CN110982721B - 提高酿酒酵母代谢产物产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种GAL基因调控系统。该GAL基因调控系统中，pCTR3或者pCTR1与GAL80基因可操作地连接；pCUP1与GAL4基因可操作地连接。发明人在实验中意外地发现，采用铜离子抑制型的CTR3基因启动子(pCTR3)或CTR1基因的启动子(pCTR1)替换pGAL80启动子(pGAL80)，采用铜离子诱导型的CUP1基因启动子(pCUP1)替换pGAL4启动子(pGAL4)，可使得GAL基因调控系统在铜离子的诱导下实现控制基因的表达，显著提高携带所述GAL基因调控系统的工程菌的代谢产物的产量，且GAL基因调控不受体系中葡萄糖浓度的影响。

Description

提高酿酒酵母代谢产物产量的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及GAL基因调控系统、酿酒酵母以及提高酿酒酵母代谢产物产量的方法。

背景技术

酿酒酵母作是一种公认安全的微生物(Generally Recognized as Safe，GRAS)，人类对其生理生化、遗传背景都有较为清楚的研究，并且遗传操作相对简单，因此在近些年的合成生物学和代谢工程研究中有着举足轻重的作用。酿酒酵母除了用以发酵乙醇，制作啤酒，它已经成为高附加值天然产物的合成方面所常用的宿主。

在大多数研究中，外源基因在酿酒酵母中的表达都采用组成型强启动子，如常用的pTEF1启动子，pHXT7启动子，pTDH3启动子，pPGK1启动子等。采用组成型启动子的缺点在于，其表达强度不可调控，过多的基因组成型强表达，或者过早表达，会造成宿主的代谢负担，影响细胞的生长，最终影响目标产物的总产量。因此，采用诱导型启动子进行外源基因的表达是最大化细胞产能常用的方式。

目前，在酿酒酵母中最为常用的诱导表达系统为酿酒酵母半乳糖诱导系统(GAL诱导系统)。该系统中pGAL1，pGAL7，pGAL10，pGAL2启动的转录激活受到GAL4转录因子的正向激活调控，GAL4转录因子的活性受到GAL80负调控蛋白的抑制，而GAL80蛋白的活性受到培养基中半乳糖的调控，当细胞生长环境中存在半乳糖时，半乳糖能竞争性与GAL80蛋白结合，释放GAL4转录因子，GAL4进一步激活系统中pGAL1，pGAL7，pGAL10，pGAL2启动子转录。因此，在GAL调控系统中，半乳糖是GAL启动子的激活剂。但是，由于半乳糖能被细胞利用，导致诱导能力随着被利用后会降低；并且半乳糖价格昂贵，因此半乳糖诱导的方式由于成本过高而并不合适工业应用。

为了避免葡萄糖的使用，有研究对GAL80转录因子进行了敲除，使得GAL启动子的诱导不需要半乳糖，而是受到高葡萄糖抑制，低葡萄糖表达。该策略从一定程度解决了该系统在工业化应用上成本过高的问题。但是，葡萄糖是补料发酵过程中常用的碳源，其过程流加的不稳定性，会导致GAL启动子所控制基因表达出现大的波动，不利用大生产过程中的批次间的稳定性。

因此，在合成生物学领域，开发一种简单，高灵敏度的控制外源基因表达的方法，用于控制酿酒酵母生产高附加值产物，是该领域研究人员一直努力的方向。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种GAL基因调控系统。根据本发明的实施例，所述GAL基因调控系统中，pCTR3或者pCTR1与GAL80基因可操作地连接；pCUP1与GAL4基因可操作地连接。发明人在实验中意外地发现，采用铜离子抑制型的CTR3基因启动子(pCTR3)或CTR1基因的启动子(pCTR1)替换GAL80基因启动子(pGAL80)，并与GAL80基因可操作地连接，采用铜离子诱导型的CUP1基因启动子(pCUP1)替换GAL4基因启动子(pGAL4)，并与GAL4基因可操作地连接，可使得GAL基因调控系统在铜离子的诱导下实现控制基因的表达，显著提高携带所述GAL基因调控系统的工程菌的代谢产物的产量，且GAL基因调控不受体系中葡萄糖浓度的影响。

根据本发明的实施例，上述GAL基因调控系统还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，pCTR3与GAL80基因可操作地连接。发明人发现，选择铜离子抑制型的CTR3基因启动子(pCTR3)替换GAL80基因启动子(pGAL80)，并与GAL80基因可操作地连接，在提高携带所述GAL基因调控系统的工程菌的代谢产物的产量方面效果更优。

根据本发明的实施例，进一步包括预定过表达基因与GAL1基因启动子(pGAL1)、GAL2基因启动子(pGAL2)、GAL7基因启动子(pGAL7)或GAL10基因启动子(pGAL10)至少之一的可操作地连接。已知在天然的GAL调控系统中，GAL4蛋白是该调控系统中的转录激活因子，GAL80是该调控系统中的转录抑制蛋白。启动子pGAL1、pGAL2、pGAL7、pGAL10的活性依赖于转录因子GAL4蛋白的结合而激活，GAL80蛋白可以结合到GAL4蛋白而阻止GAL4蛋白与上述启动子的结合。因此，将预定过表达基因与pGAL1、pGAL2、pGAL7或pGAL10至少之一的可操作地连接，在根据本发明实施例的GAL基因调控系统的控制下，可实现预定过表达基因在铜离子的诱导下的表达，即当工程菌生长环境中加入Cu离子时，pCTR3启动子被抑制，GAL80蛋白不表达，而GAL4蛋白被诱导表达，因此被pGAL1、pGAL2、pGAL7、pGAL10控制的基因也被诱导表达。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种酿酒酵母。根据本发明的实施例，所述酿酒酵母包括前面所述的GAL基因调控系统。根据本发明实施例的酿酒酵母，可以在铜离子的调控下实现目的基因的表达。当根据本发明实施例的酿酒酵母的生长环境中加入Cu离子时，pGAL1、pGAL2、pGAL7、pGAL10控制的目的基因被诱导表达而不受体系中葡萄糖浓度的影响，可实现目的基因控制的代谢产物产量的显著提高。

根据本发明的实施例，上述酿酒酵母还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，tHMG1基因与pGAL1可操作地连接，BtcrtE基因与pGAL10可操作地连接，BtcrtYB基因与pGAL1可操作地连接以及BtcrtI基因与pGAL10可操作地连接。进而可实现代谢产物β-胡萝卜素的显著提高。

根据本发明的实施例，所述BtcrtE基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，优选地，所述BtcrtI基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，优选地，所述BtcrtYB基因具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

ATGTTGACATCTTCTAAATCTATTGAATCTTTTCCAAAGAATGTCCAGCCATACGGTAAGCACTACCAGAACGGATTGGAGCCAGTCGGTAAGTCACAGGAAGACATTTTGTTGGAACCATTCCATTATTTGTGCTCTAATCCAGGTAAGGATGTCAGAACTAAGATGATTGAGGCTTTTAATGCATGGTTAAAAGTTCCAAAAGACGATTTAATTGTTATAACTAGAGTTATTGAGATGTTGCATTCTGCTTCTTTGTTGATTGATGATGTCGAAGACGACTCAGTCTTGAGAAGGGGTGTTCCAGCTGCTCACCACATTTACGGTACACCACAGACAATTAATTGTGCTAATTACGTTTATTTTTTGGCTTTGAAAGAAATTGCTAAATTGAATAAACCAAATATGATTACAATTTATACTGATGAATTAATTAACTTGCATAGAGGTCAAGGTATGGAATTGTTTTGGAGAGATACTTTAACTTGTCCAACAGAAAAAGAATTTTTGGACATGGTTAATGATAAGACTGGTGGTTTGTTGAGGTTGGCAGTCAAGTTGATGCAGGAGGCTTCTCAGTCAGGTACTGACTACACAGGTTTGGTCTCTAAAATTGGTATTCATTTTCAAGTTAGAGATGATTATATGAATTTACAGTCTAAGAATTATGCTGACAACAAGGGTTTCTGCGAGGACTTGACAGAGGGTAAGTTTTCATTCCCAATTATACATTCTATTAGATCAGATCCATCTAACAGACAATTGTTGAATATTTTGAAACAACGTTCTTCTTCTATTGAGTTGAAACAATTCGCTTTGCAATTGTTGGAAAATACAAATACTTTTCAATATTGTAGAGATTTTTTGAGAGTTTTGGAGAAGGAGGCTAGGGAGGAGATTAAGTTGTTGGGTGGTAATATAATGTTGGAAAAAATTATGGATGTTTTATCTGTTAATGAATAA(SEQ ID NO:1)。

