CN115704038A - 一种基因、重组载体、工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种基因、重组载体、工程菌及其应用。一种柠檬烯合酶LS基因，所述柠檬烯合酶LS基因选自如下a1)或a2)所示的DNA片段；a1)编码链的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA片段；a2)与a1)限定的DNA片段具有90％或以上同一性且编码具有相同功能的蛋白质的DNA片段。所述柠檬烯合酶LS基因为经过优化的柠檬烯合酶LS基因，可以在宿主细胞中顺利表达。

Description

一种基因、重组载体、工程菌及其应用

技术领域

本申请涉及一种基因、重组载体、工程菌及其应用，属于本发明属于基因工程领域。

背景技术

柠檬烯是一种天然的功能单萜。普遍存在于植物中，且是构成某些植物香精、树脂、色素等的主要成分。此外，柠檬烯是芳樟醇、香芹醇、紫苏醇、薄荷醇等的生物合成前体。因柠檬烯及其衍生物香气怡人、具有独特的生物活性和良好的理化性质等特点，被广泛应用于食品、饮料、保健品、医药、化妆品、生物材料、生物燃料等高附加值精细化工行业。

柠檬烯的生产方法主要有植物提取和化学合成两种。从植物源中分离出来的柠檬烯丰度或产量较低，且该方法提取效率低，反应条件苛刻，设备昂贵，这在经济上是不可行的。由于设备和原料的限制，化学合成柠檬烯不仅效率低、成本高、获得单一对映体较为困难，而且由于能源的消耗也会造成环境问题。微生物法生产柠檬烯具有先天优势，目前最主要的是克服柠檬烯对底盘微生物的毒性问题，随着生物技术的快速发展，通过代谢工程改造微生物生产柠檬烯已成为一个有潜力的替代。

先前的研究主要集中在对大肠杆菌和酿酒酵母两种常规菌株及非常规菌株解脂耶氏的改造，但产量都不是很高。如2019年，Dudley研究组将柠檬烯生物合成途径在大肠杆菌中过表达，裂解细胞等到途径酶，以葡萄糖作为底物进行柠檬烯的无细胞生物合成，并对辅因子水平进行调节，最终得到90.2mg/L的柠檬烯(Dudley Q M,Nash C J,Jewett MC.Cell-free biosynthesis of limonene using enzyme-enriched Escherichia colilysates.Synth Biol,2019,4(1):ysz003.)；Rolf研究组将来自留兰香的柠檬烯合酶和甲羟戊酸途径引入大肠杆菌，以苯二甲酸二异壬酯作为原位萃取剂进行补料分批发酵，得到7.3g/L_org的柠檬烯，这是迄今为止最高的产量(Rolf J,Julsing M K,Rosenthal K,etal.A Gram-Scale Limonene Production Process with Engineered Escherichiacoli.Molecules,2020,25(8):1881-1892.)。Hu研究组在酿酒酵母引入来自柠檬的d-柠檬烯合酶及过表达内源性香叶基二磷酸合酶基因(ERG20)及其变体ERG20^F96W-N127W增加流向柠檬烯的代谢通量，对发酵条件进行优化后得到23.7mg/L d-柠檬烯(Hu Z,Lin L,Li H,etal.Engineering Saccharomyces cerevisiae for production of the valuablemonoterpene d-limonene during Chinese Baijiu fermentation.J Ino MicrobiolBiot,2020,47(1).)；Dusseaux研究组将甲羟戊酸途径及柠檬烯合成途径定位到过氧化物酶体上，利用细胞器的分区作用，将柠檬烯的生物合成隔离开，使更多的代谢流流向目标产物，构建的平台菌株还能够有效的合成其他萜类物质(如香叶醇、桧烯、单帖吲哚生物碱等)，最终通过分批补料发酵得到2.58g/L柠檬烯(Dusseaux S,Wajn W T,Liu Y,etal.Transforming yeast peroxisomes into microfactories for the efficientproduction of high-value isoprenoids.Proc Natl Acad Sci U S A,2020,117(50):31789-31799.)。Cheng研究组将柠檬烯合成途径引入解脂耶氏酵母，并对柠檬烯合成途径、甲羟戊酸途径及培养基进行优化，得到的高产菌株进行分批补料发酵，产生165.3mg/L的柠檬烯(Cheng B Q,Wei L J,Lv Y B,et al.Elevating Limonene Production inOleaginous Yeast Yarrowia lipolytica via Genetic Engineering of LimoneneBiosynthesis Pathway and Optimization of Medium Composition.BiotechnologyBioproc E,2019,24(3):500-506.)。大肠杆菌虽然柠檬烯的产量很高，但大肠杆菌中的质粒是以游离形式存在，导致菌株鲁棒性不好，不适合工业使用；基因通过整合到酵母基因组上可以提高其稳定性，但通过此种方式改造的酵母菌株生物合成柠檬烯的能力还较低，限制了柠檬烯的工业生产，目前丞需高产柠檬烯的基因工程菌。

