo, seleccionado del grupo que consiste de una geraniol sintasa, una ljinalool sintasa, una limoneno sintasa, una mirceno sintasa, una ocimeno sintasa, una -pineno sintasa, ß-pineno sintasa, una sabineno sintasa, una ?-terpineno sintasa, una té'rpinoleno sintasa, una amorfadieno sintasa, una a-farneseno sintasa, una ß-farneseno sintasa, una farnesol sintasa, una nerolidol sintasa, una patchouliol sintasa, una nootkatona sintasa, una abietadieno sintasa.

En algunas modalidades, la célula huésped es capaz de producir un policétido y comprende al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima de síntesis de policétido, ; ; i en donde la enzima de síntesis de policétido se selécciona del grupo que consiste de: a) una enzima que condensa al menos uno de acefcil-CoA y malonil-CoA con una proteína portadora de acilo,· b) una enzima que condensa un primer ;¡ reactivo seleccionado del grupo que consiste de acetil-CoA y; p??????-CoA con un segundo reactivo seleccionado del grupo que consiste de malonil-CoA o metilmalonil-CoA para formar un producto policétido; c) una enzima que reduce un grupo químico ß-cetó en un compuesto policétido a un grupo ß-hidroxi; d) una enzima que deshidrata un grupo químico alcano en un compuesto policétido para producir un alqúeriO' ?-ß-insaturado; ,; e) una enzima que reduce un enlace doble ??-ß en un compuesto policétido a un alcano saturado; y, ; f) una enzima que hidroliza un compuesto policétido de una proteína portadora de acilo.

En algunas modalidades, el policétido es un lípido que tiene al menos una de actividad antibiótica, anttifúngica , y antitumor. En algunas modalidades, el policétido, se selecciona del grupo que consiste de un macrólidó, un antibiótico, un antifúngico, un compuesto citostático, un compuesto anticolesterolémico, un compuesto antiparasitario, un compuesto coccidiostático, un promotor de crecimiento, de los animales y un insecticida.

En algunas modalidades, la célula huésped es capaz de producir un ácido graso y comprende al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima de síntesis de ácido graso, en donde la enzima de síntesis de ácido! girase» se selecciona del grupo que consiste de: i a) una enzima que enlaza covalentemente , al menos i una de acetil-CoA y malonil-CoA a una proteína portadora de acilo (ACP) ; b) una enzima que condensa acetil-ACP y! m&loriil-ACP para formar acetoacetil-ACP; - , c) reducir el enlace doble en acetoacetil-ACP con NADPH para formar un grupo hidroxilo en D-3 -hidroxibutiril hidroxilasa-ACP; d) una enzima que deshidrata D-3 -hidroxibutiril hidroxilasa-ACP para crear un enlace doble entre los; carbonos beta y gamma que forman crotonil -ACP ; e) una enzima que reduce crotonil ACP cotí NADPH para formar butiril-ACP; y, f) una enzima que hidroliza un compuesto; de acilo de C16 de una proteína portadora de acilo paira ' formar palmitato.

En algunas modalidades, el ácido graso se selecciona del grupo que consiste de palmitato, palmitoil CoA, ácido palmitoleico, ácido sapiénico, ácido oleico, áqido linoleico, ácido a-linolénico, ácido araquidónico, ácido i : ; eicosapentenoico, ácido erúcico, y ácido docosahexenóido .

En otro aspecto, en la presente se proporciona un método para producir un compuesto derivado de acetil-CoA heterólogo (HACD) en una célula huésped que comprende: 1 (a) cultivar una población de células huespedes genéticamente modificadas capaces de producir un compuesto HACD en un medio de cultivo que comprende una fuente de carbono y cairente de suplementación de pantotenato ; seguido por - ¡ ? I (b) cultivar la población o una subpoblación de la misma en un medio de cultivo que comprende una fuente de carbono y suplementado con al menos 1 mg/L de pantotenato .[ En algunas modalidades, el cultivo de la etápa (a) es por un período de tiempo suficiente para que la '^población alcance una densidad celular (OD6oo) de entre 0.01 y 400. En algunas modalidades, el cultivo de la etapa (b) és por un periodo de 3 a 20 días. : : BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las FIGURAS 1A-1B muestran las estructuras moleculares de (1A) R-pantotenato, y (IB) coenzima ;A, 'con relieve de los tres segmentos de la coenzima A, que, se derivan de sus tres precursores: L-cisteína, (R) -pantotenato, y ATP.

Las FIGURAS 2A-2B muestran la trayectoria i de biosíntesis de pantotenato en levadura (2A) y bacterias (2B) .

Las FIGURAS 3A-3B muestra los rendimientos; de un compuesto HACD ejemplar (3A) y densidades celulares (3B) obtenidas para las cepas Y4689 e Y4352 en la presencia de i varias cantidades de pantotenato. Las cepas Y4689 y Y4352 cada una comprendida de enzimas heterólogas (incluyendo las ¦¡ i ¦ 1 enzimas de la trayectoria de MEV: IPP isomerasa, FPP' sintasa, y farneseno sintasa) fueron capaces de producir el compuesto HACD en rendimientos de 15% y 13%, respectivamente.

La FIGURA 4 muestra el crecimiento celular en agar que comprende 0.4 mg/L o 0.002 mg/L de pantotenato de las cepas Y4720, Y5038, e Y2205. Las cepas Y4720 e Y5038 c&da una comprendida de enzimas heterólogas (incluyendo las enzimas de la trayectoria de MEV: IPP isomerasa, FPP sintasa, y farneseno sintasa) y fueron capaces de producir un íconpuésto HACD ejemplar en rendimientos de 14% y 6%, respectivamente. La cepa Y2205 fue un control j d tipo silvestre CEN.PK2 que no produjo algún compuesto HACD.

La FIGURA 5 muestra el crecimiento celular 1 de células huéspedes de levadura capaces de producir rendimientos variables del compuesto HACD ¡ejemplar, farneseno, en presencia de 0 o 10 mg/L de pantotenato. Se indica el rendimiento de farneseno aproximado de cada jcepá, y los puntos de datos para las cepas que producen farnésén0 a un rendimiento de menos de 10% son de color gris mientras que los puntos de datos para las cepas que producen farnéseno a un rendimiento de 10% o más son de color negro.

La FIGURA 6 muestra la degeneración de cepa (es decir, disminución de la producción de compuesto HACD con el tiempo) de una población de células huéspedes de lévadura capaces de producir un compuesto HACD, farneserio, ' en presencia de 10 mg/L de pantotenato. ' La FIGURA 7 proporciona una representación esquemática de la trayectoria de mevalonato ( "MEV" ) para la producción de isopentenil difosfato ("IPP").

La FIGURA 8 proporciona una ¦ representación esquemática de la conversión de IPP y dimetilalil pirofosfato ¡i i ¦ i ("DMAPP") a geranil pirofosfato ( "GPP" ) , farnesil pirofosfato ("FPP"), y geranilgeranil pirofosfato ("GGPP").

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION El término "compuesto derivado de aceti^-C-íoA" se refiere a una molécula que se biosintetiza por una célula huésped de uno o más grupos acetilo derivados de acétil-CóA.

El término "endógeno" se refiere a una sustancia o proceso que puede ocurrir naturalmente en una célula huésped.

El término "genéticamente modificado" se refiere a una célula huésped que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga. ¡ ¡ El término "compuesto HACD" se refiere al compuesto derivado de acetil-CoA heterólogo que es producido por las células huéspedes genéticamente modificadas. Los com uestos HACD incluyen, pero no se limitan a aminoácidos, ácidos grasos, isoprenoides , y policétidos. En algunas modalidades , el compuesto HACD se selecciona del grupo que consiste de isoprenoides, ácidos grasos y policétidos.

El término "heterólogo" se refiere a lo que iio se encuentra normalmente en la naturaleza. El término "compuesto heterólogo" se refiere a la producción de un compuesto por una célula que normalmente no produce el compuesto, o a la producción de un compuesto a un nivel al cual no se produce normalmente por la célula. ' | El término "enzima heteróloga" se refiere; á una enzima que no se encuentra normalmente en una célula dada en la naturaleza. El término abarca una enzima que es: , , , (a) exógena a una célula dada (es decir, codificada por una secuencia de nucleótidos que no está · presente naturalmente en la célula huésped o no presente naturalmente en un contexto dado en la célula huésped) ; y (b) encontrada naturalmente en la célula huésped (por ejemplo, la enzima es codificada por una secuencia de nucleótidos que es endógena a la célula) , pero que se produce en una cantidad no natural (por ejemplo, mayor o menor! qué la encontrada naturalmente) en la célula huésped. ; El término "compuesto de pantotenato" se iire£iere a cualquier compuesto seleccionado del grupo que consisté de 2-deshidropantoato, (R) -pantoato, (R) -pantotenato, y cualquier sal o éster de los mismos.

El término "producción" generalmente se refiere a una cantidad de compuesto HACD producido por uiía ¡ célula huésped genéticamente modificada proporcionada en la presente. En algunas modalidades, la producción sé éxpresa como un rendimiento del compuesto HACD por la [ célula huésped. En otras modalidades, la producción se expreSa como una productividad de la célula huésped en la producción ¡del compuesto HACD .

El término "productividad" se refiere i a 1 la producción de un compuesto HACD por una célula huésped, :' i : expresada como la cantidad de compuesto HACD producido (en peso) por cantidad de caldo de fermentación en el cual se cultiva lá célula huésped (en volumen) con el tiempo (por hora) .

El término "rendimiento" se refiere a la producción dé un compuesto HACD por una célula huésped, expresado como la cantidad de compuesto HACD producido por cantidad de fuente de carborió doriSumida por la célula huésped, en peso.

Uso de Pantotenato como un Interruptor No Genético para la Modulación de la Producción de Compuestos Heteról gos Los métodos y composiciones proporcionados en la presente se basan en el descubrimiento de que cuándo1 el pantotenato se limita o se omite del medio de cultivo en el cual son cultivadas las células huéspedes genéticamente i ! modificadas capaces de producir compuestos HACD, la producción de compuesto HACD se reduce sustancialme te¿ y cuando el pantotenato se proporciona en el medio de cultivo, se aumenta la producción de compuesto HACD. Por lo tanto, el pantotenato puede actuar como un interruptor no genético j)ara la producción de compuestos HACD en células huéspedes genéticamente modificadas. En particular, el contr'bl ' dé: la sincronización de producción de compuesto HACD pajra que ocurra sólo cuando se desea la producción redirige eí flujo de carbono durante la fase de no producción en i el I mantenimiento de células y de la biomasa. Este uso más eficiente de carbono reduce en gran medida la' carga metabólica en las células huéspedes, aumenta la estabilidad de los genes heterologos, reduce la degeneración dé ¿epa, y contribuye a una mejor salud general y la viabilidad ¡ de j las células. En consecuencia, los métodos proporcionados en la presente utilizan pantotenato como un interruptor no1 genético para efectuar las etapas "apagado" y "encendido" ¦ de un proceso de fermentación mejorado para la producción de compuestos derivados de acetil-CoA heterologos. !l : " Por lo tanto, en un aspecto, en la presente se proporciona un método para producir un compuesto derivado de acetil-CoA heterólogo (HACD) en una célula huéjsped que comprende: ; (a) cultivar una población de células huéspedes genéticamente modificadas capaces de producir un compuesto HACD en un medio de cultivo que comprende una fuente' de carbono y una cantidad limitante de pantotenato, e ¦; donde la cantidad limitante de pantotenato limita la producción del compuesto HACD por la célula huésped; seguido por (b) cultivar la población o una subpoblacióri de1 la misma en un medio de cultivo que comprende una £ue¡nte: de carbono y una cantidad no limitante de pantotenato, en donde la cantidad no limitante de pantotenato es una cantidad mayor que la cantidad limitante de pantotenato, en donde ! la población o subpoblación de la misma produce una: cantidad mayor del compuesto HACD en la presencia de la cantidad no limitante de pantotenato.

En la primera etapa (es decir, la ^et& a ¡ de "construcción", etapa (a)), las células ^huéspedes genéticamente modificadas crecen en un medio de crecimiento o medio de "construcción" en donde el pantotenato se' limita o se omite. En la segunda etapa (es decir, la .etapa, de "producción" , etapa (b) ) , se añade un compuesto de pantotenato al medio de cultivo, que sirve como un interruptor no genético para aumentar sustancialmente la producción del compuesto HACD. El crecimiento inicial a niveles bajos o ausentes de pantotenato asegura: que los requerimientos de energía de las células se cumplan mientras que la biomasa de las células aumenta rápidamente. Después, el cambio a un medio de crecimiento que contiene un compuesto de pantotenato permite la síntesis del producto HACD1 ¡ El Ejemplo 5 (a continuación) y Figura 3A ilustran el efecto de la concentración del compuesto de pantoteijiatq en el medio de cultivo sobre la producción de compuesto HACD en una célula huésped genéticamente modificada que tiene un alto .1 I > flujo metabólico a través de la trayectoria de biosíht sis de acetil-CoA para producir el isoprenoide farneseno. A niveles bajos de compuesto de pantotenato (0.2 mg/L, <1% de la concentración máxima de compuesto de pantotenato analizada) , no existe prácticamente producción del compuesto HACD. Los niveles aumentados del compuesto de pantotenato se correlacionan con la producción aumentada de compuésto HACD hasta que se estabiliza el efecto. Los aumentos adjicionales más allá de 1 mg/L de pantotenato (10% de la concentración máxima de compuesto de pantotenato analizada) dan como resultado aumentos no adicionales en la produ c^ó de compuesto HACD.

En particular, el crecimiento de estag pélulas muestra la tendencia opuesta a la producción de compuesto HACD. La Figura 3B ilustra el crecimiento de las misma^ cepas a los mismos niveles de concentración de pantotenato que se analizaron para la producción de compuestos HACD. Los nivéles ausentes o bajos de un compuesto de pantotenato enjj realidad I resultan en un mejor crecimiento que el observado cuando las cepas se cultivaron a niveles de pantotenato para la producción máxima de compuesto HACD. bajos niveles de pantotenato se observó con mayor fre uenjcia entre las células huéspedes diseñadas para producir rpayores cantidades de un compuesto HACD, como se ilustra! por los Ejemplos 6 y 7 y las Figuras 4 y 5 continuación. ¡Por | lo tanto, en ciertas cepas capaces de producir compuestos ' HÁCD, se observó un beneficio adicional del crecimiento^ mejorado cuando se cultivan en poco o nada de pantotenato.1 El cepa, que puede ocurrir cuando el pantotenato se proporciona l! I ' i a lo largo de todas las etapas de un pr'oc^sp'í de fermentación. La producción sólida del farneseno HAQD ¡ se I > . ! mantiene transitoriamente en el principio de la ferm'enfcación, :| ! ' ! pero con el tiempo, la producción se reduce a cercá de sólo 60% de la producción máxima observada previamentje .' Ésto resulta en una producción disminuida general (por ej'emblo, el rendimiento y/o productividad) de la población dé huéspedes. Sin embargo, como se describe en el Ejemplo 9 y Tabla 1 a continuación, mediante la limitación u omisión 'del pantotenato del medio de cultivo durante la etapa de "construcción" , la producción de compuesto HACD se puede aumentar sustancialmente durante el curso de la ferméntación .

Cantidades Limitantes y No Limitantes de Pantotenato En algunas modalidades de los ; métodos proporcionados en la presente, una cantidad "limitante'!' ?,"?? limitante" de pantotenato para uso en los métodos proporcionados en la presente se puede determinar por cualquier célula huésped genéticamente modificada ca az! de producir un compuesto HACD. En algunas modalidades, una cantidad no limitante de pantotenato se determina mediante la realización de una curva de producción de compuesto HACD en presencia de cantidades aumentadas de pantotenato en el medio de cultivo, es decir, una titulación de pantoté;nato . Una titulación pantotenato ejemplar se proporciona en el Ejemplo 5 y las Figuras 3A-3B a continuación.

Por ejemplo, una población de células huespedes genéticamente modificadas puede ser dividida en una pluralidad de subpoblaciones y cultivarse en paralelo, en donde cada subpoblación crece en medios de cultivo que comprenden, por ejemplo, una cantidad aumentada diferente de pantotenato (incluyendo no pantotenato), y la producción de compuesto HACD se somete a ensayo después de un periodo' de tiempo definido. En modalidades preferidas, la titulación; de pantotenato comprende al menos dos concentraciones de pantotenato mediante el cual la producción de compu^stfo HACD de las células huéspedes se estabiliza a una cantidad ijiáxima, es decir, donde se observó ningún aumento adicional; en; la producción de compuesto HACD con un aumento en ; la concentración de pantotenato. En algunas modalidades, una "cantidad no limitante" de pantotenato es al menos . la cantidad mínima de pantotenato a la cual la producción de compuesto HACD de las células huéspedes se estabiliza a su máximo. Esta cantidad también puede ser referida como una cantidad de "saturación" u "óptima" de pantotenato para la producción de compuesto HACD para la célula huésped particular, por lo que la cantidad no limita la producción de compuesto HACD de la célula huésped, es decir, donde la producción de compuesto HACD no se ve afectada negativaménte debido a una falta de pantotenato en el medio de cü'ltivo. En otras modalidades, la cantidad "no limitante" de pantotenato puede incluir cualquier concentración de pantotenato a la cual se observa la producción de compuesto HACD, Incluso donde la producción de compuesto HACD es subóptima. ; ¡ Una vez que una cantidad no limitante de pantotenato se ha determinado para la célula huésped, ésta cantidad se puede utilizar durante la etapa de prodüccióm del I ¡: I ¦ ¡ proceso de fermentación, y también se puede utilizar para determinar una cantidad "limitante" de pantotenato para 'ser utilizada durante la etapa de construcción. En: algunas modalidades, una cantidad "limitante" de pantotenato puede ser cualquier cantidad por debajo de una cantidad no limitante de pantotenato, para uso en la etapa de construcción de la fermentación.

