CN102925376B - 生产达玛二烯和原人参二醇的重组微生物及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产达玛二烯和原人参二醇的重组微生物及其构建方法。本发明提供的一种构建重组菌的方法，包括如下步骤：向酿酒酵母中导入达玛二烯合酶、原人参二醇合成酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因，得到重组菌1。本发明通过同源重组的手段，将达玛二烯合酶、原人参二醇合成酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因均导入酿酒酵母中得到初始重组菌，发现其可产生微量的达玛二烯和原人参二醇；再提高初始重组菌的tHMG1的活性，得到中间重组菌，其达玛二烯和原人参二醇产量明显提高；在中间重组菌的基础上又提高其ERG1、ERG9和ERG20一个或者两个或者三个的活性，发现也能构建出达玛二烯和原人参二醇产量提高的重组菌；为人工合成达玛二烯和原人参二醇奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种生产达玛二烯和原人参二醇的重组微生物及其构建方法。
背景技术
原人参二醇（Protopanoxadiol）是药用植物人参中提取的三萜皂苷元，达玛二烯（Dammarenediol-II）为其生物合成的前体化合物。原人参二醇具有抗癌、抗抑郁、激活氯离子通道和抑制钠离子通道去极化的作用、抑制人胚肾HEK-293细胞和幽门螺旋杆菌生长等多种药理活性。原人参二醇的糖基化产物：人参二醇型人参皂苷类化合物，如人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg3等在心脑血管，抗肿瘤等方面也有很好的药理活性，这类化合物的相关产品已在临床广泛使用。当前人参皂苷类化合物的主要来源是通过中药材人参中直接提取，但随着开垦荒地、荒山伐林人参野生资源的生长环境遭到严重破坏，人参资源极度紧张；人工种植过程中也遇到品种退化，大量的土地和人力成本等因素。人参皂苷类化合物产量已经远不能满足社会的需求，严重影响了人参的临床应用和人参皂苷类制药原料中间体的开发和应用，亟待需要提供新的资源途径。
目前利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产天然产物已被国际认为是一种最有潜力的方法，如在大肠杆菌中生产紫杉醇的前体紫杉二烯已达到1000mg/L(ParayilKumaran Ajikumar et al.,2010,Science,330:70-74)；银杏内酯类（Ginkgolides）前体左旋海松二烯（Levopimaradiene），在改造后的大肠杆菌工程菌中达到700mg/L的产量(Effendi Leonard et al.,2010,PNAS,107(31):13654–13659)；在酵母工程菌中生产青蒿素（Artemisinin）的前体青蒿酸(Artemisinic acid)最高达到100mg/L(Dae-Kyun Ro etal.,2006,Nature,440:940-943)；目前国内在青蒿素，紫杉醇和丹参酮等药物分子的生物合成方面有相关研究。
原人参二醇为人参植物体内萜类合成途径的产物，由人参细胞中线粒体、细胞溶质和内质网存在的甲羟戊酸代谢途径（MVA Pathway）与在质体中存在的丙酮酸/磷酸甘油醛代谢途径（MEP Pathway）共同合成。其中前体物质鲨烯（Squalene）为IPP和DMAPP经过法呢基焦磷酸合酶（FPS）和鲨烯合酶（SQS）共同催化得到，鲨烯可以被鲨烯环氧酶（SQE）和达玛二烯合酶依次催化为达玛二烯（DDS），达玛二烯能被原人参二醇合成酶（PPDS）和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶（CPR）共同催化生成原人参二醇。作为传统发酵工艺中常用菌株：酿酒酵母在其体内存在生产萜类成分的甲羟戊酸途径，其中产三萜类成分麦角甾醇（Ergosterol）能达到生物量的4.6%(Arnezeder,C.et al.,1990,Biotechnol lett.,12:277-282)；二萜香叶酰香叶酰醇（GGOH）也能达到283mg/L(Tokuhiro,K.et al.,2009,Appl Environ Microbiol.,75:5536-5543)。由此，利用合成生物学的方法和技术在酿酒酵母中构建和优化相关生物合成途径来生产达玛二烯和原人参二醇具有很大潜力。
发明内容
本发明的一个目的是构建重组菌的方法。
本发明提供的构建重组菌的方法，包括如下步骤：向酿酒酵母中导入达玛二烯合酶编码基因表达盒、原人参二醇合成酶编码基因表达盒和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒，得到重组菌1。
上述向酿酒酵母中导入达玛二烯合酶编码基因表达盒、原人参二醇合成酶编码基因表达盒和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒为通过同源重组的方法向酿酒酵母的rDNA位点中导入达玛二烯合酶编码基因表达盒、原人参二醇合成酶编码基因表达盒和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒；
所述同源重组的方法具体为向酿酒酵母中导入含有筛选标记基因A的rDNA位点上游同源臂rDNA-LEU2-up（来源于质粒prDNA-LEU2）、达玛二烯合酶编码基因表达盒PPGK1-PgDDS-TADH1t（来源于质粒pM14-PgDDS）、原人参二醇合成酶编码基因表达盒PTEF1-PgPPDS-TCYC1（来源于质粒pM3-PgPPDS）、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒PTDH3-AtCPR1-TTPI1（来源于质粒pM11-AtCPR1）和rDNA位点下游同源臂rDNA-down（来源于质粒prDNA-LEU2）；
上述含有筛选标记基因A的rDNA位点上游同源臂rDNA-LEU2-up、达玛二烯合酶编码基因表达盒PPGK1-PgDDS-TADH1t、原人参二醇合成酶编码基因表达盒PTEF1-PgPPDS-TCYC1、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒PTDH3-AtCPR1-TTPI1、rDNA位点下游同源臂rDNA-down的制备方法均见实施例2的1），而各自片段来源的质粒的制备方法均见实施例1。
上述方法中，所述筛选标记基因A为LEU2；
所述达玛二烯合酶编码基因表达盒包括启动子PGK1、达玛二烯合酶编码基因PgDDS、终止子ADH1t；
所述原人参二醇合成酶编码基因表达盒包括启动子TEF1、原人参二醇合成酶编码基因PgPPDS和终止子CYC1；
所述烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒包括启动子TDH3、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因AtCPR1和终止子TPI 1。
上述方法还包括如下步骤：提高所述重组菌1中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性，得到重组菌2。
上述方法中，所述提高所述重组菌1中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性为向所述重组菌1中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒；
上述向所述重组菌1中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒具体为通过同源重组向所述重组菌1的δ位点中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒；上述同源重组的方法进一步具体为向所述重组菌1中导入线性化的含有3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒的质粒p δ-tHMG1；
上述线性化质粒p δ-tHMG1的制备方法见实施例3，涉及的质粒p δ-tHMG1的制备方法见实施例1。
所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒进一步包括启动子PGK1、3羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1和终止子ADH1t。
上述方法还包括如下A-F中的任一一种：
A：提高所述重组菌2中的法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组菌3；
B：提高所述重组菌2中的鲨烯合酶的活性，得到重组菌4；
C：提高所述重组菌2中的鲨烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组菌5；
D：提高所述重组菌2中的鲨烯环氧酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组菌6；
E：提高所述重组菌2中的鲨烯环氧酶和鲨烯合酶的活性，得到重组菌7；
F：提高所述重组菌2中的鲨烯环氧酶、鲨烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组菌8。
A：所述提高重组菌2中的法呢基焦磷酸合酶的活性为向所述重组菌2中导入法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；所述向所述重组菌2中导入法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒为通过同源重组的方法实现；所述同源重组的方法进一步具体为向所述重组菌2中导入含有筛选标记基因B和所述法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒片段HIS3-PPGK1-ERG20-TADH1t（来源于质粒pEHIS3-ERG20）；所述HIS3-PPGK1-ERG20-TADH1t的制备方法见实施例4，涉及的质粒pEHIS3-ERG20的制备方法见实施例1。
