CN103642888A - 一种利用酿酒酵母合成原人参二醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用酿酒酵母合成原人参二醇的方法，该方法是利用pAUR123DNA质粒为穿梭载体，能够存在于大肠杆菌和酿酒酵母菌中，并且具有不同的筛选标记的特性，分别构建PqDS和PqD12H的表达载体pAUR123-PqDS和pAUR123-PqD12H，将两个表达载体pAUR123-PqDS和pAUR123-PqD12H转化到同一个酿酒酵母菌中获得重组酿酒酵母菌CICC-pAUR123-PqDS-PqD12H，从而实现在酿酒酵母菌中表达原人参二醇。本发明利用酿酒酵母合成原人参二醇，合成效率高，生产周期短，纯化容易，生产成本低。

Description

一种利用酿酒酵母合成原人参二醇的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及西洋参基因PqDS和PqD12H，两种重组的酵母菌表达质粒pAUR123-PqDS和pAUR123-PqD12H，一种可合成原人参二醇的重组酿酒酵母菌CICC-pAUR123-PqDS-PqD12H及其制备方法。

背景技术

人参和西洋参中的主要成分均是人参皂苷，人参皂苷具有多种药理活性，如抗癌、抗疲劳、抗衰老和抗糖尿病等。近年来通过发根农杆菌转化人参组织细胞获得的人参发根，生长速度快，遗传和生物合成性状稳定，因此被认为是最具潜力的人参皂苷生产途径。然而，发根中皂苷含量较低，成为其工业化生产的主要瓶颈之一。通过代谢工程手段，基于人参皂苷生物合成途径，来提高人参发根皂苷的生物合成水平，是解决这一问题的有效手段。人参皂苷生物合成途径和人参皂苷生物合成关键酶基因的克隆是现阶段的研究热点。

目前认为人参皂苷是先经由异戊二烯途径合成2，3-氧化角鲨烯，然后2，3-氧化角鲨烯在经由后续步骤的羟基化、糖基化修饰最终生成各种人参单体皂苷。2，3-氧化鲨烯是甾醇和三萜等代谢产物生物合成的共同前体，也是异戊二烯途径的终产物。其生物合成路线为MVA途径生成的IPP及其异构化的DMAPP在牛儿基焦磷酸合成酶（GPS）作用下首先形成牛儿基焦磷酸（GPP），接着利用法尼基焦磷酸合成酶（FPS）转化成法尼基焦磷酸（FPP），又在鲨烯合成酶（SS）等的作用下合成鲨烯，然后经鲨烯环氧酶（SE）催化转变为2，3-氧化鲨烯。2，3-氧化鲨烯在环化酶的作用下生成植物甾醇和三萜类骨架。具体路线（1）2，3-氧化鲨烯在环阿桥醇合成酶（CAS）的作用下合成环阿桥醇，再经过一系列的催化反应生成植物甾醇；（2）2，3-氧化鲨烯在达玛烯二醇合成酶（DS）的作用下合成达玛烯二醇,生成的达玛烯二醇在酶的进一步的催化作用下将会合成具有生理活性的各种单体皂苷。

细胞色素P450（CYP450）是一类超基因家族编码的含有血红素的氧化酶类，分布于各种需氧生物体内，如植物、动物、真菌以及细菌等。在人参皂苷的合成途径中，P450对人参皂苷碳环骨架进行羟基化、氧化等复杂修饰作用，是人参皂苷合成途径中最为复杂的过程，最终决定人参皂苷单体的多样性。研究表明，在人参皂苷的合成途径中P450基因具有催化达玛烯二醇C-12位羟基化生成原人参二醇的原人参二醇合成酶（D12H）的功能。如何从P450家族众多基因中找出参与人参皂苷生物合成的基因并鉴定其功能，是通过生物工程合成重要药理作用的稀有人参皂苷的瓶颈。