ATGTCTGATCAGAAAAAACACATTGTTGTTATTGGTGCTGGTATAGGAGGTACAGCTACTGCAGCTAGATTGGCAAGAGAGGGTTTCAGAGTTACTGTCGTCGAAAAGAATGATTTTTCTGGAGGAAGATGTTCATTTATTCATCATGATGGTCATAGATTTGATCAAGGTCCTTCATTGTATTTGATGCCAAAATTGTTCGAGGACGCTTTCGCTGACTTGGACGAGAGAATTGGTGACCATTTAGATTTGTTGAGGTGTGATAATAATTATAAAGTTCATTTTGATGACGGTGATGCTGTTCAATTGTCTTCTGATTTGACTAAGATGAAAGGAGAGTTGGACAGGATTGAGGGTCCATTGGGTTTCGGTAGGTTCTTAGATTTCATGAAAGAAACTCATGTTCACTATGAACAAGGTACTTTTATAGCTATAAAAAGAAATTTCGAAACAATTTGGGATTTGATTAGATTACAATATGTCCCAGAAATATTTAGATTGCATTTGTTTGGTAAAATTTATGACAGAGCTTCAAAATATTTTCAGACTAAGAAGATGAGAATGGCTTTTACATTTCAAACTATGTATATGGGTATGTCTCCATACGACGCTCCTGCTGTTTATTCATTGTTGCAATATACTGAATTTGCAGAGGGTATTTGGTATCCTAGAGGTGGTTTTAACATGGTTGTTCAAAAGTTGGAATCTATTGCATCTAAAAAGTATGGTGCAGAGTTTAGATATCAATCTCCAGTTGCAAAAATTAATACTGTTGATAAGGATAAGAGAGTTACAGGTGTCACTTTGGAGTCAGGTGAGGTTATAGAAGCTGACGCTGTCGTCTGCAATGCTGACTTGGTCTACGCTTACCACCATTTGTTGCCACCATGTAATTGGACTAAGAAAACTTTGGCATCTAAGAAATTGACTTCATCTTCTATTTCTTTTTACTGGTCTATGTCTACAAAGGTTCCACAATTAGATGTTCACAATATCTTTTTAGCAGAGGCTTATAAAGAATCATTTGATGAAATTTTTAACGACTTCGGTTTGCCTTCTGAAGCATCTTTCTACGTCAACGTCCCATCAAGAATTGACGAGTCTGCTGCTCCACCTAACAAGGACTCTATTATTGTCTTAGTCCCAATTGGTCATATGAAATCTAAAACTGGTAATTCTGCAGAAGAGAACTACCCTGAGTTGGTCAACAGAGCTAGAAAAATGGTTTTGGAAGTTATTGAAAGAAGATTGGGTGTCAATAATTTCGCAAATTTAATTGAACACGAGGAAGTCAACGACCCATCTGTTTGGCAGTCTAAGTTTAATTTGTGGAGAGGTTCTATTTTAGGTTTGTCACACGATGTTTTCCAAGTCTTGTGGTTTAGACCATCAACTAAAGATTCTACTAATAGGTACGATAACTTGTTCTTTGTTGGTGCTTCTACTCACCCAGGTACAGGTGTTCCAATTGTCTTGGCTGGTTCAAAGTTAACATCTGATCAAGTTTGCAAATCATTCGGTCAGAACCCATTACCAAGGAAGTTACAAGACTCTCAAAAGAAATATGCTCCAGAACAGACAAGAAAAACAGAATCACATTGGATTTACTACTGCTTGGCTTGTTACTTCGTTACATTCTTATTCTTTTATTTCTTCCCAAGAGATGATACTACTACACCAGCTTCTTTTATTAATCAATTGTTACCTAACGTTTTTCAAGGTCAAAATTCAAATGATATTAGAATTTAA(SEQ ID NO:2)。

ATGTCAATATTAACATACTTGGAATTTCATTTATACTATACATTGCCAGTTTTGGCAGCTTTGTGCTGGTTATTAAAACCTTTTCATTCTCAGCAAGATAATTTGAAGTATAAATTCTTGATGTTGATGGCTGCATCTACAGCATCAATTTGGGATAACTATATTGTTTATCATAGAGCATGGTGGTACTGCCCAACTTGCGTTGTCGCAGTCATTGGTTACGTCCCATTGGAAGAATACATGTTTTTTATTATTATGACTTTGATGACTGTTGCTTTTTCTAACTTTGTTATGAGATGGCATTTGCATACTTTCTTTATAAGACCAAACACATCATGGAAGCAAACTTTATTGGTTAGATTGGTTCCTGTCTCAGCTTTGTTAGCTATTACTTACCATGCATGGCATTTGACATTGCCAAATAAACCATCTTTCTACGGTTCATGCATATTATGGTACGCTTGCCCAGTCTTGGCAATTTTGTGGTTGGGTGCTGGTGAATATATTTTAAGAAGACCAGTTGCAGTTTTGTTGTCTATTGTCATTCCATCAGTTTATTTATGTTGGGCTGATATTGTTGCTATATCTGCAGGTACTTGGCATATATCTTTGAGAACATCAACTGGAAAGATGGTTGTCCCAGACTTGCCTGTCGAGGAATGTTTGTTCTTTACTTTGATTAATACAGTTTTGGTCTTTGCTACATGTGCTATTGATCGTGCTCAAGCTATTTTGCATTTGTACAAATCTTCAGTTCAGAACCAAAACCCTAAACAAGCTATTTCTTTGTTCCAACACGTTAAGGAGTTAGCTTGGGCATTCTGCTTGCCTGACCAGATGTTGAACAACGAATTGTTCGATGATTTGACTATTTCATGGGATATTTTGAGAAAAGCATCTAAATCATTCTATACAGCATCAGCTGTTTTTCCTTCTTATGTTAGACAAGATTTGGGTGTCTTGTACGCATTCTGCAGGGCAACTGACGATTTGTGCGACGACGAGTCAAAGTCTGTCCAAGAGAGGAGAGACCAATTGGACTTGACTAGACAATTTGTCAGAGATTTGTTTTCTCAAAAAACATCAGCACCAATTGTTATTGACTGGGAATTGTATCAAAACCAATTGCCTGCATCTTGTATTTCAGCTTTTAGGGCATTTACTAGATTAAGACACGTTTTGGAGGTTGATCCAGTTGAAGAATTGTTGGATGGTTATAAATGGGATTTGGAAAGAAGACCAATTTTGGATGAACAAGACTTGGAGGCTTACTCAGCTTGCGTTGCATCTTCTGTCGGTGAGATGTGTACAAGAGTCATTTTAGCTCAAGATCAAAAAGAGAATGATGCTTGGATAATAGATAGAGCAAGGGAGATGGGTTTGGTTTTACAATACGTCAATATTGCAAGAGATATTGTTACTGACTCTGAAACTTTAGGTAGATGTTATTTGCCTCAACAGTGGTTGAGGAAGGAGGAGACAGAACAAATTCAACAAGGAAACGCACGTTCTTTGGGTGACCAGAGGTTGTTGGGATTATCTTTGAAGTTGGTCGGTAAGGCTGACGCAATAATGGTCAGAGCTAAAAAAGGTATTGATAAGTTGCCAGCAAACTGCCAAGGTGGTGTTAGAGCAGCTTGCCAGGTTTACGCTGCAATAGGTTCAGTCTTGAAACAACAGAAAACTACATATCCTACTCGTGCTCATTTGAAAGGTTCAGAAAGAGCAAAAATTGCTTTATTGTCTGTTTATAATTTGTACCAGTCTGAGGACAAGCCAGTTGCTTTGAGGCAGGCAAGAAAGATTAAATCTTTCTTTGTTGATTAA(SEQ ID NO:3)。