B：所述提高重组菌2中的鲨烯合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A；所述向所述重组菌2中导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A具体通过同源重组实现；所述同源重组的方法进一步具体为向所述重组菌2中导入含有所述筛选标记基因B和所述鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A片段HIS3-PPGK1-ERG9-TADH1t（来源于质粒pEHIS3-ERG9）；HIS3-PPGK1-ERG9-TADH1t的制备方法见实施例5，涉及的质粒pEHIS3-ERG9的制备方法见实施例1。
C：所述提高重组菌2中的鲨烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；所述向所述重组菌2中导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和所述法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒具体通过同源重组向所述重组菌2的Trp1位点导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒实现；上述同源重组进一步具体为向所述重组菌2中导入含有筛选标记基因B的Trp1位点的上游同源臂Trp-HIS3-up、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B PTEF1-ERG9-TCYC1、法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒PPGK1-ERG20-TADH1t和Trp1位点的下游同源臂Trp-down；
含有筛选标记基因B的Trp1位点的上游同源臂（来源于质粒pTrp-HIS3）、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B（来源于质粒pM3-ERG9）、法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒（来源于质粒pEHIS3-ERG20）和Trp1位点的下游同源臂（来源于质粒pTrp-HIS3）的制备方法均见实施例6，涉及的质粒的制备方法见实施例1。
D:所述提高重组菌2中的鲨烯环氧酶ERG1和法呢基焦磷酸合酶ERG20的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A和所述法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；所述向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒具体通过同源重组的向所述重组菌2的Trp1位点导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；所述同源重组的方法进一步具体为向所述重组菌2中导入含有筛选标记基因B的Trp1位点的上游同源臂Trp-HIS3-up、鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A PTEF1-ERG1-TCYC1、法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒PPGK1-ERG20-TADH1t、Trp1位点的下游同源臂Trp-down；
含有筛选标记基因B的Trp1位点的上游同源臂Trp-HIS3-up（来源于质粒pTrp-HIS3)、鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A PTEF1-ERG1-TCYC1（来源于质粒pM13-ERG1）、法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒PPGK1-ERG20-TADH1t（来源于质粒pEHIS3-ERG20)、Trp1位点的下游同源臂Trp-down（来源于质粒pTrp-HIS3)的制备方法均见实施例7，涉及的质粒的制备方法见实施例1。
E:所述提高重组菌2中的鲨烯环氧酶和鲨烯合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A和鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A；所述向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A和鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A具体通过同源重组向所述重组菌2的Trp1位点导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A和鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A；所述同源重组的方法进一步具体为向所述重组菌2中导入含有筛选标记基因B的Trp1位点的上游同源臂Trp-HIS3-up（来源于质粒pTrp-HIS3)、鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A PTEF1-ERG1-TCYC1（来源于质粒pM13-ERG1）、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A PPGK1-ERG9-TADH1t（来源于质粒pEHIS3-ERG9)、Trp1位点的下游同源臂Trp-down（来源于质粒pTrp-HIS3)；
含有筛选标记基因B的Trp1位点的上游同源臂Trp-HIS3-up、鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A PTEF1-ERG1-TCYC1、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A PPGK1-ERG9-TADH1t、Trp1位点的下游同源臂Trp-down的制备方法均见实施例8，涉及的质粒的制备方法见实施例1。
F：所述提高重组菌2中的鲨烯环氧酶、鲨烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒B、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；所述向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒B、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒具体通过同源重组向所述重组菌2的Trp1位点导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒B、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；所述同源重组的方法进一步具体为向所述重组菌2中导入含有筛选标记基因B的Trp1位点的上游同源臂Trp-HIS3-up（来源于质粒pTrp-HIS3)、鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒B PTDH3-ERG1-TTPI1（来源于质粒pM11-ERG1)、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B PTEF1-ERG9-TCYC1（来源于质粒pM3-ERG9)、法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒PPGK1-ERG20-TADH1t（来源于质粒pEHIS3-ERG20)、Trp1位点的下游同源臂Trp-down（来源于质粒pTrp-HIS3)；
含有筛选标记基因B的Trp1位点的上游同源臂Trp-HIS3-up、鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒B PTDH3-ERG1-TTPI1、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B PTEF1-ERG9-TCYC1、法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒PPGK1-ERG20-TADH1t、Trp1位点的下游同源臂Trp-down的制备方法均见实施例9，涉及的质粒的制备方法见实施例1。
所述筛选标记基因B进一步具体为HIS3；
所述法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒进一步具体包括启动子PGK1、法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20和终止子ADH1t；
所述鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A进一步具体包括启动子PGK1、鲨烯合酶编码基因ERG9和终止子ADH1t；
所述鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B进一步具体包括启动子TEF1、鲨烯合酶编码基因ERG9和终止子CYC1；
所述鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A进一步具体包括启动子TEF1、鲨烯环氧酶编码基因ERG1和终止子CYC1；
所述鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒B进一步具体包括启动子TDH3、鲨烯环氧酶编码基因ERG1和终止子TPI1。
上述方法中，所述编码基因PgDDS的核苷酸序列为序列表中的序列1；
所述编码基因PgPPDS的核苷酸序列为序列表中的序列2；
所述编码基因AtCPR1的核苷酸序列为序列表中的序列3；
所述编码基因ERG20的核苷酸序列为序列表中的序列4；
所述编码基因ERG9的核苷酸序列为序列表中的序列5；
所述编码基因ERG1的核苷酸序列为序列表中的序列6；
所述编码基因tHMG1的核苷酸序列为序列表中的序列7；
所述启动子PGK1的核苷酸序列为序列表中的序列8；