En algunas modalidades, la cantidad no limitánte de pantotenato es al menos 0.01 mg/L (peso de pantotenato jPor volumen de medio de cultivo) . En algunas modalidades, la cantidad no limitante de pantotenato es al menos O.lim^/L. En algunas modalidades, la cantidad no limitante de pantotenato . i es al menos 1 mg/L. En algunas modalidades, la cantidad no limitante de pantotenato es al menos 10 mg/L. Eri ftlgúnas modalidades, la cantidad no limitante de pantotenato es una cantidad de pantotenato entre 0.01 mg/L y 10 mg/L. En algunas modalidades, la cantidad no limitante de pantotenato 1 es una cantidad de pantotenato entre 0.01 mg/L y 1 mg/L. Eh algunas modalidades, la cantidad no limitante de pantotenato ! e$ una cantidad de pantotenato entre 0.01 mg/L y 0.1 : mg/L¿ En algunas modalidades, la cantidad no limitante de pantotenato es una cantidad de pantotenato entre 1 mg/L y 10 mg/L. En algunas modalidades, la cantidad no limitante de pantotenato es una cantidad arriba de 0.001 mg/L. En algunas modalidades, la cantidad no limitante de pantotenato es una cantidad arriba de 0.01 mg/L. En algunas modalidades, la cantidad, no limitante de pantotenato es una cantidad arriba de 0.02 mg/L. En algunas modalidades, la cantidad no limitahte de pantotenato es una cantidad arriba de 0.1 mg/L. Ei algunas modalidades, la cantidad no limitante de pantotenato es una cantidad arriba de 0.2 mg/L. En algunas modalidadés , la cantidad no limitante de pantotenato es una cantidad arriba de 1 mg/L. En algunas modalidades, la cantidad no limitante de pantotenato es una cantidad arriba de 2 mg/L. En. algunas modalidades, la cantidad no limitante de pantotenato es una cantidad arriba de 10 mg/L. t : En algunas modalidades, la cantidad limitante de pantotenato es una cantidad que es al menos 2 vedes,' 10 veces, 100 veces, 1000 veces, 10,000 veces o 100,000 veces menor que una cantidad no limitante de pantotenato como se determina de acuerdo con los métodos ¡descritos anteriormente. En algunas modalidades, la cantidad ¡licitante de pantotenato es una cantidad que es al menos 2 veces, 10 veces, 100 veces, 1000 veces, 10,000 veces o 100Q0Q eces menor que la cantidad de saturación de pantotenato Como se determina de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. En algunas modalidades, la cantidad limitante de pantotenato es una cantidad que es menor que 50% ^ menor que 20%, menor que 10%, menor que 1%, menor que 0.5%, menor que 0.2%, menor que 0.1%, menor que 0.01%, o menor que 0.001% de una cantidad no limitante de pantotenato como se determina de acuerdo con los métodos descritos anteriorjmeijité . En algunas modalidades, la cantidad limitante de pantotenato! es una cantidad que es menor que 50%, menor que 2 10%, menor que 1%, menor que 0.1%, menor que 0 que 0.001% de la cantidad de saturación de pantote ato como se determina de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. En otras limitante de pantotenato menor que 1 mg/1, o meno o menor que 0.02 mg/L, 0.001 mg/L de pantotenato. En una modalidad específica, la : !! ¡ 1 cantidad limitante de pantotenato es 0 mg/L, es decir) |sin pantotenato. Por lo tanto, en esta modalidad específica, las células huéspedes crecen durante la etapa de construcción en un medio de cultivo celular que no comprende fuente externa i < de pantotenato, y la única fuente de panto'te ató a disposición de las células es pantotenato endógeno ¡que! se i l i ; í produce internamente. ! . j En una modalidad específica, la no limitante de pantotenato es la cantidad de saturación para una célula huésped dada, tal como se describe I ! 1 1 i l anteriormente, y la cantidad limitante es sin pantotiénato ; En otra modalidad específica, la cantidad no limitante de pantotenato es al menos 0.01 mg/L, y la cantidad liríjitjanté es sin pantotenato. En otra modalidad específica, la cantidad1 no limitante de pantotenato es una cantidad de pantotenáto desde i 0.01 a 10 mg/L, y la cantidad limitante efi sin pantotenato. En otra modalidad específica, la cantidad no limitante de pantotenato es al menos 10 mg/L, y la cantidad limitante es sin pantotenato. ' En algunas modalidades, la producción del compuesto HACD durante la etapa de construcción (etapa (a) del método descrito anteriormente) es menos de 50, 40, 30, 20 o ,10% de i ¦ 1 la producción máxima de compuesto HACD de la célula huésped genéticamente modificada, es decir, la cantidad de producción de compuesto HACD cuando la célula huésped se cultiva en un medio que comprende una cantidad de saturación u cpptjima1 de pantotenato. En algunas modalidades, la producción del compuesto HACD durante la etapa de construcción es menos de 50% de la producción máxima de compuesto HACD de la célula huésped genéticamente modificada. En algunas modalidades, la producción del compuesto HACD durante la étajpá de construcción es menos de 40% de la producción máxima de compuesto HACD de la célula huésped genéticamente modificada. En algunas modalidades, la producción del compuesto HACD durante la etapa de construcción es ' ménós de 30% de la producción máxima de compuesto HACD de a ¡ célula huésped genéticamente modificada. En algunas modalidades, la producción del compuesto HACD durante la etapa de construcción es menos de 20% de la producción máxima de compuesto HACD de la célula huésped genéticamente modificada. En algunas modalidades, la producción del compuesto HACD durante la etapa de construcción es;menos de 10% de la producción máxima de compuesto HACD de la célula huésped genéticamente modificada. En algunas modalidades, la producción del compuesto HACD durante la e,tapa j de construcción es de menos de 5% de la producción máxima de compuesto HACD de la célula huésped gené icamente modificada. En algunas modalidades, la produccióh del compuesto HACD durante la etapa de construcción es de menos de 1% de la producción máxima de compuesto HACD de la i célula huésped genéticamente modificada.

En algunas modalidades, la producción del compuesto HACD durante la etapa de producción (etapa (b) del método descrito anteriormente) es mayor que 20, 30, 40, 50, $0, 70, 80 o 90% de la producción máxima de compuesto HA¡CD¡ (Je la célula huésped genéticamente modificada. En algunas modalidades, la producción del compuesto HACD durahte la etapa de construcción es mayor que 50% de la producción máxima de compuesto HACD de la célula huésped genéticamente modificada. En algunas modalidades, la producción del compuesto HACD durante la etapa de construcción es mayor que 60% de la producción máxima de compuesto HACD de la célula huésped gené icamente modificada. En algunas modalidades; la producción del compuesto HACD durante la etapa de construcción es mayor que 70% de la producción máxima ! de compuesto HACD de la célula huésped genéticamente modificada. En algunas modalidades, la producción del compuesto HACD durante la etapa de construcción es mayor que 80% de la producción máxima de compuesto HACD de la célula huésped genéticamente modificada. En algunas modalidades, la producción del compuesto HACD durante la etapa 1 de construcción es mayor que 90% de la producción njáxima , de compuesto HACD de la célula huésped genéticamente modificada. En algunas modalidades, la producción 'del compuesto HACD durante la etapa de construcción es mayor ique 95% de la producción máxima de compuesto HACD de la célula huésped genéticamente modificada. En algunas modalidaci.es , la producción del compuesto HACD durante la etapa de construcción es 100% o más de la producción máxima de compuesto HACD de la célula huésped genéticamente modificada.

Los períodos de tiempo durante el cual la( etapa de construcción y etapa de producción del proceso de fermentación se llevan a cabo pueden variar, y dependerá de factores tales como las velocidades de crecimiento de la célula huésped, por ejemplo, con limitación o suplementación de pantotenato en el medio de cultivo; la velocidad intrínseca de crecimiento de la célula huésped, y otras condiciones de cultivo tales como el pH, temperatura, y requisitos para las condiciones aeróbicas, microaeróbicas , o anaeróbicas, dependiendo de los requisitos específicos de la célula huésped, la fermentación, y el proceso. Sin embargo, se espera que cualquier duración de la etapa de construcción resulte en algún beneficio para la productividad final de la fermentación, ya que una cierta cantidad de la: presión selectiva negativa asociada con la producción de compuesto HACD se alivia en el estado "apagado" .

En algunas modalidades, la etapa de constricción se lleva a cabo durante un período de tiempo suficiente para producir una cantidad de biomasa celular que puede soportar la producción del compuesto HACD durante la : fase de producción. En algunas modalidades, la etapa de construcción se lleva a cabo durante un período de tiempo suficiente para que la población presente en el momento de la inoculación i sufra una pluralidad de duplicaciones hasta que se alcanza una densidad celular deseada. En algunas modalidades,, ; la etapa de construcción se lleva a cabo durante un período de tiempo suficiente para que la población de células huéspedes llegue a una densidad celular (OD60o) de entre ?.????? ??? en el recipiente o contenedor de fermentación en el cua;l se está llevando a cabo la etapa de construcción. En algunas modalidades, la etapa de construcción se lleva a cabo hasta que se alcanza una OD60o de al menos 0.01. En. algunas modalidades, la etapa de construcción se lleva a cabo hasta que se alcanza una OD60o de al menos 0.1. En · algunas modalidades, la etapa de construcción se lleva a cabo hasta que se alcanza una OD60o de al menos 1.0. En algunas modalidades, la etapa de construcción se lleva a cabo hasta que se alcanza una OD60o de al menos 10. En algunas modalidades, la etapa de construcción se lleva a cabo hasta que se alcanza una OD60o de al menos 100. En, algunas modalidades, la etapa de construcción se lleva a cabo hasta que se alcanza una OD60o de entre 0.01 y 100. En algunas modalidades, la etapa de construcción se lleva a cabo hasta que se alcanza una OD60o de entre 0.1 y 10. En álgunas modalidades, la etapa de construcción se lleva a cabo hasta que se alcanza una OD6oo de entre 1 y 100. En otras modalidades, la etapa de construcción se lleva a cabo 1 por un período de al menos 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 o más de 96 horas.

En algunas modalidades, la etapa de producción se lleva a cabo durante un período de tiempo suficiente para producir una cantidad deseada del compuesto HACD. E algunas modalidades, la etapa de producción se lleva a cabo durante un período de al menos 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 9$ o más de 96 horas. <¦ En algunas modalidades, la etapa de producción se lleva a cabo durante un período de entre 3 y 20 dias. En algunas modalidades, la etapa de producción se lleva a cabo durante un período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20 o más de 20 días. ': ! En una modalidad particular, el método ¡ de producción de un compuesto HACD comprende realizar : la fermentación de la célula huésped genéticamente modificada en un medio que comprende una fuente de carbono y una concentración de compuesto de pantotenato limitada o usente en condiciones suficientes para permitir el crecimiento y mantenimiento de la célula huésped genéticamente modificada · luego posteriormente proporcionar en el medio de cultivo un compuesto de pantotenato a una concentración suficiente para inducir la producción del compuesto HACD, y mantener la concentración del compuesto de pantotenato en toda la operación de fermentación. 1 ¡ : En otra modalidad, el método de producción de, un compuesto HACD comprende cultivar las células huéspedes en medios de cultivo de construcción y producción separados. Por ejemplo, el método puede comprender cultivar la célula huésped genéticamente modificada en una etapa de conjstjrucción en donde la célula se cultiva en un medio que comprefi.de una cantidad limitante de pantotenato (por ejemplo, po£o , o nada de pantotenato) para producir un inoculo, luego transferir el inoculo en un segundo medio de fermentación que comprende una cantidad no limitante de pantotenato, y mantene las condiciones de estado estable en la segunda ¡e ^pa de fermentación para producir un cultivo celular que contiene un producto HACD.

En algunas modalidades, el método proporcionado en la presente es suficiente para la producción de uno o más compuestos HACD en una cantidad mayor de aproximadamente 10 gramos por litro de medio de fermentación. En algunas modalidades, el compuesto derivado HACD se producé en una cantidad de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 gramos, más de aproximadamente 15 gramos, más de aproximadamente 20 gramos, más de aproximadamente 25 gramos, o ,j njás , de aproximadamente 30 gramos por litro de cultivo celula En algunas modalidades, el método proporcionado1 en la presente es suficiente para la producción de ünoi o ¡más compuestos HACD en una cantidad mayor de aproximadamente 50 miligramos por gramo de peso de células secas. En algunas modalidades, el compuesto HACD recombinantemente producido se produce en una cantidad de aproximadamente! ] 50 a aproximadamente 1500 miligramos, más de aproximadamente 100 miligramos, más de aproximadamente 150. miligramos', !tnás de aproximadamente 200 miligramos, más de aproximadamente 250 miligramos, más de aproximadamente 500 miligramos, más de aproximadamente 750 miligramos, o más de aproximadamente 1000 miligramos por gramo de peso de células secas. ¡ En algunas modalidades, la práctica del método proporcionado en la presente resulta en la producción aumentada del compuesto HACD por la población de células huéspedes genéticamente modificadas, en comparación ton la producción resultante de un método que no comprende una etapa de construcción durante la cual las células huéspedes se cultivan en una cantidad limitante de pantotenato. En lguhas modalidades, la práctica del método resulta en la producción de uno o más compuestos HACD en una cantidad que es al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, ;'al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, :al¡ menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente! 45%,' al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente' 2^ veces, al menos aproximadamen e 2.5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente '3o| veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 300 veces, al menos aproximadamente 400 veces, al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces, o más, mayor que la cantidad de compuesto HACD producido por un método que no comprende una etapa de construcción durante la cual las células huéspedes se cultivan en una cantidad limitante de pantotenato, en una base por unidad de volumen dq (tultíivo celular. t ' En algunas modalidades, la práctica del .método resulta en la producción de uno o más compuestos HACD en una cantidad que es al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, ¡al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, ,1 al , menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, .; al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, ,al menos aproximadamente 90 %, : al menos aproximadamente 2 veces, , al menos aproximadamente 2 .5 veces , ¿1 menos aproximadamente 5 veces , al menos aproximadamente : 10 veces'. , i menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 30 veces , l menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces , al menos aproximadamente 75 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 300 veces, al menos aproximadamente 400 veces, ¿1: menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces, o más, mayor que la cantidad del compuesto HACD producido por un método que no comprende una etapa de construcción durante la cual las células huéspedes se cultivan en una cantidad limitante de pantotenato, en una base por unidad de peso de células secas. . ¦ .

En algunas modalidades, la práctica del método resulta en la producción de uno o más compuestos HACD en una cantidad que es al menos aproximadamente 10%, 'al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, 'al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, x menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente ; i ', 5 veces , al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente ? I 30 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 300 veces, al menos aproximadamente 400 veces, al menos aproximadamente i I 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces, o mas, mayor que la cantidad de compuesto HACD producido por un método que no comprende una etapa de construcción durante la 1 cúal las células huéspedes se cultivan en una cantidad limitante de pantotenato, en una base por unidad de volumen de cultivo celular por unidad de tiempo.

En algunas modalidades, la práctica del método resulta en la producción de uno o más compuestos HACD en una cantidad que es al menos aproximadamente 10%, ';al¡ menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 20%, al meiios aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, 'al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, ::al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2 .5 veces , al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al ' menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 40 ¡veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 75 veces, al menos aproximadamente 100 veces, ¡al i menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente ¡300 veces, al menos aproximadamente 400 veces, al '· menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente' 1000 veces, o más, mayor que la cantidad de compuesto HACD producido por un método que no comprende una etapa de construcción durante la cual las células huéspedes se cultivan en una cantidad limitante de pantotenatoj, en una base por unidad de peso de células secas por unidad de tiempo.

Medios de Cultivo y Condiciones Los materiales y métodos para el mantenimiento y crecimiento de cultivos microbianos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica de microbiología o ciencia de fermentación (ver, por ejemplo, Bailey et al., Bióchemical Engineering Fundamentáis, second edition, McGraw Hill, New York, 1986) . Hay que prestar atención al medio de cultivo, pH, temperatura, y requisitos apropiados para las condiciones aeróbicas, microaeróbicas, o anaeróbicas, dependiendo de los requisitos específicos de la célula huésped, la fermentación, y el proceso.

Los métodos de producción de compuestos HACD proporcionados en la presente se pueden realizar en un medio de cultivo adecuado (por ejemplo, con o sin suplementación de pantotenato) en un eorjttenédor adecuado, incluyendo pero no limitado a una placa dé ultivo celular, un matraz, o un termentador. Además, los métodos i se pueden realizar en cualquier escala de fermentación conocida en la técnica para soportar la producción industrial ! de productos microbianos. Cualquier termentador adecuado puede ser utilizado incluyendo un termentador de tanque agitado, un termentador de transporte aéreo, un termentador de byrkjuja, o cualquier combinación de los mismos. En modalidades particulares que utilizan Saccharomyces cerevisiae c mo la célula huésped, las cepas pueden crecer en un termentador como se describe en detalle por Kosaric, et al, en Üllmánn's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Sixth Edition, Volume 12, pages 398-473, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co . KDaA, einheim, Alemania. ]¦ ', , .

En algunas modalidades, el medio de cultivo para uso en los métodos de producción de compuestos HACfí domo se describe en la presente incluye cualquier medio de cultivo en el cual un microorganismo genéticamente modificado capaz de producir un compuesto HACD puede subsistir, eá décir, soportar y mantener el crecimiento y viabilidad, con poca o nada suplementación de pantotenato. En algunas modalidades, el medio de cultivo, cuando se suplementa con pantotenato, también promueve la trayectoria biosintética necesaria para producir el compuesto HACD deseado. ': ! : 1 En algunas modalidades, el medio de culti o1 <s¡ un medio acuoso que comprende fuentes de carbono, nitirógenó y fosfato asimilables,. Tal medio también puede incluir 'sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados. En algunas modalidades, la fuente de carbono y cada uno;* de ilos nutrientes esenciales de la célula, diferente;: de |los compuestos de pantotenato, se añaden de manera incremental o continua a los medios de fermentación, y cada ¡nutriente requerido se mantiene a esencialmente el nivel \ mínimo necesario para la asimilación eficiente por las célalas en crecimiento, por ejemplo, de acuerdo con una Hcuj:va de crecimiento celular predeterminada con base en la función metabólica o respiratoria de las células las cuales convierten la fuente de carbono a una biomasa.

Las condiciones adecuadas y los medios ;adecuádos para el cultivo de microorganismos son bien conocidos en la técnica. En algunas modalidades, el medio adecuado se suplementa con uno o más agentes adicionales, tal como, por ejemplo, un inductor (por ejemplo, cuando una; o más secuencias de nucleótidos que codifican un producto génico están bajo el control de un promotor inducible) , un represor (por ejemplo, cuando una o más secuencias de nucleótidos que codifican un producto génico están bajo el control de un promotor reprimible) , o un agente de selección (por ejemplo, un antibiótico para seleccionar los microorganismos que ;i comprenden las modificaciones genéticas) . ! En algunas modalidades, la fuente de carbono, es: un monosacárido (azúcar simple) , un disacárido, un polisacárido, una fuente de carbono no fermentable, o una o más combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de monosacáridos adecuados incluyen glucosa, galactosa, mañosa, fructosa, ribosa, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de disacáridos adecuados incluyen sacarosa, lactosa, maltosa, trehalosa, celobiosa, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de polisacáridos adecuados incluyen almidón, glucógeno, celulosa, quitina, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes de fuentes de carbono no fermentables adecuados incluyen acetato y glicerol.

