CN110079468A

CN110079468A - 一种增强产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性的方法

Info

Publication number: CN110079468A
Application number: CN201910384299.8A
Authority: CN
Inventors: 张忠源; 诸葛斌; 王玉芹; 宗红; 陆信曜
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2019-05-09
Publication date: 2019-08-02

Abstract

本发明公开了一种增强产甘油假丝酵母2‑苯乙醇耐受性的方法，属于基因工程技术领域。本发明通过在产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)中过表达了来源于自身的麦角固醇合成途径中的C‑24(28)还原酶基因erg4，获得重组菌株Cgerg4。与空载对照菌株相比，重组菌株在高浓度2‑苯乙醇(3.5g/L)的外界环境下具有较明显的生长优势，其菌体干重提高了103％。且在发酵培养基中，重组菌株的菌体干重及2‑苯乙醇的产量得到增强，分别提高了12％和16％，2‑苯乙醇产量达到3.89g/L。

Description

一种增强产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性的方法

技术领域

本发明涉及一种增强产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

2-苯乙醇(2-PE)是一种具有玫瑰香气的高级醇，是化妆品、食品、香精的重要原料。化学合成的2-苯乙醇因含致癌物质(苯乙烯等)已被禁止在化妆品、食品等领域使用。植物萃取法获得的天然2-苯乙醇，其原材料(玫瑰花等)供应价格昂贵且产量无法满足市场供应。基于发酵法生产天然2-苯乙醇具有广阔的应用前景。然而，2-苯乙醇会对菌株产生高毒性，降低了2-苯乙醇的产量。

为解决这一瓶颈，研究者多采用两种解决方案：1.采用原位萃取技术，降低发酵液中2-苯乙醇浓度进而减弱产物对细胞生理代谢的抑制功能，提高产物的合成速率。然而由于萃取剂的加入，增加了下游产物分离的难度及成本，另外萃取剂难以清除干净严重影响了产品的质量。2.诱变获得高耐受菌株，但此方法效率低，周期长。因此，利用基因工程手段获得耐高浓度2-PE的菌株对于提高2-苯乙醇的产量具有重大意义。

麦角固醇是一种真菌细胞膜的重要组成成分，不仅可以维持细胞膜的完整性，同时参与维持细胞膜的流动性、维持膜蛋白的活性、信号分子的传递等多种生物学活动。另外，麦角固醇在抵御外界环境(低温、氧化、乙醇等)压力也发挥了重要作用(Hu,Z.,He,B.,Ma,L.,Sun,Y.,Niu,Y.,and Zeng,B.(2017).Recent Advances in ErgosterolBiosynthesis and Regulation Mechanisms in Saccharomyces cerevisiae[J].Indianjournal of microbiology57,270-277)。

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018(已在公开号为CN105713933B的专利中公开)是一株具有优良发酵性能的工业菌株，具有高效的2-苯乙醇合成能力，及较完整的基因改造工具，为进一步分子改造菌株提高2-苯乙醇的耐受性及产量提供了有利的基础。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种产甘油假丝酵母工程菌，是以pGAPa为载体，过表达C-24(28)还原酶基因，所述C-24(28)还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述产甘油假丝酵母为产甘油假丝酵母(Candidaglycerinogenes)CCTCC M 93018。

在本发明的一种实施方式中，编码所述C-24(28)还原酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种构建上述产甘油假丝酵母工程菌的方法，包括以下步骤：

(1)以产甘油假丝酵母基因组为模板，PCR扩增erg4基因；

(2)将erg4基因插入到产甘油假丝酵母过表达重组质粒pGAPa的GAP强启动子和AOXI终止子之间，获得过表达整合载体pGAPa-erg4；

(3)将pGAPa-erg4转化至产甘油假丝酵母中。

在本发明的一种实施方式中，所述转化是通过醋酸锂转化法进行的。

在本发明的一种实施方式中，PCR扩增的上游引物erg4 F核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，下游引物erg4 R核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示.

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)以产甘油假丝酵母基因组为模板，利用上下游引物erg4 F(SEQ ID No.2)和erg4 R(SEQ ID No.3)PCR扩增erg4基因；

(2)利用限制性酶切位点将其插入到产甘油假丝酵母过表达重组质粒pGAPa的GAP强启动子和AOXI终止子之间，获得过表达整合载体pGAPa-erg4；

(3)经限制性内切酶Hind III线性化后，通过醋酸锂(LiAC)转化法将其转入产甘油假丝酵母CCTCC M 93018中，线性化的重组质粒pGAPa-erg4通过同源重组整合到产甘油假丝酵母的5.8S序列，经MM平板筛选，获得单菌落，提取单菌落基因组进行PCR验证，获得过表达erg4基因的产甘油假丝酵母重组菌株Cgerg4。