目前，萜类的代谢工程研究常在大肠杆菌和酵母菌中进行基因操作。在大肠杆菌中，萜类环化酶基因表达及萜类化合物的生产受到诸多因素的限制。首先，体内异戊二烯合成前体物质的缺乏是一个重要的制约因素，其次，环化酶表达水平低下是限制萜类产量的另一重要因素。与大肠杆菌相比较，酵母表现出更活跃的异戊二烯代谢功能，基于以上分析及食品安全方面考虑，因此选取酿酒酵母作为宿主菌。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用酿酒酵母合成原人参二醇的方法，是一种在酿酒酵母菌中体外表达原人参二醇的方法，从而克服了西洋参中原人参二醇合成效率低，生产周期长，提取纯化困难等方面的问题。

原理为酿酒酵母中天然存在2，3-氧化角鲨烯，转入西洋参的达玛烯二醇合成酶和原人参二醇合成酶基因后，表达生成的达玛烯二醇合成酶可直接催化酵母中的2，3-氧化角鲨烯生成达玛烯二醇，原人参二醇合成酶可催化达玛烯二醇生成原人参二醇。

本发明中用到的西洋参中的基因PqDS和PqD12H为申请人在西洋参中首次，获得发现并克隆的两个与原人参二醇生物合成有关的新基因，现已发表在GeneBank上，基因登陆号为PqDS（KC316048）和PqD12H（JX569336）。

本发明利用pAUR123DNA质粒为穿梭载体，能够存在于大肠杆菌和酿酒酵母菌中，并且具有不同的筛选标记的特性，分别构建PqDS和PqD12H的表达载体pAUR123-PqDS和pAUR123-PqD12H，将两个表达载体pAUR123-PqDS和pAUR123-PqD12H转化到同一个酿酒酵母菌中获得重组酿酒酵母菌CICC-pAUR123-PqDS-PqD12H，从而实现在酿酒酵母菌中表达原人参二醇。

本发明的有益效果：

本发明利用酿酒酵母合成原人参二醇，合成效率高，生产周期短，纯化容易，生产成本低。

附图说明

图1是西洋参基因PqDS PCR扩增后电泳图。

图2是西洋参基因PqD12H PCR扩增后电泳图。

图3是重组质粒pAUR123-PqDS的酶切鉴定图。

图4是重组质粒pAUR123-PqD12H的酶切鉴定图。

图5是重组工程菌CICC-pAUR123-PqDS-PqD12H的菌落PCR鉴定图。

图6是原人参二醇标准品的高效液相检测图。

图7是空白对照组酿酒酵母菌菌液提取物的高效液相检测图。

图8是重组工程菌CICC-pAUR123-PqDS-PqD12H菌液的高效液相检测图。

具体实施方式

本发明是利利用pAUR123DNA质粒为穿梭载体，能够存在于大肠杆菌和酿酒酵母菌中，并且具有不同的筛选标记的特性，分别构建PqDS和PqD12H的表达载体pAUR123-PqDS和pAUR123-PqD12H，将两个表达载体pAUR123-PqDS和pAUR123-PqD12H转化到同一个酿酒酵母菌中获得重组酿酒酵母菌CICC-pAUR123-PqDS-PqD12H，从而实现在酿酒酵母菌中表达原人参二醇。

pAUR123-PqDS和pAUR123-PqD12H表达载体的构建

1、引物的设计与合成

（1）PqDS引物的设计与合成

根据NCBI已发表的人参DS基因序列号GU183405以及三七DS已发表基因序列号KC953035和Panax vietnamensis中已发表的DS基因序列号KF306328三个基因的保守区，通过Primer5.0设计简并引物。上下游引物分别为引物DS-F和引物DS-R。分别为

DS-F：5’-RTKGCAGCAGBAATGGTGTT-3’；

DS-R：5’-GTDGGGWTGTAGABGAATGDGA-3’。

（2）PqD12H引物的设计与合成

根据NCBI已发表的人参P450基因序列号JN604536以及番茄中CYP85A1家族的P450已发表基因NM001247334和拟南芥中的CYP85A1家族P450已发表基因NM203133三个基因的保守序列区，通过软件Primer5.0设计简并引物。上下游引物为引物P450-F和引物P450-R。分别为

