CN110144300B - 一种重组酵母菌株及其在类胡萝卜素合成中的应用 - Google Patents

一种重组酵母菌株及其在类胡萝卜素合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组酵母菌及其在类胡萝卜素合成中的应用。所述的重组酵母菌为过表达限速步骤动态调控tHMG1基因的BL03菌株，所述的tHMG1基因置于生长偶联动态调控元件Cit1启动子之下。该重组酵母菌基因组中的Ald6基因被敲除，竞争性代谢途径ACC1启动子被生长偶联动态调控元件PDC1启动子替换，并以不同形式过表达eutE和AtoB基因，具体的，所述的eutE和AtoB基因以单独过表达、同时过表达、同一位点整合表达、以SUMO或2A肽连接融合表达，或直接融合表达的方式整合于重组酵母菌基因组上。本发明的重组酵母菌可应用于类胡萝卜素的合成。

Description

一种重组酵母菌株及其在类胡萝卜素合成中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组酵母菌株及其在类胡萝卜素合成中的应用。
背景技术
酿酒酵母作为公认安全微生物(GRAS)，在工业生产中已得到广泛的应用。作为模式真核系统，酿酒酵母拥有众多基因操作工具，代谢工程改造方便快捷；并且酿酒酵母对严苛的工业生产条件表现出高度的耐受性。所以，酿酒酵母常常是进行生物合成的首选宿主。在酿酒酵母细胞中，乙酰辅酶A是众多化合物合成的前体物质，但酿酒酵母细胞内乙酰辅酶A含量较低，限制了目标产物的合成。
目前，改造丙酮酸脱氢酶(PDH)旁路是常常被采用的策略，主要包括过表达乙醛脱氢酶基因(Ald6)和乙酰辅酶A合成酶(ACS)，但这个途径需要消耗ATP。为了避开这个途径，有研究敲除Ald6和ACS，进而过表达醇脱氢酶eutE，用来进行乙酰辅酶A的合成，但此举只能替代PDH旁路，并没有促进产物合成，并且细胞生长还受到影响；此步反应需要COA参与，COA可能成为限速因子。所以，合理构建代谢系统，对平衡细胞生长和产物积累具有重要的意义，对实际生产也有具有巨大的经济价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种重组酵母菌，所述的重组酵母菌为过表达限速步骤动态调控tHMG1基因的BL03菌株，所述的tHMG1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的BL03菌株表达番茄红素合成基因crtE、crtB和crtI，所述的crtE、crtB和crtI基因均置于生长偶联动态调控元件HSP26启动子之下，并以串联的形式整合于酿酒酵母基因组上，BL03菌株构建的详细步骤已公开于本申请人前期申报的专利申请号为2019102678661的中国发明专利文献中。
优选，所述的tHMG1基因置于生长偶联动态调控元件Cit1启动子之下。
优选，所述的重组酵母菌中BL03菌株基因组中的Ald6基因被敲除。
优选，所述的重组酵母菌表达eutE和AtoB基因，并以不同的联合形式整合于BL03菌株基因组上，所述的eutE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的AtoB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
具体的，所述的eutE和AtoB基因以单独过表达、同时过表达、同一位点整合表达、以SUMO或2A肽连接融合表达，或直接融合表达的方式整合于BL03菌株基因组上。
更优选，所述的eutE和AtoB基因以2A肽连接融合表达的方式整合于BL03菌株基因组上的效果最好。
优选，所述的重组酵母菌中BL03菌株基因组的竞争性代谢途径ACC1启动子被生长偶联动态调控元件PDC1启动子替换。
本发明的第二个目的是提供上述的重组酵母菌在类胡萝卜素合成中的应用。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)本发明构建的eutE和AtoB途径，相较于细胞内源的PDH旁路途径，不需要ATP，两个酶之间形成了COA的循环系统，更利于反应的进行。
(2)本发明采用的生长偶联调控元件在关键基因(合成基因、限速步骤、竞争性途径)的调控中发挥着重要作用，既保证了必要的高表达，又防止代谢途径过早的进入目标代谢途径；在保证生长必需的同时使更多代谢流进入目标代谢途径。
(3)本发明利用生长偶联调控元件构建了乙酰辅酶A竞争性途径ACC1动态调控系统，该调控系统只对细胞生长状态产生响应，只有达到对数期后期，基因才进入表达高峰期，既保证了细胞的生长需要，有使代谢流更多的进入MVA途径。并且本系统不需要诱导剂，不需要进行参数调节(如葡萄糖浓度、温度等)，操作简便，易于控制，不会增加额外成本。
附图说明
图1为BL03菌株在过表达Cit1p-tHMG1和BL03,Cit1p-tHMG1菌株在ALD6基因敲除情况下表达番茄红素的含量。