所述启动子TEF1的核苷酸序列为序列表中的序列9；
所述启动子TDH3的核苷酸序列为序列表中的序列10；
所述终止子CYC1的核苷酸序列为序列表中的序列11；
所述终止子ADH1t的核苷酸序列为序列表中的序列12；
所述终止子TPI1的核苷酸序列为序列表中的序列13；
所述HIS3的核苷酸序列为序列表中的序列14；
所述LEU2的核苷酸序列为序列表中的序列15。
上述酿酒酵母具体为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742。
由上述的方法得到的重组菌1也是本发明保护的范围；
或由上述的方法得到的重组菌2也是本发明保护的范围；
或由上述的方法得到的重组菌3、重组菌4、重组菌5、重组菌6、重组菌7或重组菌8也是本发明保护的范围。
上述重组菌1、所述重组菌2或所述重组菌3-8中任意一种在生产达玛二烯和/或原人参二醇中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种生产达玛二烯和/或原人参二醇的方法。
本发明提供的方法，为发酵上述重组菌1、所述重组菌2或所述重组菌3-8中任意一种，得到达玛二烯和/或原人参二醇。
上述发酵采用的培养基为液体培养基，其中各组分及其终浓度如下：终浓度为1%（质量百分含量）Yeast Extract（酵母膏）、终浓度为2%（质量百分含量）Peptone（蛋白胨）、终浓度为2%（质量百分含量）Dextrose（葡萄糖），用水补足体积；固体培养基需再加2%琼脂粉。
上述发酵的条件为30℃，250rpm/min、振荡培养8天。
本发明中涉及的蛋白和基因的名称具体如下：
ERG9为酵母鲨烯合酶基因名，其编码的酶为鲨烯合酶（Squalene synthase）；
ERG20为酵母法呢基焦磷酸合酶基因名，其编码的酶为法呢基焦磷酸合酶（Farnesylpyrophosphate synthase）；
ERG1为酵母鲨烯环氧酶基因名，其编码的酶为鲨烯环氧酶（Squalene epoxidase）；
pgDDS为来源于人参的达玛二烯合酶编码基因，其编码的蛋白为达玛二烯合酶（Dammarenediol-II synthase）；
pgPPDS为来源于人参的原人参二醇合成酶编码基因，其编码的蛋白为原人参二醇合成酶（Protopanaxadiol synthase）；
AtCPR1为来源于拟南芥的烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶1编码基因，其编码的蛋白为烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶（NADPH-cytochrome P450reductase）；
tHMG1为来源于部分酿酒酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1编码基因，具体为酿酒酵母的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1（3-hydroxyl-3-methylglutaryl-CoAreductase）截取5’部分序列的功能蛋白。
所述PGK1启动子为酿酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶启动子。
所述TDH3启动子为酿酒酵母的3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子。
所述TEF1启动子为酿酒酵母的翻译延伸因子1启动子。
所述δ位点为酿酒酵母染色体上多个δ基因中的1-10个随机位置。
所述rDNA位点为酿酒酵母染色体上多个核糖体基因中的1-10个随机位置。
所述HIS3位点为酿酒酵母染色体上组氨酸生物合成途径中HIS3基因位置。
所述Trp1位点为酿酒酵母染色体上色氨酸生物合成途径中Trp1基因位置。
本发明的实验证明，本发明通过同源重组的手段，将PgDDS、AtCPR1和PgPPDS均导入酿酒酵母中得到初始重组菌，发现其可产生微量的达玛二烯和原人参二醇；再提高初始重组菌的tHMG1的活性，得到中间重组菌，其达玛二烯和原人参二醇产量明显提高；在中间重组菌的基础上又提高其ERG1、ERG9和ERG20一个或者两个或者三个的活性，发现也能构建出达玛二烯和原人参二醇产量提高的重组菌；为人工合成达玛二烯和原人参二醇奠定了基础。
附图说明
图1为达玛二烯GC-MS分析
图2为原人参二醇LC-MS分析
图3为工程菌株中达玛二烯和原人参二醇含量分析
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、基因元件克隆和含有对应基因原件的质粒构建
一、基因元件的克隆分为以下三步：
（1）酵母基因组DNA提取
挑取酿酒酵母BY4742(Saccharomyces cerevisiaeBY4742，记载在Carrie bakerbrachmann et al.,1998,YEAST,14:115–132，公众可从天津工业生物技术研究所和中国中医科学院中药研究所获得。）菌斑于YPD液体培养基（配方：1%Yeast Extract（酵母膏），2%Peptone（蛋白胨），2%Dextrose（葡萄糖））中，30℃，200rpm，培养24h。10000g，5分钟收集菌体于1.5ml离心管中，水清洗两次，菌体重悬于酵母破壁液中（25ul酵母破壁酶，470ul山梨醇缓冲液，5ul β-ME），30℃温浴1h后离心；菌体用500ul TENTS缓冲液（10mM Tris-HCl,pH 7.5；1mM EDTA,pH8.0；100mM NaAc；2%triton-100；1%SDS）重悬，60℃水浴1h；酚/氯仿抽提2次；上清液加3倍体积的EtOH，1/10倍体积的3M NaAc，-20℃冰箱放置2h；13000g，4℃，离心10min，倒掉上清，沉淀用70%EtOH，洗剂沉淀2次后吹干，双蒸水溶解，-20℃保存备用，得到酵母基因组DNA。
（2）人参cDNA和拟南芥cDNA的获得
总RNA提取：分别收集人参细胞（人参的愈伤组织细胞，Juan Wang etal.,2013,Industrial Crops and Products.41:57-63，公众可从天津工业生物技术研究所和中国中医科学院中药研究所获得。）组织（用茉莉酸甲酯诱导24小时）和新鲜拟南芥（col-0生态型；Athanasios Theologis et al.,2000，Nature 408：816-820，公众可从天津工业生物技术研究所和中国中医科学院中药研究所获得。）叶片各200mg用液氮研磨后CTAB法提取总RNA：在1.5ml离心管中加入1ml 2*CTAB提取液，65℃预热之后，加入20μl 2-ME；加入少量粉末(约50mg)，混合均匀，65℃保温10min，摇匀5次；4℃，12000rpm离心10min，移出上清，用等体积的氯仿/异戊醇抽提；4℃，12000rpm离心10min，移出上清，用等体积的氯仿/异戊醇抽提；4℃，12000rpm离心10min，移出上清，用1/6体积的氯仿/异戊醇抽提；4℃，15000rpm离心30min，移出上清，加入1/4体积的10mol/L LiCl，4℃放置过夜；4℃，15000rpm离心30min，弃去上清，用75％乙醇洗涤沉淀2次，无水乙醇洗涤沉淀1次，超净台放置15min(室温)；用20μl milliQ DEPC处理水溶解，加入1/10体积的2mol/L NaAC（pH4.0），加入2体积的无水乙醇，-20℃放置2h；4℃，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇洗涤两次，无水乙醇洗涤沉淀1次；超净台放置15min(室温)，加15μl milliQ DEPC处理水使沉淀充分溶解，-70℃保存。
第一链反转录-PCR：取无RNA酶PCR管，按第一链反转录试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）配备体系：Radom 6Mers 2ul、dNTP 1ul、total RNA 1ul（200ng）、H2O 6ul、Total10ul、瞬间离心，PCR 65℃5min，冰上急冷；再加入以下体系中反应液：5*primer Buffer 4ul、RNAs Inhibiter 0.5ul、R-Transcription 1ul、H2O 4.5ul，瞬间离心，PCR仪进行反应：30℃10min、42℃60min、70℃15min、4℃保温。
分别得到人参细胞cDNA和拟南芥cDNA。
（3）PCR扩增及克隆基因元件
以酵母基因组DNA为模板，用引物列表1中引物，扩增tHMG1、ERG20、ERG9、ERG1；以人参细胞cDNA为模板扩增PgDDS基因和PgPPDS基因；以拟南芥cDNA为模板扩增AtCPR1基因。扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM eachdNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。
表1引物序列
扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度见引物列表1）、72℃延伸均用2分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环）。将扩增产物分别克隆到pEASY-Blunt克隆载体（购自北京全式金生物技术有限公司）上。克隆体系为：1ul PCR扩增产物、1ul pEASY-Blunt克隆载体，轻轻混合、室温反应10分钟后加入50ul Trans10感受态细胞中（购自北京全式金生物技术有限公司），冰浴30分钟。42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入250ul LB培养基，100rpm，37℃孵育1小时。取200ul菌液涂在含有氨苄青霉素的LB平板上，过夜培养后，PCR筛选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pEASY-Blunt上插入相应的目的片段，分别命名为：p-tHMG1，p-ERG20，p-ERG9，p-ERG1，p-PgDDS，p-PgPPDS，p-AtCPR1。
PgDDS、PgPPDS、AtCPR1、ERG20、ERG9、ERG1、tHMG1的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-7。
二、含有基因元件的质粒构建