发明内容

根据本申请的一个方面，提供一种柠檬烯合酶LS基因，所述柠檬烯合酶LS基因为经过优化的柠檬烯合酶LS基因，可以在宿主细胞中顺利表达。

一种柠檬烯合酶LS基因，所述柠檬烯合酶LS基因选自如下a1)或a2)所示的DNA片段；

a1)编码链的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

a2)与a1)限定的DNA片段具有90％或以上同一性且编码具有相同功能的蛋白质的DNA片段。

可选地，所述a1)为：

a1)序列是SEQ ID NO.1所示的DNA片段。

根据本申请的一个方面，提供一种橙花基焦磷酸合酶NPPS基因，所述橙花基焦磷酸合酶NPPS基因选自如下A1)或A2)所示的DNA片段；

A1)编码链的编码序列是SEQ ID NO.2所示的DNA片段；

A2)与A1)限定的DNA片段具有90％或以上同一性且编码具有相同功能的蛋白质的DNA片段。

可选地，所述A1)为：

A1)序列是SEQ ID NO.2所示的DNA片段。

根据本申请的一个方面，提供一种重组载体I，所述重组载体I为在整合型骨架载体I中插入片段I；

所述片段I含有目的基因模块I；

所述目的基因模块I的核苷酸序列含有上述任一项所述的柠檬烯合酶LS基因的核苷酸序列和上述任一项所述的橙花基焦磷酸合酶NPPS基因的核苷酸序列。

可选地，顺着表达方向，所述目的基因模块I的核苷酸序列依次含有柠檬烯合酶LS基因的核苷酸序列和橙花基焦磷酸合酶NPPS基因的核苷酸序列；所述柠檬烯合酶LS基因的核苷酸序列和所述橙花基焦磷酸合酶NPPS基因的核苷酸序列之间通过连接肽基因连接；

优选地，所述目的基因模块I的核苷酸序列还含有N-端跨膜区截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR基因的核苷酸序列；

可选地，顺着表达方向，所述目的基因模块I的核苷酸序列依次含有柠檬烯合酶LS基因的核苷酸序列、橙花基焦磷酸合酶NPPS基因的核苷酸序列和N截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR基因的核苷酸序列；

所述柠檬烯合酶LS基因的核苷酸序列和所述橙花基焦磷酸合酶NPPS基因的核苷酸序列之间、所述橙花基焦磷酸合酶NPPS基因的核苷酸序列和所述N截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR基因的核苷酸序列之间分别通过连接肽基因连接；

可选地，所述目的基因模块I的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示或如SEQ ID No.4的第1～4128位碱基所示；

可选地，所述片段I中，在所述目的基因模块I的核苷酸序列的上游还含有启动子I的核苷酸序列；

可选地，所述启动子I选自ARA、GPD、TEF2、XYL中的任一种；

可选地，所述插入为利用片段I替换所述整合型载体I的ECoRV识别位点和SpeI识别位点间的较小片段，保持整合型载体I的其它核苷酸序列不变；

可选地，所述整合型骨架载体I为农杆菌介导的双元表达载体；

可选地，所述整合型骨架载体I选自Gateway Vector pB4GWnY和Takara pRI中的任一种。

根据本申请的一个方面，提供一种工程菌，所述工程菌通过将重组载体A转化到宿主细胞中得到；

所述重组载体A包括上述任一项所述的重组载体I。

可选地，所述重组载体A还包括重组载体II；

所述重组载体II为在整合型骨架载体II中插入片段II；

所述片段II含有目的基因模块II；

所述目的基因模块II的核苷酸序列含有MVA途径基因中的至少一种的核苷酸序列；

可选地，所述MVA途径基因包括马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶MmMK基因、粪肠球菌的甲羟戊酸合酶EfMvaS基因、粪肠球菌乙酰乙酰辅酶A硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶EfMvaE基因中的至少一种；

可选地，顺着表达方向，所述目的基因模块II的核苷酸序列依次含有马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶MmMK基因核苷酸序列、粪肠球菌的甲羟戊酸合酶EfMvaS基因核苷酸序列、粪肠球菌乙酰乙酰辅酶A硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶EfMvaE基因核苷酸序列；