本发明的第三个目的是提供一种增强产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性的方法，是以pGAPa为载体，在产甘油假丝酵母中过表达了C-24(28)还原酶基因，所述C-24(28)还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示

本发明的第四个目的是提供一种发酵上述产甘油假丝酵母工程菌的方法，所述方法是将挑取上述工程菌接入种子培养基中，在28-30℃，200-220rpm条件下，振荡培养12-20h，得到液态种子；将得到的液态种子按1-5％(v/v)的接种量接入发酵培养基中，控制发酵温度为28-30℃，转速为200-220rpm，发酵时间为60-80h。

本发明的第五个目的是提供上述产甘油假丝酵母工程菌在制备食品、化妆品或香精中的应用。

本发明的有益效果：

本发明通过过表达产甘油假丝酵母菌株erg4基因，导致在浓度大于3g/L的2-苯乙醇中，产甘油假丝酵母重组菌株Cgerg4对2-苯乙醇的耐受性有明显提高，菌体干重提高了103％。且过表达菌株的菌体干重及2-苯乙醇产量分别提高了12％和16％，2-苯乙醇产量达到3.89g/L。

附图说明

图1重组质粒pGAPa-erg4构建示意图。

图2产甘油假丝酵母过表达erg4菌株构建示意图。

图3产甘油假丝酵母过表达erg4菌株PCR验证图。

图4梯度稀释点板观察重组菌株2-苯乙醇的耐受性。

图5摇瓶观察重组菌株2-苯乙醇的耐受性。

图6重组菌株摇瓶发酵合成2-苯乙醇。

具体实施方式

(一)培养基

种子培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。

发酵培养基：L-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH₂PO₄ 5g/L，酵母粉4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L。

MM平板培养基：葡萄糖20g/L，无氨基酵母氮源(YNB)6.7g/L。

YPD培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。

(二)发酵液中2-苯乙醇的测定方法，采用高效液相色谱法(HPLC)分析，具体如下：将发酵液进行离心，10,000rpm，离心后再用0.45μm微孔滤膜过滤处理，测量设备采用高效液相色谱仪(Agilent,USA)，色谱柱为C18柱(250mm×4.6mm,10μm；Ailite,中国)，流动相为甲醇:水＝50:50(v/v)，流动相流速0.8mL/min，柱温30℃，检测波长260nm，进样10μL。

(三)载体pGAPa的构建方法：PCR扩增ura5(SEQ ID No.4)基因利用限制性内切酶Sal I和sph I酶切后连接于载体pUC-5.8S rDNA-P_CgGAP(已在公开号为CN 103173483B的专利中公开)，即得到载体pGAPa。

下面通过实施例对本发明进一步详细描述。

实施例1重组质粒pGAPa-erg4的构建

以产甘油假丝酵母基因组为模板，利用上下游引物erg4 F(SEQ ID No.2)和erg4R(SEQ ID No.3)PCR扩增erg4基因。连接T-Vector pMD19 simple(Ts)，送至上海生工测序。测序正确后将erg4与产甘油假丝酵母表达载体pGAPa一步克隆法试剂盒(购于诺唯赞生物科技有限公司，货号：C115-01)连接获得重组质粒pGAPa-erg4(见图1)。

实施例2

挑取一环产甘油假丝酵母菌株接种在液体YPD培养基，30℃过夜培养。取100μL过夜培养液转接到新鲜YPD中，30℃培养4-6小时，使培养液OD₆₀₀达到0.8-1.2，离心收集菌体。重组质粒pGAPa-erg4经Hind III线性化后，用醋酸锂转化法，将其转入产甘油假丝酵母菌株感受态细胞中，涂布在MM平板，30℃培养2-3天获得单菌落。挑取单菌落提取基因组进行PCR验证(见图3)正确后，获得重组菌株Cgerg4(见图2)。

实施例3

分别挑取1环空载对照菌株及重组菌株接入种子培养基中，在30℃，200rpm条件下，振荡培养18h，得到液态种子。测其OD₆₀₀，并用无菌水稀释至OD₆₀₀为1。按照10倍稀释方法分别获得OD₆₀₀为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4的菌液。分别取上述菌液2μL，依次点板在含不同浓度2-苯乙醇(0g/L，3.5g/L)的YPD平板上，30℃培养48h，观察对照菌株及重组菌株在平板上的生长情况。另外，将等量对照菌株及重组菌株的液态种子分别接入到50mL含不同浓度2-苯乙醇(0g/L，3.5g/L)的YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养。在不同时间内取样测其菌体干重变化。结果表明：在高浓度2-苯乙醇(3.5g/L)中，重组菌株Cgerg4的耐受性有明显提高，其菌体干重提高了103％。