图2为BL03，Cit1p-tHMG1，ΔALD6菌株以不同形式过表达eutE和AtoB基因情况下表达番茄红素的含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。除非特别说明，下面实施例中所用的技术均为本领域内的技术人员已知的常规技术，所使用的仪器设备和试剂等，均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。
对于本发明构建重组酵母菌株中所采用的各基因元件，如启动子，内源基因、外源基因等均为本领域公知，本领域技术人员知晓其具体序列。
实施例1 MVA途径限速步骤的动态调控
酿酒酵母的HMG1基因被认为是整个MVA途径的限速步骤，因为HMG1基因前面有一段跨膜区域，受到严格的代谢调控。为了克服这一问题，本发明过表达去除调控区域的HMG1基因(tHMG1)。所述的tHMG1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。为了获得较好的调控模式，本发明选择Cit1启动子。
具体的，以专利申请号为2019102678661的中国发明专利构建好的pHcas9-gRNA质粒为模板，使用引物pHCas9-gRNA-DOWN-416d-F/pHCas9-gRNA-DOWN-R构建416d位点的基因组整合质粒；以酿酒酵母基因组(BL03菌株基因组)为模板使用引物Cit1p180109-F/Cit1p180109-R、tHMG1180118-F/tHMG1180118-R分别扩增Cit1和tHMG1，重叠PCR连接构建模块，最后以Cit1p180109-F-2/tHMG1180118-R-2引物扩增添加同源臂，获得Cit1p-tHMG1-T片段。使用引物416dcheck-F/416dcheck-R对416d位点进行鉴定。
所用引物如下：
Figure BDA0002059429620000041
按标准的番茄红素测定方法，对上述BL03菌株在Cit1p-tHMG1下表达番茄红素的含量进行测定，结果见图1所示。由图1可知，BL03菌株在Cit1p-tHMG1下表达番茄红素的含量为8.65mg/g CDW，高于未改造前的BL03菌株表达番茄红素的含量1.27mg/g CDW(已公开于申请号为2019102678661的专利中)。
以BL03菌株为基础，过表达限速步骤动态调控tHMG1基因，并将所述的tHMG1基因置于生长偶联动态调控元件Cit1启动子之下，获得BL03，Cit1-tHMG1菌株。
实施例2 Ald6基因的敲除
Ald6基因是负责乙酸合成的基因，其敲除会导致乙酸含量的减少，对萜类物质合成有益。本发明敲除Ald6考察其对番茄红素合成的影响。
具体的，使用引物pHCas9-gRNA-DOWN-Ald6-F/pHCas9-gRNA-DOWN-R构建Ald6位点的gRNA质粒；使用引物Ald6-UP-P11211-F/Ald6-UP-P21211-R扩增Ald6上游同源臂，使用引物Ald6-DOWN-P11211-F/Ald6-DOWN-P21211-R扩增Ald6下游同源臂，重叠PCR将上、下游同源臂连接构建Ald6敲除模块，将Ald6敲除片段与Ald6位点的gRNA质粒一同导入BL03，Cit1-tHMG1菌株，即可完成Ald6基因敲除。使用Ald6敲除鉴定引物Ald6-delete-check-F/Ald6-delete-check-R对Ald6基因敲除进行鉴定。
所用引物如下：
Figure BDA0002059429620000051
Figure BDA0002059429620000061
按标准的番茄红素测定方法，对上述BL03，Cit1-tHMG1菌株在Ald6敲除情况下表达番茄红素的含量进行测定，结果见图1。由图1可知，敲除Ald6可促进BL03,Cit1-tHMG1菌株表达番茄红素。
以实施例2获得BL03，Cit1-tHMG1菌株为基础，敲除Ald6基因，获得BL03，Cit1-tHMG1，ΔAld6菌株。
实施例3构建COA循环系统增加乙酰辅酶A的供应
为了避开酿酒酵母内源PDH旁路途径，并且使COA能够循环利用，本发明提供一种利用eutE和AtoB构建循环系统的方法，并对其耦合方式进行了筛选。
具体的，使用引物pHCas9-gRNA-DOWN-106-F/pHCas9-gRNA-DOWN-R构建106位点的gRNA质粒；使用引物pHCas9-gRNA-DOWN-911-F/pHCas9-gRNA-DOWN-R构建911位点的gRNA质粒；使用引物分别扩增获得HSP104p-eutE-T，EFT1-AtoB-T，HSP104p-eutE-T-EFT1-AtoB-T，HSP104p-eutE-T-EFT1-Erg10-T，HSP104p-eutE-T-EFT1-SH3-AtoB-T，HSP104p-eutE-T-EFT1-SH3-Erg10-T，HSP104p-eutE-SUMO-AtoB-T，HSP104p-eutE-2A-AtoB-T，HSP104p-eutE-R-AtoB-T，HSP104p-eutE-2A-T片段。