La concentración de una fuente de carbono, tal como glucosa, en el medio de cultivo debe promover el crecimiento celular, pero no ser tan alta como para reprifni'r el crecimiento del microorganismo utilizado. Típicaménté, ' los cultivos se ejecutan con una fuente de carbono, taj. cbmo glucosa, que se añade a los niveles para lograr el' nivel deseado de crecimiento y biomasa, pero a ! niveles indetectables (con límites de detección que son aproximadamente <0.1 g/1) . En otras modalidades^ ! la concentración de una fuente de carbono, tal como glucosa,1 en el medio de cultivo es mayor de aproximadamente! 1 g/1, preferiblemente mayor de aproximadamente 2 g/L>| 'y más preferiblemente mayor de aproximadamente 5 g/L. Ademas, la concentración de una fuente de carbono, tal como glijic0sa,> en el medio de cultivo es típicamente menor de aproximadamente 100 g/1, preferiblemente menor de aproximadamente 550 ¡g/L, y más preferiblemente menor de aproximadamente 20 Cj/L. Debe tenerse en cuenta que las referencias a concentraciones de componente de cultivo pueden referirse a concentraciones de componente iniciales y/o en curso. En algunos casos,, püede ser deseable permitir que el medio de cultivo pliegue a agotarse de una fuente de carbono durante el cultivo f , Las fuentes de nitrógeno asimilable que se pueden utilizar en un medio de cultivo adecuado incluyen, p.erp no se limitan a, fuentes de nitrógeno simples, fuentes de nitrógeno orgánicas y fuentes de nitrógeno complejas. Tales ?µe??ß? de nitrógeno incluyen amoniaco anhidro, sales de amonio y sustancias de origen animal, vegetal y/o microb.iapq. Las fuentes de nitrógeno adecuadas incluyen, pero no se1 imitan a, hidrolizados de proteínas, hidrolizados de ijiomása microbiana, peptona, extracto de levadura, sulfato de amonio, urea y aminoácidos. Típicamente, la concentración' de las fuentes de nitrógeno, en el medio de cultivo es mayor de aproximadamente 0.1 g/L, preferiblemente máyot de aproximadamente 0.25 g/L, y más preferiblemente 'mayor ' de aproximadamente 1.0 g/L. Más allá de ciertas concentraciones, sin embargo, la adición de una fuente de nitrógeno aí medio de cultivo no es ventajosa para el crecimiento' dé' los microorganismos. Como resultado, la concentración! áe 'las fuentes de nitrógeno, en el medio de cultivo es ,menor¡ de aproximadamente 20 g/1, preferiblemente menor de aproximadamente 10 g/L y más preferiblemente meiior de aproximadamente 5 g/L. Además, en algunos casos puede ser deseable permitir que el medio de cultivo llegue a acotarse de las fuentes de nitrógeno durante el cultivo. ,1 : ; El medio de cultivo eficaz puede contener otros compuestos tales como sales inorgánicas, vitaminas, ( razas metálicas o promotores de crecimiento. Tales otros compuestos también pueden estar presentes en las fuentes de c&rbono, nitrógeno o mineral en el medio eficaz o pueden ser específicamente añadidos al medio.

El medio de cultivo también puede contener una fuente de fosfato adecuada. Tales fuentes de fosfato, incluyen fuentes de fosfato tanto inorgánicas como orgánicas . Las fuentes de fosfato preferidas incluyen, pero no 1 se limitan a, sales de fosfato tales como fosfatos de! sodio y potasio mono o dibásicos, fosfato de amonio y mezcl s dé los mismos. Típicamente, la concentración de fosfato en: el medio de cultivo es mayor de aproximadamente G 0 i g/l, preferiblemente mayor de aproximadamente 2.0 g/L ¡y más preferiblemente mayor de aproximadamente 5.0 g/L. Más llá de ciertas concentraciones, sin embargo, la adición dé fosfato al medio de cultivo no es ventajosa para el crecimi0nto; de los microorganismos. En consecuencia, la concentración de fosfato en el medio de cultivo es típicamente meíior ¡ de aproximadamente 20 g/l, preferiblemente menor ; de aproximadamente 15 g/L y más preferiblemente menor , de aproximadamente 10 g/L. ;; Un medio de cultivo adecuado puede incluir también una fuente de magnesio, preferiblemente en la forma ;de una sal fisiológicamente aceptable, tal como heptahidrato de sulfato de magnesio, aunque se pueden utilizar otras fuentes de magnesio en concentraciones que contribuyen cantidades similares de magnesio. Típicamente, la concentración de magnesio en el medio de cultivo es mayor de aproximadamente 0.5 g/l, preferiblemente mayor de aproximadamente 1.0. g/l, y más preferiblemente mayor de aproximadamente 2.0 g/L. Más allá de ciertas concentraciones, sin embargo, la adición de magnesio al medio de cultivo no es ventajosa para ; el crecimiento de los microorganismos. En consecuencia, ' la concentración de magnesio en el medio de cultivo 1 es típicamente menor de aproximadamente 10 g/1, preferiblemente menor de aproximadamente 5 g/1, y más preferiblemente menor de aproximadamente 3 g/L. Además, en algunos casos puede ser deseable permitir que el medio de cultivo llegue a agotarse de una fuente de magnesio durante el cultivo. :¡ En algunas modalidades, el medio de cultivo taínbién puede incluir un agente quelante biológicamente aceptable, tal como el dihidrato de citrato de trisodio. En tal: c^só,¡ la concentración de un agente quelante en el medio dé cultivq es mayor de aproximadamente 0.2 g/1, preferiblemente -mayor, de aproximadamente 0.5 g/1, y más preferiblemente ,mayor ¡ de aproximadamente 1 g/L. Más allá de ciertas concentraciones, sin embargo, la adición de un agente quelante al^m^dio; de cultivo no es ventajosa para el crecimiento;; de; los. microorganismos. En consecuencia, la concentración de un agente quelante en el medio de cultivo es típicamente menor de aproximadamente 10 g/1, preferiblemente menor de aproximadamente 5 g/1, y más preferiblemente menor de aproximadamente 2 g/L.

? I El medio de cultivo también puede incluir inicialmente un ácido o base biológicamente aceptable para mantener el pH deseado del medio de cultivo. Lós ácidos ! i ; biológicamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y mezclas de los mismos. Las bases biológicamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, hidróxido de amonio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio y mezclas de los mismos^ En algunas modalidades, la base utilizada es hidróxido de amonio. " i El medio de cultivo también puede incluir una fuente de calcio biológicamente aceptable, incluyendo, pero no limitado a, cloruro de calcio. Típicamente, la concentración de la füuejnte de calcio, tal como dihidrato de cloruro de calcio, en el medio de cultivo está dentro del intervalo de aproximadamente 5 mg/L a aproximadamente 2000 mg/L, preferiblemente dentro del intervalo de aproximadamente 20 mg/L a aproximadamente 1000 mg/L, y más preferiblemente en el intervalo ! de aproximadamente 50 mg/L a aproximadamente 500 mg/L. ¦ El medio de cultivo también puede incluir cloruro de sodio. Típicamente, la concentración de cloruro ' de! ¿odio en el medio de cultivo está dentro del intervalo de 1 aproximadamente 0.1 g/1 a aproximadamente 5 g/1, preferiblemente dentro del intervalo de aproximadamente 1 g/L a aproximadamenté 4 g/1, y más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 2 g/1 a aproximadamente 4 g/L. Én algunas modalidades, el medio de cultivo también puede incluir trazas metálicas. Tales trazas metálicas se pueden añadir al medio de cultivo como una solución madre i que, por conveniencia, puede prepararse separadamente del resto del medio de cultivo. Típicamente, la cantidad de tal solución de trazas metálicas añadida al medio de cultivo es mayor de aproximadamente 1 ml/1, preferiblemente mayor de aproximadamente 5 ml/L, y más preferiblemente mayor de aproximadamente 10 ml/L. Más allá de ciertas concentraciones, sin embargo, la adición de trazas metálicas al medio de cultivo no es ventajosa para el crecimiento '¡ de los microorganismos. En consecuencia, la cantidad de tal" splución de trazas metálicas añadida al medio de cultivo es típicamente menor de aproximadamente 100' ' tnl/1, preferiblemente menor de aproximadamente 50 ml/L, ' y 'más preferiblemente menor de aproximadamente 30 ml/L? Sfe debe señalar que, además de añadir trazas metálicas én ¡una solución madre, los componentes individuales se puede ! añadir separadamente, cada uno dentro de los intervalos correspondientes independientemente a las cantidades !dé los componentes dictadas por los intervalos anteriores de la solución de trazas metálicas. , Además de pantotenato o B5 , que puede estar ausente o presente del medio de cultivo dependiendo de la! etapa de fermentación, los medios de cultivo pueden incluir otras vitaminas, tales como biotina, calcio, pantotenato, inositol, piridoxina-HCl , y tiamina-HCl . Tales vitaminas, pueden añadirse al medio de cultivo como una solución madre¡ que, por conveniencia, puede prepararse separadamente del resto del medio de cultivo. Más allá de ciertas concentraciones, ¡sin embargo, la adición de vitaminas al medio de cultivo; no : es ventajosa para el crecimiento de los microorganismos;; ¡ Los métodos de fermentación descritos, en la presente se pueden realizar en modos de cultivo convencionales, que incluyen, pero no se limitan por lotes, de alimentación por lotes, recirculación de < células , continuo o semi -continuo . En algunas modalidacle$ , ; la fermentación se lleva a cabo en el modo de alimentación por lotes. En tal caso, algunos de los componentes del medio se '' i : agotan durante el cultivo, incluyendo pantotenato durante la etapa de producción de la fermentación. En Algunas modalidades, el cultivo puede ser suplementad<> ' ícon concentraciones relativamente altas de tales componentes desde el principio, por ejemplo, de la etapa de producción, de modo que el crecimiento y/o producción de compuesto HACD se soporta por un período de tiempo antes de que se requieran adiciones. Los intervalos preferidos de estos compófterites se mantienen durante todo el cultivo haciendo adiciones ¡ ?µ3??? los niveles se agotan por el cultivo. Los niveles de componentes en el medio de cultivo se pueden monitore&r, por ejemplo, muestreando el medio de cultivo periódicamente y sometiéndolo a ensayo para concentraciones. Alternativamente , una vez que se desarrolla un procedimiento dé'< Cultivo estándar, las adiciones se pueden realizar a intervalos sincronizados correspondientes a los niveles conocidos en momentos particulares durante todo el cultivo. Cotno se reconocerá por los expertos en la técnica, la velocidad de consumo de nutrientes aumenta durante el cultivo cuando la densidad celular del medio aumenta. Además, para evitar la introducción de microorganismos extraños en el medio de cultivo, la adición se realiza utilizando métodos de adición asépticos, como son conocidos en la técnica. Además, se puede añadir una pequeña cantidad de agente antiespumante durante el cultivo.

La temperatura del medio de cultivo puede ser cualquier temperatura adecuada para el crecimiento de las células genéticamente modificadas y/o producción de compuestos HACD. Por ejemplo, antes de la inoculación del medio de cultivo con un inoculo, el medio de cultivo puede ser llevado y mantenerse a una temperatura en el intervalo desde aproximadamente 20 °C a aproximadamenté 45°C, preferiblemente a una temperatura en el intefvdlo ' de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C, ' más preferiblemente en el intervalo de aproximadamente '2ÚÓC a aproximadamente 32°C. · El pH del medio de cultivo puede ser controlado por la adición de ácido o base al medio de cultivo. Eri tales casos, cuando se utiliza amoniaco para controlar ¡el pH, también sirve convenientemente como una fuente de nitrógeno en el medio de cultivo. Preferiblemente, el pH se mantiene desde aproximadamente 3.0 a aproximadamente 8.0 más preferiblemente desde aproximadamente 3.5 a aproximadamente 7.0, y muy preferiblemente desde aproximadamente A .0 a aproximadamente 6.5. , t El medio de cultivo también puede ser mantenido para tener un contenido de oxígeno disuelto durante > el curso del cultivo para mantener el crecimiento celular! y para mantener el metabolismo celular para la producción de compuestos HACD. La concentración de oxígeno del medio de cultivo se puede monitorear utilizando métodos conocidos/ tal como mediante el uso de un electrodo de oxígeno. El oxígeno puede ser añadido al medio de cultivo utilizando rtiétodos conocidos en la técnica, a través de la agitación y aireación del medio por agitación, sacudimiento o i rociando. Preferiblemente, la concentración de oxígeno en el ¡m^d o de cultivo está en el intervalo desde aproximadamente 20% a aproximadamente 100% del valor de saturación de oxígénj) el medio con base de la solubilidad del oxígeno en el ,| medió de cultivo a presión atmosférica y a una temperatura ¦ en el intervalo desde aproximadamente 20°C a aproximadameíté 40°C. Las caídas periódicas de la concentración de oxígeno por debajo de este intervalo pueden ocurrir durante culti o, sin embargo, sin afectar negativamente el cultivo. , ll i Aunque la aireación del medio se ha descrito en la presente con relación al uso de aire, se pueden utilizar otras fuentes de oxígeno. Particularmente útil es el uso de un gas aireador que contiene una fracción en volumen de oxígeno mayor que la fracción en volumen de oxígeno eh ^1 aire ambiental. Además, tales gases de aireación pueden incluir, otros gases, que no afectan negativamente al cultivo. , i En algunas modalidades, la concentración ide 1 la fuente de carbono, tal como la concentración de glu&odaj del medio de cultivo se monitorea durante el cultivo.1 La concentración de glucosa del medio de cultivo pue<¡ie ser monitoreada utilizando técnicas conocidas, tal comó, por ejemplo, el uso de la prueba de enzima glucosa dxidasá o cromatografía líquida de alta presión, que puede ser utilizada para monitorear la concentración de glucosa en el sobrenadante, por ejemplo, un componente libre de células del medio de cultivo. Como se estableció previamente, la concentración de la fuente de carbono debe mantenerse por debajo del nivel al cual ocurre la inhibición del crecimiento celular. Aunque tal concentración puede variar de organismo a organismo, para la glucosa como una fuente de carbono, la inhibición del crecimiento celular ocurre a concentra Iciones de glucosa mayores de aproximadamente 60 g/L, y , se, puede determinar fácilmente por ensayo. En consecuencia, cuando se utiliza glucosa como una fuente de carbono, la gluj:o$a se alimenta preferentemente al termentador y se mantiefte por debajo de los límites de detección. Alternativamente, la concentración de glucosa en el medio de cultivo se mantiene en el intervalo desde aproximadamente 1 g/1 a aproximadamente 100 g/1, más preferiblemente en el intervalp desde aproximadamente 2 g/1 a aproximadamente 50 g/L, y aíin más preferiblemente en el intervalo desde aproximadamenté 5 g/1 a aproximadamente 20 g/L. Aunque la concentración de ía fuente de carbono se puede mantener dentro de los niveles deseados ' i i por la adición de, por ejemplo, una solución de <luqosa sustancialmente pura, es aceptable, y puede ser preferida, para mantener la concentración de fuente de carbono del medio de cultivo mediante la adición de alícuotas del medio1 de cultivo original. El uso de alícuotas del medio dé cultivo ¦I I original puede ser deseable debido a que las concentraciones i de otros nutrientes en el medio (por ejemplo, las füeñtes de nitrógeno y fosfato) se pueden mantener simultáneamente. Igualmente, las concentraciones de trazas metálicas sel pueden mantener en el medio de cultivo por la adición de alícuotas de la solución de trazas metálicas.

Recuperación de Compuestos HACD Una vez que el HACD se produce por Xa célula I I huésped, se puede recuperar o aislar para uso ¡posterior utilizando cualquiera de los métodos de separación y purificación adecuados conocidos en la técnica. E algunas K I i ! modalidades, una fase orgánica que comprende el HACD se separa de la fermentación por centrifugación. En otras modalidades, una fase orgánica que comprende el Compuesto HACD se separa de la fermentación espontáneamente. En otras modalidades, una fase orgánica que comprende el compuesto derivado HACD se separa de la fermentación añadiendo , un desemulsionante y/o un agente de nucleación en la re cdión1 de fermentación. Los ejemplos ilustrativos de desemulsionantes i i : incluyen floculantes y coagulantes. Los ejemplos ilustrativos de agentes de nucleación incluyen gotitas del compu^stjo , HACD mismo y disolventes orgánicos tales como dodecano, miristiato de isopropilo, y oleato de metilo. t' I · El compuesto HACD producido en estas células puede estar presente en el sobrenadante de cultivo y/o asoCi$dó con las células huéspedes. En modalidades donde el compuesto HACD se asocia con la célula huésped, la recuperación de ía HACD I! I puede comprender un método de permeabilización o lisis de ,las células. Alternativamente o simultáneamente, el HACD: én el medio de cultivo puede recuperarse utilizando un proceso de recuperación, incluyendo, pero no limitado a, cromatografía, extracción, extracción con solvente, separación de metnbrana, electrodiálisis , osmosis inversa, destilación, derivatización química y cristalización.

En algunas modalidades, el compuesto HACD se separa de otros productos que pueden estar presentes en; ¾a. fase orgánica. En algunas modalidades, la separación $e ¡ logra utilizando adsorción, destilación, extracción gas-líquido (separaicón) , extracción líquido-líquido (ext acción con solvente) , ultrafiltración, y técnicas cromatógráficas estándares.

En algunas modalidades, el compuesto HACD recuperado es puro, por ejemplo, al menos aproximadamente 40% puro, al menos aproximadamente 50% puro, al menos aproximadamente 60% puro, al menos aproximadamente "†0% puro, al menos aproximadamente 80% puro, al menos aproximadamente 90% puro, al menos aproximadamente 95% puro, ^l ! menos aproximadamente 98% puro, o más de 98% puro, donde ^púró"1 en el contexto de un compuesto HACD se refiere a un corpuesto HACD que está libre de otros compuestos HACD, contaminantes, etc .

Microorganismos Genéticamente Modificados En la presente se proporcionan microorganismos genéticamente modificados (por ejemplo, una: célula Saccharomyces cerevisiae genéticamente modificada). que producen compuesto derivado de acetil-CoA hét^rólogo (HACD) . Los microorganismos genéticamente modificados producen mayores cantidades de uno o más compuestos biosintetizados a partir de acetil-CoA en comparación con un microorganismo parental que carece de las modificaciones genéticas descritas en la presente.

