CN112553096B - 一种利于酿酒酵母类胡萝卜素合成的发酵培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利于酿酒酵母类胡萝卜素合成的发酵培养基。它包括酿酒酵母基础培养基和铜离子。本发明的发酵培养基显著提升了重组酿酒酵母类胡萝卜素的积累(提高10倍)。本发明利用转录组学揭示了培养基中锌离子和铜离子的添加可以显著提升类胡萝卜素合成,并且它们之间存在协同增强作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种利于酿酒酵母类胡萝卜素合成的发酵培养基。
背景技术
类胡萝卜素是一大类有颜色的物质,天然存在于植物、藻类、真菌和细菌中。这类物质具有较强的抗氧化性,对人类健康有保护作用,可以用于食品、营养品、化妆品等。当前,化学合成和天然提取是制备类胡萝卜素的主要方式。但是,由于结构的复杂性,化学合成过程比较困难;而原料供应不稳定、有机溶剂污染、得率低等导致天然提取成本较高,无法规模化生产。所以,利用微生物合成特定类胡萝卜素越来越受到人们关注。
随着代谢工程和合成生物学的快速发展,构建微生物细胞工厂合成类胡萝卜素逐渐成为一种可持续生产方式。所以,当前有众多研究集中于优化内源代谢途径、引入外源途径增加代谢流量、辅因子平衡等。在酿酒酵母中,通过过表达tHMG1基因增加MVA途径代谢流、下调ERG9基因或者过表达ALD6和ACS增加前体物质乙酰辅酶A、增加TCA或PPP途径代谢流量等众多策略用于提高类胡萝卜素的产量。但是,通过优化培养基成分来提高类胡萝卜素产量的报道并不多见。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于针对实验过程中发现的现象,提供一种利于酿酒酵母类胡萝卜素合成的发酵培养基。
在研究中我们发现,不同公司及不同批次的酵母提取物会对类胡萝卜素含量造成显著影响。为了找出这个现象背后隐藏的原因,我们进行了比较转录组分析并结合反向代谢工程,确定了培养基中铜离子起了决定性作用。
本发明的利于酿酒酵母类胡萝卜素合成的发酵培养基,包括酿酒酵母基础培养基和铜离子。
优选,所述的铜离子浓度为:40~160μM。
进一步优选,所述的铜离子浓度为:80μM。
优选,还含有锌离子,所述的锌离子浓度为40μM,铜离子浓度为40μM。
所述的酿酒酵母基础培养基为:按质量分数计,包括酵母提取物5~15g/L,蛋白胨15~25g/L,葡萄糖15~25g/L,溶剂为水。
进一步优选,所述的发酵培养基按质量分数计,包括酵母提取物5~15g/L,蛋白胨15~25g/L,葡萄糖15~25g/L,磷酸二氢钾5~15g/L,七水硫酸镁5~15g/L,硫酸钾3.0~8.0g/L,磷酸钠0.5~3g/L,TMS溶液1ml/L,溶剂为水,pH为5.0~7.0。
更进一步优选为:所述的发酵培养基按质量分数计,包括酵母提取物10g/L,蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L,磷酸二氢钾10g/L,七水硫酸镁5g/L,硫酸钾3.5g/L,磷酸钠2.5g/L,TMS溶液1ml/L,溶剂为水;
所述TMS溶液配方为:六水氯化镁250mg/L,二水氯化钙104.5mg/L,五水合硫酸铜0.4mg/L,碘化钠0.08mg/L,四水合氯化锰0.1mg/L,二水合钼酸钠0.5mg/L,硼酸1mg/L,六水合氯化钴0.3mg/L,七水硫酸锌6.25mg/L,七水合硫酸亚铁3.5mg/L,溶剂为水
本发明的第二个目的是提供上述发酵培养基在用于促进酿酒酵母发酵产类胡萝卜素中的应用。
本发明的第三个目的是提供在酿酒酵母中过表达转录因子ACE1在促进酿酒酵母产类胡萝卜素中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种促进酿酒酵母产类胡萝卜素的方法,其是将在酿酒酵母中过表达转录因子ACE1。
相对于现有技术本发明具有以下优点和有益效果之一:
(1)本发明在酿酒酵母的发酵培养基中添加铜离子或含有铜离子的酵母提取物,可以有效促进微生物细胞的生长和类胡萝卜素的积累。
(2)本发明在培养基中添加合适浓度的铜离子,可以显著增加酿酒酵母类胡萝卜素的积累,防止发酵原料的不稳定而导致发酵效果的不稳定,有效提高生产的成功率。
附图说明
