CN110951739B - 一种由高温诱导表达的启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种由高温诱导表达的启动子及其应用，属于基因工程技术领域。本发明利用一种启动子片段，该启动子来源于产甘油假丝酵母对温度敏感的一个基因，YWP1。本发明提供的启动子序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的启动子能够特异的驱动外源基因在高温诱导条件下在产甘油假丝酵母中高表达。应用该启动子诱导表达木糖还原酶基因，在42℃培养条件下可使木糖醇的产量达到15.45g/L，比30℃诱导的产量5.07提高了3倍以上，在实际应用中具有显著价值。

Description

一种由高温诱导表达的启动子及其应用

技术领域

本发明涉及一种由高温诱导表达的启动子及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

在外部环境发生变化的时候，维持功能内平衡的能力对所有微生物的生存至关重要。温度是影响微生物生长和生存的重要环境因素之一。大规模的工业发酵常常产生大量的热量，凝结水的消耗增加了发酵成本，发酵过程中的污染和温度波动引起的酵母细胞死亡必然导致巨大的产量损失。

产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes,CCTCC：M93018)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，在中国专利CN1070235C中公开，公告日2001年8月29日，具有耐高温，高产量，高转化率，生产强度大等特点，居世界领先地位。它能在25％葡萄糖或5％NaCl的高渗透压培养基上正常生长，在实验室规模发酵中，甘油产量可达12％，即使在工业化规模中，甘油产量也达10％。同时，产甘油假丝酵母在发酵过程中温度会随着发酵时间的延长逐渐升高。甘油产量依然维持在较高水平。相对于模式菌株酿酒酵母而言，产甘油假丝酵母具有良好的在高温条件下生长的特性。

启动子是基因表达调控的顺式元件，也是基因工程表达载体的一个重要元件。启动子在转录水平上的重要作用，决定了基因的表达水平，可以说启动子活性的高低在很大程度上影响着基因表达最终产物的表达水平。木糖还原酶(XR)是木糖代谢的关键酶，催化木糖还原为木糖醇。来自Neurospora crassa的XR在高温下具有较高的Kcat和NADPH催化效率。本实验由来自Candida glycerinogenes的高温诱导启动子调控来自Neurosporacrassa的木糖还原酶基因的表达，在高温条件下发酵。

发明内容

本发明的目的在于应用适当的高温诱导控制外源基因的选择性表达，并由此提供一种受高温诱导的启动子及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种受高温诱导的启动子，其核苷酸序列为SEQ IDNO.1。

在一种实施方式中，所述高温诱导指在30～45℃诱导。

本发明的第二个目的是提供含有所述启动子的表达载体。

本发明的第三个目的是提供含有所述启动子的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞是产甘油假丝酵母细胞。

在一种实施方式中，所述产甘油假丝酵母以pUGA为载体，表达目的基因。

在一种实施方式中，所述目的基因为木糖还原酶基因。

一种高温诱导生产木糖醇的方法，包括如下步骤：

(1)将SEQ ID NO.1所示的启动子片段和木糖还原酶基因分别连接至载体上，获得重组质粒；

(2)在步骤(1)制备的重组质粒转化至宿主细胞中，获得重组菌；

(3)将重组菌在含甘油和木糖的培养基中培养，并控制培养温度为30～45℃。

在一种实施方式中，所述木糖还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述培养基含有30～50g/L木糖、10～30g/L甘油、10～30g/L蛋白胨、5～15g/L酵母粉。

在一种实施方式中，所述载体为pUGA，其构建方法已公开于题为《Identificationand application of novel low pH-inducible promoters for lactic acidproduction in the tolerant yeast Candida glycerinogenes》的论文中。

本发明还要求保护所述启动子在酵母表达系统、功能基因的筛选、功能基因的鉴定及优化、调控基因表达等方面的应用。

有益效果：本发明提供了一种产甘油假丝酵母启动子，能够调控外源基因在高温诱导下高表达，应用该启动子诱导表达木糖还原酶基因，在42℃培养条件下可使木糖醇的产量达到15.45g/L，比30℃诱导的产量5.07g/L提高了3倍以上，在实际应用中具有显著价值。