Los métodos para genéticamente modificar microbios utilizando vectores de expresión o constructos de integración cromosómica, por ejemplo, para efectuar la producción aumentada de uno o más compuestos HACD en una célula , huésped, son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sherman, F., et al., Methods Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1978); Guthrie, C, et al. (Eds.) Guide To Yeast Genetics and Molecular Biology Mol. 194, ' Academic Press, San Diego (1991); Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning—A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Sprincj H ribor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; y Ausubel et al., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Inters<£ieríce , NY. ; las descripciones de las cuales se incorporan en- la presente como referencia. Además, la inhibició de la expresión génica, por ejemplo, la cual resulta en 1 la producción aumentada de uno o. más compuestos HACD en la 'célula, puede llevarse a cabo mediante supresión, mutación, y/o reordeftamiento de genes. También puede llevarse a cabo con el uso de AR ariti^entdo, ARsi, ARmi, ribozimas, ADN de cadena triple, y transcripción y/o inhibidores de traducción. Además, los transposones pueden ser empleados para interrumpir la expresión génica, por ejemplo, insertándolos entre el promotor y lá región codificante, o entre dos genes adyacentes para Infrctivar uno o ambos genes .

En algunas modalidades, la producción aumentada de compuesto HACD en la célula se efectúa mediante eí uso ! de vectores de expresión para expresar una proteína particular, por ejemplo, una proteína implicada en una trayectoria biosintética como se describió anteriormente. Generalmente, los vectores de expresión son moléculas de polinucléótidos recombinantes que comprenden señales de replicación' y secuencias de control de expresión, por ejemplo, promotores y terminadores , enlazadas operativamente a una secuencia 1 de nucleótidos que codifica un polipéptido. Los vectores de expresión útiles para la expresión de secuencias < de nucleótidos que codifican polipéptido incluyen l| vectores virales (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus i adeno-asociados) , vectores plasmídicos, y cósmidos. Los ejemplos ilustrativos de vectores de expresión adecuados para ¡uso, en células de levadura incluyen, pero no se limitan a !<DEI}J/ARS y 2µ plásmidos . Los ejemplos ilustrativos de pjroijnotores adecuados para uso en células de levadura incluyen,, ¾>ero: no se limitan al promotor del gen TEFl de K. lactis, el promotor del gen PGK1 de Saccharomyces cerevisiae, el promotor del gen TDH3 dé Saccharomyces cerevisiae, promotores represibl^s,, por ejemplo, el promotor del gen CTR3 de Saccharomyces cerevisiae, y promotores inducibles, por ejemplo, promotores inducibles de galactosa de Saccharomyces cerevisiae (por ejemplo, promotores de los genes GALl, GAL7 , y GALIO).

Los vectores de expresión y construpt<í>s de integración cromosómica pueden ser introducidos : en : las células microbianas por cualquier método conocido para un experto en la técnica sin limitación. Ver, por /ejemplo, Hinnen et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 75:1292-3 (1978); Cregg et al., Mol. Cell . Biol . 5:3376-3385 (1985); Patente; de Estados Unidos de América No. 5,272,065; Goeddel, et al., eds, 1990, Methods in Enzymology, vol . 185, Academic ¡Press, i Inc., CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression—A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook et al., 19,89, Molecular Cloning—A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; y Ausubel et al., eds., Current Edition, Current Protocole in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and iley Interscience , NY. Las técnicas ejemplares incluyen, pero no se limitan ( a, esferoplastación, electroporación, transformación PEG 1000, y transformación mediada por acetato cloruro de litio. ¡ Células Huéspedes Las células útiles en los métodos y composiciones proporcionados en la presente incluyen cualquier célula capaz de naturalmente o recombinantemente producir un compuesto HACD, por ejemplo, un isoprenoide, un policétido, un ácido graso, y similares. En algunas modalidades, la célula es una célula procariota. En algunas modalidades, la célula es una célula bacteriana. En algunas modalidades, la célulá és' una célula de Escherichia coli. En algunas modalidades, la célula es una célula eucariota. En algunas modalidades, la célula es una célula de mamífero. En algunas modalidades, la célula es una célula de ovario de hámster Chino (CHO) , una célula COS-7, una célula de fibroblasto de ratón, una célxila de carcinoma embrionario de ratón, o una célula > maÜre embrionaria de ratón. En algunas modalidades, lá célula : es una célula de insecto. En algunas modalidades, la célula es una célula S2 , una célula de Schneider, una célula 1 S1Í2 , una célula 5B1-4, una célula Tn5 , o una célula - Sf9. En algunas modalidades, la célula es una célula de organismo : ucari¡ota unicelular. ¡; ¡ En algunas modalidades, la célula es una célula bacteriana micelial. En algunas modalidades, la ' célula bacteriana micelial es de la clase actinomicetos :, En modalidades particulares, la célula bacteriana micelial;¡ e^ de los géneros Streptomyces, por ejemplo, .Streptomyces ambofaciens, Streptomyces avermitilis, Streptomyces azureus, Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces , curacoi, Streptomyces erythraeus, Streptomyces fradiae, Streptomycesítga¡Li¡Laeus, Streptomyces glaucescens, Streptomyces hygroscopic s, Streptomyces lividans, Streptomyces parvulus, Streptomyces peucetius, S reptomyces ri osus, Streptomyces roseofulvus, Streptomyces thermütoleráns, Streptomyces violaceoruber .

En otra modalidad, la célula es una célula fúngica. En una modalidad más particular, la célula una célula de levadura. Las levaduras útiles en los métodos y composiciones proporcionados en la presente ^incluyen levaduras que han sido depositadas con depositarios , de microorganismos (por ejemplo, IFO, ATCC, etc.) y pertenecen a los géneros Aciculoconidium, Ambrosiozyma, Arthroascus, Arxiozyma, Ashbya, Babjevia, Bensingtonia, Botryóascus, Botryozyma, Brettanomyces, Bullera, Bulleromyces, , (andida, 1 Citerovnyces, Clavispora, Cryptococcus, Cystofilobasidium, Debaryomyces, Dekkara, Dipodascopsis, Dipodascus, Eeniella, Endomyc0psella, Eremascus, Eremothecium, Erythrobasidium, Fellomyces, Filob&sidium, Galactomyces, Geotrichu , Guilliermondella, Hanseniaspora, Hansenula, Hasegawaea, Holtermannia, Hormoascus, Hyphopichia, Issatchenkia, Kloeckera, Kloeckeraspora, Kluyveromyces, Kondoa, Kuraishia, Kurtzmanomyces, Leucosporidium, Lipomyces, Lodderomyces, Mal&ssezia, Metschnikowia,_ Mrakia, Myxozyma, Nadsonia, Nakazawaea, Nematospora, Ogataea, Oosporidium, Pachysolen, Phachytichospora, Phaffia, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccháromycodes, Saccharomycopsis, Saitoella, Sakaguchia, Saturnospora, Schizoblastosporion, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, 1 i Sporidiobolus, Sporobolomyces Sporopachydermia, Stephanoascus, Sterigmatomyces, Sterigmatosporidium, Symbiotaphrina, Sympodiomyces, Sympodiomycopsis, Torul&spora, Trichosporiella, Trichosporon, Trigonopsis, Tsuchiyaea, Udeniomyces, Naltomyces, Nickerhamia, Wickerhamiella, Williopsis, Yamadazyma, Yarrowía, Zygoascus, Zygosaccharomyces, Zygowilliopsis, y Zygozyma, entre otros.

En modalidades particulares, las levaduras útiles en los métodos y composiciones proporcionados en la presente incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia jas^toris, Schizosaccharomyces pombe, Dekkera bruxéllensis, Kluyveromyces lactis (anteriormente llamada Saccharomyces lactis) , Kluveromyces marxianus, Arxula adeniniyorans, o Hansenula polymorpha (ahora conocida como Pichia angusta) . En algunas modalidades, el microbio es una; c^pa del género Candida, tales como Candida lipolytica, ¦ (andida guilliermondii , Candida krusei, Candida pseudotropicalis, o Candida utilis. ' ! En una modalidad particular, la célula &s una célula de Saccharomyces cerevisiae. En algunas modalidades, la cepa de célula de Saccharomyces cerevisiae se selecciona del grupo que consiste de levadura de panadero, CBS 79$9, CBS 7960, CBS 7961, CBS 7962, CBS 7963, CBS 7964, IZ-Í904, TA, BG-1, CR-1, SA-1, M-26, Y-904, PE-2, PE-5, VR-1, BR 1, BR-2, ME-2, VR-2, MA-3, MA-4, CAT-1, CB-1, NR-1, BT-1, y AJj-1. En algunas modalidades, la cepa de Saccharomyces cerevisiae se selecciona del grupo que consiste de PE-2, CAT-1, VR;-1^ BG-1, CR-1, y SA-1. En una modalidad particular, la cepa de Saccharomyces cerevisiae es PE-2. En otra modalidad particular, la cepa de Saccharomyces cerevisiae es GAT-1. En otra modalidad particular, la cepa de Saccharomyces cerevisiae es BG-l. 1 ¦ ! En algunas modalidades, la célula es un ;célüla microbiana haploide . En otras modalidades, la célula es una célula microbiana diploide. En algunas modalidades, la célula es heterocigota . En otras modalidades, la célula 1 es homocigota diferente de su alelo de tipo de apareamiento !(es decir, si la celda debe esporular, las cuatro' (¿éluílas microbianas haploides resultantes serían genéticamente idénticas excepto por su alelo de tipo de apareamiento, ¡ el cual en dos de las células haploides sería :!t¾ ó > de apareamiento a y en las otras dos células haploides sería tipo de apareamiento alfa) . ; En algunas modalidades, la célula es una célula ¡que es adecuada para la fermentación industrial, por .; ejemplo, fermentación de bioetanol . En modalidades particulares!,; la I célula está condicionada para subsistir bajo alta concentración de solvente, alta temperatura, uso expandida de sustrato, limitación de nutrientes, estrés osmótico debida, acidez, contaminación bacteriana y sulfito, o combinaciones de los mismos, que son condiciones de estrés reconocidas del ambiente de fermentación industrial.

Las células productoras de compuesto HACD ejemplares, por ejemplo, células que producen recombinantemente isoprenoides, policétidos, y ácidos grasos, y los métodos para la generación de tales células, se proporcionan a continuación.

Producción de Isoprenoides En algunas modalidades, el compuesto HACÍD 1 es un isoprenoide. Los isoprenoides son derivados de IPP, que en la levadura se biosintetiza por las enzimas de la trayeótdria de MEV (Figura 6) . El IPP generado vía la trayectoria de MEV se puede convertir a su isómero, DMAPP, condensar, y modificar a través de la acción de varias enzimas adicionales para 1 formar compuestos isoprenoides HACD simples y más complejos (Figura 7) . '; En algunas modalidades, el microorganismo genéticamente modificado descrito en la presente comprende una secuencia de nucleótidos heterologa que codifica una enzima seleccionada del grupo que consiste de enzimas de1 la trayectoria de MEV, IPP isomerasas, poliprenil sintasas:, y enzimas que pueden modificar un poliprenilo para fotfmar un hemiterpeno, un monoterpeno, un sesquiterpeno , un diterpeno, un triterpeno, un tetraterpeno, un politerpeno., un compuesto esteroide, un carotenoide, o un compu sto, HACD modificado. ¡ ; En algunas modalidades, la célula que: produce isoprenoide comprende una secuencia de nucleótidos heterologa que codifica una enzima que puede condensar dos moléculas de acetil-coenzima A para formar acetoacetil-CoA, por ejemplo, una acetil-CoA tiolasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que codifican tal enzima incluyen, pero no se limitan a: (NC_000913 REGIÓN: 2324131.2325315; Escherichia coli) , (D49362; P racoccus denitrificans) , y (L20428; Saccharomyces cerevisiae) . i En algunas modalidades, la célula que' produce isoprenoide comprende una secuencia de nucleótidos hetérologa que codifica una enzima que puede condensar acetoaqetil-CoA con otra molécula de acetil-CoA para formar 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) , por ejemplo, una , ¾MG-CoA sintasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias \ de nucleótidos que codifican tal enzima incluyen, pero! no 1 se limitan a: (NC_001.145. complemento 19061*20536; 1 I Saccharomyces cerevisiae) , (X96617; Saccharomyces cerevisiae) , (X83882; Arabidopsis thaliana) , (AB037907; Kitasatospora griseola) , (BT007302, Homo sapiens) y (NC_002758, Marca de locus SAV2546, ID de gen 1;.122.571; Staphylococcus aureus) . ' 1 ' ' En algunas modalidades, la célula que" produce isoprenoide comprende una secuencia de nucleótidos hetérologa que codifica una enzima que puede convertir HMG-CoA en ? I mevalonato, por ejemplo, una HMG-CoA reductasa. Los¡ ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que codifican tal enzima incluyen, pero no se limitan a: (NM_206548; Drósophila melanogaster) , (NC_002758, Marca de locus SAV2545, ID de gen 1122570; Staphylococcus aureus) , (NM_204485; Gallus gallus) , (AB015627; Streptomyces sp . KO 3988) , (AF542543; Nidotiana attenuata) , (AB037907; Kitasatospora griseola) , (AX128213, que proporciona la secuencia que codifica un HMGR truncado; Saccharomyces cerevisiae) , y (NC_001145: complemento (115734.118898; Saccharomyces cerevisiae) .

En algunas modalidades, la célula que;i produce isoprenoide comprende una secuencia de nucleótidos hétéróloga ; i que codifica una enzima que puede convertir mevalonato en mevalonato 5-fosfato, por ejemplo, una mevalonato ciiiasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos 'que codifican tal enzima incluyen, pero no se limitan a: (L77688; Arabidopsis thaliana) , y (X55875; Saccharomyces cerevisiae) .

I En algunas modalidades, la célula que produce isoprenoide comprende una secuencia de nucleótidos hétéróloga que codifica una enzima que puede convertir mevalonato 5-fosfato en mevalonato 5-pirofosfato, por ejemplo, una fosfomevalonato cinasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que codifican tal enzima incluyen, pero no se limitan a: (AF429385; Hevea brasiliensis) , (NM_006556; Ho o sapiens) , y (NC_001145. complemento 712315.713670; Saccharomyces cerevisiae) .

En algunas modalidades, la célula que produce isoprenoide comprende una secuencia de nucleotidos h^t^rólpga que codifica una enzima que puede convertir 5-meva,lonáto pirofosfato en IPP, por ejemplo, un mevalonato pirofosfato descarboxilasa . Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleotidos que codifican tal enzima incluyen, pero no se limitan a: (X97557; Saccharomyces cerevisiae) , (AF290095; Enterococcus faecium) , y (U49260; Ho o sapiens) .

En algunas modalidades, la célula que;! produce isoprenoide comprende una secuencia de nucleotidos heteróloga que codifica una enzima que puede convertir IPP generado vía la trayectoria de MEV en DMAPP, por ejemplo, '¡ uña :IPP isomerasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias 1 de nucleotidos que codifican tal enzima incluyen, pero no se limitan a: (NC_000913, 3031087.3031635; Escherichia coli) , y (AF082326; Jíaema ococcus pluvialis) . > En algunas modalidades, la célula que: produce isoprenoide adicionalmente comprende una secuencia de nucleotidos heteróloga que codifica una poliprenil sintasa que puede condensar moléculas de IPP y/o DMAPP para > formar compuestos de poliprenilo que contienen más de ! cinco carbonos . : En algunas modalidades, la célula que ¿produce isoprenoide comprende una secuencia de nucleotidos heteróloga que codifica una enzima que puede condensar una molécula de IPP con una molécula de DMAPP para formar una molécula de geranil pirofosfato ("GPP"), por ejemplo, üna GPP sintasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias 'de nucleótidos que codifican tal enzima incluyen, pero no se limitan a: (AF513111; Abies granáis), (AF5131Í2;1 Ábies granáis), (AF513113; Abies granáis), (AY534686; Aníirrhinum majus) , (AY534687; Antirrhinum majus) , (Y17376; Arabidopsis thaliana) , (AE016877, Locus AP11092, Bacillus cereus,< ATCC 14579), (AJ243739; Citrus sinensis) , (??534745· Clarkia breweri) , (AY953508; Ips pini) , (DQ286930; Lycopérsücon esculentum) , (AF182828; Mentha x piperita) , (AF182827 ; Mentha x piperita) , (MPI249453 Mentha x piperita) , (PZE43Í6,97, Locus CAD24425 Paracoccus zeaxanthinifaciens), (ÁY^664,98; Picrorhiza kurrooa) , (AY351862; Vitis vinifera) , y (AF2038,81, Locus AAF12843; Zymomonas mobilis) . ,> . , En algunas modalidades, la célula que; produce isoprenoide comprende una secuencia de nucleótidos hét^róloga que codifica una enzima que puede condensar dos molecijilas de IPP con una molécula de DMAPP, o añadir una molécula, dé ÜPP a una molécula de GPP, para formar una molécula de., farnesil pirofosfato ("FPP"), por ejemplo, una FPP sintasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que codifican tal enzima incluyen, pero no se limitan a: (ATU80605; Arabidopsis thaliana), (ATHFPS2R; Arabidopsis thaliana), (AAU36376; Artemisia annua) , (AF461050; Bos taurus) , (D00694; Escherichia coli K-12), (AE009951, , Locus AAL95523 Fusobacterium nucleatum subsp. Nucleat\im ( ATCC 25586), (GFFPPSGEN; Gibberella fujikuroi) , (CPOOOOOS, ¡ Locus AAW60034 Gluconobacter oxydans 621H) , (AF019892; Helianthus annuus) , (HU FAPS ; Homo sapiens) , ( LPFPSQCR; Kluyve omyces lactis) , (LAU15777; Lupinus alb s) , (LAU20771; Lupinus albus) , (AF309508; Mus musculus) , (NCFPPSGEN; Neurospora crassa) , (PAFPS1; Parthenium argentatum), (PAFPS2; Párthenium argentatum) , (RATFAPS ; Rattus norvegicus) , ., (^SCFjPP Saccharomyces cerevisiae) , (d89104; Schizosaccharomypes I pombe) , (CP000003, Locus AAT87386 Streptococcus pyogenes) , i í (CP000017, Locus AAZ51849; Streptococcus pyogenes) , (NC_008022, Locus YP_598856; Streptococcus pyogenes MGAS10270), (NC_008023, Locus YP 600845; Streptococcus pyogenes MGAS2096), (NC_008024, Locus YP_602832; Streptococcus pyogenes MGAS10750) , (MZEFPS; Zea mays) , j (AE000657, Locus AAC06913; Aquifex aeolicus VF5), (Nto_20¿836; Arabidopsis thaliana) , (D84432, Locus BAA12575; B cillus subtilis) , (U12678, Locus AAC28894; Bradyrhizobium aponicum USDA 110) , (BACFDPS; Geobacillus stearothermophilus) , (NC_002940, Locus NP_873754; Haemophilus ducreyi 35Q00HP) , (L42023, Locus AAC23087; Haemophilus influenzae R<i ' ? 20) , (J05262, Homo sapiens), (YP_395294; Lactobacillu$ sakei . Subsp. sakei 23K) , (NC_005823, Locus YP_000273; Le'ptospira interrogans serovar Copenhageni str. Fiocruz ', LÍ.-130) , (AB003187; Micrococcus luteus) , (NC_002946, ! Locus YP_208768; Neisseria gonorrhoeae FA 1090), (U0009Ó:, I Locus AAB91752; Rhizobium sp. NGR234), (J05091; Saecharomyces cerevisiae) , (CP000031, Locus AAV93568; Silicibacter pomeroyi DSS-3), (AE008481, Locus AAK99890;. Streptococcus pneumoniae R6), y (NC_004556, Locus NP 779706,· ylella f stidiosa Temeculal) .