图1是不同批次酵母提取物对类胡萝卜素合成的影响,(A)不同公司及不同批次酵母提取物培养基中类胡萝卜素积累情况,YPD1,含有批号为LOT:2665431-02OXIOD公司酵母提取物的YPD培养基;YPD2,含有批号为LOT:2315359-02OXIOD公司酵母提取物的YPD培养基;YPD3,含有批号为LOT:2018082210C9安琪酵母股份公司酵母提取物的YPD培养基;含安琪酵母股份公司酵母提取物的YPM培养基;YPM1,YPM2,YPM3;(B)在YPM或YPD2培养基中细胞生长情况及生产情况(三次重复)。
图2是比较转录组分析,(A)基因差异表达情况;(B)GO富集情况;(C)KEGG富集情况;(D)显著上调代谢途径。
图3是不同添加物对类胡萝卜素合成的影响(A)YPD2,含有批号为LOT:2315359-02OXIOD公司酵母提取物的YPD培养基;YPD2+salt,含有批号为LOT:2315359-02OXIOD公司酵母提取物的YPD培养基中添加salt;YPD2+Zn2+含有批号为LOT:2315359-02OXIOD公司酵母提取物的YPD培养基中添加Zn2+;YPD2+Cu2+,含有批号为LOT:2315359-02OXIOD公司酵母提取物的YPD培养基中添加Cu2+;YPD2+TMS,含有批号为LOT:2315359-02OXIOD公司酵母提取物的YPD培养基中添加TMS;YPD2+Cu2++Zn2+,含有批号为LOT:2315359-02OXIOD公司酵母提取物的YPD培养基中添加Zn2+和Cu2+;在YPD2培养基中分别添加0.04mM,0.8mM,0.16mM的铜离子,对应图中的0.04mM、0.8mM、1.6mM。不同酵母提取物中铜离子浓度含量测定(B)YPD1,含有批号为LOT:2665431-02OXIOD公司酵母提取物的YPD培养基;YPD2,含有批号为LOT:2315359-02OXIOD公司酵母提取物的YPD培养基;YPD3,含有批号为LOT:2018082210C9安琪酵母股份公司酵母提取物的YPD培养基;含不同铜离子浓度YPD2条件下细胞生长曲线(C)。
图4是反向代谢工程改造,BL03-D-4是酿酒酵母BL03,Cit1-tHMG1,ΔAld6菌株;MO1是敲除ADY2;MO2是过表达HES1;MO3是过表达ACE1。
具体实施方式
本发明公开了一种利于类胡萝卜素积累的酿酒酵母的发酵培养基。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明,下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明,本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品,均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1不同批次酵母提取物对类胡萝卜素合成的影响
本实施例的酿酒酵母发酵培养基为:YPD培养基:酵母提取物10g/L(OXOID公司或安琪酵母股份有限公司),蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L,溶剂为水,其配制方法是将各成分按其含量混合均匀,灭菌备用;或YPM培养基:酵母提取物10g/L(安琪酵母股份有限公司),蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L,salt(磷酸二氢钾10g/L,七水硫酸镁5g/L,硫酸钾3.5g/L,磷酸钠2.5g/L),TMS溶液1ml/L,溶剂为水,其配制方法是将各成分按其含量混合均匀,灭菌备用。
所述TMS溶液配方为:六水氯化镁250mg/L,二水氯化钙104.5mg/L,五水合硫酸铜0.4mg/L,碘化钠0.08mg/L,四水合氯化锰0.1mg/L,二水合钼酸钠0.5mg/L,硼酸1mg/L,六水合氯化钴0.3mg/L,七水硫酸锌6.25mg/L,七水合硫酸亚铁3.5mg/L,溶剂为水,其配制方法是将各成分按其含量混合均匀,灭菌备用。
在长期的实验过程中,我们发现使用不同批次的酵母提取物,类胡萝卜素的含量会出现波动情况,导致实验结果的不稳定。为了弄清楚这里面的原因,我们首先对不同批次酵母提取物类胡萝卜素含量进行表征。
将酿酒酵母(申请号为:2019103999462中酿酒酵母BL03,Cit1-tHMG1,ΔAld6菌株)将菌株划线于新鲜YPD固体培养基中,48小时后,挑取单菌落接种于5ml YPD液体培养基中,过夜培养后,按体积比2%接种量分别接种到50ml上述不同的YPD和YPM液体培养基中。于30℃,200rpm条件下培养96小时。培养结束,按标准的测定方法,分别测定各培养条件下类胡萝卜素含量和生长曲线。