附图说明

图1为pUR-PCgYWP-GFP物理图谱。

图2为pUR-PCgYWP-XR物理图谱。

图3为PCgywp1和PCggap在不同温度条件下启动gfp荧光。

图4为C.g-PCgywp1-XR在不同温度条件下的木糖醇产量。

具体实施方式

实施例1：产甘油假丝酵母基因组DNA的提取

将产甘油假丝酵母野生菌WL2002-5(即Candida glycerinogenes,CCTCC：M93018)培养至稳定期，按照参考文献《酵母遗传学技术手册》进行。将提取的DNA用核酸蛋白分析仪进行测定，根据A260/A280的比值判断所提取的DNA的纯度，A260/A280为1.8，浓度为1000ng/ul,同时通过琼脂糖凝胶电泳判断模板质量。

实施例2：高温诱导启动子的获取

根据产甘油假丝酵母转录组数据，酵母壁蛋白基因在高温条件下转录数据最高，对产甘油假丝酵母的酵母壁蛋白基因在不同温度条件下做实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究其在不同温度条件下转录水平情况，结果发现酵母壁蛋白基因随着温度的升高，相对转录倍数增大，将这个基因序列上游约1.6kb碱基序列克隆。

Pywp1通过引物ywp1-F和ywp1-R进行扩增，两端含有BamH1和SacII酶切位点，启动子连接到pMD-19(sample)上进行测序，引物序列如下：

上游引物：CGGATCCGATTTCCTTGAGCCCATC

下游引物：GCCGCGGTATGTATGGTTTGTTTTAGCG

测序获得的启动子PCgywp1序列为：

GATTTCCTTGAGCCCATCAATGTCTATTTGGTCGTTTTCGGTTCGGGTATTTTGACATTTCATTTTTCGCCTATTGTGAACCCCGCCAACGTCAGACGTAGAGTTCGTCAGTTGAGGGACTATGTGAATGTGTCACCAGACTGGCTTTGTTATGCCATGATTGATGATATTACCGATGGATTTGCGCCAATAATCCAGTCCATTGAATATGAAGCCGATTCGATTGAGGATTCTGTATTTTTAAGTACAGACATGGACATCGGTTCTATGCTTTTGAAGATTGGTGAAAGTAGACGGAAAGTCATGACATTGATGAGGTTGTTACAAGGTAAGGCTGATGTTATTAAGATGTTTGCCAAGCGGTGTCAAGATGAAATGGCAAGATTCAATTTAAGCAATCAGAACTTACAAGCACAGCCAAGAGCGGATATTGCCCTATATTTAGGTGATATTCAAGATCATATTATTACCATGTTCCAGTCGTTACTATCCTATGAGAAGATTTTCAGCAGGTCCCATTCCAATTACTTGGCACAACTACAGGTTGAATCCTTTTATAGTAACGTTCAAGTCACCGATATGCTCTCCAAAGTTACCCTTCTGGGTACCATCCTAGTCCCAATGAACTTGATCACAGGGTTATTTGGTATGAATGTTCGGGTGCCTGGACAAGATGGTTCCAACTATGGATGGTTTGGAGGAATAATTGGTGTTATTTTTGTGATTATATTTGTCAGTTTACTAGGAGCAACCCAATACATGAAGTATGTGGAAAAACAGGCTGGTAGAAATGGATTGAGGAGCGGCATAAGCGTCAAGAACTTCAAGTTTGGACGCAAGAAACAGACCAATGGCACACAACGCCAAGACGCTGTTAGTTTACCAACTAGGTTTACGAGGTATGGTGATTGGTAATGTTAGCTGAGAACTAAAAAAAATAACAACAAACAAACAAACAAACAAATTCTAAGGATGCCAATCATTTTCTCGTGTATGTTTCTTTTTTTAAGCTTTGTTTGCGTCTTTTTGTTTACATTTTTGTGTATCTAATTAACGCAGTGTGTACATTGCATGTCGAATACTGGAAATAGAACCGAGTACTACTCTATCCGAGATTCCAATACCAAACCCCGGCGCTCTCTGCAACAACAACGCCAGGAAGCTGAAAGAGGAGGGAGGGGACACAAAGGAGAATTTGCTAATTCCTAAGGGTGAATTGCCGAATGTTGACCTTTCTTGTAGGAGTGACGTGCATCTGTCACCTCTGTTTTGCCAGAGTTGTTAGGTAAGGTGAGGGCCTTTCCCCTTTAAGTTGCTATTTTCAGATAATATTTCTATAAATACGGCTTTAGCTTTAAGCTTTGTGATAGTATAGCCCTCTTTTTTTCCAGAGGTTTCCGTCTTTGTTTACCTTTGGTTATTTACGTGTGGAGTTACCATATTTGTCTCTCCCTCTCTCTTTGTAGCCATGCAGTATTCATCACCACTACTAAGGCTAGCATCGAGAGGTCTATATAAACCAGCATCCCCACCATCTTATAGGCATATGCTCTCGGAGTTTTTTACTTGTTGATTTTCTTTTTATACCATAACAGTCACTCGCTAAAACAAACCATACATA(如SEQ ID NO.1所示)。