En algunas modalidades, la célula que ¡ produce isoprenoide adicionalmente comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una enzima qüe 1 puede combinar IPP y DMAPP o IPP y FPP para formar geranileferanil pirofosfato ( "GGPP" ) . Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que codifican tal enzima incluyen, pero no se limitan a: (ATHGERPYRS; Arabidopsis thaliana) , (BT005328; Arabidopsis thaliana) , (N _119845; Arabidopsis thaliana), (NZ_AAJM01000380 , Locus ZP_00743052 ; ; Bácillus thuringiensis serovar israelensis, ATCC 35646 ,¡sql563), (CRGGPPS; Catharanthus roseus) , (NZ_AABF02000074-¡ ; tocus ZP_00144509; Fusobacterium nucleatum. subsp. vincenti , , ATCC 49256), (GFGGPPSGN; Gibberella fujikuroi), (AY371321 ;, G¿nkgo biloba) , (AB055496; Hevea brasiliensis) , (AB017971 ; , Homo sapiens) , (MCI276129; Mucor circinelloides f. lusitanicus) , (AB016044; Mus musculus) , (AABX01000298 , Locus NCU01427; Neurospora crassa) , (NCU20940; Neurospora crassa) , (NZ_AAKL01000008 , Locus ZP .00943566; Ralstonia solanacearum i: ! UW551) , (AB118238; Rattus norvegicus) , (SCÜ31632; Saccharomyces cerevisiae) , (AB016095; Synechococcus elongates) , (SAGGPS; Sinapis alba) , (SSOGDS; Sülfolobus acidocaldarius) , (NC_007759, Locus YP_461832; Syntirophus aciditrophicus SB) , (NC_006840, Locus YP_204095; Vibrio fischeri ES114) , (N _112315; Arabidopsis thaliana) , <ERWCRTE; Pantoea agglomerans) , (D90087, Locus BAA14124; Bantbea ananatis) , (X52291, Locus CAA36538; Rhodobacter capsulatus) , (AF195122, Locus AAF24294; Rhodobacter sphaeroidés) i y (NC_04350, Locus NP_721015; Streptococcus mutans UA159H En algunas modalidades, el microórganilsmo genéticamente modificado descrito en la pifesente adicionalmente comprende una secuencia de nucl^óti^ios heteróloga que codifica una enzima que puede modificar , un poliprenilo para formar un hemiterpeno, un monoterpeíao, un sesquiterpeno, un diterpeno, un triterpeno, un tetraterpeno, un politerpen.o , un compuesto esteroide, un carotenoide,, o un compuesto HACD modificado.

En algunas modalidades, la secuencia de nucleotidos heteróloga codifica una careno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de las secuencias de nucleotidos adecuadas incluyen, pero no se ¡limitan a: (AF461460, REGIÓN 43..1926; Picea abies) y (AF527416, ; REGIÓN: 78..1871; Salvia stenophylla) . [ En algunas modalidades, la secuenciá de nucleotidos heteróloga codifica una geraniol sintasa. Los ; ejemplos ilustrativos de las secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a: (AJ457070 Cinñamomum tenuipilum) , (AY362553; Ocimum basilicum) , (DQ234300; cepa 1864 de Perilla frutescens) , (DQ234299; cepa 1861 dé Perilla citriodora) , (DQ234298; cepa 4935 de Perilla citriodora) , y (DQ088667; Perilla citriodora) . ; : En algunas modalidades, la secuencia de nuál ó idos heteróloga codifica una linalool sintasa. Los ejemplos ilustrativos de una secuencia de nucleótidos \ adecuada incluyen, pero no se limitan a: (AF497485; Arabidopsis thaliana) , (AC002294, Locus AAB71482; Arabidopsis thaliana) , (AY059757; Arabidopsis thaliana), (NM_104793; Arabidopsis ¡i ! thaliana), (AF154124; Artemisia annua) , (AF067603 blarkia breweri) , (AF067602; Clarkia concinna) , (AF067601; larkia !! I i breweri) , (U58314; Clarkia breweri) , (AY840091; Lycop&rsicon esculentum) , (DQ263741; Lavandula angustífolia) , (AY083653; Mentha citrate) , (AY693647; Ocimum basilicum) , . (X _^639l8; Oryza sativa) , (AP004078, Locus BAD07605; Oryza sativa) , (X _463918, Locus XP_463918; Oryza sativa), (AYS17193; Perilla citriodora) , (AF271259; Perilla frutescens), (AY473623; Picea abies) , (DQ195274; Picea sitcheksis) , y (AF444798; Perilla frutescens var. crispa cultivar No. 79) . „ En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica una limoneno sintasa. Los ¦ ejemplos ilustrativos de las secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a: (+) -limoneno ' s entabas (AF514287, REGIÓN: 47.1867; Citrus limón) y (ÁY055214, REGIÓN: 48.1889 ;' Agastache rugosa) y (-)- limoneno "> síntasas (DQ195275, REGIÓN: 1.1905; Picea sitchensis) , (AF006193, REGIÓN: 73.1986; Abies granáis) y (MHC4SLSP, 1 REGIÓN: 29.1828; Mentha spicata) . : En algunas modalidades, la secuencia de nucl ótidos heteróloga codifica una mirceno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de las secuencias de nucleótidos ^d^c adas incluyen, pero no se limitan a: (U87908; Abies grándis) , (AY195609; Antirrhinum majus) , (AY195608; Antirrhinum ipajus) , (NM_127982; Arabidopsis thaliana TPS10) , (N _113485; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN) , (NM_113483; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN) , (AF271259; Perilla frutescens) , (AY473626; Picea abies), (AF369919; Picea abie$) , , y (AJ304839; Quercus -ilex) . ;¡ ¡ En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica una ocimeno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de las secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a: (AY195607; Antirrhinum majus), (AY195609; Antirrhinum majus), (AY195608; Aiiti¡rrhinum majus), (AK221024; Arabidopsis thaliana), Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN) , (NM_113483; Arabidopsis thaliana ATTPS-CIN) , (NM_117775; Arabidopsis , thaliana.

ATTPS03) , (??_00103657 ; Arabidopsis thaliana ATTPS03) , (??_127982; Arabidopsis thaliana TPS10) , (AB110642; Citrus unshiu CitMTSL4) y (AY575970; Lotus corniculatus var. japonicus) .

En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica una a-pineno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de las secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a: (+) -pineno 1 Sintasa (AF543530, REGIÓN: 1.1887; Pinus taeda) , (-) a-pinenO sintasa (AF543527, REGIÓN: 32.1921; Pinus taeda), y (+ )/(-) ¦ CHpineno sintasa (AGU87909, REGIÓN: 6111892; Abies granáis). '¦ I En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica una ß-pineno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de las secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a: (-) ß-pineno síntásas (AF276072, REGIÓN: 1.1749; Artemisia annua) y (AF$14288, Región: 26.1834; Citrus limón). : ? , En algunas modalidades, la secuencia de nucléótidos heteróloga codifica una sabineno sintasa. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuada, incluye, pero no se limita a AF051901, REGIÓN: 26.1798 'de' Salvia officinalis.

En algunas modalidades, la secuencia de nu,cleótidos heteróloga codifica una ?-terpineno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de las secuencias de nucleótidos adecuadas 1 incluyen, pero no se limitan a: (AF514286, REGIÓN: 30.1832 de! Citrus limón) y (AB110640, REGION 1.1803 de Citrus unshiu).

En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica una terpinoleno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de una secuencia de nucleótidos adecuada incluyen, pero no se limitan a: (AY693650 de Oscimum basilicum) y (AY906866, REGION: 10.1887 de Pseudotsuga menziesii) .

En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica una amorfadieno sintasa. Un; ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuaba ¡ es la SEC ID No. 37 de la Publicación de Patente de Estadós Unidos de América No. 2004/0005678.

En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica una a-farneseno sintasa. Los ejemplos ilustrativos de las secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a DQ309034 1 d Pyrus communis cultivar d'Anjou (pera; nombre de gen ; AFS1) y AY182241 de Malus domestica (manzana; gen AFS1) . Pechouus et al., Planta 219 (l) :84-94 (2004) . ; En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica una ß-farneseno sintasa. Los ; ejemplos ilustrativos de las secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a número de acceso de GenBank ???24615 de Mentha x piperita (menta piperita; gen Tspall) , y AY835398 de .Artemisia annua. Picaud et al,. Phytoche istry 66 (9) : 961-957 (2005) , , En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica una farnesol sintasa. Los ejemplos 'i I 1 ilustrativos de las secuencias de nucleótidos adecuadas I incluyen, pero no se limitan a número de acceso de GenBank AF529266 de Zea mays y YDR481C de Saccharomyces cérevisiae (gen Pho8) . Song, L. , Applied Biochemistry and Biotéchnology 128 : 149-158 (2006) .

En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos '? I ' 1 heteróloga codifica una nerolidol sintasa. Ün ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuada '¡ incluye, pero no se limita a AF529266 de Zea mays (maíz; gen tps ) .

En algunas modalidades, la secuencia de nu'cl ótidos heteróloga codifica una patchouliol sintasa. Los ' Ejemplos ilustrativos de las secuencias de nucleótidos adecuadas inclúyn, pero 11 I no se limitan a AY508730 REGIÓN: 1.1659 de Pogostemon cablin.

En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica una ncotkatona sintasa. Los ejemplos ilustrativos de una secuencia de nucleótidos adecuada incluyen, pero no se 1 limitan a AF441124 REGIÓN: 1.1647 de Citrus sinensis y ! AY917195 'i I REGIÓN: 1.1653 de Perilla frutescens .

En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos heteróloga codifica una abietadieno sintasa. Los · ejemplos ilustrativos de las secuencias de nucleótidos adecuadas incluyen, pero no se limitan a: (U50768 Abies gtañdis) y (AY473621; Picea abies) .

En algunas modalidades, el isoprenoide producido por la célula es un isoprenoide de C5. Estos compuestos se derivan de una unidad de isopreno y también sé. llaman hemiterpenos . Un ejemplo ilustrativo de un hemiterpéno 'es isopreno. En otras modalidades, el isoprenoide; és un isoprenoide de Ci0 - Estos compuestos se derivan'1 de dos unidades de isopreno y también se llaman monoterpénos . Los ejemplos ilustrativos de monoterpénos son lintoneno, citranellol, geraniol, mentol, alcohol perilico, Íinalool, tujona, y mirceno. En otras modalidades, el isoprenoide 'es un isoprenoide de Ci5. Estos compuestos se derivan d¡£ tires unidades de isopreno y también se conocen ¡ como sesquiterpenos . Los ejemplos ilustrativos de sesquitqrpehos son periplanona B, gingkolido B, amorfadieno, artemisinina, ácido artemisínico, valenceno, nootkatona, epi-cedr;ol> epi-aristoloqueno, farnesol, gosipol, sanonina, periplanona, forskolina, y patchoulol (que también se conoce como alcohol de pachulí) . En otras modalidades, el isoprenoide es un isoprenoide de C20. Estos compuestos se derivan de cuatro unidades de isopreno y también son llamados diterpenos , Los ejemplos ilustrativos de diterpenos son ; casbeno, eleuterobina , paclitaxel, prostratina, pseudopterosina y i' ! taxadieno. En otros ejemplos, el isoprenoj.d$ es un isoprenoide de C+2o¦ Estos compuestos se derivan de más de cuatro unidades de isopreno e incluyen: triterpenos (compuestos isoprenoides de C30 derivados de 6 unidades de isopreno) , tales como arbrusido E, bruceantina, testosterona , progesterona, cortisona, digitoxina, y eácualeno; tetraterpenos (compuestos isoprenoides de C40 derivados de más de 8 isoprenoides) tales como ß-caroteno y politerpenos (compuestos isoprenoides de C40+ derivados de más de 8 unidades de isopreno) tal como poliisopreno . En algunas modalidades, el isoprenoide se selecciona del grupo que consiste de abietadieno, amorfadieno, careno, a-farnésenq, ß-farneseno, farnesol , geraniol, geranilgeraniol , isopreno, linalool, limoneno, mirceno, nerolidol, ocimeno, patfcrjoulpl , ß-pineno, sabineno, ?-terpineno, terpinoleno y valenceno. Los compuestos isoprenoides también incluyen, pero rio 1 se limitan a, carotenoides (tales como licopeno, OÍ y ß-caroteno, a y ß-criptoxantina, bixina, zeaxantina, astaxaritina , y luteína) , compuestos esteroides, y compuestos que se componen de isoprenoides modificados por otros grupos químicas,j tales como terpeno-alcaloides mezclados, y coenzima Q-10.

Producción de Policétidos En algunas modalidades, el compuesto derivado de acetilo es un policétido. Los policétidos son sintetizados por reacciones secuenciales catalizadas por una coléctíión de actividades enzimáticas llamadas policétido sintasas (PKS) , que son grandes complejos de proteínas de múltiple^ enzimas que contienen un grupo coordinado de sitios activos. La de unidades derivadas de malonil-CoA vía reacciípn'es de condensación de Claisen. Los genes de PKS se órganizan usualmente en un operón en bacterias y en grupos de l!gefces ¡ en ir i ¦ «¦ ¡ eucariotas. Tres tipos de policétido sintasas ! s? han caracterizado: Las policétido sintasas Tipo I son proteínas ,j! . , , I grandes, altamente modulares subdivididas en dos clases: | 1) PKS iterativas, las cuales reutilizan una manera cíclica y 2) PKS modulares, la una secuencia de módulos separados y no repiten dominios . Las II I < ' policétido sintasas Tipo II son agregados dé jircjtéínas monofuncionales , y las policétido sintasas Tipo ! 1:11 no utilizan dominios de proteína portadora de acilo. !¡ ! ! J A diferencia de la biosíntesis de ácidos gíasos, ; en ir i ¡ ; la cual cada etapa de elongación de cadena suc' s-ív^ ; es seguida por una secuencia fija de cetorréducción, ;¡ i ; I deshidratación, y reducción de enoilo, como se de|sc}ribe a ! continuación, los intermediarios de elongación de cádéna individuales de la biosíntesis de policétido se s;om t.erí a todas, algunas o modificación de grupo funcional, lo resultando en un gran número de productos quími^arfieiate i1 i diversos . Los grados de complej idad adicionales surgén de el uso de di ferentes unidades iniciadoras y unidades de i elongación de cadena , así como la generación de nuevos estéreo- isómeros . 1 El orden de síntesis de pol icétido completa como se dirige por una pol icétido sintasa sigue ( en el orde de N-termino a C- termino) : iniciando o cargando los bloques , de construcción de carbono iniciales sobre una ? proteína portadora de ac ilo , los módulos de elongación los cuales i catalizan la extens ión de la cadena de macról ido creciente y los módulos de terminación que catalizan la liberación del; macrólido sintetizado. Los dominios de componentes o funcionalidades de i enzimas separadas activos en esta biosíntesis incluyen acil-transferasas para la carga de unidades de acilo iniciadoras, extendedoras e intermedias; proteínas portadoras de acilo las cuales retienen el macrólido creciente como un éster de tiol ; ß-ceto-acil sintasas las cuáles catalizan la extensión de cadena; ß-ceto reductasas responsables : dé la primera reducción a una funcionalidad alcohol ; deshidratasas las cuales el iminan el agua para producir un jt i< >léster insaturado ; enoil reductasas las cuales catali zan la reducción f inal a la saturación completa ; y tiolesté'rasa's las cuales catal i zan la l iberación de macról ido y ciclación .

En algunas modal idades , el microorganismo genéticamente modi f icado descrito en la presente comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codif ica una enzima que puede condensar al menos una de aeet,il-;CoA! y malonil-CoA con una proteína portadora de acilo, por ejemplo, 'i- 1 ; I una acil-transferasa .

'! ! ' ' En algunas modalidades, el microorganismo ¡I genéticamente modificado descrito en la presente comprende i¡. i ¦ i una secuencia de nucleotidos heteróloga que codifica una enzima que puede condensar un primer reactivo seleccionado del grupo que consiste de acetil-CoA y malonil-CoA ton j un segundo reactivo seleccionado del grupo que cortéidté j de malonil-CoA o metilmalonil-CoA para formar un |¡ p^odubto policétido, por ejemplo, una ß-ceto-acil sintasa. ¡ |¡ j : ( En algunas modalidades, el microorganismo i ¦ i genéticamente modificado descrito en la presente comprende '! I ' una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una ¡r ¡ ! enzima que puede reducir un grupo químico ß-ceto en un compuesto policétido a un grupo ß-hidroxi, por ejemplo, una ß-ceto reductasa. 'I ' : ! En algunas modalidades, el micro'or^añiismo genéticamente modificado descrito en la presente una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifEiia; juna enzima que puede deshidratar un grupo químico alcahoi enj un compuesto policétido para producir un alqueno por ejemplo, una deshidratasa . ¡|. ; í t En algunas modalidades, el microorganismo genéticamente modificado descrito en la presente com ¡pr'einde una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una enzima que puede reducir un enlace doble a-ß en un gompuesto policétido a un alcano saturado, por ejemplo, una enoil-reductasa.