（1）p δ-tHMG1质粒的构建
以酿酒酵母基因组DNA为模板，用表2中引物，扩增启动子PGK1(771bp)、终止子ADH1t(185bp)；以p-tHMG1为模板，用表2中引物，扩增tHMG1(1614bp)。扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸1.5分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环）。
表2引物序列
SexA1酶切PGK1、SexA1和Asc1酶切tHMG1、Asc1酶切ADH1t，割胶纯化三个目的片段，各50ng加入连接体系：2ul 10XT4 ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4 ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul，室温反应2小时得到连接产物；取1ul连接产物加入PCR体系：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、加引物Sac11-pGK1和Sac 11-Pme-ADHt（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用1.5分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环）；得到约2539bp的目标片段PPGK1-tHMG1-TADH1t，为tHMG1基因的表达盒，其中PPGK1的核苷酸序列为序列表中的序列8，tHMG1基因的核苷酸序列为序列表中的序列7，TADH1t的核苷酸序列为序列表中的序列12。
将约2539bp目标片段与pEASY-Blunt克隆载体连接，得到pM2-tHMG1。
Sac11分别酶切质粒pM2-tHMG1和pδ-UB（Lee FW and Da Silva NA,1997,Biotechnol Prog.13:368-373，公众可从天津工业生物技术研究所和中国中医科学院中药研究所获得。），割胶回收目的片段：约2539bpPPGK1-tHMG-TADH1t（100ng）和p δ-UB（30ng）各50ng加入连接体系：2ul 10XT4ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul，室温反应2小时得到连接产物，转入Trans10感受态细胞得到转化子，提取质粒为p δ-tHMG1质粒。将该质粒为将tHMG1基因的表达盒PPGK1-tHMG1-TADH1t插入p δ-UB的Sac11酶切位点间得到的载体，命名为p δ-tHMG1质粒。
（2）pEHIS3-ERG9的质粒构建
携带ERG9基因的质粒构建，共有以下二步：
第一步：p δ-ERG9质粒的构建
SexA1和Asc1分别双酶切p δ-tHMG1和质粒p-ERG9，割胶回收目的片段：p δ-UB-PGK1-//-ADH1t（100ng，约8610bp）和ERG9（30ng，约1350bp），连接，得到质粒p δ-ERG9。
第二步：pEHIS3-ERG9质粒的构建
以pRS313（Sikorski,R.S.and Hieter,P.1989,Genetics 122(1):19-27，公众可从天津工业生物技术研究所和中国中医科学院中药研究所获得。）为模板，用引物列表3中引物，扩增HIS3。扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、Phusion High-FidelityDNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸1.5分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环）；得到约1180bp的目标片段HIS3（其核苷酸序列为序列表中的序列14）。将目标片段克隆到pEASY-Blunt克隆载体，测序验证，得到p-HIS3。
表3引物
Sac 11-Pme-ADHt和pme-PGK1（引物列表2，3）为引物，质粒p δ-ERG9为模板，PCR获得约2258bpDNA片段：ERG9的表达盒PPGK1-ERG9-TADH1t，其中启动子为PPGK1，终止子为TADH1t，基因ERG9的核苷酸序列为序列表中的序列5。
Pme1酶切质粒p-HIS3和DNA片段PPGK1-ERG9-TADH1t，割胶回收目的片段：p-HIS3（100ng，约5000bp）和PPGK1-ERG9-TADH1t（30ng，约2258bp），连接，得到重组载体pEHIS3-ERG9；该载体为将ERG9的表达盒PPGK1-ERG9-TADH1t插入p-HIS3的Pme1位点间得到的载体。
（3）pEHIS3-ERG20的质粒构建
SexA1和Asc 1分别双酶切pEHIS3-ERG9和质粒p-ERG20，割胶回收目的片段：pEHIS3-PGK1-//-ADH1t（约5918bp；100ng）和ERG20（30ng；约1059bp），连接，转化，得到转化子，提取转化子的质粒送去测序，该质粒为将序列表中的序列4所示的基因ERG20替换了pEHIS3-ERG9的ERG9基因得到的载体；命名为pEHIS3-ER20。
（4）pM3-ERG9的质粒构建
以酵母基因组DNA为模板，用引物列表4中引物，扩增启动子TEF1(约430bp)、终止子CYC1t(约307bp)。扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、Phusion High-FidelityDNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸1分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环）。
表4引物
SexA1酶切TEF1；Asc1酶切CYC1t；SexA1和Asc 1酶切质粒p-ERG9；割胶纯化三个目的片段，各50ng加入连接体系：2ul 10XT4ligat ion Buffer(NEB公司)、1ul T4ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul，室温反应2小时得到连接产物，取1ul连接产物加入PCR体系：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、加引物Pac 1-TEF1和CYC1t-Pme 1（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用1.5分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），得到约2087bp的ERG9的表达盒PTEF1-ERG9-TCYC1t，其中启动子在为PTEF1（核苷酸序列为序列表中的序列9），终止子为TCYC1t（核苷酸序列为序列表中的序列11），基因ERG9的核苷酸序列为序列表中的序列5。将约2087bp的ERG9的表达盒PTEF1-ERG9-TCYC1t克隆到pEASY-BluntSimple克隆载体（购自北京全式金生物技术有限公司），得到重组载体pM3-ERG9，测序，该载体中为将ERG9的表达盒PTEF1-ERG9-TCYC1t插入pEASY-Blunt Simple的克隆位点间得到的载体。
（5）pM3-PgPPDS的质粒构建
SexA1和Asc1分别双酶切pM3-ERG9和质粒p-PgPPDS，割胶回收目的片段：pEASY-Blunt-TEF1-//-CYC1t（约4567bp，100ng）和PgPPDS（1461bp，30ng），连接，得到重组载体，经过测序，该载体为将PgPPDS基因的表达盒PTEF1-PgPPDS-TCYC1t插入pEASY-Blunt Simple的克隆位点间得到的载体，命名为pM3-PgPPDS。
PgPPDS基因的表达盒PTEF1-PgPPDS-TCYC1，其中启动子在为PTEF1（核苷酸序列为序列表中的序列9），终止子为TCYC1t（核苷酸序列为序列表中的序列11），基因PgPPDS的核苷酸序列为序列表中的序列2。
（6）pM11-AtCPR1的质粒构建
以酵母基因组DNA为模板，用引物列表5中引物，扩增启动子TDH3(800bp)、终止子TPI1t(400bp)。扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、PhusionHigh-Fidelity DNAPolymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸1分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环）。
表5引物
SexA1酶切TDH3、Asc1酶切TPI1t、SexA1和Asc1酶切质粒p-AtCPR1；割胶纯化三个目的片段，各50ng加入连接体系：2ul 10XT4ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul，室温反应2小时得到连接产物，取1ul连接产物加入PCR体系：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、加引物Pac1-TDH3和Pme-TPI1t(10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用1.5分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），得到约3305bp的AtCPR1表达盒PTDH3-AtCPR1-TTPI1t，其中启动子PTDH3的核苷酸序列为序列表中的序列10，终止子TTPI1t的核苷酸序列为序列表中的序列13，基因AtCPR1的核苷酸序列为序列表中的序列3；将约3305bp的AtCPR1表达盒PTDH3-AtCPR1-TTPI1t克隆到pEASY-Blunt Simple的克隆位点间得到的载体pM11-AtCPR1。
（7）pM11-ERG1的质粒构建
以酵母基因组DNA为模板，用引物列表6中引物，扩增800bp启动子TDH3、400bp（终止子TPI1t（引物列表5）。扩增体系为：NewEnglandBiolabs Phus ion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、PhusionHigh-FidelityDNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸1分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环）。