实施例3：产甘油假丝酵母酵母壁蛋白基因启动子表达强度验证

高温诱导启动子表达载体的构建：将实施例2通过PCR克隆的产甘油假丝酵母酵母壁蛋白基因启动子采用BamH1和Sac11酶进行双酶切，连接到经过相同酶酶切的重组载体pUR-5.8S rDNA-gfp-URA5(即质粒pUGA，构建方法参见论文《Identification andapplication of novel low pH-inducible promoters for lactic acid production inthe tolerant yeast Candida glycerinogenes》)得到pUR-PCgYWP1-GFP(GFP基因如SEQID NO.2所示)，采用热激法转化至大肠杆菌JM109，获得pUR-PCgYWP1-GFP。

实施例4：重组表达载体的转化与筛选

将构建的重组表达质粒pUR-PCgYWP1-GFP，HindIII单酶切线性化后，采用醋酸锂转化法转化至产甘油假丝酵母URA缺陷菌株中，涂布于选择性培养基。从平板上挑取单菌落，进行菌落PCR验证，然后挑取阳性转化子，转接到YEPD液体培养基中，培养至对数生长期，玻璃珠法提取其基因组，PCR验证，保存菌株。

实施例5：重组酵母培养，高温诱导表达和荧光强度分析

从平板上挑取验证的重组菌，接种于10mL液体YEPD培养基中，培养至对数生长期，转接到50mL YEPD培养基中，分别于30℃和42℃、200r/m培养24h。利用Olympus荧光显微镜进行荧光观察，绿色荧光蛋白是一种极具潜力的标记物，其内源荧光基因在受到紫外光或蓝光激发时可发射清晰可见的绿光且荧光信号稳定，故实验以蓝光为激发光，检测重组菌在不同培养温度条件下的荧光强度。可见野生型对照在30℃和42℃条件下均没有荧光产生，Pgap是产甘油假丝酵母用于过表达基因的强组成型启动子，按照实施例3相同的方法将启动子连接在质粒上，使用Image-Pro Plus软件对荧光图片进行光密度值(IOD值)定量分析。组成型启动子Pgap转化子在30℃条件下荧光强度为8200，在42℃条件下荧光强度为7800，在45℃条件下荧光强度为7980；Pywp1转化子在30℃条件下荧光微弱，只有700，在42℃的时候，荧光强度较强，达到8100，在45℃时的荧光强度为11300，说明Pywp1是高温诱导的强启动子。

实施例6：粗糙脉孢菌cDNA的提取

将粗糙脉孢菌野生菌培养至稳定期，按照参考文献《酵母遗传学技术手册》进行。将提取的cDNA用核酸蛋白分析仪进行测定，根据A260/A280的比值判断所提取的cDNA的纯度，A260/A280为1.92，浓度为1600ng/ul,同时通过琼脂糖凝胶电泳判断模板质量。

实施例7：木糖还原酶基因的获取

以粗糙脉孢菌cDNA为模板，通过引物XR-F和XR-R扩增木糖还原酶基因XR(SEQ IDNO.3所示)，两端含有Sac11和KpnI酶切位点，启动子连接到pMD-19(sample)上进行测序，引物序列如下：

上游引物：GCCGCGGATGGTTCCTGCTATCAAGCTCAA(SEQ ID NO.4所示)

下游引物：GGGTACCCTAACCGAAAATCCAGAGGTTCTC(SEQ ID NO.5所示)

实施例8：高温诱导启动子表达载体的构建

将重组载体pUR-PCgYWP1-GFP用Sac11和KpnI酶切，和克隆得到的XR基因连接，采用热激法转化至大肠杆菌JM109，获得pUR-PCgYWP1-XR。