En algunas modalidades, el microorganismo genéticamente modificado descrito en la presente Comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una enzima que puede hidrolizar un compuesto de policétido de una proteína portadora de acilo, por ejemplo, una tioestejrajsa . ¡ En algunas modalidades, la célula que, produce policétido comprende una o más secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican una enzima que comprende una ¡región catalítica de KS. En algunas modalidades, la célula que produce policétido comprende una o más secuencias de !i nucleótidos heterólogas que codifican una enzima que comprende una región catalítica de AT. En :! algunas modalidades, la célula que produce policétido com rende más de una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una enzima que comprende una región catalítica de AT. Eti algunas modalidades, la célula que produce policétido comprende una o más secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican Una enzima que comprende una región catalítica de CLF . En algunas modalidades, la célula que produce policétido comprendé una o más secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican una enzima que comprende una actividad de ACP . En algunas modalidades, la célula que produce policétido comprende más de una secuencia de nucleótidos heterologa que codifica úna enzima que comprende una actividad de ACP. ¡ En una modalidad particular, la célula que, produce policétido comprende un sistema de PKS aromático mínimo, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos heterólogas codifican una enzima que comprende una región catalítica de KS , una enzima que comprende una región catalítica de AT, una enzima que comprende una región catalítica de CLF, y una enzima' que comprende una actividad de ACP, respectivamente*, En, una modalidad particular, la célula que produce policétido comprende un sistema de PKS modular mínimo, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos heterólogas codifican una enzima que comprende una región catalítica de KS, una enizitna que comprende una región catalítica de AT, y una enzima que comprende una actividad de ACP, respectivamente. En aún otra modalidad particular, la célula que produce pplic$tido comprende un sistema de PKS aromático modular para la síntesis de policétido de novo, por ejemplo, las secvjLeijicias de nucleótidos heterólogas codifican una enzima que «omprende una región catalítica de KS, una o más enzimas que comprenden ¦I . una región catalítica de AT, y uno o más enzimas que comprenden una actividad de ACP, respectivamente.

En algunas modalidades, la célula que | produce policétido comprende un sistema de PKS mínimo, por ejetnplo, " i ¦ , un sistema de PKS aromático mínimo o sistema de PK-5 modular mínimo, adicionalmente comprende actividades catalíticas adicionales las cuales pueden contribuir a la producción del producto final policétido. En algunas modalidades, la célula que produce policétido comprende una o más secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican una enzimá. que comprende una región catalítica de ciclasa (CYC) , la cual facilita la ciclización del esqueleto de policétido 'i í naciente. En algunas modalidades, la célula que,; ^ródüce policétido comprende una o más secuencias de nuíl^ótidos heterólogas que codifican una enzima que comprende uifia ' región catalítica de cetorreductasa (KR) . En algunas modalidades, la célula que produce policétido comprende una o más secuencias 'de nucleótidos heterólogas que codifican una enzima que comprende una región catalítica de aromatasa (ARO) .; En algunas modalidades, la célula que produce policétido comprende una o más secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican una enzima que comprende una región catalítica de enoilreductasa (ER) . En algunas modalidades, la célula que produce policétido comprende una o más secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican una enzima que comprende una región catalítica de tioesterasa 1 (??) . En algunas modalidades, la célula que produce policétido adicionalmente comprende una o más secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican una enzima que comprende, una actividad de holo ACP sintasa, la cual efectúa la pantetinilación de la ACP. 1 ¡ En algunas modalidades, la célula que ' produce policétido adicionalmente comprende una o más secuencias de nucleótidos heterólogas que confieren una actividad modificadora de policétido post-síntesis . En ' algunas modalidades, la célula que produce policétido adicionalmente comprende una o más secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican una enzima que comprende una actividad' de glicosilasa, la cual efectúa modificaciones post-síritesis ' de policétidos, por ejemplo, donde se desean policét'id<j>s que tienen actividad antibiótica. En algunas modalidades / ' la célula que produce policétido adicionalmente comprende1 una o más secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican Una enzima que comprende una actividad de hidroxilasa. En algunas modalidades, la célula que produce policétido adicionalmente comprende una o más secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican una enzima que comprende una actividad , de epoxidasa. En algunas modalidades, la célula que; produce policétido adicionalmente comprende una o más secuencias, de nucleótidos heterólogas que codifican una enzima ; que comprende una actividad de metilasa.

? En algunas modalidades, la célula que! produce policétido adicionalmente comprende una o más secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican una enzima biosintética incluyendo, pero no limitado a, al menos una enzima ! de la trayectoria de síntesis de policétidos, y enzimas qü:e pueden modificar un compuesto acetil-CoA para formar un ¡producto policétido tal como un macrólido, un antibiótico, 1 un antifúngico, un compuesto citostático, un compuesto anticolesterolémico, un compuesto antiparasitario, : un compuesto coccidiostático, un promotor del crecimiento ariimal o un insecticida. En algunas modalidades, el compuesto HÁCD es un polieno. En algunas modalidades, el compuesto HACD ¡ es una lactona cíclica. En algunas modalidades, el Compuesto HACD comprende un anillo de lactona de 14, 15, o 16 miembros. En algunas modalidades, el compuesto HACD es i un policétido seleccionado del grupo que consiste; de ; un policétido macrólido, antibiótico, antifúngico, cit©stfáti;co, anticolesterolémico, antiparasitario, un coccidipsttático, promotor de crecimiento animal e insecticida. ¡ ; En algunas modalidades, la célula que produce policétido comprende secuencias de nucleótidos heterologas, por ejemplo, secuencias que codifican enzimas PKS y enzimas de modificación de policétidos, capaces de produci un policétido seleccionado de, pero no limitado a, los siguientes policétidos: avermectina (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos de América No. 5,252,474; Patente de Estados Unidos de América No. 4,703,009; Publicación EP No. 118,367; MacNeil et al., 1993, "Industrial '! i 1 G i : Microorganisms : Basic and Applied Molecular Genetics"; Báltz, Hegeman, & Skatrud, eds . (ASM), p . 245-256, "A Comparison 1 of the Genes Encoding the Polyketide Synthases for Avérm¡ectin, Erythromycin, and Nemadectin" ; MacNeil etl ¡ al., 1992, Gene 115: 119-125; e Ikeda and Omura, 1997, 1 Ché . Res. 97: 2599-2609); Candicidina (FR008) (ver, por 'ejemplo, Hu et al., 1994, Mol. Microbiol . 14: 163-172); Car orniciha , Curamicina (ver, por ejemplo, Bergh et al., Biotechnól Appl Biochem. 1992 February; 15(1) :80-9); Daunorrubicina vqr,' por ejemplo, J Bacteria 1994 October; 176 (20) : 6270-80) ; Epjtilona (ver, por ejemplo, Publicación PCT No. 99/660^8; ; y Publicación PCT No. 00/031247) ; Eritromicina (ver, por ejemplo, Publicación PCT No. 93/13663; Patente déi Estados Unidos de América No. 6,004,787; Patente de Estados Unidos! de América No. 5,824,513; Donadío et al., 1991, Science' 252 : 675-9; y Cortes et al., Nov. 8, 1990, Nature 348:176-8); ; ¡F -506 (ver, . por ejemplo, Motamedi et al., 1998,- ;¡ Eur . J Biochem. 256: 528-534; y Motamedi et al., 1997,,; £ur. J" Biochem. 244: 74-80); FK-520 (ver, por ejemplo, Pupl.caaión PCT No. 00/020601; y Nielsen et al., 1991, Biochem. i 3<¡) : 5789-96); Griseusina (ver, por ejemplo, Yu et al., J Bacterial. 1994 May; 176 ( 9 ) : 2627 - 34 ) ; Lovastatina (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos de América No. 5 , ;744 , 350 ) ; i Frenolicina (ver, por ejemplo, Khosla et al., Bacterio .. 1993 April; 175 ( 8 ) : 2197 - 204 ; y Bibb et al., Gene 1994, jVIay 3; i 142 (1) : 31-9) ; Granaticina (ver, por ejemplo, Shérmán et al., EMBO J. 1989 September; 8 ( 9 ) : 2717 -25 ; y Bechtóld et al., Mol Gen Genet . 1995 Sep. 20; 248 (5) : 610-20) ; Mecíermicina (ver, por ejemplo, Ichinose et al., Microbiology 2003 July; 149(Pt 7) :1633-45); Monensina (ver, por ejemplo, Atfrowsmith et al., Mol Gen Genet. 1992 August; 234 (2) : 254-64) ; Nonactina (ver, por ejemplo, FEM5 Microbiol Lett . 2000 Fet» . 1 ; 183 (1) : 171-5) ; Nanaomicina (ver, por ejemplo, Kitao et al., J" Antibiot (Tokyo) . 1980 July; 33 (7 ) : 711-6 ) ; Nemadectjna (ver, por ejemplo, MacNeil et al., 1993, supra) ; Nidamici,na, (ver, por ejemplo, Publicación PCT No. 98/51695; y Kakavas qt al., 1997, J". Bacteriol. 179: 7515-7522); Oleandomicina (ve , por ejemplo, Swan et al., 1994, Mol. Gen. Genet. 242 : ' 3$8-362 ; Publicación PCT No. 00/026349; Olano et al., 1998, Mol. den. Genet. 259(3): 299-308; y Publicación de Solicitud de Patente PCT No. WO 99/05283) ; Oxitetraciclina (ver, por ejemplo» Kim et al., Gene. 1994 Apr. 8; 141 (1) : 141-2) ; Picromicina (ver, por ejemplo, Publicación PCT No.' 99/61599; Publicación PCT No. 00/00620; Xue et al., 1998, Chemistry & Bioldgy'5''(11) : 661-667; Xue et al., October 1998, Proc . Nati. A<?acl. Sci. USA 95: 12111 12116); Platenólido (ver, por : ejemplo, ¡ I Publicación EP No. 791,656; y Patente de Estados Unidos de América No. 5,945,320); Rapamicina (ver, por [ ejjemplo, Schwecke et al., August 1995, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:7839-7843; y Aparicio et al., 1996, Gene 169: i 9-16); Rifamicina (ver, por ejemplo, Publicación PCT No. O 98/07868; y August et al., Feb . 13, 1998, Chemistry & Biology, 5(2) : 69-79) ; Sorangio (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos de América No. 6,090,601); Sorafen (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos de América No. 5,716,849; Schupp et al., 1995, J. Bacteriology 177: 3673-3679); Espinocina (ver, por ejemplo, Publicación PCT No. 99/46387) ; Espiramicina (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos de América No. 5,098,837); Tetracenomicina (ver, por ejemplo, Summers et al . , J Bacteria 1992 March; 174 (6) : 1810-20 ; y Shen et al., J Bacterial992 June; 174 (11) : 3818-21) ; Tetraciclina (ver, por ejemplo, J Am Chem Soc. 2009 Dec . 9; 131 (48) : 17677-89) ; Tilosina (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos de América No. 5,876,991; Patente de Estados Unidos de América No. 5,672,497; Patente de Estados Unidos, de América No. 5,149,638; Publicación EP No. 791,655; Publicación EP No. 238,323; Kuhstoss et al., 1996, Gene 183:231-6; y Merson-Davies and Cundliffe, 1994, Mol. Microbiol . 13: 349-355); y ácido 6 -metilsalicílico (ver, por ejemplo, Richardson et al., Metab Eng. 1999 April; l(2) :180-7; y Shao et al., Biochem Biophys Res Commun. 2006 Jun. 23; 345 (1) : 133-9) .

Producción de Ácidos Grasos En algunas modalidades, el compuesto HACD es un ácido graso. Los ácidos grasos se sintetizan por una serie de reacciones de condensación descarboxilativa de Claisen de acetil-CoA y malonil-CoA catalizadas por ácido graso sintasas. Similar a las policétido sintasas, las ácido graso sintasas no son una enzima única sino un sistema enzimático compuesto de polipéptido multifuncional de 272 kDa en el cual los sustratos son entregados de un dominio funcional al siguiente. Dos clases principales de ácido graso sintasas se han caracterizado: las ácido graso sintasas Tipo I son, polipéptidos multifuncionales únicos comunes a los mamíferos y hongos (aunque la disposición estructural de las sintasas fúngicas y de mamíferos difieren) y el grupo de CMN de bacterias (corinebacterias , micobacterias , y nocardia) . Las sintasas tipo II, encontradas en arqueobacterias y eubacterias, son una serie de enzimas monofuncionales discretas que participan en la síntesis de ácidos grasos. Los mecanismos de elongación y reducción de ácidos grasos son los mismos . en · las dos clases de sintasas, ya que los dominios de enzima responsables de estos eventos catalíticos son en gran medida homólogos entre las dos clases.

Después de cada ronda de elongación de la cadena de ácido graso en las reacciones de condensación descarboxilativa de Claisen, el grupo ß-ceto se reduce a una cadena de carbono completamente saturada por la acción secuencial de una cetorreductasa, una deshidratasa , y una enol reductasa. La cadena de ácido graso creciente se mueve entre estos sitios activos unidos a una proteína portadora de acilo y se libera finalmente por la acción de una tioesterasa al alcanzar una longitud de cadena de carbono de 16 (ácido palmitídico) .

En algunas modalidades, el microorganismo genéticamente modificado descrito en la presente comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una enzima biosintética incluyendo, pero no limitado a, al menos una enzima de la trayectoria de síntesis de ácido graso, y enzimas que pueden modificar un compuesto acetil-CoA para formar un producto de ácido graso tal como un palmitato, palmitoil CoA, ácido palmitoleico, ácido sapiénico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido a-linolénico, ácido araquidónico, ácido eicosapentenoico, ácido erúcico, y ácido docosahexenoico . En algunas modalidades, el compuesto HACD es un ácido graso seleccionado del grupo que consiste de palmitato, palmitoil CoA, ácido palmitoleico, ácido sapiénico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido a-linolénico, ácido araquidónico, ácido eicosapentenoico, ácido erúcico, y ácido docosahexenoico.

En algunas modalidades, el microorganismo genéticamente modificado descrito en la presente comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una enzima que puede enlazar covalentemente al menos uno de acetil-CoA y malonil-CoA con una proteína portadora de acilo, por ejemplo, una acil-transferasa.

En algunas modalidades, el microorganismo genéticamente modificado descrito en la presente comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una enzima que puede condensar la porción química acetilo y una porción química malonilo, cada una unida a una proteína portadora de acilo (ACP) , para formar acetoacetil-ACP, por ejemplo, una ß-cetoacil-ACP sintasa.

En algunas modalidades, el microorganismo genéticamente modificado descrito en la presente comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una enzima que puede reducir el enlace doble en acetoacetil-ACP con NADPH para formar un grupo hidroxilo en D-3-hidroxibutiril hidroxilasa-ACP, por ejemplo, una ß-cetoacil-ACP reductasa.

En algunas modalidades, el microorganismo genéticamente modificado descrito en la presente comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una enzima que puede deshidratar D-3-hidroxibutiril hidroxilasa-ACP para crear un enlace doble entre los carbonos beta y gamma que forman crotonil-ACP, por ejemplo, un ß-hidroxiacil-ACP deshidrasa.

En algunas modalidades, el microorganismo genéticamente modificado descrito en la presente comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una enzima que puede reducir la crotonil ACP con NADPH para formar butiril-ACP, por ejemplo, una enoil ACP reductasa.

En algunas modalidades, el microorganismo genéticamente modificado descrito en la presente comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una enzima que puede hidrolizar un compuesto acilo de C16 de una proteína portadora de acilo para formar palmitato, por ejemplo, una tioesterasa.

En algunas modalidades, la célula que produce ácido graso comprende una o más secuencias de nucleótidos heterólogas que codifican acetil-CoA sintasa y/o malonil-CoA sintasa, para efectuar la producción aumentada de uno o más ácidos grasos en comparación con una célula parental genéticamente no modificada.

Por ejemplo, para aumentar la producción de acetil- CoA, uno o más de los siguientes genes se pueden expresar en la célula: phd, panKK, aceEF (que codifica el componente deshidrogenasa Elp y el componente dihidrolipoamida aciltransferasa E2p de los complejos de 2 -oxoglutarato deshidrogenasa y piruvato) , fabH, fabD, fabG, acpP y fabF. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que codifican tales enzimas incluyen, pero no se limitan a: pdh (BAB34380, AAC73227, AAC73226), panK (también conocida como coaA, AAC76952), aceEF (AAC73227, AAC73226), fabH (AAC74175) , fabD (AAC74176) , fabG (AAC74177) , acpP (AAC74178), fabF (AAC74179) .

En algunas modalidades, los niveles de ácidos grasos aumentados se pueden efectuar en la célula mediante la atenuación o la inactivación de los genes que codifican proteínas implicadas en la degradación de ácidos grasos. Por ejemplo, los niveles de expresión de fadE, gpsA, idhA, pflb, adhE, pta, poxB, ackA, y/o ackB pueden atenuarse o inactivarse en una célula huésped modificada genéticamente utilizando técnicas conocidas en la técnica. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos que codifican tales proteínas incluyen, pero no se limitan a: fadE (AAC73325) , gspA (AAC76632) , IdhA (AAC74462), pflb (AAC73989), adhE (AAC74323), pta (AAC75357), poxB (AAC73958) , ackA (AAC75356) y ackB (BAB81430) . Las células huéspedes resultantes tendrán niveles de producción de acetil-CoA aumentados cuando crecen en un ambiente apropiado.

En algunas modalidades, la célula que produce ácido graso comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una enzima que puede convertir acetil-CoA en malonil-CoA, por ejemplo, la proteína AccABCD de múltiples subunidades . Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuada que codifica AccABCD incluye, pero no se limita, al número de acceso AAC73296, EC 6.4.1.2.

En algunas modalidades, la célula que produce ácido graso comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga que codifica una lipasa. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas que codifican una lipasa incluyen, pero no se limitan a los números de acceso CAA89087 y CAA98876.

En algunas modalidades, los niveles de ácidos grasos aumentados se pueden efectuar en la célula mediante la inhibición de PlsB, que puede conducir a un aumento en los niveles de acil-ACP de cadena larga, que inhibirá las etapas tempranas en la trayectoria de biosíntesis de ácidos grasos (por ejemplo, accABCD, fabH, y fabl) . El nivel de expresión de PlsB puede ser atenuado o inactivado en una célula huésped modificada genéticamente utilizando técnicas conocidas en la técnica. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuada que codifica PlsB incluye, pero no se limita a, número de acceso AAC77011. En modalidades particulares, la mutación de plsB D31 IE se puede utilizar para aumentar la cantidad de acil-CoA disponible en la célula .