P450-F：5'-RCAGYAGCAATGBTGTTGDT-3'；

P450-R：5'-TYHATTGTGGGGATVTAGA-3'。

引物的合成，由大连宝生物公司进行。（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝A／T，H＝A／C／T，B＝C／G／T，V＝A／C／G，D＝A/G/T，N=A／C／G/T）

2、PqDS和PqD12H基因的扩增

以西洋参发根为原材料，按照RNA提取试剂盒的操作说明提取西洋参的总RNA，经反转录后作为模板，分别以设计的DS-F、DS-R；P450-F、P450-R为引物进行PCR扩增，反应体系为25μl：西洋参模板1μl，dNTP1μl，5×LAbuffer2.5μl，引物1μl，引物R1μl，LA Taq高保真聚合酶（5U/μl）0.2μl，ddH₂O补充到25μl。PCR反应条件为：94℃，3min；94℃30sec，60℃45sec，72℃1min，30次循环；72℃10min。将获取的小片段分别采用RACE法进行全长目的基因的扩增，按照试剂盒进行操作后，分别获得了大约2300bp和1500bp的目的片段，如图1和图2所示；目的片段由金唯智公司进行测序整理后，确定为两条新的目的基因并发表于GeneBank，命名为PqDS以及PqD12H。分别为：PqDS，2331bp，登录号为KC316048；PqD12H，1459bp，登录号为JX569336。碱基序列见碱基序列表。

3、酵母表达载体的构建及酶切鉴定

（1）向目的基因添加酶切位点

将所获得的目的片段分析后，分别向片段的两端添加酶切位点Smal和Sacl以便于构建表达载体。通过软件Primer50重新设计的引物分别为

PqDS-F：5’-CCCGGGATGGCAGCAGCAATGGTGTT-3’；

PqDS-R：5’-GAGCTCGTGGGGATGTAGATGAATGGGA-3’；

PqDl2H-F：5’-CCCGGGATGGCAGCAGCAATGGTG-3’；

PqDl2H-R：5’-GAGCTCTTAATTGTGGGGATGTAGAT-3’。

PCR体系同上，反应条件分别为：PqDS，94℃，3min；94℃30sec，65℃45sec，72℃2min，30次循环，72℃10min；PqD12H，94℃，3min；94℃30sec，58℃45sec，72℃2min，30次循环，72℃10min。将PCR所得的产物进行切胶回收纯化。

(2)产物的双酶切及连接

pAUR123载体长度为6982bp，含有一个氨苄青霉素抗性基因(AMP)，可用作筛选标记，在酿酒酵母中的选择标记是AureobasidinA(AbA)。能够在酿酒酵母细胞中自主复制，其抗性基因是AUR1-C，含有可以在酿酒酵母中自主复制的序列CEN／ARS。

分别利用Smal和Sacl酶对两个PCR切胶回收目的片段及pAUR123表达载体进行双酶切。反应条件分别为：PCR切胶回收产物2μl，10×M Buffer1μl，Sacl 0.5μl，Smal 0.5μl，dH₂O16μl，共20μl，37℃反应1小时；载体pAUR1232μl，10×M Buffer1μl，Sacl 0.5μl，Smal 0.5μl，dH₂O16μl，共20μl，37℃反应1小时。

使用TaKaRa DNA Ligation Kit T4连接酶，将目的片段与pAUR123Vector进行连接，将目的片段与pAUR123Vector连接后，热转化至JM109中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落培养，提取质粒并分别命名为pAUR123-PqDS、pAUR123-PqD12H。分别利用双酶切方法进行目的基因的鉴定，结果如图3和图4所示。

表达载体的转化

（1）酿酒酵母感受态的制备

将酿酒酵母宿主菌（CICC，31476）培养于10ml YPD培养基中，30℃，200r/min振摇过夜，培养到OD600值为0.8-1.0时，收获细胞；取该菌液用新鲜温暖的YPD稀释到1-2×10⁶cells/ml，30℃，200rpm，摇晃培养约3～5小时，直到2×10⁷cells/ml，使产生3-4次分裂；用50ml离心管，4500rpm离心10min，收集菌体；25ml无菌水重悬，再次4500rpm离心10min收集菌体；用1ml100mM的TE/LiAc重悬，转移到1.5ml的离心管，12000rpm离心15sec，除去LiAc液体；再用400μl的100mM的LiAc重悬，约2×10⁹cells/ml，轻轻混匀细胞，30℃静止孵育5min即可获得酿酒酵母菌的感受态细胞。