分别为：1)使用引物106UP0621-F/106UP0621-R、106DOWN0621-F/106DOWN0621-R分别扩增106位点的上下游片段；使用引物HSP104-180621-F/HSP104-180621-R、eutE180621-F/eutE180621-R分别扩增HSP104和eutE，重叠PCR连接构建模块，最后以HSP104-180621-F/eutE-106-180621-2-R引物扩增添加同源臂，获得HSP104p-eutE-T片段，将106位点的上游片段、HSP104p-eutE-T片段、106位点的下游片段顺次通过重叠PCR拼接，获得在106位点表达的HSP104p-eutE-T片段。
2)使用引物911UP0621-F/911UP0621-R、911DOWN0621-F/911DOWN0621-R分别扩增911位点的上下游片段；使用引物EFT118706-F/EFT1-180621-R、AtoB20180621-F/AtoB20180621-R分别扩增EFT1和AtoB，重叠PCR连接构建模块，最后以EFT118706-F/AtoB20180706-2-R引物扩增添加同源臂，获得EFT1-AtoB-T片段，将911位点的上游片段、EFT1-AtoB-T片段、911位点的下游片段顺次通过重叠PCR拼接，获得在911位点表达的EFT1-AtoB-T片段。
3)使用引物106UP0621-F/106UP0621-R、106DOWN0621-F/106DOWN0621-R分别扩增106位点的上下游片段；使用引物HSP104-180621-F/HSP104-180621-R、eutE180621-F/eutE180621-R分别扩增HSP104和eutE，重叠PCR连接构建模块，最后以HSP104-180621-F/eutE-106-180621-2-R引物扩增添加同源臂，获得HSP104p-eutE-T片段，使用引物EFT1-180621-F/EFT1-180621-R、AtoB20180621-F/AtoB20180621-R、Erg1020180621-F/Erg1020180621-R分别扩增EFT1、AtoB和Erg10，重叠PCR连接构建模块，最后以EFT1-180621-F/AtoB20180621-2-R引物扩增添加同源臂，获得EFT1-AtoB(Erg10)-T片段，将106位点的上游片段、HSP104p-eutE-T片段、EFT1-AtoB(Erg10)-T片段、106位点的下游片段顺次通过重叠PCR拼接，获得在106位点表达的HSP104p-eutE-T-EFT1-AtoB(Erg10)-T片段。
4)使用引物106UP0621-F/106UP0621-R、106DOWN0621-F/106DOWN0621-R分别扩增106位点的上下游片段；使用引物HSP104-180621-F/HSP104-180621-R、eutE180621-F/eutE180805-R/eutE180805-2-R/eutE180805-3-R分别扩增HSP104和eutE(3轮扩增添加SH3Ligant)，重叠PCR连接构建模块，最后以HSP104-180621-F/eutE-106-180621-2-R引物扩增添加同源臂，获得HSP104p-eutE-T片段，使用引物EFT1-180621-F/EFT1-180805-R/EFT1-180805-2-R/EFT1-180805-3-R/EFT1-180805-4-R/EFT1-180805-5-R/EFT1-180805-6-R/EFT1-180805-7-R(7轮扩增添加SH序列)、AtoB20180805-F/AtoB20180621-R、Erg1020180805-F/Erg1020180805-R分别扩增EFT1、AtoB和Erg10，重叠PCR连接构建模块，最后以EFT1-180621-F/AtoB20180621-2-R引物扩增添加同源臂，获得EFT1-SH3-AtoB(Erg10)-T片段，将106位点的上游片段、HSP104p-eutE-T片段、EFT1-SH3-AtoB(Erg10)-T片段、106位点的下游片段顺次通过重叠PCR拼接，获得在106位点表达的HSP104p-eutE-T-EFT1-SH3-AtoB(Erg10)-T片段。
5)使用引物106UP-HSP104-eutE-F/106UP-HSP104-eutE-sumo-R扩增含106位点上游片段的HSP104p-eutE片段，使用引物sumo-F/sumo-R扩增sumo片段，重叠PCR连接构建模块，最后以sumo-F/106UP-HSP104-eutE-sumo-R引物扩增添加同源臂，获得HSP104p-eutE-SUMO片段。使用引物AtoB-106DOWN-F/AtoB-106DOWN-R扩增含106位点下游片段的AtoB-T片段，将HSP104p-eutE-SUMO片段、AtoB-T片段顺次通过重叠PCR拼接，获得在106位点表达的HSP104p-eutE-SUMO-AtoB-T片段。