En algunas modalidades, la producción aumentada de ácidos grasos monoinsaturados se puede efectuar en la célula mediante la sobreexpresión de un gen sfa, lo que resultaría en la supresión de fabA. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuada que codifica sfa incluye, pero no se limita a, el número de acceso AA 79592.

En algunas modalidades, los niveles de ácidos grasos aumentados se pueden efectuar en la célula mediante la modulación de la expresión de una enzima la cual controla la longitud de la cadena de un sustrato de ácido graso, por ejemplo, una tioesterasa. En algunas modalidades, la célula que produce ácido graso se ha modificado para sobreexpresar un gen tes o fat. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos de tes adecuadas incluyen, pero no se limitan a los números de acceso: (tesA: AAC73596, de E. Coli, capaz de producir ácidos grasos de Ci8:1) y (tesB: AAC73555 de E . Coli) . Los ejemplos ilustrativos de las secuencias de nucleótidos de fat adecuadas incluyen, pero no se limitan a: (fatB: Q41635 y AAA34215, de U bellularia california, capaz de producir ácidos grasos de Ci2:o) , (fatB2: Q39513 y AAC49269, de Cuphea hookeriana, capaz de producir ácidos grasos de C8:0 - Ci0:0) , (fatB3: AAC49269 y AAC72881, de Cuphea hookeriana, capaz de producir ácidos grasos de C1 :0 - Ci6:o) (fatB: Q39473 y AAC49151, de Cinnamomum camphorum, capaz de producir ácidos grasos de C14:0) , (fatB [M141T] : CAA85388, de Arabidopsis thaliana , capaz de producir ácidos grasos de Ci6:1) , (fatA: NP 189147 y NP 193041, de Arabidopsis thaliana, capaz de producir ácidos grasos de C18:1) , (fatA: CAC39106, de Bradvrhiizobium japonicum, capaz de producir preferentemente ácidos grasos de Ci8:1) , (fatA: AAC72883, de Cuphea hookeriana , capaz de producir ácidos grasos de Ci8:1) , y (fatAl, AAL79361 de Helianthus annus) .

En algunas modalidades, los niveles aumentados de ácidos grasos de C10 se pueden efectuar en la célula mediante la atenuación de la expresión o actividad de tioesterasa de Cíe utilizando técnicas conocidas en la técnica. Los ejemplos ilustrativos de secuencias de nucleótidos adecuadas que codifican tioesterasa de Ci8 incluyen, pero no se limitan a los números de acceso AAC73596 y P0ADA1. En otras modalidades, los niveles aumentados de ácidos grasos de Cío se pueden efectuar en la célula mediante el aumento de la expresión o actividad de tioesterasa de Ci0 utilizando las técnicas conocidas en la técnica. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuada que codifica tioesterasa de C10 incluye, pero no se limita al número de acceso Q39513.

En algunas modalidades, los niveles aumentados de ácidos grasos de C14 se pueden efectuar en la célula mediante la atenuación . de la expresión o actividad de tioesterasas endógenas que producen ácidos grasos no de Ci4, utilizando técnicas conocidas en la técnica. En otras modalidades, los niveles aumentados de ácidos grasos de Ci4 se pueden efectuar en la célula mediante el aumento de la expresión o actividad de tioesterasas que utilizan el sustrato de Ci-ACP, utilizando técnicas conocidas en la técnica. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuada que codifica tal tioesterasa incluye, pero no se limita al número de acceso Q39473.

En algunas modalidades, los niveles aumentados de ácidos grasos de Cx2 se pueden efectuar en la célula mediante la atenuación de la expresión o actividad de tioesterasas endógenas que producen ácidos grasos no de C12l utilizando técnicas conocidas en la técnica. En otras modalidades, los niveles aumentados de ácidos grasos de C12 se pueden efectuar en la célula mediante el aumento de la expresión o actividad de tioesterasas que utilizan el sustrato de C12-ACP, utilizando técnicas conocidas en la técnica. Un ejemplo ilustrativo de una secuencia de nucleótidos adecuada que codifica tal tioesterasa incluye, pero no se limita al número de acceso Q41635.

Métodos de Almacenamiento de Células En algunas modalidades, las células huéspedes genéticamente modificadas capaces de producir un compuesto HACD son más viables y saludables cuando se almacenan en un medio que está bajo o ausente de compuestos de pantotenato. En particular, tales células crecen mejor después de la inoculación en un medio de crecimiento adecuado y producen más compuesto HACD durante la fase de producción cuando se almacenan en un medio libre de compuesto de pantotenato o de baja concentración de pantotenato.

Por lo tanto, en otro aspecto, en la presente se proporciona un método de almacenamiento de una célula huésped genéticamente modificada capaz de producir un compuesto HACD, el método comprende preparar una composición que comprende la célula huésped genéticamente modificada y un medio de almacenamiento que comprende una fuente asimilable de carbono, nitrógeno y fosfato y entre 0 µp?1/1?^? y 10 pmol/litro de un compuesto de pantotenato; y congelar la composición. En una modalidad específica, el medio de almacenamiento contiene compuesto de pantotenato no detectable. En otra modalidad específica, el medio de almacenamiento comprende glicerol en una cantidad que varía entre 1 parte de glicerol : 3 partes de medios de cultivo, hasta 3 partes de glicerol: 1 parte de medios de cultivo. En otra modalidad específica, el medio de almacenamiento se congela a -80°C.

En otro aspecto, en la presente se proporciona un medio de almacenamiento que contiene una fuente asimilable de carbono, nitrógeno y fosfato y entre 0 µ????/??^? y 10 mol/litro de un compuesto de pantotenato. En una modalidad específica, el medio de almacenamiento contiene compuesto de pantotenato no detectable. En otra modalidad específica, el medio de almacenamiento comprende glicerol en una cantidad que varía entre 1 parte de glicerol: 3 partes de medios de cultivo, hasta 3 partes de glicerol: 1 parte de medios de cultivo. En otra modalidad específica, el medio de almacenamiento se congela a -80°C. En otra modalidad específica, el medio de almacenamiento comprende una célula huésped genéticamente modificada capaz de producir un compuesto HACD.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Este ejemplo describe un método ejemplar para la determinación de la densidad celular (ODSOo) de un cultivo celular de levadura.

Una muestra de 8 µ? de un cultivo celular se combinó con 92 µL de Diluyente Tritón OD (20 g/L de Tritón X-114, 200 ml/L de PEG 200, 200 ml/L de etanol al 100%, el resto agua) en una placa clara de 96 cavidades, la solución se agitó a 1000 rpm durante 6 minutos, y la OD6oo se determinó midiendo la absorbancia a 600 nm en un espectrofotómetro 5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) .

Ejemplo 2 Este ejemplo describe un método ejemplar basado en Rojo Nilo útil para determinar el título de farneseno de cultivos celulares de levadura.

Una muestra de 98 µL de un cultivo celular se transfirió en una placa de ensayo de fondo plano, de poliestireno, negra, de 96 cavidades y 2 µL de Rojo Nilo (Invitrogen, Carlsbad, CA) disueltos en 100 µg/mL de DMSO se añadieron a cada cavidad. Los niveles de fluorescencia se midieron inmediatamente en un espectrofotómetro M5 con excitación a 500 nm y emisión a 550 nm.

Ejemplo 3 Este ejemplo describe un método basado en cromatografía de gases (GC, por sus siglas en inglés) ejemplar útil para determinar el título de farneseno de cultivos celulares de levadura.

La muestra se extrajo con metanol-heptano (1:1 v/v) , y la mezcla se centrifugó para eliminar el material celular. Una alícuota del extracto de metanol-heptano se diluyó en n-heptano con 0.001% t-cariohileno (el cual sirvió como un marcador de tiempo de retención para monitorear la inyección con éxito y la elución durante el perfil de horno de GC especificado) y luego se inyectó en una fase estacionaria de metil silicona utilizando una inyección con división pulsada. El farneseno se separó por punto de ebullición mediante GC con detección por ionización de llama (FID, por sus siglas en inglés) .

Ejemplo 4 Este ejemplo ilustra el uso de un compuesto de pantotenato como un interruptor no genético para mejorar la construcción de biomasa en un primer cultivo simiente, seguido por la producción de compuesto HACD mejorada en la etapa de producción del proceso de fermentación. a) Preparación de un Cultivo de Siembra Se preparó un medio de siembra que contiene 2% sacarosa BSM (medio de construcción de biomasa) y 0 mg/L de D-pantotenato de calcio. El pH del medio de siembra se ajustó a pH 7.0 con una solución de NaOH. El medio (250 mi) se esterilizó y se inoculó con un vial de siembra de células huéspedes genéticamente modificadas y se incubó a 34°C durante 24-36 horas en condiciones aeróbicas . b) Proceso de Fermentación Principal Un fermentador agitado con un tamaño de recipiente de 2 litros se llenó con un medio de cultivo celular de producción estéril que contiene 2% sacarosa y 10 mg/L de D-pantotenato de calcio. La fermentación se llevó a cabo a 34 °C durante 6 días bajo condiciones aeróbicas para maximizar la producción del producto HACD .

Ejemplo 5 Este ejemplo demuestra que en cultivos de células de levadura genéticamente modificadas para producir niveles mayores de un metabolito secundario HACD heterologo ejemplar, el rendimiento de biomasa se puede aumentar y la producción del metabolito secundario heterologo se puede reducir mediante la reducción de la cantidad de (R) -pantotenato exógenamente proporcionado.

Las cepas de levadura Y4689 y Y4352 comprenden cada una enzimas heterólogas, incluyendo las siguientes enzimas de la trayectoria de MEV: IPP isomerasa, FPP sintasa, y farneseno sintasa. Estas cepas son capaces de producir un metabolito secundario HACD heterologo ejemplar (farneseno) a rendimientos de 15% y 13%, respectivamente.

Las células de las cepas de levadura Y4689 y Y4352 se obtuvieron de cultivos que crecieron exponencialmente , se lavaron tres veces con agua, y luego se resuspendieron en 2% sacarosa BSM que comprende 0 mg/L de D-pantotenato de calcio. 15 µ?. tomados de cada suspensión celular se añadieron a cultivos de construcción de biomasa que consisten de cavidades de una placa de 96 cavidades que contiene 360 L de 2% sacarosa BMS que comprende ya sea 10 mg/L (100%) , 1 mg/L (10%), 0.2 mg/L (2%), 0.1 mg/L (1%), 0.02 mg/L (0.2%), 0.01 mg/L (0.1%), 0.001 mg/L (0.01%), o 0 mg/L de D-pantotenato. Los cultivos de construcción de biomasa se incubaron durante 48 horas en un agitador ATR a 1,000 rpm, 80% de humedad, y 34°C, en este momento los cultivos han alcanzado su OD60o máxima. Los cultivos de construcción de biomasa luego se diluyeron 1:25 en cultivos de producción que consisten de cavidades de una segunda placa de 96 cavidades que contiene los mismos medios y disposición de placa como la primera placa de 96 cavidades . Los cultivos de producción se incubaron durante 48 horas en un agitador ATR a 1,000 rpm, 80% de humedad, y 34°C, en este tiempo se tomaron muestras de cada cavidad para medir la biomasa final (es decir, la densidad celular final) y el título de farneseno, como se describe en los Ejemplos 1 y 2 anteriores, respectivamente.

Las Figuras. 3A y 3B muestran que ambas cepas fueron severamente restringidas en su capacidad para producir farneseno cuando los niveles de pantotenato se redujeron en los cultivos de construcción y producción de biomasa, y que esta reducción en la producción del HACD ejemplar (farneseno) estuvo acompañada por un aumento en la biomasa celular final. Estos resultados demuestran que el pantotenato se puede limitar u omitir del medio de cultivo para reducir efectivamente la producción de compuesto HACD, y se puede añadir en el medio de cultivo para inducir o mejorar la producción de compuesto HACD.

Ej emplo 6 Este ejemplo ilustra que las cepas de levadura que son capaces de producir cantidades comerciales de un compuesto HACD exhiben el comportamiento inesperado de un mejor crecimiento en la ausencia de un compuesto de pantotenato externamente suministrado. En contraste, las cepas de levadura y levadura tipo silvestre que producen cantidades menores de compuestos HACD exhiben el comportamiento esperado de mejor crecimiento en la presencia del compuesto de pantotenato externamente suministrado que en su ausencia.

Las cepas de levadura Y4720 y Y5038 comprenden cada una enzimas heterólogas, incluyendo las siguientes enzimas de la trayectoria de MEV: IPP isomerasa, FPP sintasa, y farneseno sintasa. La cepa Y4720 es capaz de producir farneseno a rendimientos de 14% mientras que la cepa 5038 es capaz de producir menos de la mitad como mucho de farneseno a 6%. La cepa Y2205 es un control de CEN.PK2 tipo silvestre que no produce algún farneseno.

Los cultivos que crecen exponencialmente de Y4720, Y5038, y Y2205 se diluyeron en PBS estéril a una OD6oo de 1, y 20 µL de cada dilución se transfirieron a un cavidad en la columna 1 de una placa de 96 cavidades que contiene 180 xh de PBS estéril por cavidad. Utilizando una pipeta multicanal, 20 µL de la columna 1 se transfirieron a la columna 2, y así sucesivamente, resultando en 1:10 diluciones seriales a través de la placa. Finalmente, se utilizó una herramienta de clavado de 48 púas esterilizada para estampar los cultivos de la placa de 96 cavidades sobre placas de agar CSM que comprenden ya sea 0.4 mg/L o 0.002 mg/L de D-pantotenato de calcio. Las placas de agar se incubaron a 30°C durante 112 horas, y se monitoreó el crecimiento de colonias.

Como se muestra en la Figura 4, las colonias de Y4720 fueron más pequeñas que las colonias de las otras dos cepas en la presencia de 0.4 mg/L de D-pantotenato de calcio, pero más grandes en la presencia de 0.002 mg/L de D-pantotenato de calcio, lo que sugiere que, en comparación con las cepas Y5038 y Y2205, la cepa Y4720 tuvo una mayor velocidad de crecimiento en agar que comprende la menor concentración de (R) -pantotenato . Se obtuvieron resultados similares utilizando placas de agar que carecieron por completo de D-pantotenato de calcio.

Ejemplo 7 Este ejemplo demuestra que la omisión de ( ) -pantotenato aumenta la velocidad de crecimiento de las células de levadura genéticamente modificadas para producir niveles mayores de un metabolito secundario HACD heterologo y disminuye la velocidad de crecimiento de las células de levadura genéticamente modificadas para producir niveles menores del metabolito secundario heterologo.

Cuatro colonias individuales de un número de cepas de levadura que comprenden enzimas heterólogas, incluyendo las enzimas de la trayectoria de MEV: IPP isomerasa, FPP sintasa, y farneseno sintasa, y capaces de producir un compuesto HACD ejemplar (farneseno) se inocularon en los cultivos de construcción de biomasa que consisten de cavidades de placas de 96 cavidades que contienen 360 yL de 2% sacarosa BSM que comprende ya sea 10 mg/L o 0 mg/L de D-pantotenato . de calcio. Los cultivos de construcción de biomasa crecieron durante 72 horas a 34 °C en un agitador ATR a 1,000 rpm y 80% de humedad, por este punto los cultivos han alcanzado su OD600 máxima. Los cultivos de construcción de biomasa luego se diluyeron 1:25 en cultivos de producción que. consisten de cavidades de un segundo conjunto de placas de 96 cavidades que contienen 360 ih de 4% sacarosa BSM que comprende 10 mg/L de D-pantotenato de calcio. Los cultivos de producción se incubaron durante 48 horas en un agitador ATR a 1,000 rpm, 80% de humedad, y 34°C( en este punto se tomaron muestras de cada cavidad para medir la biomasa final (densidad celular final) y título de farneseno como se describe en los Ejemplos 1 y 3, respectivamente.

Como se muestra en la Figura 5, las cepas que produjeron farneseno a un rendimiento mayor de 12% tuvieron mayor rendimiento de biomasa a menores concentraciones de (R) -pantotenato que a mayores concentraciones de (R) -pantotenato. Lo opuesto fue cierto para las cepas que produjeron farneseno a un rendimiento menor de 12%.

Ejemplo 8 Este ejemplo demuestra el fenómeno de la degeneración de cepa que ocurre cuando el pantotenato está presente en el medio de cultivo, y por consiguiente la producción de compuesto HACD está "encendida" , durante las etapas tanto de construcción como de producción de un proceso de fermentación.

Un vial de 1 mi de suspensión celular congelada de una cepa de levadura que comprende enzimas heterólogas, incluyendo las enzimas de la trayectoria de MEV: IPP isomerasa, FPP sintasa, y farneseno sintasa, y capaz de producir un compuesto HACD ejemplar (farneseno) , se descongeló, se transfirió en un matraz con deflector de 250 mi que contiene 50 mi de BSM 2.0 que contiene 2% sacarosa y 10 mg/L de D-pantotenato de calcio, y creció en un agitador a 34°C, 200 rpm durante 24 horas. El cultivo completo luego se transfirió en un matraz Fernbach de 2.8 L que contiene 850 mi de BSM 2.0 que contiene 2.0% de sacarosa y 10 mg/L de D-pantotenato de calcio, y creció en un agitador a 34°C, 250 rpm durante 24 horas. El cultivo completo luego se transfirió en un termentador de 2 L. La alimentación de nutrientes al termentador fue un medio de jarabe de caña Brasileño no definido que comprende 10 mg/L de D-pantotenato de calcio, suministrado con impulsos iniciales a unos 14 g/L/h de azúcar. La velocidad de alimentación luego se auto-ajustó con base en la demanda de termentador para carbono, como se indica por los aumentos de oxígeno disuelto. La fermentación se ejecutó micro-aeróbicamente a una temperatura constante de 34 °C, un pH constante de 4.5 (controlado mediante adiciones de hidróxido de sodio) , y una velocidad de transferencia de oxígeno inicial de 200 mmol de 02/L/h hasta que el oxígeno disuelto alcanzó 0%, y luego se redujo a 100 mmol de 02/L/h durante el resto de la fermentación. Cada tres días, el volumen del tanque se redujo a aproximadamente 0.9 L para prevenir el desbordamiento. Las trazas metálicas y vitaminas ausentes en la alimentación de jarabe de caña se repusieron en este momento. La cantidad de farneseno producido y el total consumido por las células se monitoreó diariamente y la relación de estos dos valores (es decir, el rendimiento de producto de azúcar) se determinó para cada período de 72 horas y se gráfico como se muestra en la Figura 6. El rendimiento del producto del cultivo se declina desde su pico a los 6 días a <65% de este pico por 21 días.