（2）重组工程菌的构建

取1ml SS-DNA用沸水煮5min，并迅速在冰水中冷却，与上述感受态酿酒酵母菌液涡旋混匀后依次加入40%PEG4000，240μl；H₂O，74μl；SS-DNA，5μl（50ng）；Target DNA，5μl（500ng）；1M LiAc，36μl。然后强烈涡旋混匀1min，直到细胞完全悬浮；30℃静止孵育30min；42℃水浴热休克20-30min；6000-8000rpm离心15sec，去除转染混合液，再次离心，用移液器移去上层液体；细胞在1ml无菌水中重悬，用水稀释，轻轻混匀；取200μl菌液，用玻璃杆涂布于含抗生素ABA的YPD培养基平板，30℃孵育2-4天，至转化子出现，挑取单菌落进行扩大培养后，分别利用引物PqDS-F、PqDS-R；PqD12H-F、PqD12H-R对同一菌悬液进行PCR，PCR产物跑琼脂糖凝胶（1%）电泳，以确定同时将表达载体pAUR123-PqDS、PAUR123-PqD12H都转化到同一酿酒酵母菌中构建重组工程菌CICC-pAUR123-PqDS-PqD12H。结果如图5所示。

重组工程菌CICC-pAUR123-PqDS-PqD12H中原人参二醇的检测

（1）酵母提取液的抽提。

重组工程菌CICC-pAUR123-PqDS-PqD12H接种于含有抗生素ABA的培养基中，在30℃恒温箱中培养12小时后，再将菌种接种于液体培养基中，于30℃恒温摇床中培养17小时。取细胞培养液6000rpm离心5min，弃去上清液得到沉淀；用2ml的20%氢氧化钾和50%乙醇溶液溶解菌体5min；用等体积的正己烷抽提；用旋转蒸发仪减压蒸馏干燥正己烷萃取液；加入10mlHPLC级乙腈，待测。

（2）原人参二醇的检测

色谱条件的确定采用SHIMADZU公司的VP-C18ODS色谱柱（5μm，250mm×4.6mm），柱温：25℃，检测波长为202nm，进样体积为10μl，流动相由乙腈和水组成，流速0.8ml/min，流动相体系如下：