实施例9：重组表达载体的转化与筛选

将构建的重组表达质粒pUR-PCgYWP1-XR，HindIII单酶切线性化后，采用醋酸锂转化法转化至产甘油假丝酵母URA缺陷菌株中，涂布于选择性培养基。从平板上挑取单菌落，进行菌落PCR验证，然后挑取阳性转化子，转接到YEPD液体培养基中，培养至对数生长期，玻璃珠法提取其基因组，PCR验证，保存菌株。

实施例10：重组酵母培养，高温诱导表达外源基因

从平板上挑取验证的重组菌，接种于10mL液体YEPD培养基中，培养至对数生长期，转接到含有40g/L木糖、20g/L甘油、20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉的50mL培养基中，分别于30℃和42℃，200r/m培养144h。50mL发酵液离心取上清，高效液相色谱仪检测木糖醇产量，甘油消耗，木糖消耗。结果如图4所示，在30℃培养144h的菌株，菌体量为26.61，木糖消耗为10.20g/L，甘油消耗为20g/L,木糖醇产量为5.07g/L；在42℃培养144h的菌株，菌体量为18.32，木糖消耗为21.88g/L，甘油消耗为20g/L,木糖醇产量为15.45g/L。

实施例11：在45℃诱导表达外源基因

将实施例9构建的重组菌在45℃条件下培养，结果显示，培养144h后的菌体量为5.12，木糖消耗为4.20g/L，木糖醇产量为1.97g/L，产量较低的原因可能是菌体生长缓慢，无法有效利用木糖。

对比例1：

按照实施例1～2的方法，还筛选获得高温条件下转录水平上调的基因ADP、ATP载体蛋白AAC(SEQ ID NO.6所示)、3-酮酰基-COA硫醇酶POT1(SEQ ID NO.7所示)、热休克蛋白HSP12(SEQ ID NO.8所示)，经过荧光强度验证，PCgaac、PCgpot1、PCghsp12在30℃下的荧光强度分别为710、2000、390，在42℃下的荧光强度为6040、6000、2950，在45℃下的荧光强度为7140、6900、3550，但是都没有PCgywp1在45℃下的荧光强度强。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种由高温诱导表达的启动子及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1621