E em lo 9 Este ejemplo demuestra que la omisión de (R) -pantotenato durante el crecimiento y almacenamiento de las células de levadura genéticamente modificadas para producir un compuesto HACD ejemplar aumenta la producción del metabolito secundario heterólogo por las células de levadura.

La cepa de levadura Y4954 comprende enzimas heterólogas, incluyendo las siguientes enzimas de la trayectoria de MEV: IPP isomerasa, FPP sintasa, y farneseno sintasa. Esta cepa de levadura es capaz de producir farneseno a un rendimiento de 13.6%.

Dos conjuntos de viales de siembra se prepararon mediante la inoculación de la mitad de una colonia única de células Y4954 en un matraz de agitación de 125 mi que contiene 15 mL de 2% sacarosa BSM (medio de vial de siembra) que comprende 10 mg/L de D-pantotenato de calcio (medio de vial de siembra, "+"), y la otra mitad en un matraz de agitación de 125 mi que contiene 15 mi de 2% sacarosa BSM (medio de vial de siembra) que comprende 0 mg/L de D-pantotenato de calcio (medio vial de siembra, "-") . Las células crecieron a 30°C en un agitador a 200 rpm hasta que se alcanzó una OO6QO entre 4 y 9, y hasta que la sacarosa residual fue de alrededor de 6.3 g/L. Dos partes de solución estéril de glicerol al 50% se añadieron a tres partes de caldo celular, la suspensión se dividió en alícuotas en viales de siembra, y los viales de siembra se congelaron lentamente a -80°C a una velocidad de aproximadamente l°C/min.

La construcción de biomasa se llevó a cabo descongelando un vial de siembra en un matraz de agitación de 250 mi que contiene 50 mi de 2% sacarosa BSM (medio de construcción de biomasa) que comprende ya sea 10 mg/L de D-pantotenato de calcio (medio de construcción de biomasa, "+") o 0 mg/L de calcio D-pantotenato (medio de construcción de biomasa "-"), y haciendo crecer el cultivo durante 24 horas a 34 °C y 200 RPM . El cultivo luego se transfirió a un matraz de 1 L que contiene 800 mL del mismo medio, y creció durante unas 48 horas adicionales.

Para la producción del compuesto HACD ejemplar (farneseno) , el cultivo de construcción de siembra se transfirió a un termentador de sobremesa de 2 L que contiene medio de producción que comprende 10 mg/L de D-pantotenato de calcio (medio de producción, "+"), y el cultivo se incubó durante 6 días después de un protocolo de alimentación que maximizó el rendimiento de farneseno.

Como se muestra en la Tabla 1, las células Y4954 produjeron un mayor rendimiento de farneseno cuando el (R) - pantotenato se omitió del medio de vial de siembra. Produjeron un rendimiento aún mayor de farneseno cuando el (R) -pantotenato también se omitió del medio de construcción de biomasa.

La Tabla 1 también muestra que la omisión de (R) -pantotenato en el vial de siembra y medios de construcción de biomasa no compromete irreversiblemente la capacidad de las células huéspedes para producir farneseno cuando se proporciona con (R) -pantotenato durante la fase de producción. De hecho, el uso de un medio de siembra y los medios de construcción de biomasa que tienen (R) -pantotenato reducido o ausente, seguido por cultivo en fase de producción en un medio de producción que contiene (R) -pantotenato resulta en la mejor producción de los compuestos HACD heterólogos .

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en esta especificación se incorporan en la presente por referencia como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera indicada específicamente e individualmente para ser incorporada por referencia. Diversas modificaciones y variaciones de la presente descripción serán evidentes para los expertos en la técnica sin apartarse del alcance y espíritu de la descripción. Aunque la descripción se ha descrito en algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de comprensión, será fácilmente evidente para los expertos ordinarios en la técnica a la luz de las enseñanzas proporcionadas en la presente que se pueden hacer ciertos cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones adjuntas, y que las reivindicaciones no deben ser indebidamente limitadas a tales modalidades específicas. En efecto, diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la descripción, que se entenderán por los expertos en la técnica, se proponen para estar dentro del alcance de las reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método de producción de un compuesto derivado de acetil-CoA heterólogo (HACD) en una célula huésped, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una población de células huéspedes genéticamente modificadas capaces de producir un compuesto HACD en un medio de cultivo que comprende una fuente de carbono y una cantidad limitante de pantotenato, en donde la cantidad limitante de pantotenato limita la producción del compuesto HACD por la célula huésped; seguido por (b) cultivar la población o una subpoblación de la misma en un medio de cultivo que comprende una fuente de carbono y una cantidad no . limitante de pantotenato, en donde la cantidad no limitante de pantotenato es una cantidad mayor que la cantidad limitante de pantotenato, en donde la población o subpoblación de la misma produce una cantidad mayor del compuesto HACD en la presencia de la cantidad no limitante de pantotenato.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad limitante de pantotenato se determina mediante la realización de una titulación de pantotenato en donde las células huéspedes se cultivan en un medio de crecimiento que comprende concentraciones aumentadas de pantotenato, y la producción de compuesto HACD se determina en cada concentración de pantotenato, en donde la titulación de pantotenato comprende cantidades de saturación de pantotenato por lo cual la producción de compuesto HACD está en su máximo; en donde la cantidad limitante de pantotenato es cualquier concentración de pantotenato a la cual la producción de compuesto HACD es menor que en su máximo.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la producción del compuesto HACD durante la etapa (a) es menor de 50, 40, 30, 20 o 10% de la producción máxima de compuesto HACD de la célula huésped genéticamente modificada.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la producción del compuesto HACD durante la etapa (b) es mayor de 50, 60, 70, 80 o 90% de la producción máxima de compuesto HACD de la célula huésped genéticamente modificada.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el cultivo de la etapa (a) es por un período de al menos 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 o más de 96 horas.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el cultivo de la etapa (a) es por un período de tiempo suficiente para que la población alcance una densidad celular (OD60o) de entre 0.01 y 400.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el cultivo de la etapa (b) es por un periodo de 3 a 20 días.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la cantidad limitante de pantotenato está por debajo de 0.2 mg/L.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la cantidad limitante de pantotenato es de 0 mg/L.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la cantidad no limitante de pantotenato está arriba de 0.2 mg/L.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la cantidad no limitante de pantotenato es al menos la concentración mínima de pantotenato a la cual la producción de compuesto HACD está en su máximo .

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la cantidad no limitante de pantotenato es al menos 1 mg/L.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la cantidad no limitante de pantotenato es 10 mg/L.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la etapa (b) comprende añadir pantotenato al medio de cultivo que comprende la cantidad limitante de pantotenato hasta que el medio comprenda una cantidad no limitante de pantotenato.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la etapa (b) comprende transferir la población de la etapa (a) a un nuevo medio de cultivo que comprende una cantidad no limitante de pantotenato .

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque el método resulta en la producción aumentada del compuesto HACD por la población de células huéspedes genéticamente modificadas, en comparación con la producción que resulta de un método que no comprende el cultivo de las células en una cantidad limitante de pantotenato.

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque la producción del compuesto HACD se mide en términos de rendimiento (gramo de HACD producido por gramo de sustrato de carbono) o productividad (gramos de compuesto HACD producido por litro de medio de cultivo por hora) .

18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque adicionalmente comprende recuperar el compuesto HACD.

19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque el pantotenato se selecciona del grupo que consiste de 2 -deshidropantoato, (R) -pantoato, (R) -pantotenato, y cualquier sal o éster de los mismos .

20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque la célula huésped se selecciona del grupo que consiste de una célula fúngica, una célula bacteriana, una célula de planta, y una célula animal .

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque la célula huésped es una célula de levadura.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque el compuesto HACD se selecciona del grupo que consiste de un aminoácido, un ácido graso, un isoprenoide, y un policétido.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque la célula huésped es capaz de producir un isoprenoide y comprende al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima de la trayectoria de isoprenoide seleccionada del grupo que consiste de: n) una enzima que condensa dos moléculas de acetil-coenzima A para formar acetoacetil-CoA; o) una enzima que condensa acetoacetil-CoA con otra molécula de acetil-CoA para formar 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) ; p) una enzima que convierte HMG-CoA en mevalonato ; q) una enzima que convierte mevalonato en mevalonato 5-fosfato; r) una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato en mevalonato 5-pirofosfato; s) una enzima que convierte mevalonato 5-pirofosfato en IPP; t) una enzima que convierte IPP en DMAPP; u) una poliprenil sintasa que puede condensar moléculas de IPP y/o DMAPP para formar compuestos de poliprenilo que contienen más de cinco carbonos; v) una enzima que condensa IPP con DMAPP para formar GPP; ) una enzima que condensa dos- moléculas de IPP con una molécula de DMAPP; x) una enzima que condensa IPP con GPP para formar FPP; y) una enzima que condensa IPP y DMAPP para formar GGPP; y, z) una enzima que condensa IPP y FPP para formar GGPP.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la célula huésped adicionalmente comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima que modifica una poliprenilo, seleccionada del grupo que consiste de una geraniol sintasa, una linalool sintasa, una limoneno sintasa, una mirceno sintasa, una ocimeno sintasa, una a-pineno sintasa, ß-pineno sintasa, una sabineno sintasa, una ?-terpineno sintasa, una terpinoleno sintasa, una amorfadieno sintasa, una a-farneseno sintasa, una ß-farneseno sintasa, una farnesol sintasa, una nerolidol sintasa, una patchouliol sintasa, una nootkatona sintasa, una abietadieno sintasa.

25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque la célula huésped es capaz de producir un policétido y comprende al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima de síntesis de policétido, en donde la enzima de síntesis de policétido se selecciona del grupo que consiste de: g) una enzima que condensa al menos una de acetil-CoA y malonil-CoA con una proteína portadora de acilo; h) una enzima que condensa un primer reactivo seleccionado del grupo que consiste de acetil-CoA y malonil- CoA con un segundo reactivo seleccionado del grupo que consiste de malonil-CoA o metilmalonil-CoA para formar un producto policétido; i) una enzima que reduce un grupo químico ß-ceto en un compuesto policétido a un grupo ß-hidroxi; j) una enzima que deshidrata un grupo químico alcano en un compuesto policétido para producir un alqueno -ß-insaturado; k) una enzima que reduce un enlace doble a-ß en un compuesto policétido a un alcano saturado; y, 1) una enzima que hidroliza un compuesto policétido de una proteína portadora de acilo.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el policétido es un lípido que tiene al menos una de actividad antibiótica, antifúngica, y antitumoral .

27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el policétido se selecciona del grupo que consiste de un macrólido, un antibiótico, un antifúngico, un compuesto citostático, un compuesto anticolesterolémico, un compuesto antiparasitario, un compuesto coccidiostático, un promotor de crecimiento de animales y un insecticida.

28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque la célula huésped es capaz de producir un ácido graso y comprende al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima de síntesis de ácidos grasos, en donde la enzima síntesis de ácidos grasos se selecciona del grupo que consiste de: g) una enzima que enlaza covalentemente al menos una de acetil-CoA y malonil-CoA a una proteína portadora de acilo (ACP) ; h) una enzima que condensa acetil-ACP y malonil-ACP para formar acetoacetil-ACP; i) reducir el enlace doble en acetoacetil-ACP con NADPH para formar un grupo hidroxilo en D-3 -hidroxibutiril hidroxilasa-ACP; j) una enzima que deshidrata D-3-hidroxibutiril hidroxilasa-ACP para crear un enlace doble entre los carbonos beta y gamma que forman crotonil -ACP ; k) una enzima que reduce crotonil ACP con NADPH para, formar butiril-ACP; y, 1) una enzima que hidroliza un compuesto de acilo de C16 de una proteína portadora de acilo para formar palmitato.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el ácido graso se selecciona del grupo que consiste de palmitato, palmitoil CoA, ácido palmitoleico, ácido sapiénico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido a-linolénico, ácido araquidónico, ácido eicosapentenoico, ácido erúcico, y ácido docosahexenoico .

30. Un método de producción de un compuesto derivado de acetil-CoA heterólogo (HACD) en una célula huésped, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una población de células huéspedes genéticamente modificadas capaces de producir un compuesto HACD en un medio de cultivo que comprende una fuente de carbono y que carece de suplementación de pantotenato; seguido por (b) cultivar la población o una subpoblación de la misma en un medio de cultivo que comprende una fuente de carbono y suplementado con al menos 1 mg/L de pantotenato.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el cultivo de la etapa (a) es durante un período de al menos 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 o más de 96 horas.

32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el cultivo de la etapa (a) es durante un período de tiempo suficiente para que la población alcance una densidad celular (??ß??) de entre 0.01 y 400.

33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, caracterizado porque el cultivo de la etapa (b) es durante un periodo de 3 a 20 días.

34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, caracterizado porque la etapa (b) comprende añadir pantotenato al medio de cultivo de la etapa (a) hasta que el medio comprenda al menos 1 mg/L de pantotenato .

35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, caracterizado porque la etapa (b) comprende transferir la población de la etapa (a) a un nuevo medio de cultivo que comprende al menos 1 mg/L de pantotenato .

36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 35, caracterizado porque el método resulta en la producción aumentada del compuesto HACD por la población de células huéspedes genéticamente modificadas, en comparación con la producción que resulta de un método que no comprende el cultivo de las células en una cantidad limitante de pantotenato.

37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 36, caracterizado porque la producción del compuesto HACD se mide en términos de rendimiento (gramo de HACD producido por gramo de sustrato de carbono) o productividad (gramos de compuesto HACD producido por litro de medio de cultivo por hora) .

38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 37, caracterizado porque adicionalmente comprende recuperar el compuesto HACD.

39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 38, caracterizado porque el pantotenato se selecciona del grupo que consiste de 2 -deshidropantoato, (R) -pantoato, (R) -pantotenato, y cualquier sal o éster de los mismos .

40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 39, caracterizado porque la célula huésped se selecciona del grupo que consiste de una célula fúngica, una célula bacteriana, una célula de planta, y una célula animal .

41. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 39, caracterizado porque la célula huésped es una célula de levadura.

42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 41, caracterizado porque el compuesto HACD se selecciona del grupo que consiste de un aminoácido, un ácido graso, un isoprenoide, y un policétido.

43. El método de conformidad, con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 41, caracterizado porque la célula huésped es capaz de producir un isoprenoide y comprende al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima de la trayectoria de isoprenoide seleccionada del grupo que consiste de : aa) una enzima que condensa dos moléculas de acetil-coenzima A para formar acetoacetil -CoA; bb) una enzima que condensa acetoacetil-CoA con otra molécula de acetil-CoA para formar 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) ; ce) una enzima que convierte HMG-CoA en mevalonato; dd) una enzima que convierte mevalonato en mevalonato 5 -fosfato; ee) una enzima que convierte mevalonato 5-fosfato en mevalonato 5-pirofosfato; ff) una enzima que convierte mevalonato 5-pirofosfato en IPP; gg) una enzima que convierte IPP en DMAPP; hh) una poliprenil sintasa que puede condensar moléculas de IPP y/o DMAPP para formar compuestos de poliprenilo que contienen más de cinco carbonos ; ii) una enzima que condensa IPP con DMAPP para formar GPP; . ~. jj) .una enzima que condensa dos moléculas de IPP con una molécula de DMAPP; kk) una enzima que condensa IPP con GPP para formar FPP; 11) una enzima que condensa IPP y DMAPP para formar GGPP; y, mm) una enzima que condensa IPP y FPP para formar GGPP.

44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la célula huésped adicionalmente comprende un ácido nucleico heterologo que codifica una enzima que modifica una poliprenilo, seleccionada del grupo que consiste de una geraniol sintasa, una linalool sintasa, una limoneno sintasa, una mirceno sintasa, una ocimeno sintasa, una a-pineno sintasa, ß-pineno sintasa, una sabineno sintasa, una ?-terpineno sintasa, una terpinoleno sintasa, una amorfadieno sintasa, una a-farneseno sintasa, una ß-farneseno sintasa, una farnesol sintasa, una nerolidol sintasa, una patchouliol sintasa, una nootkatona sintasa, una abietadieno sintasa.

45. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 41, caracterizado porque la célula huésped es capaz de producir un policétido y comprende al menos un ácido nucleico heterologo que codifica una enzima de síntesis de policétido, en donde la enzima de síntesis de policétido se selecciona del grupo que consiste de: m) una enzima que condensa al menos una de acetil-CoA y malonil-CoA con una proteína portadora de acilo; n) una enzima que condensa un primer reactivo seleccionado del grupo que consiste de acetil-CoA y malonil-CoA con un segundo reactivo seleccionado del grupo que consiste de malonil-CoA o metilmalonil-CoA para formar un producto policétido; o) una enzima que reduce un grupo químico ß-ce o en un compuesto policétido a un grupo ß-hidroxi; p) una enzima que deshidrata un grupo químico alcano en un compuesto policétido para producir un alqueno a-ß-insaturado; q) una enzima que reduce un enlace doble a-ß en un compuesto policétido a un alcano saturado; y, r) una enzima que hidroliza un compuesto policétido de una proteína portadora de acilo.

46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el policétido es un lípido que tiene al menos una de actividad antibiótica, antifúngica, y antitumoral .

47. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el policétido se selecciona del grupo que consiste de un macrólido, un antibiótico, un antifúngico, un compuesto citostático, un compuesto anticolesterolémico, un compuesto antiparasitario, un compuesto coccidiostático, un promotor de crecimiento de animales y un insecticida.

48. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 41, caracterizado porque la célula huésped es capaz de producir un ácido graso y comprende al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima de síntesis de ácidos grasos, en donde la enzima síntesis de ácidos grasos se selecciona del grupo que consiste de: m) una enzima que enlaza covalentemente al menos una de acetil-CoA y malonil-CoA a una proteína portadora de acilo (ACP) ; n) una enzima que condensa acetil-ACP y malonil-ACP para formar acetoacetil-ACP; o) reducir el enlace doble en acetoacetil-ACP con NADPH para formar un grupo hidroxilo en D-3 -hidroxibutiril hidroxilasa-ACP; p) una enzima que deshidrata D-3 -hidroxibutiril hidroxilasa-ACP para crear un enlace doble entre los carbonos beta y gamma que forman crotonil-ACP; q) una enzima que reduce crotonil ACP con NADPH para formar butiril-ACP; y, r) una enzima que hidroliza un compuesto de acilo de C16 de una proteína portadora de acilo para formar palmitato .

49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el ácido graso se selecciona del grupo que consiste de palmitato, palmitoil CoA, ácido palmitoleico, ácido sapiénico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido a-linolénico, ácido araquidónico, ácido eicosapentenoico, ácido erúcico, y ácido docosahexenoico .