发明人通过密码子优化，获得上述BtcrtE基因、BtcrtI基因、BtcrtYB基因的序列，发明人发现，将具有上述核苷酸序列的BtcrtE基因、BtcrtI基因、BtcrtYB基因设置于pGAL10和pGAL1调控下，可进一步提高代谢产物β-胡萝卜素的产量。

根据本发明的实施例，GAL1基因沉默，GAL7基因沉默以及GAL10基因沉默。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种提高酿酒酵母代谢产物产量的方法。根据本发明的实施例，将携带前面所述的GAL基因调控系统的酿酒酵母进行发酵处理。根据本发明实施例的方法，代谢产物的产量不受葡萄糖浓度的影响，且产量得到显著提高。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，携带所述GAL基因调控系统的酿酒酵母是通过如下方式获得的：替换pGAL80为pCTR3或者pCTR1，优选地，替换pGAL80为pCTR3；替换pGAL40为pCUP1。

根据本发明的实施例，进一步包括将预定过表达基因与pGAL1、pGAL2、pGAL7和pGAL10至少之一可操作地连接。

根据本发明的具体实施例，所述代谢产物为β-胡萝卜素，进一步包括：tHMG1基因与pGAL1可操作地连接，BtcrtE基因与pGAL10可操作地连接，BtcrtYB基因与pGAL1可操作地连接以及BtcrtI基因与pGAL10可操作地连接；以及沉默GAL1基因，GAL7基因以及GAL10基因。根据本发明实施例的方法，酿酒酵母在Cu离子的调控下，实现了β-胡萝卜素产量的显著提高。

根据本发明的实施例，所述BtcrtE基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，优选地，所述BtcrtI基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，优选地，所述BtcrtYB基因具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。发明人通过密码子优化，获得具有上述核苷酸序列的BtcrtE基因、BtcrtI基因以及BtcrtYB基因，可进一步提高β-胡萝卜素产量。

根据本发明的实施例，所述沉默GAL1基因，GAL7基因以及GAL10基因是通过敲除GAL1基因，GAL7基因以及GAL10基因实现的。

根据本发明的实施例，所述酿酒酵母为选自BY4743，BY4742，BY4743，INVSC1、HEC-YLK的至少之一，所述HEC-YLK于2018年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018062，分类命名为：Saccharomyces cerevisiae HEC-YLK，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，中国典型培养物保藏中心。

根据本发明的实施例，所述酿酒酵母为HEC-YLK。发明人发现，以HEC-YLK为工程菌株进行发酵，β胡萝卜素的产量进一步显著提高。

根据本发明的实施例，在发酵处理过程中，将酿酒酵母与铜离子进行接触，进而实现铜离子对pGAL1、pGAL2、pGAL7和pGAL10至少之一控制基因的调控。

根据本发明的实施例，所述铜离子在发酵体系中的浓度为0.1～100μM。发明人发现，铜离子在发酵体系中的浓度为1～100μM，β-胡萝卜素的产量高。

根据本发明的实施例，当发酵体系中菌体浓度OD₆₀₀为90～100时，将所述酿酒酵母与所述铜离子进行接触。发明人发现，当发酵体系中菌体浓度OD₆₀₀为90～100时，在发酵体系中添加铜离子，实现了菌体数量和β-胡萝卜素产量的平衡，使β-胡萝卜素产量达到了一个更高的水平。

附图说明

图1是根据本发明实施例的Cu离子诱导型GAL调控系统原理图；

图2是根据本发明实施例的不同浓度的Cu离子对菌株产色素和菌体生物量的影响；

图3是根据本发明实施例的荧光定量所计算的基因转录水平的结果；

图4是根据本发明实施例的半乳糖诱导菌株YLK-GAL-BT2中，葡萄糖对GAL调控系统的影响；以及

图5是根据本发明实施例的Cu离子诱导菌株YLK-Cu-BT2菌株中，葡萄糖对GAL调控系统的影响。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，本申请所述的“GAL80基因”、“GAL4基因”等某某基因是指从基因起始密码子一直到基因终止密码子之间的序列。

本发明提出了一种改造酿酒酵母中GAL调控系统的方法：通过对原酿酒酵母中GAL调控系统进行改造，使得原来需要通过半乳糖进行诱导，且受到培养环境中葡萄糖抑制的半乳糖调控系统可以只受到Cu离子的控制。

在天然的GAL调控系统中，GAL4蛋白是该调控系统中的转录激活因子，GAL80是该调控系统中的转录抑制蛋白。启动子pGAL1、pGAL2、pGAL7、pGAL10的活性依赖于转录因子GAL4蛋白的结合而激活，GAL80蛋白可以结合到GAL4蛋白而阻止GAL4蛋白与上述启动子的结合。

pCTR3启动子和pCUP1启动子的特点为：在存在Cu离子条件下，pCTR3启动子所控制基因的转录会被抑制，pCUP1启动子所控制基因的转录会被激活，在没有Cu离子存在时则出现相反的效果。

基于上述理论，本发明实现的Cu离子诱导型GAL调控系统原理如下所述：

本发明中通过替换了GAL80基因和GAL4基因原本的启动子，改变了酵母原本的半乳糖诱导模式，而成为Cu离子诱导模式。当酵母生长环境中不存在Cu离子时：pCTR3启动子不被抑制，GAL80蛋白表达，而GAL4蛋白未被诱导，因此pGAL1、pGAL2、pGAL7、pGAL10控制的基因不表达。但酵母生长环境中加入Cu离子时，pCTR3启动子被抑制，GAL80蛋白不表达，而GAL4蛋白被诱导表达，因此pGAL1、pGAL2、pGAL7、pGAL10控制的基因也被诱导表达。