表6引物
Pac1酶切TDH3、Asc1酶切TPI1t、Pac1和Asc1酶切质粒p-ERG1；割胶纯化三个目的片段，各50ng加入连接体系：2ul 10XT4 ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4 ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul，室温反应2小时得到连接产物，取1ul连接产物加入PCR体系：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、加引物X-Only-TDH3-F和Pme-TPI1t（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用1.5分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），得到约2691bp的ERG1表达盒PTDH3-ERG1-TTPI1t，其中启动子PTDH3的核苷酸序列为序列表中的序列10，终止子TTPI1t的核苷酸序列为序列表中的序列13，ERG1的核苷酸序列为序列表中的序列6。约2691bp的ERG1表达盒PTDH3-ERG1-TTPI1t克隆到pEASY-Blunt Simple克隆位点间，得到重组载体pM11-ERG1。
（8）pM13-ERG1的质粒构建
以酵母基因组DNA为模板，用引物列表7中引物，扩增430bp启动子TEF1、307bp终止子CYC1t（引物列表4）。扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、PhusionHigh-FidelityDNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸1分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环）。
表7引物
Pac1酶切TEF1；Asc1酶切CYC1t；Pac1和Asc1酶切质粒p-ERG1；割胶纯化三个目的片段，各50ng加入连接体系：2ul 10XT4ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4ligase(NEB公司，400,000cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul，室温反应2小时得到连接产物，取1ul连接产物加入PCR体系：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、加引物X-Only-pTEF1-F和CYC1t-Pme1（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用1.5分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），得到约2249bp的ERG1表达盒PTEF1-ERG-TCYC1t，其中启动子PTEF1的核苷酸序列为序列表中的序列9；ERG1的核苷酸序列为序列表中的序列6，终止子TCYC1t的核苷酸序列为序列表中的序列11。将约2249bp的ERG1表达盒PTEF1-ERG1-TCYC1t克隆到pEASY-Blunt simple克隆载体，得到重组载体pM13-ERG1。
（9）pM14-PgDDS的质粒构建
以酵母基因组DNA为模板，用引物列表8中引物,扩增771bp启动子PGK1、158bp终止子ADH1t（引物列表2）。扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、Phusion High-FidelityDNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸1分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环）。
表8引物
Pac1酶切PGK1、Asc1酶切ADH1t、Pac1和Asc1酶切质粒p-PgDDS；割胶纯化三个目的片段，各50ng加入连接体系：2ul 10XT4ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4 ligase(NEB公司，400,000 cohesive end units/ml)，补充蒸馏水至20ul，室温反应2小时得到连接产物，取1ul连接产物加入PCR体系：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、加引物X-Only-pPGK1-F和Sac11-Pme-ADH1t（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、58℃退火10秒、72℃延伸均用1.5分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），得到约3291bp的PgDDS基因表达盒PPGK1-PgDDS-TADH1t，其中启动子PPGK1的核苷酸序列为序列表中的序列8，终止子TADH1t的核苷酸序列为序列表中的序列12，基因PgDDS的核苷酸序列为序列表中的序列1。
将约3291bp的PgDDS基因表达盒PPGK1-PgDDS-TADH1t克隆到pEASY-Blunt simple克隆载体，得到重组载体pM14-PgDDS。
（10）prDNA-LEU2的质粒构建
prDNA-LEU2的构建分两步：
第一步：p-rDNA质粒的构建
以酵母基因组DNA为模板，用引物列表9中引物，扩增rDNA。扩增体系为：NewEnglandBiolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸1分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），得到约1264bp rDNA（核苷酸序列为序列表中的序列16）。将1264bp rDNA克隆到pEASY-Blunt克隆载体，得到p-rDNA。
表9引物
第二步：prDNA-LEU2质粒的构建
Kpn1酶切p-rDNA，割胶纯化目的片段（30ng，约5094bp），加入2ul 10XNEB Buffer(NEB公司)、1ul Klenow(NEB公司)，补充蒸馏水至20ul，37℃60分钟补平，纯化目的片段p-rDNA。
以pRS425质粒（Christianson,T.W.et al.,1992,Gene 110:119-122，公众可从天津工业生物技术研究所和中国中医科学院中药研究所获得）为模板，用引物列表10中引物，扩增约1820bp LEU2（核苷酸序列为序列表中的序列15）。扩增体系为：NewEngland BiolabsPhusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸1分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环）。
表10引物
割胶约1820bp LEU2（30ng），加入2ul 10XT4 ligat ion Buffer(NEB公司)、1ulT4 Polynucleotide kinase(NEB公司)，补充蒸馏水至20ul，37℃磷酸化60分钟；同p-rDNA用T4连接酶连接，得到质粒prDNA-LEU2。
（11）pTrp-HIS3的质粒构建
pTrp-HIS3的构建分两步：
第一步：p-LoxpHIS3质粒的构建
以pRS313质粒为模板，用引物列表11中引物，扩增约1180bp Loxp-HIS3。扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、PhusionHigh-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸1分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环）。将约1180bp Loxp-HIS3扩增产物克隆到pEASY-Blunt克隆载体，得到p-LoxpHIS3。
表11引物
第二步：pTrp-HIS3质粒的构建
Pme1酶切p-LoxpHIS3，割胶纯化目的片段（30ng，约5010bp），加入2ul 10XNEBBuffer(NEB公司)、1ul CIP(NEB公司)，补充蒸馏水至20ul，37℃去磷酸化60分钟。割胶纯化目的片段p-LoxpHIS3。
以酵母基因组为模板，用引物列表12中引物，扩增1558bp Trp（核苷酸序列为序列表中的序列17）。扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNAPolymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性2分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸1分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环）。
表12引物
割胶纯化Trp（30ng），加入2ul 10XT4 ligation Buffer(NEB公司)、1ul T4Polynucleotide kinase(NEB公司)，补充蒸馏水至20ul，37℃磷酸化60分钟；同p-LoxpHIS3用T4连接酶连接，得到质粒pTrp-HIS3。
上述构建的质粒基本信息见表13。
表13质粒信息
实施例2、
酿酒酵母基因工程菌ZD-PPD-000的构建
1）rDNA-LEU2-up，PPGK1-PgDDS-TADH1t，PTDH3-AtCPR1-TTPI1，PTEF1-PgPPDS-TCYC1和rDNA-down的制备