6)使用引物106UP-HSP104-eutE-F/106UP-HSP104-eutE-2A-R扩增含106位点上游片段的HSP104p-eutE片段，使用引物AtoB-106DOWN-2A-F/AtoB-106DOWN-R扩增含106位点下游片段的AtoB-T片段，重叠PCR连接构建模块，使用引物AtoB-106DOWN-2A-2-F/106UP-HSP104-eutE-2A-R扩增，获得在106位点表达的HSP104p-eutE-2A-AtoB-T片段。
7)使用引物106UP-HSP104-eutE-F/106UP-HSP104-eutE-sumo-R扩增含106位点上游片段的HSP104p-eutE-R片段，使用引物AtoB-R-106DOWN-F/AtoB-106DOWN-R扩增含106位点下游片段的AtoB-T片段，将HSP104p-eutE-R片段、AtoB-T片段顺次通过重叠PCR拼接，获得在106位点表达的HSP104p-eutE-R-AtoB-T片段。
8)使用引物106UP0621-F/106UP0621-R、106DOWN-2A-F/106DOWN-2A-2-F/106DOWN0218-R分别扩增106位点的上下游片段；使用引物HSP104-180621-F/HSP104-180621-R、eutE-Tguo-F/eutE-2A-R分别扩增HSP104和eutE，重叠PCR连接构建模块，最后以HSP104-180621-F/eutE-106-180621-2-R引物扩增添加同源臂，获得HSP104p-eutE-2A片段，
利用上述扩增的片段和构建的质粒对BL03，Cit1-tHMG1，ΔAld6菌株进行改造，具体为：1)将HSP104p-eutE-T片段、106a位点的gRNA质粒一同导入BL03，Cit1-tHMG1，ΔAld6菌株，构建eutE基因单独过表达的BL03-E-1菌株。
2)将EFT1-AtoB-T片段、911b位点的gRNA质粒一同导入BL03，Cit1-tHMG1，ΔAld6菌株，构建AtoB基因单独过表达的BL03-E-2菌株。
3)将HSP104p-eutE-T片段、EFT1-AtoB-T片段、106a位点的gRNA质粒、911b位点的gRNA质粒一同导入BL03，Cit1-tHMG1，ΔAld6菌株，构建eutE、AtoB基因同时过表达的BL03-E-3菌株。
4)将HSP104p-eutE-T-EFT1-AtoB-T片段，106a位点的gRNA质粒一同导入BL03，Cit1-tHMG1，ΔAld6菌株，构建eutE、AtoB基因在106a同一位点整合表达的BL03-E-4菌株。
5)将HSP104p-eutE-T-EFT1-Erg10-T片段，106a位点的gRNA质粒一同导入BL03，Cit1-tHMG1，ΔAld6菌株，构建eutE、Erg10基因在106a同一位点整合表达的BL03-E-5菌株。
6)将HSP104p-eutE-T-EFT1-SH3-AtoB-T片段，106a位点的gRNA质粒一同导入BL03，Cit1-tHMG1，ΔAld6菌株，构建eutE、AtoB基因以SH3肽连接融合表达的BL03-E-6菌株。
7)将HSP104p-eutE-T-EFT1-SH3-Erg10-T片段，106a位点的gRNA质粒一同导入BL03，Cit1-tHMG1，ΔAld6菌株，构建eutE、Erg10基因以SH3肽连接融合表达的BL03-E-7菌株。
8)将HSP104p-eutE-SUMO-AtoB-T片段，106a位点的gRNA质粒一同导入BL03，Cit1-tHMG1，ΔAld6菌株，构建eutE、AtoB基因以SUMO肽连接融合表达的BL03-E-8菌株。
9)将HSP104p-eutE-R-AtoB-T片段，106a位点的gRNA质粒一同导入BL03，Cit1-tHMG1，ΔAld6菌株，构建eutE、AtoB基因直接融合表达的BL03-E-9菌株。
10)将HSP104p-eutE-2A-AtoB-T片段，106a位点的gRNA质粒一同导入BL03，Cit1-tHMG1，ΔAld6菌株，构建eutE、AtoB基因以2A肽连接融合表达的BL03-E-10菌株。
11)将HSP104p-eutE-2A-T片段，106a位点的gRNA质粒一同导入BL03，Cit1-tHMG1，ΔAld6菌株，构建含有2A肽eutE基因单独表达的BL03-E-11菌株。
使用鉴定引物106-check-F/106-check-R，911-check-F/911-check-R对各菌株进行鉴定。
所用引物如下：
Figure BDA0002059429620000101
Figure BDA0002059429620000111
Figure BDA0002059429620000121
Figure BDA0002059429620000131
Figure BDA0002059429620000141
Figure BDA0002059429620000151
按标准的番茄红素测定方法，对上述BL03，Cit1-tHMG1，ΔAld6菌株在eutE和AtoB基因以不同形式表达情况下表达番茄红素的含量进行测定，结果见图2。由图2可知，以2A肽连接eutE和AtoB基因促进BL03，Cit1-tHMG1，ΔAld6菌株表达番茄红素效果最好(BL03-E-10菌株)。