所述MVA途径基因包括马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶MmMK基因核苷酸序列和所述粪肠球菌的甲羟戊酸合酶EfMvaS基因核苷酸序列之间、所述粪肠球菌的甲羟戊酸合酶EfMvaS基因核苷酸序列和粪肠球菌乙酰乙酰辅酶A硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶EfMvaE基因核苷酸序列之间分别通过连接肽连接；

可选地，所述目的基因模块II的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5所示；

可选地，所述片段II中，在所述目的基因模块II的核苷酸序列的上游还含有启动子II的核苷酸序列；

优选地，所述启动子II选自ARA、GPD、TEF2、XYL中的任一种；

可选地，所述插入为利用片段II替换所述整合型骨架载体II的ECoRV识别位点和SpeI识别位点间的较小片段，保持整合型骨架载体II的其它核苷酸序列不变；

可选地，所述整合型骨架载体II为农杆菌介导的双元表达载体，所述转化通过农杆菌介导介导转化；

可选地，所述整合型骨架载体II选自Gateway Vector pB4GWnY和Takara pRI中的任一种。

可选地，所述宿主细包括红酵母属真菌中的至少一种；

可选地，所述红酵母属真菌包括圆红冬孢酵母、粘红酵母、瘦果红酵母、禾本红酵母中的任一种；

可选地，所述红酵母属真菌为敲除类胡萝卜素合成途径的红酵母属真菌。

可选地，所述N-端跨膜区截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR指的是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR的第1～798位氨基酸被截去。

可选地，所述N-端跨膜区截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR的核苷酸序列如SEQ ID No.4的第2578～4128位碱基所示。

根据本申请的一个方面，提供一种产柠檬烯的方法，所述方法包括以下步骤：培养上述任一项所述工程菌，得到所述柠檬烯。

可选地，所述方法包括以下步骤：

将工程菌在培养基I中发酵I得到发酵液I，加入十二烷I，继续发酵，得到所述柠檬烯；

可选地，所述发酵I的条件包括：

温度为15～35℃；

转数为100～200rpm；

时间为8～144h；

优选地，所述继续发酵的条件为：

温度为15～35℃；

转数为100～200rpm；

时间为4～7d；

可选地，所述十二烷I和所述培养基I的体积比为1:2～5。

可选地，所述十二烷I和所述培养基I的体积比为1：3～5。

可选地，用正己烷对继续发酵得到的发酵液进行二次萃取，得到所述柠檬烯；

可选地，所述方法包括以下步骤：

将种子液、十二烷II加入培养基II中，发酵II，得到所述柠檬烯；

可选地，所述种子液和所述培养基II的体积比为1～15：85～99；

所述十二烷II和所述培养基II的体积比为1:2～5。

可选地，所述十二烷II和所述培养基II的体积比为1：3～5。

所述发酵II的条件包括：

pH为3.0～6.5；

通气量为0.5～3L/min；

搅拌速度为50～350rpm；

葡萄糖浓度高于2g/L；

可选地，发酵II过程中，当葡萄糖浓度降低至2g/L以下时进行以下补料：

补充葡萄糖20～50g/L，补充酵母浸粉10～20g/L，补充硫酸铵2～10g/L.

可选地，发酵II过程中，当葡萄糖浓度降低至2g/L以下时进行以下补料：

补充葡萄糖20～30g/L，补充酵母浸粉15～20g/L，补充硫酸铵5～10g/L。

可选地，发酵II过程中，当葡萄糖浓度降低至2g/L以下时进行以下补料：

补充葡萄糖20～25g/L，补充酵母浸粉18～20g/L，补充硫酸铵8～10g/L。

经过补料5～10次，结束发酵II；

可选地，所述种子液经过如下步骤得到：

单菌落在培养基A中培养A，得到第一种子液，第一种子液在培养基B中培养B，得到所述种子液；

可选地，所述第一种子液和所述培养基B的体积比为1～10：50～100；

可选地，所述培养A和培养B的条件独立地包括：

温度为15～35℃；

转数为100～200rpm；

时间为12～48h。

作为一种实施方案，本申请提供一种产柠檬烯的红酵母基因工程菌，其是将优化的基因LS和NPPS与携带抗生素的载体连接，形成重组载体，然后转化敲除类胡萝卜素的红酵母(Rhodotorula/Rhodosporidium toruloides)构建而成，所述优化的基因柠檬烯合酶LS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述优化的橙花基焦磷酸合酶基因NPPS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