分别用表14描述的PCR模板和引物进行PCR获得功能模块：M1（rDNA-LEU2-up），M2（PPGK1-PgDDS-TADH1t），M3（PTDH3-AtCPR1-TTPI1），M4（PTEF1-PgPPDS-TCYC1），M5（rDNA-down）等功能模块。扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mMeach dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、Phus ionHigh-Fidelity DNAPolymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性1.5分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸均用2分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），产物经割胶回收保存。
分别得到如下PCR产物：
约2396bp M1（rDNA-LEU2-up）、约3300bp M2（PPGK1-PgDDS-TADH1t）、约3400bp M3（PTDH3-AtCPR1-TTPI1）、约2300bp M4（PTEF1-PgPPDS-TCYC1）和约740bp M5（rDNA-down）。
表14引物
（2）ZD-PPD-000的构建
出发菌酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742于YPD中过夜培养，取1ml(OD约0.6-1.0)分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液（10mM LiAc；10mM DTT；0.6Msorbitol；10mM Tris-HCl(pH7.5),处理液使用时才加DTT），25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1ml 1M sorbitol（0.22um水系膜过膜除菌）重悬，离心，弃上清（用1M sorbitol重悬二次），到最终体积约为90μl，即为BY4742感受态细胞。
向BY4742感受态细胞中加入转化用片段：M1、M2、M3、M4和M5共5ug（摩尔比=1:1:1:1:1），在筛选培养中培养，得到转化子。
筛选培养的培养基为：0.8%酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-HIS3（北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司），2%葡萄糖，0.005%HIS3.，0.01%Ura.，0.01%Trp.；筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。
转化子分别用表14引物进行PCR鉴定，得到全部5条对应的目的片段的为正确的阳性克隆，命名为菌株ZD-PPD-000。
实施例3、酿酒酵母基因工程菌ZD-PPD-010的构建
用Xho1单酶切质粒p δ-tHMG1，割胶约10200bp回收目的片段δ-tHMG（含有表达盒PPGK1-tHMG1-TADH1t）。
采用和实施例2中相同的方法进行ZD-PPD-000感受态细胞的制备及转化，转入δ-tHMG1，在筛选培养中培养，得到转化子。筛选培养的培养基为：0.8%酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-HIS3，2%葡萄糖，0.005%HIS3.，0.01%Trp.；筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。
用Sac11-pGK1和Sac11-Pme-ADHt引物进行PCR鉴定，得到约2539bp的片段为正确阳性克隆，命名为菌株ZD-PPD-010。
实施例4、酿酒酵母基因工程菌ZD-PPD-011的构建
质粒模板pEHIS3-ERG20，用表15引物进行PCR扩增。扩增体系为：NewEnglandBiolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性1.5分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸均用2分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），得到约3247bp的PCR产物HIS3-ERG20（HIS3-PPGK1-ERG20-TADH1t），产物经割胶回收保存。
表15引物
采用和实施例2中相同的方法进行ZD-PPD-010感受态细胞的制备及转化，转入片段HIS3-ERG20，在筛选培养中培养，得到转化子。筛选培养的培养基为：0.8%酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-HIS3，2%葡萄糖，0.01%Trp.；筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。
用引物HIS3(50)-up-peasy和HIS3(50)-down-peasy进行PCR鉴定，得到3247bp的正确的阳性克隆，命名为菌株ZD-PPD-011。
实施例5、酿酒酵母基因工程菌ZD-PPD-012的构建
质粒模板pEHIS3-ERG9，用引物列表15中的引物扩增，扩增体系为：NewEnglandBiolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性1.5分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸均用2分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），得到约3438bp的PCR产物，命名为HIS3-ERG9（HIS3-PPGK1-ERG9-TADH1t）；产物经割胶回收保存。
采用和实施例2中相同的方法进行ZD-PPD-010感受态细胞的制备及转化，转入片段HIS3-ERG9（HIS3-PPGK1-ERG9-TADH1t），在筛选培养中培养，得到转化子。筛选培养的培养基为：0.8%酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-HIS3，2%葡萄糖，0.01%Trp.；筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。
用引物HIS3(50)-up-peasy和HIS3(50)-down-peasy进行PCR鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株ZD-PPD-012。
实施例6、酿酒酵母基因工程菌ZD-PPD-013的构建
分别用表16描述的PCR模板和引物进行PCR获得功能模：M1（Trp-HIS3-up），M2（PPGK1-ERG20-TADH1t），M3（PTEF1-ERG9-TCYC1），M4（Trp-down）等功能模块。扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性1.5分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸均用2分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），产物经割胶回收保存。
得到如下PCR产物：
2040bp M1（Trp-HIS3-up）、2067bp M2（PPGK1-ERG20-TADH1t）、2172bp M3（PTEF1-ERG9-TCYC1）、800bp M4（Trp-down）。
表16引物
采用和实施例2中相同的方法进行ZD-PPD-010感受态细胞的制备及转化，转入片段M1，M2，M3和M4共1ug（摩尔比为1:1:1:1）基因模块，在筛选培养中培养，得到转化子。筛选培养的培养基为：0.8%酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-HIS3，2%葡萄糖，0.01%Trp.；筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。
转化子分别用表16引物进行PCR鉴定，得到全部4条对应的目的片段的为正确的阳性克隆，命名为菌株ZD-PPD-013。
实施例7、酿酒酵母基因工程菌ZD-PPD-014的构建
分别用表17描述的PCR模板和引物进行PCR获得功能模：M1（Trp-HIS3-up），M2（PPGK1-ERG20-TADH1t），M3（PTEF1-ERG1-TCYC1），M4（Trp-down）等功能模块。扩增条件为98℃预变性1.5分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸均用2分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），产物经割胶回收保存。
得到如下PCR产物：
2040bp M1（Trp-HIS3-up）、2067bp M2（PPGK1-ERG20-TADH1t）、2300bp M3（PTEF1-ERG1-TCYC1）、800bp M4（Trp-down）。
表17引物
采用和实施例2中相同的方法进行ZD-PPD-010感受态细胞的制备及转化，转入M1，M2，M3和M4共1ug（摩尔比为1:1:1:1）基因模块，在筛选培养中培养，得到转化子。筛选培养的培养基为：0.8%酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-HIS3，2%葡萄糖，0.01%Trp.；筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。
转化子分别用表17引物进行PCR鉴定，得到全部4条对应的目的片段的为正确的阳性克隆，命名为菌株ZD-PPD-014。
实施例8、酿酒酵母基因工程菌ZD-PPD-015的构建
分别用表18描述的PCR模板和引物进行PCR获得功能模：M1（Trp-HIS3-up），M2（PPGK1-ERG9-TADH1t），M3（PTEF1-ERG1-TCYC1），M4（Trp-down）等功能模块。扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性1.5分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸均用2分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），产物经割胶回收保存。
得到如下PCR产物：