通过上述改造，达到Cu离子控制目标基因表达的目的。具体原理可参见图1。

所述的pCTR3启动子是来源于酿酒酵母的铜离子抑制型启动子，所述的pCUP1启动子是来源于酿酒酵母的铜离子诱导型启动子。

pCTR3启动子和pCUP1启动子的序列为如下核苷酸序列所示，通过碱基的增加、删减、替换，但仍然具有相同功能的类似序列在本发明的保护范围之内。

pCTR3启动子：

GTATTCCAATGAGAATCGCTAGAAATGCTTTACCAGAACTAGACTACTTGTCGCAGATCACTTTTGAACTGTATGAGAGTACGGATGCTTCTGGTCAAAAATCGCATTCCATTAGACTGAAAATGTCTCCTGGGTGTCATACTCAAGATCCGTTAGATGTTCAATTAGATGACAGGCATTATATTAGTTGTATTCCAAAGATTTCCCTGACGAAGCATTTGGATATGGACTACGTTCAACAGAAATTGAGAAACAAATTTACCAGGGTCATTATGCCTCCGAAATTTACACCAGTAAACATTACGAGCCCCAACTTGAGTTTCCAGAAACGCAAAACCAGAAGAAAGTCGGTATCTGTTGAGAAGTTGAAGCTTCCTGCCTCGTCCGGATCTTCATCATCTACCTCCGTTAACAAGACATTAGATTAGTGATCACACCCAATTTTTAATTTAGCAACCCAAAATAAATAAGTATTTACTCAACTTTTTTTTAATAAAAAAAAACTTAATTGAATTTTGCTCGCGATCTTTAGGTCCGGGGTTTTCGTTGAACCCTTAGACGAGCAAATTAGCGCCATAAGGATATACGTCAGAGCACATTAATTAGTGACATATACCTATATAAAGAGCAACCTTCTCCGATAGACTTGTAATTTATCTTATTTCATTTCCTAACACTTTGGTCGAAGAAGAGGGATAAGAACAGACGAAAACACATTTAAGGGCTATACAAAG

pCUP1启动子：

TATCTGTATTTAAAACACTTTTGTATTATTTTTCCTCATATATGTGTATAGGTTTATACGGATGATTTAATTATTACTTCACCACCCTTTATTTCAGGCTGATATCTTAGCCTTGTTACTAGTTAGAAAAAGACATTTTTGCTGTCAGTCACTGTCAAGAGATTCTTTTGCTGGCATTTCTTCTAGAAGCAAAAAGAGCGATGCGTCTTTTCCGCTGAACCGTTCCAGCAAAAAAGACTACCAACGCAATATGGATTGTCAGAATCATATAAAAGAGAAGCAAATAACTCCTTGTCTTGTATCAATTGCATTATAATATCTTCTTGTTAGTGCAATATCATATAGAAGTCATCGAAATAGATATTAAGAAAAACAAACTG

为了实现本发明的实施例，发明所用的酿酒酵母为酿酒酵母属(Saccharomyces)的任意菌株。优选的采用HEC-YLK【菌株保藏号(CCTCC NO：M2018062)】作为出发菌株。

为了实现上述启动子的替换，本发明采用基因编辑的方法在基因组上将pGAL80启动子替换为pCTR3启动子，将pGAL4启动子替换为pCUP1启动子。

为了验证本发明改造的GAL调控系统，本发明还构建了一株可以受Cu离子调控的beta-胡萝卜素合成菌株。在上述改造的基础上，本发明将合成beta-胡萝卜素所需要的基因tHMG1，BtcrtE，BtcrtI，BtcrtYB都克隆到GAL启动下，并采用基因编辑的方法整合进酿酒酵母基因组。

为了实现采用基因编辑的方法进行GAL调控系统的改造及beta-胡萝卜素菌株的构建，本发明构建了pCAS9-HO、pCAS9-GAL7、pCAS9-GAL80、pCAS9-GAL4，4个基因编辑载体。并采用带同源臂的引物扩增了替换pGAL80启动子的pCTR3供体(donor)DNA，扩增了替换pGAL4启动子的pCUP1 donor DNA，扩增了在HO位点进行基因整合的BtcrtE-tHMG1 donorDNA，扩增了在GAL1-GAL7位点进行基因整合的BtcrtI-BtcrtYB donor DNA。其中BtcrtE和tHMG1基因分别处于pGAL10和pGAL1启动子的控制下表达；BtcrtI和BtcrtYB基因分别处于pGAL10和pGAL1启动子的控制下表达。

通过将HEC-YLK中的pGAL80启动子的pCTR3启动子，构建了YLK-Cu01菌株；进一步，将YLK-Cu-CTR3中的pGAL4启动子替换为pCUP1启动子，构建了YLK-Cu02。

为了证明YLK-Cu02具有调控工程菌株基因表达，从而对代谢合成途径及产物积累进行控制，在YLK-Cu02的基础上先后在HO位点整合了BtcrtE-tHMG1表达盒构建YLK-Cu-BT1，在GAL1-7位点整合了BtcrtI-BtcrtYB表达盒构建了YLK-Cu-BT2。YLK-Cu-BT2用于进行Cu离子诱导系统的表征。

为了将Cu离子控制的GAL调控系统与半乳糖诱导的GAL调控系统进行比较。以HEC-YLK菌株为出发菌株先后在HO位点整合了BtcrtE-tHMG1表达盒构建YLK-GAL-BT1，在GAL1-7位点整合了BtcrtI-BtcrtYB表达盒构建了YLK-GAL-BT2。

为了说明证明所构建的Cu离子诱导系统的有效性，本发明采用摇瓶实验在0μM-100μM的Cu离子诱导条件下对Cu离子诱导条件下，所构建的Cu离子控制的YLK-Cu-BT2β-胡萝卜素合成菌株的色素合成能力进行了考察。

为了证明Cu离子诱导系统的GAL4，GAL80的转录模式以及改造后的GAL调控系统所控制的GAL1，GAL10，GAL7，GAL2启动子的转录确实受到Cu离子的控制，本发明采用了Real-time PCR的方式对YLK-Cu-BT2菌株中GAL4，GAL80，BtcrtYB和BtcrtI基因在10μM Cu离子及无Cu表达模式进行了这4个基因转录水平的比较。

为了证明所构建的Cu离子诱导系统不受葡萄糖的抑制，本发明对带有半乳糖诱导型GAL调控系统所控制的产β-胡萝卜菌株YLK-Cu-BT2和Cu离子诱导型的GAL调控体系所控制的产β-胡萝卜菌株YLK-GAL-BT2进行了摇瓶发酵过程beta-胡萝卜素产生时间与葡萄糖消耗之间的测定。

为了进一步说明所构建的Cu离子诱导系统在酿酒酵母生产高附加值化合物的有益益处，本发明对所构建的Cu离子诱导型beta-胡萝卜素菌株YLK-GAL-BT2在不加Cu，发酵初始就加Cu，和发酵中途加Cu三种诱导条件下进行了比较。

本发明将Cu离子调控和GAL调控系统相结合，实现高灵敏度的Cu离子控制型基因表达策略。可基于不同的目的，采用0.1μM Cu离子到100μM铜离子对菌株进行诱导。采用本发明构建的beta-胡萝卜素菌株，其基因的诱导开启不依赖半乳糖，不受体系中葡萄糖的影响，只受到Cu离子的控制，GAL启动子所控制基因数百到上千倍表达水平的调控，诱导成本低，简单便捷。由此构建的产β-胡萝卜素工程菌株产量高。Cu离子控制基因诱导表达的方式在酿酒酵母中蛋白过表达和代谢过程合成高附加值产物上有很好的应用前景。

实施例1基因编辑载体的构建

本发明中所有的基因整合及基因组上DNA片段替换都采用基因编辑的方法，为此，本发明预先构建一系列的基因编辑载体用于后续的实施例。构建的基因编辑载体均以pCAS9W03为出发载体(专利申请号：201910754882.3)，采用融合PCR的方式将原载体上的N20序列进行替换，以获得不同的基因编辑靶向载体，编辑位点的设计采用sgRNA在线设计工具，网站链接为：http://crispr.dbcls.jp/。

其中构建基因编辑载体所需要的引物序列如表1所示，其中下划线部分为N20替换区域，即为在基因组上相应位点的靶向区域。

表1：

载体的构建过程如表2所示。

先采用上述引物扩增以下4个片段。

表2：

将上述得到的4个片段分别用分别用NheI+NotI就行酶切，并连接到同样酶切的pCAS9W03载体骨架，转化到大肠杆菌DH5α，涂布于含有100mg/ml的氨苄霉素抗性平板，筛选到的阳性克隆，所构建成功的质粒分别命名为pCAS9-HO，pCAS9-GAL7，pCAS9-GAL80，pCAS9-GAL4。