<212> DNA

<213> Candida glycerinogenes

<400> 1

gatttccttg agcccatcaa tgtctatttg gtcgttttcg gttcgggtat tttgacattt 60

catttttcgc ctattgtgaa ccccgccaac gtcagacgta gagttcgtca gttgagggac 120

tatgtgaatg tgtcaccaga ctggctttgt tatgccatga ttgatgatat taccgatgga 180

tttgcgccaa taatccagtc cattgaatat gaagccgatt cgattgagga ttctgtattt 240

ttaagtacag acatggacat cggttctatg cttttgaaga ttggtgaaag tagacggaaa 300

gtcatgacat tgatgaggtt gttacaaggt aaggctgatg ttattaagat gtttgccaag 360

cggtgtcaag atgaaatggc aagattcaat ttaagcaatc agaacttaca agcacagcca 420

agagcggata ttgccctata tttaggtgat attcaagatc atattattac catgttccag 480

tcgttactat cctatgagaa gattttcagc aggtcccatt ccaattactt ggcacaacta 540

caggttgaat ccttttatag taacgttcaa gtcaccgata tgctctccaa agttaccctt 600

ctgggtacca tcctagtccc aatgaacttg atcacagggt tatttggtat gaatgttcgg 660

gtgcctggac aagatggttc caactatgga tggtttggag gaataattgg tgttattttt 720

gtgattatat ttgtcagttt actaggagca acccaataca tgaagtatgt ggaaaaacag 780

gctggtagaa atggattgag gagcggcata agcgtcaaga acttcaagtt tggacgcaag 840

aaacagacca atggcacaca acgccaagac gctgttagtt taccaactag gtttacgagg 900

tatggtgatt ggtaatgtta gctgagaact aaaaaaaata acaacaaaca aacaaacaaa 960

caaattctaa ggatgccaat cattttctcg tgtatgtttc tttttttaag ctttgtttgc 1020

gtctttttgt ttacattttt gtgtatctaa ttaacgcagt gtgtacattg catgtcgaat 1080

actggaaata gaaccgagta ctactctatc cgagattcca ataccaaacc ccggcgctct 1140

ctgcaacaac aacgccagga agctgaaaga ggagggaggg gacacaaagg agaatttgct 1200

aattcctaag ggtgaattgc cgaatgttga cctttcttgt aggagtgacg tgcatctgtc 1260

acctctgttt tgccagagtt gttaggtaag gtgagggcct ttccccttta agttgctatt 1320

ttcagataat atttctataa atacggcttt agctttaagc tttgtgatag tatagccctc 1380

tttttttcca gaggtttccg tctttgttta cctttggtta tttacgtgtg gagttaccat 1440

atttgtctct ccctctctct ttgtagccat gcagtattca tcaccactac taaggctagc 1500

atcgagaggt ctatataaac cagcatcccc accatcttat aggcatatgc tctcggagtt 1560

ttttacttgt tgattttctt tttataccat aacagtcact cgctaaaaca aaccatacat 1620

a 1621

<210> 2

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggtagatc tgactagtaa aggagaagaa cttttcactg gagttgtccc aattcttgtt 60

gaattagatg gtgatgttaa tgggcacaaa ttttctgtca gtggagaggg tgaaggtgat 120

gcaacatacg gaaaacttac ccttaaattt atttgcacta ctggaaaact acctgttccg 180

tggccaacac ttgtcactac tttctcttat ggtgttcaat gcttttcaag atacccagat 240

catatgaagc ggcacgactt cttcaagagc gccatgcctg agggatacgt gcaggagagg 300

accatcttct tcaaggacga cgggaactac aagacacgtg ctgaagtcaa gtttgaggga 360

gacaccctcg tcaacaggat cgagcttaag ggaatcgatt tcaaggagga cggaaacatc 420

ctcggccaca agttggaata caactacaac tcccacaacg tatacatcat ggccgacaag 480

caaaagaacg gcatcaaagc caacttcaag acccgccaca acatcgaaga cggcggcgtg 540

caactcgctg atcattatca acaaaatact ccaattggcg atggccctgt ccttttacca 600

gacaaccatt acctgtccac acaatctgcc ctttcgaaag atcccaacga aaagagagac 660

cacatggtcc ttcttgagtt tgtaacagct gctgggatta cacatggcat ggatgaacta 720

tacaaagcta gccaccacca ccaccaccac gtgtga 756

<210> 3

<211> 969

<212> DNA

<213> Neurospora crassa

<400> 3

atggttcctg ctatcaagct caactccggc ttcgacatgc cccaggtcgg cttcggcctc 60

tggaaggtcg acggctccat cgcttccgat gtcgtctaca acgctatcaa ggcaggctac 120

cgcctcttcg atggtgcctg cgactacggc aacgaggttg agtgcggcca gggtgtagcc 180

cgcgccatca aggagggcat cgtcaagcgc gaggagctct tcatcgtctc caagctctgg 240

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ggtctcgagt acttcgatct ctacctgatc cacttccccg tcgccctcga gtacgtcgac 360

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aaggccacca tccaagagac ctggacggcc atggagtcgc tcgtcgagaa gggtctctcc 480

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ctcaaccttg ccaaggctga gggcatcgcc gtgaccgcct actcctcctt cggccctgct 660

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aacctcaact ctcttgattt cgatctctcc gaggaggaca tcaagaccat ctctggtttc 900

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ttcggttag 969

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gccgcggatg gttcctgcta tcaagctcaa 30

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gggtacccta accgaaaatc cagaggttct c 31