原人参二醇标准品、空白对照组酿酒酵母菌菌液提取物及重组工程菌菌液提取物经高效液相检测后的结果如图6、图7和图8所示。

从图中可以看出：重组工程菌菌液中能够检测出原人参二醇。所以本发明成功的达到了在酿酒酵母菌中表达原人参二醇的目的。

PqDS和PqD12H的碱基序列：

PqDS碱基序列：

AGATTAAGAATGTGGAAGCTGAAGGTTGCCCAAGGAAATGATCCATATTTGTATAGCACTAACAACTTTGTTGGCAGACAATATTGGGAGTTTCAGCCCGATGCTGGTACTCCAGAAGAGAGGGAAGAGGTTGAAAAAGCACGCAAGGATTATGTAAACAATAAAAAGCTACATGGAATTCATCCATGCAGTGATATGCTGATGCGCAGGCAGCTTATTAAAGAAAGTGGAATCGATCTCCTAAGCATACCGCCGGTGAGATTAGATGAAAACGAACAAGTGAACTACGATGCAGTTACAACCGCTGTGAAGAAAGCTCTTCGATTGAACCGGGCAATTCAAGCACACGATGGTCACTGGCCAGCTGAAAATGCAGGCTCTTTACTTTATACACCTCCCCTTATCATTGCCCTATATATCAGCGGAACGATTGACACTATTCTGACAAAACAACACAAGAAGGAACTGATTCGCTTCGTTTACAACCATCAAAATGAGGATGGTGGATGGGGATCCTATATTGAGGGGCACAGCACGATGATTGGGTCAGTACTTAGCTACGTGATGTTACGTTTGCTAGGAGAAGGATTAGCTGAATCTGATGATGGAAATGGTGCAGTTGAGAGAGGCCGGAAGTGGATACTTGATCATGGAGGTGCAGCCAGCATACCCTCTTGGGGAAAGACTTATCTAGCGGTGCTTGGAGTATATGAGTGGGAAGGGTGCAACCCGCTGCCCCCAGAATTCTGGCTTTTCCCTTCAAGTTTTCCTTTTCATCCAGCAAAAATGTGGATCTACTGCCGGTGCACCTACATGCCAATGTCGTATTTGTATGGGAAGAGATATCATGGACCAATAACCGATCTTGTTTTATCTTTGAGGCAAGAAATTTACAACATTCCTTATGAGCAGATAAAGTGGAATCAACAGCGCCATAACTGTTGCAAGGAGGATCTCTACTACCCTCATTCCCTTGTACAAGACCTGGTTTGGGATGGTCTTCACTACTTTAGTGAACCATTCCTCAAACGTTGGCCCTTCAACAAACTGCGAAAAAGAGGTCTAAAAAGAGTTGTTGAACTAATGCGCTATGGTGCCACCGAGACCAGATTCATAACCACAGGAAATGGGGAAAAAGCTTTACAAATAATGAGTTGGTGGGCAGAAGATCCCAATGGTGATGAGTTTAAACATCACCTTGCTAGAATTCCTGATTTCTTATGGATTGCTGAGGATGGAATGACAGTACAGAGTTTTGGTAGTCAACTATGGGACTGTATTCTTGCTACTCAAGCAATTATCGCCACCAATATGGTTGAAGAATACGGAGATTCTCTTAAGAAGGCGCATTTCTTCATCAAAGAATCGCAGATAAAAGAAAATCCAAGAGGAGACTTCTTAAAAATGTGTCGACAGTTTACCAAAGGTGCGTGGACTTTCTCTGATCAAGATCATGGTTGCGTTGTCTCGGACTGCACAGCTGAAGCGCTAAAGTGCCTACTGTTACTTTCACAAATGCCACAGGACATTGTCGGAGAAAAACCTGAGGTTGAGCGATTATATGAGGCTGTGAATGTTCTTCTCTATTTGCAGAGTCGTGTAAGTGGTGGCTTCGCAGTTTGGGAGCCTCCAGTTCCAAAACCATATTTGGAGATGTTGAATCCTTCAGAAATTTTTGCAGACATTGTTGTTGAGAGAGAGCACATTGAATGCACTGCATCTGTAATCAAAGGTCTGATGGCATTTAAATGCTTGCATCCTGGGCATCGTCAGAAAGAGATAGAGGATTCTGTGGCGAAAGCCATCCGTTATCTTGAAAGAAACCAAATGCCTGATGGTTCATGGTATGGCTTTTGGGGAATTTGTTTCCTCTATGGGACATTTTTTACCCTATCTGGGTTTGCTTCTGCTGGGAGGACTTATGACAACAGTGAAGCAGTTCGTAAGGGTGTTAAATTTTTCCTTTCAACACAAAATGAAGAAGGTGGTTGGGGGGAGAGTCTTGAATCATGCCCAAGCGAGAAATTTACACCACTCAAGGGAAACAGAACAAATCTAGTACAAACATCATGGGCTATGCTAGGTCTTATGTTTGGTGGACAGGCCGAGAGAGATCCGACACCTCTGCATAGAGCAGCGAAGTTGTTGATCAATGCGCAAATGGATAATGGAGATTTCCCTCAACAGGAAATTACTGGAGTATACTGTAAAAATAGTATGTTACATTATGCGGAGTACAGAAATATATTTCCTCTTTGGGCACTCGGAGAATATCGGAAACGTGTTTGGTTGCCTAAGCACCAGCAGCTCAAAATTTAAGTTACATTCTTA