实施例2Cu离子诱导型GAL调控系统的改造

(1)pCRT3 donor DNA的制备及pGAL80启动子的替换

采用酿酒酵母HEC-YLK基因组为模板，以核酸序列：PCTR3-F2：TTTCTTCATTTACCGGCGCACTCTCGCCCGAACGACCTCAAAATGTCTGCGTATTCCAA TGAGAATCGCTAG和PCTR3-R2：GGAGCTGCATTAGGCACGGTTGAGACCGAAGATCTCTTGTTGTAGTCCATCTTTGTATA GCCCTTAAATG为引物，进行扩增。上下游引物5’端各具有50bp与pGAL80启动子上下游同源区域。

(2)pCUP1 donor DNA的制备及pGAL4启动子的替换

采用酿酒酵母HEC-YLK基因组为模板，以核酸序列：046-CUP1p-F：AGGGGCGATTGGTTTGGGTGCGTGAGCGGCAAGAAGTTTCGTAAGCCGATCCCATTA CCG和047-CUP1p-R：AGAAGACAGTAGCTTCATCTTTCAGGAGGCTTGCTTCTCTGTCAGTTTGTTTTTCTTAA TATCTATTTCG为引物，进行高保真PCR扩增。上下游引物5’端各具有40bp与pGAL4启动子上下游同源区域。扩增得到的DNA为pCUP1donor DNA。

(3)基因编辑进行基因组上DNA片段替换的转化方法：

按照Gietz,R.D.and R.H.Schiestl(2007)."High-efficiency yeasttransformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method."Nature Protocols 2(1):31-34.所述方法制备酿酒酵母感受态，并进行转化，在含有100μL酵母细胞的离心管中加入表3所示物质。

表3：

将上述混合体系放入到42℃保温40min进行热击。然后加入1ml YPD液体培养基，30℃摇床复苏培养3h，复苏后取100μl转化液涂布在含有200μg/ml G418的YPD固体平板上，30℃进行培养，3天后挑取平板上所长出的克隆，进行基因型验证，得到正确基因型的克隆子。将克隆子在YPD液体培养基中传代培养2次，以丢失其中的CAS9基因编辑载体。

(4)菌株的构建

采用上述转化方法，使用HEC-YLK作为宿主，pCAS9-GAL80为基因编辑载体，DonorDNA为pCRT3 donor DNA，得到pGAL80启动子被pCRT3启动子替换的基因工程菌株YLK-Cu01。

采用上述转化方法，使用YLK-Cu01作为宿主，pCAS9-GAL4为基因编辑载体，DonorDNA为pCUP1 donor DNA，得到pGAL4启动子被pCUP1启动子替换的基因工程菌株YLK-Cu02。

实施例3铜离子诱导型Beta-胡萝卜素菌株的构建

(1)Beta-胡萝卜素合成途径基因的合成

按照酿酒酵母的密码子对来源于三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora)的beta-胡萝卜素合成途径基因BtcrtE(GGPP合酶，GenBank:：AFC92798.1)，BtcrtI(八氢番茄红素脱氢酶，GenBank:：AAX20903.1)和BtcrtYB(八氢番茄红素合酶/环化酶双功能酶，GenBank:：Q67GH9.1)进行密码子优化并进行基因合成。优化后的基因序列如表4所示。

表4：

(2)beta-胡萝卜素合成途径基因donor DNA的制备

在进行基因合成时，BtcrtE基因的上下游分别加上EcoRI、BglII两个酶切位点，BtcrtI基因的上下游分别加上EcoRI、BglII两个酶切位点，BtcrtYB基因的上下游分别加上BamHI、HindIII两个酶切位点。

将BtcrtE基因EcoRI、BglII双酶切连接克隆到酿酒酵母表达载体pESC-URA上，转化大肠杆菌DH5a，Amp抗性筛选克隆，得到pESC-URA-BtcrtE，以HEC-YLK酵母菌基因组为模板，tHMG1-BamHI：CCCGGATCCAAAAATGGACCAATTGGTGAAAACTGAAG和tHMG1-SalI：CCCGTCGACTTAGGATTTAATGCAGGTGACG为引物，扩增出HMG1的催化区域tHMG1(tHMG1序列参见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001145.3？from＝115734&to＝118898&report＝genban k&strand＝true)，BamHI+SalI酶切，凝胶电泳回收，连接到同样酶回收的pESC-URA-BtcrtE载体上，转化大肠杆菌DH5α，Amp抗性筛选克隆，得到pESC-URA-BtcrtE-tHMG1，由于PESC-URA上的启动子为pGAL1-pGAL10双向启动子，BtcrtE和tHMG1基因分别处于pGAL10和pGAL1启动子的控制下表达。

为了将BtcrtE和tHMG1通过基因编辑的方式整合到HO位置处，设计携带HO切割位点上下游同源臂的引物HO-donor-F：cttatgatggttttttggaattattattatcctaccatcaagcgtctgacccagctgaattggagcga和HO-donor-R：cgcggaaaaaagtaaacagctattgctactcaaatgaggtttgcagaagcgcagctggatcttcgagcgtcccaaaacc。从pESC-URA-BtcrtE-tHMG1上采用高保真酶扩增出BtcrtE-tHMG1 donor DNA。

将BtcrtI基因EcoRI、BglII双酶切连接克隆到酿酒酵母表达载体pESC-URA上，转化大肠杆菌DH5a，Amp抗性筛选克隆，得到pESC-URA-BtcrtI，BtcrtYB基因BamHI、HindIII双酶切，连接到同样酶切的pESC-URA-BtcrtI载体上，转化大肠杆菌DH5α，Amp抗性筛选克隆，得到pESC-URA-BtcrtI-BtcrtYB。由于PESC-URA上的启动子为pGAL1-PGAL10双向启动子，BtcrtI和BtcrtYB基因分别处于pGAL10和PGAL1启动子的控制下表达。

为了将BtcrtI和BtcrtYB表达盒通过基因编辑的方式替换基因组上GAL1-GAL7区域，设计携带GAL1-GAL7切割位点上下游同源臂的引物GAL7-CAS9-F：tgtagataatgaatctgaccatctaaatttcttagtttttcagcagcttgttccgaagttaaatctctttcggttagagcggatcttagc和

GAL1-CAS9-R：gcattttctagctcagcatcagtgatcttagggtacttgaccttgtagaactcattggcaagggcttcttgaccaaacctctggcgaag从pESC-URA-BtcrtI-BtcrtYB上采用高保真酶扩增出BtcrtI-BtcrtYB donor DNA。

(3)菌株的构建

采用实施例2第4部分菌株构建中所述的酿酒酵母转化方法，使用YLK-Cu02作为宿主，pCAS9-HO为基因编辑载体，BtcrtE-tHMG1 donor DNA，得到HO基因被BtcrtE-tHMG1表达盒替换的基因工程菌株YLK-Cu-BT1。

采用实施例2第4部分菌株构建中所述的酿酒酵母转化方法，使用YLK-Cu-BT1作为宿主，pCAS9-GAL7为基因编辑载体，BtcrtI-BtcrtYB donor DNA，得到GAL1-GAL7区域被BtcrtI-BtcrtYB表达盒替换的基因工程菌株YLK-Cu-BT2。