<210> 6

<211> 2057

<212> DNA

<213> Candida glycerinogenes

<400> 6

ggtaagttat ctgcttctgt tggttggaaa tacgattcta ttgtctctac tttagaagac 60

aagagaaagg caagagcagc agaatactac gcaaagaagt tagttgctgc aaagaagttg 120

actgctgcaa aggcatctgt tgcagaatcc gaagcttctc aaaaattagc tgctttaggt 180

tactaaatca gatcggtata ttactttaag taaagaataa aatatatata ctacctcttt 240

aattataatc aatcttgttt gtaattctat cgacccaagt gttttaagta caaaagattt 300

tcatttctca cattacgagt ttgcgaaggc agtggacgct ctggtccaag tttggtggat 360

ttcaactatt tggaagttgg agaaacagat ccaacattct tgttcatgga gggggagaac 420

aggactctgt cagggtttat gtttcaccac cttcatcacc aactatgtat acgatgcacg 480

ccgctgtagc ttctatgcac ctgtagcggg agggtaaatg tactctcttt cctgtgtacg 540

tctctttctt cctattcttt catgcgctgt cttactacta caggacggtg ccacaatggg 600

ccaatgcaaa caggactttg gattaagttt tactgtctca ttgtaaagcg gtttctttgg 660

atgcgtgcta gtagctgcgt tcaatggggg cgggggacac gactgatcca gtaacagcgt 720

ccaggcggtt acaatatacc actacagaaa tattaagcac accaccacca agtccctcgt 780

caatccttgt aatggacaag ccaattcctg ttgtacttgg atacattgca taacccgcta 840

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ttgttaaggc gggaacgcaa cacaacatac attgcagagc tgcagttacc gtcctcattt 960

ccaagagtgc ctatgttgta cgtgggagat atcgggttgg caatctgcgg atttacatct 1020

accaacacat gcaactgctt cagatagcaa aaacgccgca aggagaggga ggggtatggg 1080

cactctttcg aagaggcatc acttcaacct tttctggctc tatatatata tatataattt 1140

caaaccacca gcattcagag cggcattagt tggtgaaggt ttccaatctc atcagagact 1200

gctcagttct ctgaggtggc tgtctctatt attgctcgga tcaactaccg gaaaggcaaa 1260

accgcgttta caacaaaacc ggaaacagcg gccgctagcc gactctgagg agccgagcca 1320

actccaaata tctcagcact gtggctctag gcagtagaca gacaactcag cagagatgct 1380

gaagttggat ccaacctttg acctttgacc atcgaatcgt catccctcat agagcaagtt 1440

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<210> 7

<211> 1972

<212> DNA

<213> Candida glycerinogenes

<220>

<221> misc_feature

<222> (1010)..(1010)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1125)..(1125)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1596)..(1596)

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<400> 7

gagccacgta aggtcaaaga attgagagga aactttcata aaggcaaaga gaatgtatgg 60

taaatttctc ttattcttaa taacaggaac atcgtacacg gaaatgtctg gagttttgag 120

gtaatccggt aaattactct ccaaataccc acagaggttg acctggtaac ccagtttctc 180

aaagcttctg gcatggtatg acatccttgg agagtgtcct aaatctccta gaactacaat 240

gaccacctcg ttctgctgct cagacactat gatgttgctc cgacgttcaa atacacggca 300

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tatgcacagt ctgattgttg ggtgaaaaaa aaaaggtacg tattgttatc ccccacctct 540

ctcctttcct ctacagctcg tggcagtagt ttccaacctc atttctatca gtataggaat 600

tgcaactatt tcttcacacg tggagcgcgt tttaaagttt atataccgtt attcttctga 660

gcctccaggg ggggaaatgt ttaacttctg aattagagta aaccctaatt ttgcgtgaca 720

ctatttaatc aaacaaacaa aaacaaagag cccacaagtc agatacctta gagtagcagc 780

atatataacg ttgtaagtta aatgccatta actatgtagt ctttctcccc ggctcaatca 840

cctcttcaag cgtaagacaa cactgactaa ctgctcacaa gaaacacagt ctatttcaaa 900

gatataaaaa gaggacagaa aaggggcaac tgagtttcga agacaggact gttatgaaat 960

caaaagaata ggggtaattc cgggccctag tctgtttcaa aagctacatn tttcaaagat 1020

ataaaaagag gacagaaaag gggcaactga gtttcgaaga caggactgtt atgaaatcac 1080

aagaataggg gtaattccgg gccctagtct gtttcaagag ctacngatct cttacaattt 1140

cagatgggtg tgtggccgag aggttaaggc gtcaggatca gaacctgatt ttcttaggat 1200

ttcctgggtt cgatccccag cacactcatc actctcttat tatttttact agtagttatg 1260

gtctagattg attgatttag attgtataaa aggagggact tgaactatta tcagaactaa 1320

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atgttttatt tttatttatt tatttttatt tttattttta ttttttttta tttatttatt 1500