实施例4

分别挑取1环空载对照菌株及重组菌株接入种子培养基中，在30℃，200rpm条件下，振荡培养18h，得到液态种子。将得到的液态种子按5％(v/v)的接种量接入含有30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，控制发酵温度为30℃，转速为200rpm，时间为72h，发酵结束。

发酵过程中对菌株的生长情况及2-苯乙醇的产量进行检测。与空载对照菌株相比，发酵结束时，重组菌株的菌体干重提高了12％和16％，产量达到3.89g/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种增强产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性的方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1455

<212> DNA

<213> Candida glycerinogenes

<400> 1

atgacccaga aggatttccc ggttttaaat gaccaaaagt tgcaagaact agtccatgaa 60

gtgagccaat tcggattatc aaatggctta gtaatgtatc cacctgctcc atacaaggac 120

tacgaacccg ttctggcacc tattactata ttcccaacgc cgtttccacg gaaacaattt 180

gaaaaaagtt acgatattca gaaaagctac aataaactat atgctaacgt tgtttctgag 240

aaaaaatggt tggagggtat cattgagaag ttatcaattc atgataaacc ttttactgga 300

aaactatggg attgttacca aaaggctctg gaaaaaggta ttcctcaaga tgtttctctt 360

gctttgacga gatcggacta tatgtatgat gagaccttga acttaataaa acaggtggaa 420

tataacactg tgagtgtttc gtttggtgga ttgagtccaa aggttggcca agcacacact 480

tacttaaaca aaataggtgc ctacactggt gtgccactat cccaatacta tgaagaaaac 540

gagctaccaa taagtgaaag tgataaaaaa ttggcacgag gacttcattc tggggttaaa 600

tattacaatg acaagtactt aaaaggggaa aacaagtcaa ttgttctaat ggttgtccag 660

ccatctgaaa ggaacgcatt tgaccagaga agcatcgaat ataatttact caatgaattc 720

aatgttctca ctaaaagggt ggaattgcca agtgtctcga ggttggttca tatcgatcca 780

aacagtcgta aattgtttta tcaggggtat gaagtatctg tcgtttatta cagatcggca 840

tatggaccag cagaatttga tttaccagaa acatggagat gtagaagcat gctcgaatcc 900

actttagcca tcaagtgtcc ttccctgttg acccaattga gcggctcaaa aaaagtacaa 960

cagctattaa ctaagcagga caatctatca ctattcttaa atgataagga aattgagtcg 1020

ctaggcgatt cattctgtaa gatctatccg ttggatgata gtgaagatgg tagtctagcc 1080

aagaagttag catttgaaag cccggaaaag tttgtgttaa aaccacaaag agagggtggg 1140

ggcaataata tctataagga agaaatacca ttgtttctta aatctatcca agaaaatgaa 1200

tgggaagcat atattttgat ggaactgatt aatcctaaaa tccatgaaaa tctaatatta 1260

agaaacggtg aagtgttgaa cgatggcata gtttcagagt tgggtgtatt cggtagttat 1320

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<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 48

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<210> 4

<211> 1611

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctcgaaaacg gcgacggtat tagacgtccc gattgtaatt gacttagtcc tcttaggttc 60

actatttgcc tcttgtggtt cttatcaaaa ttgttgccgg ttgtggcagc tggagtagtg 120

cttatagtac tgaatgatga tgacgatgac aatctcctct ttggcctgat tgactttggc 180

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aacaggaagg aaaagaaaga ccatggtgaa ggaggttcta ttgtcggatg caatatgaag 1080