实施例4竞争性代谢途径ACC1的动态调控
ACC1基因是催化脂肪酸合成的关键基因，与MVA途径竞争乙酰辅酶A，但由于其是脂肪酸合成的必需基因，对细胞生长至关重要。ACC1基因敲除会导致细胞死亡，而始终使其低表达，会导致菌株生长缓慢，本发明提供一种方法，利用动态下调元件PDC1控制ACC1基因，使其在对数期处于较高表达，满足细胞生长，进入稳定期，转录处于低表达，使代谢流更多进入MVA途径。
具体的，使用引物pHCas9-gRNA-DOWN-ACC1-F/pHCas9-gRNA-DOWN–R构建ACC1位点的gRNA质粒。使用引物ACC1-UP-F/ACC1-UP-R、PDC1180716-F/PDC1180716-R、ACC1-DOWN-F/ACC1-DOWN-R分别扩增ACC1上游同源臂、PDC1启动子和ACC1下游同源臂，重叠PCR构建置换模块，将模块和ACC1位点的gRNA质粒一同导入BL03,Cit1-tHMG1,ΔAld6菌株即可完成ACC1→PDC1启动子替换。使用引物ACC1p-check-F/ACC1p-check-R对ACC1位点进行鉴定。
所用引物如下：
Figure BDA0002059429620000161
Figure BDA0002059429620000171
按标准的番茄红素测定方法，对上述BL03,Cit1-tHMG1,ΔAld6菌株在ACC1→PDC1p启动子替换情况下表达番茄红素的含量进行测定，结果显示ACC1启动子被PDC1启动子替换，明显促进BL03,Cit1-tHMG1,ΔAld6菌株表达番茄红素，提高2.5倍。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)
<120> 一种重组酵母菌株及其在类胡萝卜素合成中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1584
<212> DNA
<213> 基因(tHMG1)
<400> 1
atgactgcag accaattggt gaaaactgaa gtcaccaaga agtcttttac tgctcctgta 60
caaaaggctt ctacaccagt tttaaccaat aaaacagtca tttctggatc gaaagtcaaa 120
agtttatcat ctgcgcaatc gagctcatca ggaccttcat catctagtga ggaagatgat 180
tcccgcgata ttgaaagctt ggataagaaa atacgtcctt tagaagaatt agaagcatta 240
ttaagtagtg gaaatacaaa acaattgaag aacaaagagg tcgctgcctt ggttattcac 300
ggtaagttac ctttgtacgc tttggagaaa aaattaggtg atactacgag agcggttgcg 360
gtacgtagga aggctctttc aattttggca gaagctcctg tattagcatc tgatcgttta 420
ccatataaaa attatgacta cgaccgcgta tttggcgctt gttgtgaaaa tgttataggt 480
tacatgcctt tgcccgttgg tgttataggc cccttggtta tcgatggtac atcttatcat 540
ataccaatgg caactacaga gggttgtttg gtagcttctg ccatgcgtgg ctgtaaggca 600
atcaatgctg gcggtggtgc aacaactgtt ttaactaagg atggtatgac aagaggccca 660
gtagtccgtt tcccaacttt gaaaagatct ggtgcctgta agatatggtt agactcagaa 720
gagggacaaa acgcaattaa aaaagctttt aactctacat caagatttgc acgtctgcaa 780
catattcaaa cttgtctagc aggagattta ctcttcatga gatttagaac aactactggt 840
gacgcaatgg gtatgaatat gatttctaaa ggtgtcgaat actcattaaa gcaaatggta 900
gaagagtatg gctgggaaga tatggaggtt gtctccgttt ctggtaacta ctgtaccgac 960
aaaaaaccag ctgccatcaa ctggatcgaa ggtcgtggta agagtgtcgt cgcagaagct 1020
actattcctg gtgatgttgt cagaaaagtg ttaaaaagtg atgtttccgc attggttgag 1080