实施例4半乳糖诱导型Beta-胡萝卜素菌株的构建

当不对GAL调控系统中的GAL80和GAL4进行改造时，GAL调控系统中的pGAL1、pGAL2、pGAL7、pGAL10等启动子的转录活性需要受到半乳糖的诱导。为了构建一株半乳糖诱导型的Beta-胡萝卜素合成菌株用于对照实验，采用实施例3第3部分菌株构建的方法，以HEC-YLK作为宿主，pCAS9-HO为基因编辑载体，BtcrtE-tHMG1 donor DNA，得到HO基因被BtcrtE-tHMG1表达盒替换的基因工程菌株YLK-GAL-BT1。使用YLK-GAL-BT1作为宿主，pCAS9-GAL7为基因编辑载体，BtcrtI-BtcrtYB donor DNA，得到GAL1-GAL7区域被BtcrtI-BtcrtYB表达盒替换的基因工程菌株YLK-GAL-BT2。工程菌株YLK-GAL-BT2在添加了2％半乳糖的YPD平板生长3天上能明显看到菌落变红，而在没有半乳糖的YPD平板上培养3天，菌落为白色，说明所构建的菌株确实需要半乳糖的诱导。

实施例5Cu离子诱导型Beta-胡萝卜素菌株的摇瓶表征验证

(1)菌株的摇瓶培养及诱导

从-80℃冰箱取YLK-Cu-BT2甘油种子接种至50mL YPD培养基中，30℃250rpm活化12-16h，获得一级种子；其次，在实验组YPD发酵培养基中依次加入浓度为15mM的硫酸铜母液，至终浓度分别为0μM、0.2μM、0.5μM、1μM、2μM、5μM、10μM、30μM、50μM、100μM；再按1％接种量将一级种子转接至上述50mlYPD培养基中，30℃250rpm发酵72h，每个浓度进行三个重复。

(2)菌体中色素(本申请所述色素是指Beta-胡萝卜素)的提取及含量测定

Beta-胡萝卜素的提取：发酵结束取培养物1mL到15ml离心管中，离心去上清收集菌体；然后加入1mL的3M浓度盐酸，在沸水浴中处理3min，破坏酵母细胞壁；将处理过后的细胞在冰水浴中冷却1min，离心去上清，并用纯水水洗2遍去除残余的盐酸；再加入5ml丙酮，上下震荡萃取其中的色素。

Beta-胡萝卜素含量的测定：在450nm波长下检测OD值，并按如下公式计算提取液中的β-胡萝卜素含量；

A1-----稀释后的β-胡萝卜素在450nm波长下，1cm光程比色皿中的吸光值

A^1％-----1％浓度(10mg/mL)的β-胡萝卜素的消光系数，此处的数值为2500AU

N-----测定OD₄₅₀时的β-胡萝卜素溶液稀释倍数

10g/mL----A^1％为2500AU时的β-胡萝卜素溶液浓度

发酵液中β胡萝卜素的含量＝上述所测定的β-胡萝卜素浓度C×提取所用丙酮ml数÷所用发酵液的ml数。

(3)不同Cu离子浓度对色素含量的影响结果分析

添加不同浓度的Cu离子，对菌株产色素和菌体生物量的影响如图2所示。该图说明，通过对GAL调控系统的改造，可以实现Cu离子对外源基因表达的控制，从而实现对产物产量的控制。同时，该结果也说明，过高的诱导浓度，会导致菌株表达外源基因过强，菌体生长受到抑制，反而其最终产量不一定越高。

该结果也说明：所构建的YLK-Cu-BT2菌株类胡萝卜素产量在1-100μM的Cu离子浓度范围内有良好的响应。

实施例6 Cu离子控制改造GAL调控系统基因表达的real-time PCR验证

(1)考察基因的选择

为了考察所改造的GAL调控系统基因表和所设计具有一致性，采用real-time PCR的方法对改造过后YLK-Cu-BT2菌株的的GAL80基因、GAL4基因的转录对铜离子的响应进行考察；同时，选取该菌株中的pGAL1启动子所控制的BtcrtYB和pGAL10启动子所控制得BtcrtI来验证改造过后的GAL调控系统对目标基因转录水平的影响。上述基因转录的变化以酵母中组成型表达的ACT1作为内参。

(2)Real-time PCR过程

为了获取加Cu离子和不加Cu离子的mRNA，按照实施例4的培养方法，设置不加Cu离子的对照组(0μM)和加10μM两个实验组。培养12h后各取5ml发酵液离心去上清，并用无菌水清洗1遍，采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒抽提发酵样品RNA；并采用TaKaRa PrimeScript^TM RT reagent Kit反转录试剂盒，以oligo dT为引物获得cDNA；随后以已获得的cDNA为模板，采用TTB

Premix DimerEraser^TM(Perfect RealTime)试剂盒配制qPCR体系,反应体系为总体积为10μL。其中荧光定量检测所使用的正反向引物如表5所示。

表5：

上机；利用Master Cycle Rep Realplex(Eppendorf)进行实时荧光定量。扩增程序为95℃预变性30s，95℃变性5s，55℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环，再运行溶解曲线阶段的95℃15s，60℃1min，95℃15s的分析，每个样品设3个重复，并设阴性对照。基因的相对转录水平按照2-△△^CT方法进行计算【Golay J,Passerini F,Introna M.A simple andrapid method to analyze specific mRNAs from few cells in a semi-quantitativeway using the polymerase chain reaction.[J].Pcr Methods&Applications,1991,1(2):144.】。

(3)YLK-Cu-BT2在有Cu离子和无Cu离子条件下基因表达的结果

荧光定量所计算的基因转录水平的结果如图3所示。从数值上而言，通过在培养体系中添加10μM的Cu离子，与没有加Cu的实验组相比，GAL80基因转录水平下调了大约59倍，GAL4基因转录水平上调了21倍，BtcrtYB基因转录水平上调了788倍，BtcrtI基因转录水平上调了1112倍。该结果证明：通过改造GAL调控系统后，转录激活因子GAL4和抑制蛋白GAL80的表达确实实现了受Cu离子响应。此外，由GAL4转录因子所控制的pGAL1,pGAL10等启动子的活性及所控制的基因表达也就间接受到Cu离子的调控。该结果和本发明所设计的改造模型相符合。

实施例7葡萄糖对Cu离子诱导型GAL调控系统的影响考察

由于pGAL4启动子本身的转录受到葡萄糖浓度的影响，高葡萄糖浓度下其表达会被抑制。因此，一般的研究就发明中，在采用GAL调控系统进行外源基因表达时，都需要在葡萄糖使用完毕之后才能实现基因的诱导表达。

本发明中采用了Cu离子响应的启动子替换了pGAL80和pGAL4启动子，理论上改造后的GAL调控系统不再受到葡萄糖的影响。为验证该结论，采用实施例3中的Cu离子诱导型YLK-Cu-BT2菌株和实施例4中的半乳糖诱导型的YLK-GAL-BT2菌株进行摇瓶对比实验，考察两个菌株色素积累与葡萄糖消耗之间的差异。

其中YLK-GAL-BT2菌株的培养为：从-80℃冰箱取甘油种子接种至50ml YPD培养基中，30℃250rpm活化12-16h，获得一级种子；转接0.5ml种子液到50ml YPDG培养基中(YPDG：2％葡萄糖，2％半乳糖，1％酵母粉，2％蛋白胨)。30℃250rpm发酵72h，每个浓度进行三个重复。

其中YLK-Cu-BT2菌株的培养为：从-80℃冰箱取甘油种子接种至50ml YPD培养基中，30℃250rpm活化12-16h，获得一级种子；转接0.5ml种子液到含有10μM铜离子的50mlYPD培养基中，30℃250rpm发酵72h，每个浓度进行三个重复。