从图1可以看出,不同公司的酵母提取物对类胡萝卜素积累有显著影响,并且不同批次OXOID公司的酵母提取物同样会有显著影响。其中安琪酵母公司来源的酵母提取物不仅可以促进类胡萝卜素的积累,还可以促进细胞生长,最后含量可以达到18.8mg/g细胞干重。是其它批次含量的10倍(1.85mg/g)。此结果揭示了,在安琪酵母公司的酵母提取物中含有某种物质可以促进类胡萝卜素的积累。
实施例2比较转录组揭示潜在机制
为了搞清楚培养基中何种物质促进了类胡萝卜素积累,我们将含有安琪酵母公司的酵母提取物培养条件和普通YPD2培养条件下的酿酒酵母菌株进行转录组测序,进行比较转录组分析。从图2可以看出,总计有464个基因发生了显著变化(大于2倍),其中203个基因显著上调,261基因显著下调。KEGG和GO富集分析发现,乙醛酸途径、糖酵解途径、类固醇合成途径、脂肪酸降解途径和磷酸戊糖途径显著上调,特别是麦角固醇合成途径中的大部分基因都显著上调。其中,HES1基因上调了11倍,ADY2基因下调了8倍,CUP1-2基因上调94倍,这些显著变化的基因有可能与类胡萝卜素积累有关。
实施例3铜离子对类胡萝卜素合成的影响
本实施例YPD2液体培养基为:酵母提取物10g/L,蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L,溶剂为水,pH为5.0~7.0,其配制方法是将各成分按其含量混合均匀,调pH值,灭菌备用。其中酵母提取物有来至OXOID公司,LOT:2315359-02。YPD2固体培养基是在YPD2液体培养基中加入琼脂。
从比较转录组获得启示,安琪酵母公司的酵母提取物对类胡萝卜素积累的促进作用可能与锌离子和铜离子有关。所以我们尝试在培养基中添加多种营养成分,考察其对类胡萝卜素合成的影响。
将酿酒酵母BL03,Cit1-tHMG1,ΔAld6菌株划线于新鲜YPD2固体培养基(其中酵母提取物有来至OXOID公司)中,48小时后,挑取单菌落接种于5ml YPD2液体培养基中,过夜培养后,按体积比2%接种量分别接种到50ml含有salt(磷酸二氢钾10g/L,七水硫酸镁5g/L,硫酸钾3.5g/L,磷酸钠2.5g/L)-对应图3A中的YPD2+Salt,TMS(六水氯化镁250mg/L,二水氯化钙104.5mg/L,五水合硫酸铜0.4mg/L,碘化钠0.08mg/L,四水合氯化锰0.1mg/L,二水合钼酸钠0.5mg/L,硼酸1mg/L,六水合氯化钴0.3mg/L,七水硫酸锌6.25mg/L,七水合硫酸亚铁3.5mg/L)-对应图3A中的YPD2+TMS,Zn2+(80μM)-对应图3A中的YPD2+Zn2+,Cu2+(80μM)-对应图3A中的YPD2+Cu2+,Zn2+(40μM)+Cu2+(40μM)-对应图3A中的YPD2+Cu2+Zn2+,Cu2+(0.04M)-对应图3A中的0.04mM,Cu2+(0.8M)-对应图3A中的0.08mM,Cu2+(1.6mM)-对应图3A中的1.6mM等不同成分的YPD2液体培养基中。于30℃,200rpm条件下培养96小时。培养结束,按标准的测定方法,分别测定各培养条件下类胡萝卜素含量和生长曲线。
从图3可以看出,80μM锌离子和80μM铜离子的添加都可以促进类胡萝卜素合成,其中铜离子起主导作用。锌离子和铜离子同时添加有协同作用,可以达到YPM培养基的效果,最高产量可以达到19.8mg/g细胞干重(图3A)。我们还发现铜离子浓度对类胡萝卜素积累也有影响,浓度高于160μM会对细胞造成抑制作用,浓度低于40μM促进作用有限(图3A)。
随后,我们对出发菌株进行反向代谢工程研究,参考文献(Chen,Y.;Xiao,W.;Wang,Y.;Liu,H.;Li,X.;Yuan,Y.,Lycopene overproduction in Saccharomycescerevisiae through combining pathway engineering with host engineering.MicrobCell Fact.2016,15,(1),113.)一步法基因失活方法,利用组氨基酸(HIS3)缺陷对ADY2(Gene ID:850368)基因进行敲除,对HES1(Gene ID:854412)和ACE1(Gene ID:852710)基因进行过表达,获得ADY2基因敲除的突变菌株MO1;HES1基因过表达的突变菌株MO2;ACE1基因过表达的突变菌株MO3。发现ADY2基因敲除和HES1基因过表达对类胡萝卜素积累无促进作用,而与铜离子有关的转录因子ACE1的过表达,可以使类胡萝卜素含量提高6.4倍到11.9mg/g细胞干重(图4)。