ttgaacattg ctaagaattt ggttggatct gcaatggctg ggtctgttgg tggatttaac 1140
gcacatgcag ctaatttagt gacagctgtt ttcttggcat taggacaaga tcctgcacaa 1200
aatgttgaaa gttccaactg tataacattg atgaaagaag tggacggtga tttgagaatt 1260
tccgtatcca tgccatccat cgaagtaggt accatcggtg gtggtactgt tctagaacca 1320
caaggtgcca tgttggactt attaggtgta agaggcccgc atgctaccgc tcctggtacc 1380
aacgcacgtc aattagcaag aatagttgcc tgtgccgtct tggcaggtga attatcctta 1440
tgtgctgccc tagcagccgg ccatttggtt caaagtcata tgacccacaa caggaaacct 1500
gctgaaccaa caaaacctaa caatttggac gccactgata taaatcgttt gaaagatggg 1560
tccgtcacct gcattaaatc ctaa 1584
<210> 2
<211> 1404
<212> DNA
<213> 基因(eutE)
<400> 2
atgaatcaac aggatattga acaggtggtg aaagcggtac tgctgaaaat gcaaagcagt 60
gacacgccgt ccgccgccgt tcatgagatg ggcgttttcg cgtccctgga tgacgccgtt 120
gcggcagcca aagtcgccca gcaagggtta aaaagcgtgg caatgcgcca gttagccatt 180
gctgccattc gtgaagcagg cgaaaaacac gccagagatt tagcggaact tgccgtcagt 240
gaaaccggca tggggcgcgt tgaagataaa tttgcaaaaa acgtcgctca ggcgcgcggc 300
acaccaggcg ttgagtgcct ctctccgcaa gtgctgactg gcgacaacgg cctgacccta 360
attgaaaacg caccctgggg cgtggtggct tcggtgacgc cttccactaa cccggcggca 420
accgtaatta acaacgccat cagcctgatt gccgcgggca acagcgtcat ttttgccccg 480
catccggcgg cgaaaaaagt ctcccagcgg gcgattacgc tgctcaacca ggcgattgtt 540
gccgcaggtg ggccggaaaa cttactggtt actgtggcaa atccggatat cgaaaccgcg 600
caacgcttgt tcaagtttcc gggtatcggc ctgctggtgg taaccggcgg cgaagcggta 660
gtagaagcgg cgcgtaaaca caccaataaa cgtctgattg ccgcaggcgc tggcaacccg 720
ccggtagtgg tggatgaaac cgccgacctc gcccgtgccg ctcagtccat cgtcaaaggc 780
gcttctttcg ataacaacat catttgtgcc gacgaaaagg tactgattgt tgttgatagc 840
gtagccgatg aactgatgcg tctgatggaa ggccagcacg cggtgaaact gaccgcagaa 900
caggcgcagc agctgcaacc ggtgttgctg aaaaatatcg acgagcgcgg aaaaggcacc 960
gtcagccgtg actgggttgg tcgcgacgca ggcaaaatcg cggcggcaat cggccttaaa 1020
gttccgcaag aaacgcgcct gctgtttgtg gaaaccaccg cagaacatcc gtttgccgtg 1080
actgaactga tgatgccggt gttgcccgtc gtgcgcgtcg ccaacgtggc ggatgccatt 1140
gcgctagcgg tgaaactgga aggcggttgc caccacacgg cggcaatgca ctcgcgcaac 1200
atcgaaaaca tgaaccagat ggcgaatgct attgatacca gcattttcgt taagaacgga 1260
ccgtgcattg ccgggctggg gctgggcggg gaaggctgga ccaccatgac catcaccacg 1320