上述实验组均在0h、8h、12h、16h、20h、24h、36h、48h、60h、72h进行葡萄糖浓度、菌体浓度、β-胡萝卜素含量的测定。

摇瓶测定结果如图4和图5所示，结果表明：在半乳糖诱导菌株YLK-GAL-BT2中，由于GAL调控系统中GAL4和GAL80的表达均受到原系统调控，色素的积累表现出葡萄糖抑制，只有在葡萄糖消耗完后，才开始逐渐积累色素；在Cu离子诱导菌株YLK-Cu-BT2菌株中，色素的积累和菌体生物量的积累同步，不受发酵培养基中葡萄糖浓度的影响。该结果表明，改造过后的GAL调控系统只受到Cu离子的调控，发酵体系中的葡萄糖对该系统没有太大影响。

实施例8Cu离子诱导系统上罐考察

(1)YLK-Cu-BT2补料发酵是否加Cu及Cu离子诱导时机实验的设计

YLK-Cu-BT2种子液培养：将-80℃保存的YLK-Cu-BT2甘油种子接种至50ml YPD培养基(2％葡萄糖，2％大豆蛋白胨，1％酵母浸粉)中，30℃，250rpm培养12h活化，获得一级种子；再按5％接种量转接至新的300ml/L YPD培养基中按上述条件培养9h后，获得二级种子；将所获得的全部种子液分别转接到装有30L发酵培养基发酵罐中。发酵培养基的配方为：葡萄糖30g/L，硫酸铵7g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨2g/L，玉米浆30g/L，磷酸二氢钾5g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锌1g/L，维生素B1 200mg/L，维生素B3 200mg/L，维生素B6 200mg/。

为了对比Cu离子在罐上诱导的效果，进行三组发酵测试实验。

发酵试验1：发酵过程不添加Cu离子进行诱导。在罐上葡萄糖耗完，在线监测溶氧反弹后进行葡萄糖的流加，控制体系中葡萄糖的含量不超过1g/L。发酵过程采用氨水将pH控制在5-6之间。补葡萄糖后溶氧控制在30％，溶氧与搅拌转速关联，发酵84h。

发酵试验2：在上罐接种时，往发酵罐中加入CuSO4溶液。使最终的发酵罐中Cu离子浓度在10μM的浓度。在罐上葡萄糖耗完，在线监测溶氧反弹后进行葡萄糖的流加，控制体系中葡萄糖的含量不超过1g/L。发酵过程采用氨水将pH控制在5-6之间。补葡萄糖后溶氧控制在30％，溶氧与搅拌转速关联，发酵84h。

发酵试验3：在发酵前期不添加CuSO4溶液，待发酵到30h，菌体生长到大约OD600为90-100时，往发酵罐中加入CuSO4溶液。使最终的发酵罐中Cu离子浓度在10μM的浓度。过程葡萄糖的流加策略为：在罐上葡萄糖耗完，在线监测溶氧反弹后进行葡萄糖的流加，控制体系中葡萄糖的含量不超过1g/L。发酵过程采用氨水将pH控制在5-6之间。补葡萄糖后溶氧控制在30％，溶氧与搅拌转速关联，发酵84h。

(2)Cu离子诱导对YLK-Cu-BT2产色素造成的影响

发酵过程样检测结果如表6所示。

该结果说明：

1)整个过程没有补加Cu离子的菌株，其整个过程没有产生色素。但其细胞生物量最高，达到了OD600达到了243。

2)在发酵初始就进行了Cu离子诱导的实验组，在10h左右即明显看到发酵液变红，29h达到1.13g/L，但由于诱导过早色素产生过早，产物对细胞的生长产生了抑制，最终导致生物量增长受到抑制，发酵84h后产量只有785.8mg/L。

3)在发酵中途进行诱导的实验组，前期生物量已经积累了大约100OD，再进行诱导后，beta-胡萝卜素的产量持续增加，最终产量达到3g/L。虽然生物量比不产色素组低，但是通过前期长菌体，后期诱导积累产物的策略，实现了生物量和产量的平衡，使产量达到了一个较高水平。

表6：

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 东莞市东阳光生物合成药有限公司

<120> 提高酿酒酵母代谢产物产量的方法

<130> PIDC4190287

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 963

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> BtcrtE基因核苷酸序列

<400> 1

atgttgacat cttctaaatc tattgaatct tttccaaaga atgtccagcc atacggtaag 60

cactaccaga acggattgga gccagtcggt aagtcacagg aagacatttt gttggaacca 120

ttccattatt tgtgctctaa tccaggtaag gatgtcagaa ctaagatgat tgaggctttt 180

aatgcatggt taaaagttcc aaaagacgat ttaattgtta taactagagt tattgagatg 240

ttgcattctg cttctttgtt gattgatgat gtcgaagacg actcagtctt gagaaggggt 300

gttccagctg ctcaccacat ttacggtaca ccacagacaa ttaattgtgc taattacgtt 360

tattttttgg ctttgaaaga aattgctaaa ttgaataaac caaatatgat tacaatttat 420

actgatgaat taattaactt gcatagaggt caaggtatgg aattgttttg gagagatact 480

ttaacttgtc caacagaaaa agaatttttg gacatggtta atgataagac tggtggtttg 540

ttgaggttgg cagtcaagtt gatgcaggag gcttctcagt caggtactga ctacacaggt 600

ttggtctcta aaattggtat tcattttcaa gttagagatg attatatgaa tttacagtct 660

aagaattatg ctgacaacaa gggtttctgc gaggacttga cagagggtaa gttttcattc 720

ccaattatac attctattag atcagatcca tctaacagac aattgttgaa tattttgaaa 780

caacgttctt cttctattga gttgaaacaa ttcgctttgc aattgttgga aaatacaaat 840

acttttcaat attgtagaga ttttttgaga gttttggaga aggaggctag ggaggagatt 900

aagttgttgg gtggtaatat aatgttggaa aaaattatgg atgttttatc tgttaatgaa 960

taa 963

<210> 2

<211> 1749

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> BtcrtI基因的核苷酸序列

<400> 2

atgtctgatc agaaaaaaca cattgttgtt attggtgctg gtataggagg tacagctact 60

gcagctagat tggcaagaga gggtttcaga gttactgtcg tcgaaaagaa tgatttttct 120

ggaggaagat gttcatttat tcatcatgat ggtcatagat ttgatcaagg tccttcattg 180

tatttgatgc caaaattgtt cgaggacgct ttcgctgact tggacgagag aattggtgac 240

catttagatt tgttgaggtg tgataataat tataaagttc attttgatga cggtgatgct 300

gttcaattgt cttctgattt gactaagatg aaaggagagt tggacaggat tgagggtcca 360

ttgggtttcg gtaggttctt agatttcatg aaagaaactc atgttcacta tgaacaaggt 420

acttttatag ctataaaaag aaatttcgaa acaatttggg atttgattag attacaatat 480

gtcccagaaa tatttagatt gcatttgttt ggtaaaattt atgacagagc ttcaaaatat 540

tttcagacta agaagatgag aatggctttt acatttcaaa ctatgtatat gggtatgtct 600

ccatacgacg ctcctgctgt ttattcattg ttgcaatata ctgaatttgc agagggtatt 660

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aagtatggtg cagagtttag atatcaatct ccagttgcaa aaattaatac tgttgataag 780