tatttttttt cgcgtatatg cggcaaaaaa aataaaattc aaaaaatggg atagtgcaat 1560

gccgagatta gatggatcga tccgagtatt tagtgntgcc gagattagat ggatcgatcc 1620

aagtatttat tacactattc ccaaactgga aatgggagtc atccacattg ctccctacct 1680

tgttacccca tttgttcaag agctgagccg ccgtttcgga gtatcttttt catctcctct 1740

tccccccccc tctttccttt ttctattttc ctgttatccc ccctcttctc cacaaactcg 1800

gagtattatc ttttttttat gtcattctag tatcggccaa attgaaatat gatttttttt 1860

ttgatttttc tcatgtacta aactctatat aaggaccaat atgtgaataa ttgtatgtaa 1920

agtaatgata atcaacaaaa tgaaaggtta gaattgccac tgttgtacaa ag 1972

<210> 8

<211> 2005

<212> DNA

<213> Candida glycerinogenes

<400> 8

actttacact cttgttggac tactgctctc tctccacgtt gtggcattaa gtttgacaaa 60

caccatgagt tatacttacc ccaaagtatg gagtttccct ccctttttca caaaacagcc 120

caacaaggaa acctacgata cgcaggtaaa cgaatggatc aaaataatac atgaatactg 180

caagtcttgt aaggtttgga aaatcacaag agaatgtcct gttttcacca acacggcaat 240

acggcggcag ctggagacgt cctttatcga ggagatcttt cgggaactgg agagaagggg 300

cggtgggagt atagttagcg atggggtcta tatatggtgg tacacacttg aggagtggag 360

cagccgtgtc tacgagtggg ttgaggacaa cgggcagaag ggggttatga tgacggtctt 420

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actcgagaag caggggaaag tcaccacggt tgtagagagg gacgaaattg ttggtgttaa 540

gttctagagg acgttcatct tcttgagctt ctccaagagg agctcgttca aggtgtggcc 600

ctctggtctg ccaactcgtt tctcgtagag atagtacgca gaaacaccca ttccaacagc 660

aagaagaggg tctagccact tggaaatgag gtacggataa tgtttgaact ggttgatcac 720

acgtgctgag tcggatgccg tcataatgtc tatgtttatt gcgataacta tttctggtgc 780

aactactgtg actatatatt ggtaaaaata taatccactc tagataattc tttatacgca 840

atgtccaact gttgaacaaa agctgttctc tcctagttca tttttccccc cttttttttt 900

aaacctcccc cacgaaaacc gacattcccc ccccgttggc cctccatgga aaccaaacct 960

cgcccgcgtc tcttggaatg tcccaggaaa aaaaaaagaa aaaaagggga agggggggtg 1020

cgccctacag aaatgatgtg caattgcacg gtaaatggga actataaacg gatttacagg 1080

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tgtgggacag gcagagcctt gtggaatgtt acagcagtga gcgggacagg tacatacacc 1800

tgtagaggag gctaacggtg actttagatg tggaagttta atgtctctat ggcgtctacg 1860

tgaatatttc caacgaggag cagtatacta taaaaggaca agtgtttctc ccactgtttg 1920

taatgtgttg gtggtagttt tatcccccat atattttcta caagacaaga caacccaata 1980

ccttatacat tcacaacata taaca 2005

Claims (10)

1.一种受高温诱导的启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.含有权利要求1所述启动子的表达载体。

3.含有权利要求1所述启动子或权利要求2所述表达载体的微生物细胞。

4.根据权利要求3所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物是产甘油假丝酵母。

5.一种产甘油假丝酵母，其特征在于，以pUGA为载体，以权利要求1所述的启动子诱导表达目的基因。

6.根据权利要求5所述的产甘油假丝酵母，其特征在于，所述目的基因为木糖还原酶基因。

7.一种高温诱导生产木糖醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将SEQ ID NO.1所示的启动子片段和木糖还原酶基因分别连接至载体上，获得重组质粒；

(2)在步骤(1)制备的重组质粒转化至宿主细胞中，获得重组菌；

(3)将重组菌在含甘油和木糖的培养基中培养，并控制培养温度为30～45℃。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述木糖还原酶基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述载体为pUGA。

10.权利要求1所述的启动子在酵母表达系统的构建、功能基因的筛选、功能基因的鉴定或调控基因表达方面的应用。

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