2040bp M1（Trp-HIS3-up）、2172bp M2（PPGK1-ERG9-TADH1t）、2300bp M3（PTEF1-ERG1-TCYC1）、800bp M4（Trp-down）。
表18引物
采用和实施例2中相同的方法进行ZD-PPD-010感受态细胞的制备及转化，转入M1，M2，M3和M4共1ug（摩尔比为1:1:1:1）基因模块，在筛选培养中培养，得到转化子。筛选培养的培养基为：0.8%酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-HIS3，2%葡萄糖，0.01%Trp；筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。
转化子分别用表18引物进行PCR鉴定，得到全部4条对应的目的片段的为正确的阳性克隆，命名为菌株ZD-PPD-015。
实施例9、酿酒酵母基因工程菌ZD-PPD-016的构建
分别用表19描述的PCR模板和引物进行PCR获得功能模：M1（Trp-HIS3-up），M2（PPGK1-ERG20-TADH1t），M3（PTDH3-ERG1-TTPI1），M4（PTEF1-ERG9-TCYC1），M5（Trp-down）等功能模块。
扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5Xbuffer 10ul、dNTP(10mM each dNTP)1ul、DNA模板20ng、引物（10uM）各1ul、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(2.5U/ul)0.5ul、补加蒸馏水至总体积50ul。扩增条件为98℃预变性1.5分钟（1个循环）；98℃变性10秒、退火10秒（退火温度58℃）、72℃延伸均用2分钟（32个循环）；72℃延伸8分钟（1个循环），产物经割胶回收保存。
得到如下PCR产物：2040bp M1（Trp-HIS3-up）、2067bp M2（PPGK1-ERG20-TADH1t）、2300bp M3（PTDH3-ERG1-TTPI1）、2172bp M4（PTEF1-ERG9-TCYC1）、800bp M4（Trp-down）。
表19引物
采用和实施例2中相同的方法进行ZD-PPD-010感受态细胞的制备及转化，转入M1，M2，M3，M4和M5共1ug（摩尔比为1:1:1:1）基因模块。筛选培养的培养基为：0.8%酵母选择培养基SD-Ura-Trp-Leu-HIS3，2%葡萄糖，0.01%Trp.；筛选培养的条件为：30度，培养36h以上。
转化子分别用表19引物进行PCR鉴定，得到全部5条对应的目的片段的为正确的阳性克隆，命名为菌株ZD-PPD-016。
各工程菌基本信息见表20。
表20工程菌信息
实施例10、工程菌生产达玛二烯和原人参二醇
1、工程菌培养及产物提取
在固体筛选培养平板中活化的BY4742、由实施例2-8构建的重组工程菌株ZD-PPD-000、ZD-PPD-010、ZD-PPD-011、ZD-PPD-012、ZD-PPD-013、ZD-PPD-014ZD-PPD-015、ZD-PPD-016；于YPD液体筛选培养基中制备发酵种子液（30℃，250rpm，16小时）；离心收集菌体，转移至含10ml发酵液的100ml三角瓶中，调OD至0.5，各菌株相应的发酵培养基同筛选培养基，30℃，250rpm/min.振荡培养6天，得到发酵产物。进一步检查OD600和产物达玛二烯、原人参二醇的含量。
提取产物条件：发酵产物8000g收集菌体，加少量石英砂，600ul丙酮，振荡破碎5分钟，冰水中超声30min，7000g离心5min，取上清液（提取三次，合并上清液）；上清液过0.22um有机膜后备用，得到提取产物。
2、LC-MS鉴定原人参二醇
将上述提取产物经下述处理：
检测采用：液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)仪由安捷伦1200高效液相色谱仪和Bruker-micrOTOF-II质谱仪组成，MicroOTOF control version 3.0/Data AnaysisVersion 4.0数据采集和处理系统。
色谱条件：色谱柱Waters SymmetryC18柱(50mm×2.1mm，5μm)）；流动相A乙腈(加0.1%甲酸）;流动相B水(加0.1%甲酸)；梯度洗脱条件（0-8min乙腈A从50%到90%，8-15min乙腈A保持90%到90%，15-20min A从90%到50%）；柱温（室温）；流速（1ml/min）；进样体积（20μl）。
质谱条件：电喷雾电离源正离子模式（ESI+），喷雾电压（4.5kV），雾化气流量（6L/h），雾化器温度（180℃），碰撞气为氮气，压力为1.0Bar，数据采集频率1.0HZ：碰撞能量为8.0eV。
原人参二醇含量采用HPLC测定：色谱柱WatersSymmetry C18柱(50mm×2.1mm，5μm)；流动相为乙腈：甲醇：水（90%:9%:1%）保持25min等度洗脱；柱温为室温；流速（1ml/min）；进样体积（20μl），原人参二醇标准品中的原人参二醇保留时间为10.14min。
3、GC-MS鉴定和测定达玛二烯
将上述提取产物经下述处理：
GC-MS测定：进样口温度300℃，进样体积1ul，不分流，溶剂延时12min.；色谱柱：HP-5ms（30m*0.25*0.5um）；色谱条件：80℃，1min；20℃min-1到300℃保温18min；MS条件：SIM：69、109、135、363和411；标准曲线定量分析。
4、结果
1）酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742没有达玛二烯合和原人参二醇。
2）ZD-PPD-000：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BY4742中引入外源的达玛二烯合酶、原人参二醇合成酶和细胞色素P450氧化还原酶基因得到的重组菌；
其提取产物经达玛二烯GC-MS分析，结果如图1所示，其中，（A）达玛二烯标准品，（B）空白对照，（C）样品，（D）达玛二烯质谱图，（E）达玛二烯结构图；可以看出，样品中和达玛二烯标准品中的达玛二烯保留时间为21.614min和21.617min，同时有相同的质谱图，表明提取产物中有达玛二烯；
其提取产物经原人参二醇LC-MS，结果如图2所示，其中，（A）原人参二醇标准品，（B）空白对照，（C）样品，（D）原人参二醇质谱图；可以看出，样品中和原人参二醇标准品中的原人参二醇保留时间为18.51min和18.58min；同时有相同的质谱图，表明提取产物中有原人参二醇。
结果为达玛二烯含量达0.261mg/L（0.048mg/g,细胞干重），原人参二醇含量达0.257mg/L（0.053mg/g,细胞干重）；
在此基础上通过对酿酒酵母中tHMG1，ERG20，ERG9和ERG1基因的表达调控后获得系列显著提高目标产物产量的工程菌，各工程菌发酵6天时产量如下：
3）ZD-PPD-010：在ZD-PPD-000的基础上提高tHMG1表达后，得到的工程菌；
其发酵的提取产物检测方法同上，结果为达玛二烯含量达12.379mg/L（1.048mg/g,细胞干重），原人参二醇含量达48.116mg/L（4.045mg/g,细胞干重）；
4）ZD-PPD-011：在ZD-PPD-010的基础上提高ERG20表达后，得到的工程菌；
其发酵的提取产物检测方法同上，结果为达玛二烯含量达11.919mg/L（0.974mg/g,细胞干重），原人参二醇含量达35.969mg/L（2.932mg/g,细胞干重）；
5)ZD-PPD-012:在ZD-PPD-010的基础上提高ERG9表达后，得到的工程菌；
其发酵的提取产物检测方法同上，结果为达玛二烯含量达17.258mg/L（1.459mg/g,细胞干重），原人参二醇含量达55.52mg/L（4.696mg/g,细胞干重）；
6)ZD-PPD-013:在ZD-PPD-010的基础上提高ERG20和ERG9表达后，得到的工程菌；
其发酵的提取产物检测方法同上，结果为达玛二烯含量达12.70mg/L（1.054mg/g,细胞干重），原人参二醇含量达47.466mg/L（3.94mg/g,细胞干重）；
7)ZD-PPD-014:在ZD-PPD-010的基础上提高ERG20和ERG1表达后，得到的工程菌；
其发酵的提取产物检测方法同上，结果为达玛二烯含量达59.036mg/L（4.580mg/g,细胞干重），原人参二醇含量达65.049mg/L（5.091mg/g,细胞干重）；
8）ZD-PPD-015：在ZD-PPD-010的基础上提高ERG9和ERG1表达后，得到的工程菌；
其发酵的提取产物检测方法同上，结果为达玛二烯含量达108.515mg/L（8.428mg/g,细胞干重），原人参二醇含量达56.542mg/L（4.398mg/g,细胞干重）；
9）ZD-PPD-016：在ZD-PPD-010的基础上提高ERG20，ERG9和ERG1表达后，得到的工程菌；
其发酵的提取产物检测方法同上，结果为ZD-PPD-016与ZD-PPD-000菌相比产量有较大提高：达玛二烯含量达126.379mg/L（9.788mg/g,细胞干重），提高484倍；原人参二醇含量达86.906mg/L（6.71mg/g,细胞干重），提高338倍。
将上述重组工程菌的结果统计见图3（上图为mg/L，下图为mg/g），DD-I I为达玛二烯；PPD为原人参二醇可以看出，产量最高的为ZD-PPD-016。
实施例11、ZD-PPD-016酿酒酵母基因工程菌发酵生产达玛二烯和原人参二醇
配制培养基：
培养基1：液体培养基，配方：1%Yeast Extract（酵母膏），2%Peptone（蛋白胨），2%Dextrose（葡萄糖）；固体培养基需再加2%琼脂粉。
发酵培养：挑取在固体培养基1平板中复活的工程菌株ZD-PPD-016，于液体培养基1中培养制备发酵种子液（30℃，250rpm，16小时）；离心收集菌体，转移至含100ml发酵液的250ml三角瓶中，调OD至0.5，30℃，250rpm/min.振荡培养8天得到发酵产物。进一步检查产物达玛二烯、原人参二醇的含量。
检测方法同上述实施例10，结果：酿酒酵母ZD-PPD-016在好养氧条件下，利用液体培养基1，发酵8天时可生产达玛二烯和原人参二醇分别达75mg/L和235mg/L。
Claims (10)
1.一种构建重组菌的方法，包括如下步骤：向酿酒酵母中导入达玛二烯合酶编码基因表达盒、原人参二醇合成酶编码基因表达盒和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒，得到重组菌1；