gataagagag ttacaggtgt cactttggag tcaggtgagg ttatagaagc tgacgctgtc 840

gtctgcaatg ctgacttggt ctacgcttac caccatttgt tgccaccatg taattggact 900

aagaaaactt tggcatctaa gaaattgact tcatcttcta tttcttttta ctggtctatg 960

tctacaaagg ttccacaatt agatgttcac aatatctttt tagcagaggc ttataaagaa 1020

tcatttgatg aaatttttaa cgacttcggt ttgccttctg aagcatcttt ctacgtcaac 1080

gtcccatcaa gaattgacga gtctgctgct ccacctaaca aggactctat tattgtctta 1140

gtcccaattg gtcatatgaa atctaaaact ggtaattctg cagaagagaa ctaccctgag 1200

ttggtcaaca gagctagaaa aatggttttg gaagttattg aaagaagatt gggtgtcaat 1260

aatttcgcaa atttaattga acacgaggaa gtcaacgacc catctgtttg gcagtctaag 1320

tttaatttgt ggagaggttc tattttaggt ttgtcacacg atgttttcca agtcttgtgg 1380

tttagaccat caactaaaga ttctactaat aggtacgata acttgttctt tgttggtgct 1440

tctactcacc caggtacagg tgttccaatt gtcttggctg gttcaaagtt aacatctgat 1500

caagtttgca aatcattcgg tcagaaccca ttaccaagga agttacaaga ctctcaaaag 1560

aaatatgctc cagaacagac aagaaaaaca gaatcacatt ggatttacta ctgcttggct 1620

tgttacttcg ttacattctt attcttttat ttcttcccaa gagatgatac tactacacca 1680

gcttctttta ttaatcaatt gttacctaac gtttttcaag gtcaaaattc aaatgatatt 1740

agaatttaa 1749

<210> 3

<211> 1827

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> BtcrtYB基因的核苷酸序列

<400> 3

atgtcaatat taacatactt ggaatttcat ttatactata cattgccagt tttggcagct 60

ttgtgctggt tattaaaacc ttttcattct cagcaagata atttgaagta taaattcttg 120

atgttgatgg ctgcatctac agcatcaatt tgggataact atattgttta tcatagagca 180

tggtggtact gcccaacttg cgttgtcgca gtcattggtt acgtcccatt ggaagaatac 240

atgtttttta ttattatgac tttgatgact gttgcttttt ctaactttgt tatgagatgg 300

catttgcata ctttctttat aagaccaaac acatcatgga agcaaacttt attggttaga 360

ttggttcctg tctcagcttt gttagctatt acttaccatg catggcattt gacattgcca 420

aataaaccat ctttctacgg ttcatgcata ttatggtacg cttgcccagt cttggcaatt 480

ttgtggttgg gtgctggtga atatatttta agaagaccag ttgcagtttt gttgtctatt 540

gtcattccat cagtttattt atgttgggct gatattgttg ctatatctgc aggtacttgg 600

catatatctt tgagaacatc aactggaaag atggttgtcc cagacttgcc tgtcgaggaa 660

tgtttgttct ttactttgat taatacagtt ttggtctttg ctacatgtgc tattgatcgt 720

gctcaagcta ttttgcattt gtacaaatct tcagttcaga accaaaaccc taaacaagct 780

atttctttgt tccaacacgt taaggagtta gcttgggcat tctgcttgcc tgaccagatg 840

ttgaacaacg aattgttcga tgatttgact atttcatggg atattttgag aaaagcatct 900

aaatcattct atacagcatc agctgttttt ccttcttatg ttagacaaga tttgggtgtc 960

ttgtacgcat tctgcagggc aactgacgat ttgtgcgacg acgagtcaaa gtctgtccaa 1020

gagaggagag accaattgga cttgactaga caatttgtca gagatttgtt ttctcaaaaa 1080

acatcagcac caattgttat tgactgggaa ttgtatcaaa accaattgcc tgcatcttgt 1140

atttcagctt ttagggcatt tactagatta agacacgttt tggaggttga tccagttgaa 1200

gaattgttgg atggttataa atgggatttg gaaagaagac caattttgga tgaacaagac 1260

ttggaggctt actcagcttg cgttgcatct tctgtcggtg agatgtgtac aagagtcatt 1320

ttagctcaag atcaaaaaga gaatgatgct tggataatag atagagcaag ggagatgggt 1380

ttggttttac aatacgtcaa tattgcaaga gatattgtta ctgactctga aactttaggt 1440

agatgttatt tgcctcaaca gtggttgagg aaggaggaga cagaacaaat tcaacaagga 1500

aacgcacgtt ctttgggtga ccagaggttg ttgggattat ctttgaagtt ggtcggtaag 1560

gctgacgcaa taatggtcag agctaaaaaa ggtattgata agttgccagc aaactgccaa 1620

ggtggtgtta gagcagcttg ccaggtttac gctgcaatag gttcagtctt gaaacaacag 1680

aaaactacat atcctactcg tgctcatttg aaaggttcag aaagagcaaa aattgcttta 1740

ttgtctgttt ataatttgta ccagtctgag gacaagccag ttgctttgag gcaggcaaga 1800

aagattaaat ctttctttgt tgattaa 1827

Claims (23)

1.一种用于酿酒酵母的GAL基因调控系统，其特征在于，pCTR3或者pCTR1与GAL80基因可操作地连接；且pCUP1与GAL4基因可操作地连接。

2.根据权利要求1所述的GAL基因调控系统，其特征在于，pCTR3与GAL80基因可操作地连接。

3.根据权利要求1所述的GAL基因调控系统，其特征在于，进一步包括预定过表达基因与pGAL1、pGAL2、pGAL7或pGAL10至少之一的可操作地连接。

4.一种酿酒酵母，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的GAL基因调控系统。

5.根据权利要求4所述的酿酒酵母，其特征在于，tHMG1基因与pGAL1可操作地连接，BtcrtE基因与pGAL10可操作地连接，BtcrtYB基因与pGAL1可操作地连接以及BtcrtI基因与pGAL10可操作地连接。

6.根据权利要求5所述的酿酒酵母，其特征在于，所述BtcrtE基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求5所述的酿酒酵母，其特征在于，所述BtcrtI基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求5所述的酿酒酵母，其特征在于，所述BtcrtYB基因具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

9.根据权利要求4所述的酿酒酵母，其特征在于，GAL1基因沉默，GAL7基因沉默以及GAL10基因沉默。

10.一种提高酿酒酵母代谢产物产量的方法，其特征在于，将携带权利要求1～3任一项所述的GAL基因调控系统的酿酒酵母进行发酵处理。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，携带所述GAL基因调控系统的酿酒酵母是通过如下方式获得的：

替换pGAL80为pCTR3或者pCTR1；

替换pGAL40为pCUP1。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，替换pGAL80为pCTR3。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，进一步包括将预定过表达基因与pGAL1、pGAL2、pGAL7和pGAL10至少之一可操作地连接。

14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述代谢产物为β-胡萝卜素，进一步包括：

tHMG1基因与pGAL1可操作地连接，BtcrtE基因与pGAL10可操作地连接，BtcrtYB基因与pGAL1可操作地连接以及BtcrtI基因与pGAL10可操作地连接；以及

沉默GAL1基因，GAL7基因以及GAL10基因。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述BtcrtE基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述BtcrtI基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

17.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述BtcrtYB基因具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

18.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述沉默GAL1基因，GAL7基因以及GAL10基因是通过敲除GAL1基因，GAL7基因以及GAL10基因实现的。

19.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母为选自BY4743，BY4742，INVSC1、HEC-YLK的至少之一，所述HEC-YLK于2018年1月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018062。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述酿酒酵母为HEC-YLK。

21.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在发酵处理过程中，将酿酒酵母与铜离子进行接触。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述铜离子在发酵体系中的浓度为1～100μM。

23.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，当发酵体系中菌体浓度OD₆₀₀为90～100时，将所述酿酒酵母与所述铜离子进行接触。

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