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<210> 5

<211> 484

<212> PRT

<213> Candida glycerinogenes

<400> 5

Met Thr Gln Lys Asp Phe Pro Val Leu Asn Asp Gln Lys Leu Gln Glu

1 5 10 15

Leu Val His Glu Val Ser Gln Phe Gly Leu Ser Asn Gly Leu Val Met

20 25 30

Tyr Pro Pro Ala Pro Tyr Lys Asp Tyr Glu Pro Val Leu Ala Pro Ile

35 40 45

Thr Ile Phe Pro Thr Pro Phe Pro Arg Lys Gln Phe Glu Lys Ser Tyr

50 55 60

Asp Ile Gln Lys Ser Tyr Asn Lys Leu Tyr Ala Asn Val Val Ser Glu

65 70 75 80

Lys Lys Trp Leu Glu Gly Ile Ile Glu Lys Leu Ser Ile His Asp Lys

85 90 95

Pro Phe Thr Gly Lys Leu Trp Asp Cys Tyr Gln Lys Ala Leu Glu Lys

100 105 110

Gly Ile Pro Gln Asp Val Ser Leu Ala Leu Thr Arg Ser Asp Tyr Met

115 120 125

Tyr Asp Glu Thr Leu Asn Leu Ile Lys Gln Val Glu Tyr Asn Thr Val

130 135 140

Ser Val Ser Phe Gly Gly Leu Ser Pro Lys Val Gly Gln Ala His Thr

145 150 155 160

Tyr Leu Asn Lys Ile Gly Ala Tyr Thr Gly Val Pro Leu Ser Gln Tyr

165 170 175

Tyr Glu Glu Asn Glu Leu Pro Ile Ser Glu Ser Asp Lys Lys Leu Ala

180 185 190

Arg Gly Leu His Ser Gly Val Lys Tyr Tyr Asn Asp Lys Tyr Leu Lys

195 200 205

Gly Glu Asn Lys Ser Ile Val Leu Met Val Val Gln Pro Ser Glu Arg

210 215 220

Asn Ala Phe Asp Gln Arg Ser Ile Glu Tyr Asn Leu Leu Asn Glu Phe

225 230 235 240

Asn Val Leu Thr Lys Arg Val Glu Leu Pro Ser Val Ser Arg Leu Val

245 250 255

His Ile Asp Pro Asn Ser Arg Lys Leu Phe Tyr Gln Gly Tyr Glu Val

260 265 270

Ser Val Val Tyr Tyr Arg Ser Ala Tyr Gly Pro Ala Glu Phe Asp Leu

275 280 285

Pro Glu Thr Trp Arg Cys Arg Ser Met Leu Glu Ser Thr Leu Ala Ile

290 295 300

Lys Cys Pro Ser Leu Leu Thr Gln Leu Ser Gly Ser Lys Lys Val Gln

305 310 315 320

Gln Leu Leu Thr Lys Gln Asp Asn Leu Ser Leu Phe Leu Asn Asp Lys

325 330 335

Glu Ile Glu Ser Leu Gly Asp Ser Phe Cys Lys Ile Tyr Pro Leu Asp

340 345 350

Asp Ser Glu Asp Gly Ser Leu Ala Lys Lys Leu Ala Phe Glu Ser Pro

355 360 365

Glu Lys Phe Val Leu Lys Pro Gln Arg Glu Gly Gly Gly Asn Asn Ile

370 375 380

Tyr Lys Glu Glu Ile Pro Leu Phe Leu Lys Ser Ile Gln Glu Asn Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ala Tyr Ile Leu Met Glu Leu Ile Asn Pro Lys Ile His Glu

405 410 415

Asn Leu Ile Leu Arg Asn Gly Glu Val Leu Asn Asp Gly Ile Val Ser

420 425 430

Glu Leu Gly Val Phe Gly Ser Tyr Leu Phe Asn Glu Asn Thr Gly Glu

435 440 445

Ile Ile Asp Asn Gln Val Cys Gly His Leu Leu Arg Ser Lys Thr Ser

450 455 460

Ser Ser Asn Glu Gly Gly Val Ala Ala Gly Tyr Gly Cys Val Asp Asn

465 470 475 480

Met Tyr Leu Tyr

Claims

1.一种产甘油假丝酵母工程菌，其特征在于，是以pGAPa为载体，在产甘油假丝酵母中过表达了C-24(28)还原酶基因，所述C-24(28)还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.如权利要求1所述的产甘油假丝酵母工程菌，其特征在于，以产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)CCTCC M 93018为宿主。

3.如权利要求1或2所述的产甘油假丝酵母工程菌，其特征在于，编码所述C-24(28)还原酶基因erg4的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种构建权利要求1-3任一所述的产甘油假丝酵母工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以产甘油假丝酵母基因组为模板，PCR扩增erg4基因；

(3)将pGAPa-erg4转化至产甘油假丝酵母中。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述转化是通过醋酸锂转化法进行的。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR扩增的上游引物erg4 F核苷酸序列如SEQID NO.2所示，下游引物erg4 R核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.一种增强产甘油假丝酵母2-苯乙醇耐受性的方法，其特征在于，是以pGAPa为载体，在产甘油假丝酵母中过表达了C-24(28)还原酶基因，所述C-24(28)还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

8.一种发酵权利要求1-3任一所述的产甘油假丝酵母工程菌的方法，其特征在于，是将权利要求1-3任一所述的产甘油假丝酵母工程菌的液态种子按1-5％(v/v)的接种量接入发酵培养基中，发酵温度为28-30℃，转速为200-220rpm，发酵时间为60-80h。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，挑取产甘油假丝酵母工程菌接入种子培养基中，在28-30℃，200-220rpm条件下，振荡培养12-20h，得到液态种子。

10.权利要求1-3任一所述的产甘油假丝酵母工程菌在制备食品、化妆品或香精中的应用。