所述达玛二烯合酶编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1；
所述原人参二醇合成酶编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2；
所述烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列3。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述向酿酒酵母中导入达玛二烯合酶编码基因表达盒、原人参二醇合成酶编码基因表达盒和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒为通过同源重组向酿酒酵母的rDNA位点中导入达玛二烯合酶编码基因表达盒、原人参二醇合成酶编码基因表达盒和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒；
所述达玛二烯合酶编码基因表达盒进一步具体包括启动子PGK1、达玛二烯合酶编码基因PgDDS、终止子ADH1t；
所述原人参二醇合成酶编码基因表达盒进一步具体包括启动子TEF1、原人参二醇合成酶编码基因PgPPDS和终止子CYC1；
所述烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因表达盒进一步具体包括启动子TDH3、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶编码基因AtCPR1和终止子TPI1。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：提高所述重组菌1中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性，得到重组菌2。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述提高所述重组菌1中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性为向所述重组菌1中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因的表达盒；
所述向所述重组菌1中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒具体为通过同源重组向所述重组菌1的δ位点中导入3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因表达盒；
所述3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶1编码基因表达盒进一步具体包括启动子PGK1、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因tHMG1和终止子ADH1t。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下A-F中的任一一种：
A：提高所述重组菌2中的法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组菌3；
B：提高所述重组菌2中的鲨烯合酶的活性，得到重组菌4；
C：提高所述重组菌2中的鲨烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组菌5；
D：提高所述重组菌2中的鲨烯环氧酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组菌6；
E：提高所述重组菌2中的鲨烯环氧酶和鲨烯合酶的活性，得到重组菌7；
F：提高所述重组菌2中的鲨烯环氧酶、鲨烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性，得到重组菌8。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
A：所述提高重组菌2中的法呢基焦磷酸合酶的活性为向所述重组菌2中导入法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；
所述向所述重组菌2中导入法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒具体为通过同源重组的方法实现；
B：所述提高重组菌2中的鲨烯合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A；所述向所述重组菌2中导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A具体通过同源重组实现；
C：所述提高重组菌2中的鲨烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；
所述向所述重组菌2中导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和所述法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒具体通过同源重组向所述重组菌2的Trp1位点导入鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒实现；
D:所述提高重组菌2中的鲨烯环氧酶和法呢基焦磷酸合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A和所述法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；
所述向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒具体通过同源重组的向所述重组菌2的Trp1位点导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；
E:所述提高重组菌2中的鲨烯环氧酶和鲨烯合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A和鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A；
所述向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A和鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A具体通过同源重组向所述重组菌2的Trp1位点导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A和鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A；
F：所述提高重组菌2中的鲨烯环氧酶、鲨烯合酶和法呢基焦磷酸合酶的活性为向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒B、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；
所述向所述重组菌2中导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒B、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒具体通过同源重组向所述重组菌2的Trp1位点导入鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒B、鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B和法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒；
所述法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20表达盒进一步具体包括启动子PGK1、法呢基焦磷酸合酶编码基因ERG20和终止子ADH1t；
所述鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒A进一步具体包括启动子PGK1、鲨烯合酶编码基因ERG9和终止子ADH1t；
所述鲨烯合酶编码基因ERG9表达盒B进一步具体包括启动子TEF1、鲨烯合酶编码基因ERG9和终止子CYC1；
所述鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒A进一步具体包括启动子TEF1、鲨烯环氧酶编码基因ERG1和终止子CYC1；
所述鲨烯环氧酶编码基因ERG1表达盒B进一步具体包括启动子TDH3、鲨烯环氧酶编码基因ERG1和终止子TPI1。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述编码基因ERG20的核苷酸序列为序列表中的序列4；
所述编码基因ERG9的核苷酸序列为序列表中的序列5；
所述编码基因ERG1的核苷酸序列为序列表中的序列6；
所述编码基因tHMG1的核苷酸序列为序列表中的序列7；
所述启动子PGK1的核苷酸序列为序列表中的序列8；
所述启动子TEF1的核苷酸序列为序列表中的序列9；
所述启动子TDH3的核苷酸序列为序列表中的序列10；
所述终止子CYC1的核苷酸序列为序列表中的序列11；
所述终止子ADH1t的核苷酸序列为序列表中的序列12；
所述终止子TPI1的核苷酸序列为序列表中的序列13。
8.由权利要求1或2所述的方法得到的重组菌1；
或由权利要求3或4所述的方法得到的重组菌2；
或由权利要求5-7中任一所述的方法得到的重组菌3、重组菌4、重组菌5、重组菌6、重组菌7或重组菌8。
9.权利要求8所述重组菌1、所述重组菌2或所述重组菌3-8中任意一种在生产达玛二烯和/或原人参二醇中的应用。
10.一种生产达玛二烯和/或原人参二醇的方法，为发酵权利要求8所述重组菌1、所述重组菌2或所述重组菌3-8中任意一种，得到达玛二烯和/或原人参二醇。
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