PqD12H的碱基序列：

GGCAGCAGCAATGGTGTTGTTTTTCTCCCTATCTCTTCTTCTCCTTCCCCTATTATTATTGTTTGCCTATTTTTCTTATACAAAACGCATCCCCCAGAAAGAAAATGATTCAAAAGCTCCCCTCCCCCCAGGTCAAACAGGTTGGCCTTTGATAGGCGAAACTCTTAATTATTTATCTTGTGTCAAAAGTGGGGTTTCTGAAAATTTTGTGAAATACAGGAAGGAAAAGTATTCCCCCAAAGTTTTCAGGACATCACTTTTAGGAGAACCGATGGCAATCTTGTGTGGGCCGGAGGGCAACAAATTCCTCTACTCAACGGAAAAAAAGCTAGTCCAAGTTTGGTTCCCGAGCAGTGTTGAAAAGATGTTCCCCAGATCTCATGGAGAATCCAACGCAGACAACTTCTCCAAAGTACGCTGCAAAATGATGTTTCTACTCAAGGTGGACGGGATGAAAAAATATGTTGGCCTAATGGACAGGGTGATGAAACAGTTTTTAGAGTCAGATTGGAATCGCCAACAACAGATCAACGTTCATAACACGGTTAAGAAATACACGGTCACGATGTCGTGTCGGGTGTTTATGAGTATCGATGATGAAGAGCAAGTTACAAGACTTGGCAGCTCAATTCAGAACATAGAGGCCGGACTCCTTGCCGTGCCTATAAATATACCGGGGACTGCTATGAATCGTGCCATTAAGACCGTAAAGTTGCTAACTAGAGAAGTTGAGGCGGTGATTAAGCAAAGAAAAGTGGATCTTTTGGAGAATAAGCAAGCGTCCCAACCGCAAGATTTATTGTCACACTTGCTACTTACGGCCAATCAGGATGGCCAATTTTTGAGCGAATCGGATATTGCTAGCCACTTGATAGGCTTGATGCAAGGTGGCTATACCACCTTAAATGGTACAATCACCTTCGTTCTCAACTATCTTGCAGAGTTTCCTGATGTCTACAATCAAGTCCTTAAAGAGCAAGTGGAAATAGCAAACTCAAAACACCCAAAAGAGTTGCTTAATTGGGAGGATTTGAGGAAGATGAAGTATTCGTGGAATGTTGCTCAAGAGGTATTGAGAATAATACCACCAGGAGTTGGAACATTCAGAGAAGCTATTACCGATTTCACCTATGCTGGATATTTAATTCCAAAGGGATGGAAGATGCATCTGATTCCACATGACACGCACAAGAACCCAACATATTTTCCAAGTCCAGAAAAATTCGATCCAACCAGGTTTGAAGGAAATGGACCGGCTCCATATACATTTACTCCTTTCGGAGGAGGACCTCGAATGTGTCCGGGAATTGAGTATGCACGTCTAGTAATACTCATTTTTATGCACAATGTGGTTACAAACTTCAGATGGGAGAAGCTCATCCCTAATGAAAAAATTCTCACCGATCCCATTCCAAGATTTGCGCATGGACTTCCCATTCATCTACATCCCCACAATTAA

Claims (2)

1.一种利用酿酒酵母合成原人参二醇的方法，该方法是：利用pAUR123DNA质粒为穿梭载体，能够存在于大肠杆菌和酿酒酵母菌中，并且具有不同的筛选标记的特性，分别构建PqDS和PqD12H的表达载体pAUR123-PqDS和pAUR123-PqD12H，将两个表达载体pAUR123-PqDS和pAUR123-PqD12H转化到同一个酿酒酵母菌中获得重组酿酒酵母菌CICC-pAUR123-PqDS-PqD12H，从而实现在酿酒酵母菌中表达原人参二醇。

2.根据权利要求1所述的一种利用酿酒酵母合成原人参二醇的方法，其特征在于：所述的PqDS和PqD12H的碱基序列如碱基序列表所示。

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