本发明使用菌株和质粒
本发明所使用引物
Claims (8)
1.利于酿酒酵母类胡萝卜素合成的发酵培养基在用于促进酿酒酵母发酵产类胡萝卜素中的应用,所述的利于酿酒酵母类胡萝卜素合成的发酵培养基,包括酿酒酵母基础培养基和铜离子,所述的铜离子浓度为:40~160μM,所述的酿酒酵母是酿酒酵母BL03,Cit1-tHMG1,ΔAld6。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的铜离子浓度为:80μM。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,还含有锌离子,所述的锌离子浓度为40μM,铜离子浓度为40μM。
4. 根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的酿酒酵母基础培养基为:按质量分数计,由酵母提取物5~15 g/L,蛋白胨15~25 g/L,葡萄糖15~25 g/L和水组成。
5. 根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的酿酒酵母基础培养基按质量分数计,由酵母提取物5~15 g/L,蛋白胨15~25 g/L,葡萄糖15~25 g/L,磷酸二氢钾5~15 g/L,七水硫酸镁5~15 g/L,硫酸钾3.0~8.0 g/L,磷酸钠0.5~3 g/L,TMS溶液1 ml/L和水组成,pH为5.0~7.0。
6. 根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述的酿酒酵母基础培养基按质量分数计,由酵母提取物10 g/L,蛋白胨20 g/L,葡萄糖20 g/L,磷酸二氢钾10 g/L,七水硫酸镁5g/L,硫酸钾3.5 g/L,磷酸钠2.5 g/L,TMS溶液1 ml/L和水组成;
所述TMS溶液的组成为:六水氯化镁250 mg/L,二水氯化钙104.5 mg/L,五水合硫酸铜0.4 mg/L,碘化钠0.08 mg/L,四水合氯化锰0.1mg/L,二水合钼酸钠0.5 mg/L,硼酸1 mg/L,六水合氯化钴0.3 mg/L,七水硫酸锌6.25 mg/L,七水合硫酸亚铁3.5 mg/L,水。
7. 在酿酒酵母中过表达转录因子ACE1在促进酿酒酵母产类胡萝卜素中的应用,所述的酿酒酵母是酿酒酵母BL03,Cit1- tHMG1,ΔAld6。
8. 一种促进酿酒酵母产类胡萝卜素的方法,其特征在于,是将在酿酒酵母中过表达转录因子ACE1,所述的酿酒酵母是酿酒酵母BL03,Cit1- tHMG1,ΔAld6。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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CB02 | Change of applicant information |
Address after: 510070 No.56 courtyard, No.100 Xianlie Middle Road, Yuexiu District, Guangzhou City, Guangdong Province Applicant after: Institute of Microbiology, Guangdong Academy of Sciences Address before: 510070 No.56 courtyard, No.100 Xianlie Middle Road, Yuexiu District, Guangzhou City, Guangdong Province Applicant before: GUANGDONG INSTITUTE OF MICROBIOLOGY (GUANGDONG DETECTION CENTER OF MICROBIOLOGY) |
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CB02 | Change of applicant information | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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