ccaaccggtg aaggggtaac cagcgcgcgt acgtttgtcc gtctgcgtcg ctgtgtatta 1380
gtcgatgcgt ttcgcattgt ttaa 1404
<210> 3
<211> 1185
<212> DNA
<213> 基因(AtoB)
<400> 3
atgaaaaatt gtgtcatcgt cagtgcggta cgtactgcta tcggtagttt taacggttca 60
ctcgcttcca ccagcgccat cgacctgggg gcgacagtaa ttaaagccgc cattgaacgt 120
gcaaaaatcg attcacaaca cgttgatgaa gtgattatgg gtaacgtgtt acaagccggg 180
ctggggcaaa atccggcgcg tcaggcactg ttaaaaagcg ggctggcaga aacggtgtgc 240
ggattcacgg tcaataaagt atgtggttcg ggtcttaaaa gtgtggcgct tgccgcccag 300
gccattcagg caggtcaggc gcagagcatt gtggcggggg gtatggaaaa tatgagttta 360
gccccctact tactcgatgc aaaagcacgc tctggttatc gtcttggaga cggacaggtt 420
tatgacgtaa tcctgcgcga tggcctgatg tgcgccaccc atggttatca tatggggatt 480
accgccgaaa acgtggctaa agagtacgga attacccgtg aaatgcagga tgaactggcg 540
ctacattcac agcgtaaagc ggcagccgca attgagtccg gtgcttttac agccgaaatc 600
gtcccggtaa atgttgtcac tcgaaagaaa accttcgtct tcagtcaaga cgaattcccg 660
aaagcgaatt caacggctga agcgttaggt gcattgcgcc cggccttcga taaagcagga 720
acagtcaccg ctgggaacgc gtctggtatt aacgacggtg ctgccgctct ggtgattatg 780
gaagaatctg cggcgctggc agcaggcctt acccccctgg ctcgcattaa aagttatgcc 840
agcggtggcg tgccccccgc attgatgggt atggggccag tacctgccac gcaaaaagcg 900
ttacaactgg cggggctgca actggcggat attgatctca ttgaggctaa tgaagcattt 960
gctgcacagt tccttgccgt tgggaaaaac ctgggctttg attctgagaa agtgaatgtc 1020
aacggcgggg ccatcgcgct cgggcatcct atcggtgcca gtggtgctcg tattctggtc 1080
acactattac atgccatgca ggcacgcgat aaaacgctgg ggctggcaac actgtgcatt 1140
ggcggcggtc agggaattgc gatggtgatt gaacggttga attaa 1185

Claims (5)

1.一种重组酵母菌，其特征在于，所述的重组酵母菌为过表达限速步骤动态调控tHMG1基因的BL03菌株，所述的tHMG1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的tHMG1基因置于生长偶联动态调控元件Cit1启动子之下。
2.根据权利要求1所述的重组酵母菌，其特征在于，所述的重组酵母菌中BL03菌株基因组中的Ald6基因被敲除。
3.根据权利要求1所述的重组酵母菌，其特征在于，所述的重组酵母菌表达eutE和AtoB基因，所述的eutE和AtoB基因以单独过表达、同时过表达、同一位点整合表达、以SUMO或2A肽连接融合表达，或直接融合表达的方式整合于BL03菌株基因组上，所述的eutE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的AtoB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的重组酵母菌，其特征在于，所述的重组酵母菌中BL03菌株基因组的竞争性代谢途径ACC1启动子被生长偶联动态调控元件PDC1启动子替换。
5.权利要求1-4任一所述的重组酵母菌在类胡萝卜素合成中的应用。
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