可选地，所述重组载体为质粒Xyl-LN-Ntc，所述质粒Xyl-LN-Ntc，XYL为启动子，LN为柠檬烯合酶LS和橙花基焦磷酸合酶基因NPPS利用2A肽连接形成的基因模块，质粒Xyl-LN-Ntc的目的基因模块的序列如序列表SEQ ID No.3所示；所述敲除类胡萝卜素的红酵母为红酵母np11按照Sun W,Yang X,Wang X,et al.Homologous gene targeting of acarotenoids biosynthetic gene in Rhodosporidium toruloides by Agrobacterium-mediated transformation.Biotechnol Lett,2017,39:1001-1007中的制备方法制得。

可选地，其是将XYL-20190821-Ble转化敲除类胡萝卜素红酵母(R.toruloides)构建而成。所述质粒XYL-20190821-Ble，XYL为启动子，20190821为柠檬烯合酶LS、橙花基焦磷酸合酶基因NPPS和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR利用2A肽连接形成的基因模块，质粒XYL-20190821-Ble的目的基因模块和his标签融合得到的序列如序列表SEQ ID No.4所示。

可选地，其是将XYL-KSE-Ntc转化转化体A构建而成，所述质粒XYL-KSE-Ntc的目的基因模块如序列表SEQ ID No.5所示；

可选地，所述转化体A是将所述质粒XYL-20190821-Ble转化敲除类胡萝卜素红酵母(R.toruloides)构建而成。

作为另一种实施方案，本申请提供一种产柠檬烯的方法，其包括以下的步骤：培养上述任一项所述的产柠檬烯的敲除类胡萝卜素红酵母基因工程菌，添加十二烷进行两相原位萃取发酵得发酵液及十二烷相，发酵完成利用正己烷进行萃取离心得有机相。

可选地，所述的十二烷的体积与发酵液的体积之比为1:2～5，较佳的为1:3，所述的体积比为所述十二烷与添加十二烷前所述发酵液的体积比。

作为另一种实施方案，本申请提供上述任一项所述的产柠檬烯的红酵母基因工程菌在制备柠檬烯中的应用。

作为另一种实施方案，本申请提供一种制备产产柠檬烯的红酵母基因工程菌的方法，其包括以下的步骤：

(1)构建含有优化的基因LS和优化的基因NPPS的重组载体，所述优化的基因LS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述优化的基因NPPS的核苷酸序列如序列表SEQID No.2所示。

(2)按照Sun W,Yang X,Wang X,et al.Homologous gene targeting of acarotenoids biosynthetic gene in Rhodosporidium toruloides by Agrobacterium-mediated transformation.Biotechnol Lett,2017,39:1001-1007中的制备方法制备敲除类胡萝卜素合成途径的红酵母np11。

(3)将步骤(1)制备的Xyl-LN-Ntc重组载体转化步骤(2)制得的敲除类胡萝卜素的红酵母(R.toruloides)，得产柠檬烯的转化体。

可选地，其还包括以下的步骤：

(4)构建质粒XYL-20190821-Ble，将所述质粒XYL-20190821-Ble，转化步骤(2)所得的敲除类胡萝卜素合成途径的红酵母np11，所述质粒XYL-20190821-Ble的目的基因核苷酸序列和his标签融合得到的序列如序列表SEQ ID No.4所示.

(5)构建质粒XYL-KSE-Ntc，将所述质粒XYL-KSE-Ntc，转化步骤(4)所得的转化体，所述质粒XYL-KSE-Ntc的目的基因核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5所示。

作为另一种实施方案，本申请提供一种用于制备上述任一项所述的产柠檬烯的红酵母基因工程菌的重组载体，其含有优化的基因LS和优化的基因NPPS，所述优化的基因LS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述优化的基因NPPS的核苷酸序列如序列表SEQID No.2所示；所述的重组载体为将所述的优化的基因LS和优化的基因NPPS导入质粒pZPK而得的质粒Xyl-LN-Ntc，所述质粒Xyl-LN-Ntc的目的基因模块的序列如列表SEQ ID No.3所示。

作为另一种实施方案，本申请提供一种产柠檬烯的红酵母基因工程菌及其应用。该基因工程菌是将密码子优化的柠檬烯合酶LS和橙花基焦磷酸合酶NPPS基因分别与携带抗生素的载体连接，形成重组载体，然后转化敲除类胡萝卜素的红酵母(Rhodotorula/Rhodosporidium toruloides)构建而成，所述优化的基因LS和NPPS的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1～2所示。在此基础上同时过表达内源N截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR和引入异源甲羟戊酸MVA途径相关关键酶(缩写为KSE：分别是来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶MmMK；来源于粪肠球菌的甲羟戊酸合酶EfMvaS；粪肠球菌的乙酰乙酰辅酶A硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶EfMvaE)，对构建的高产柠檬烯工程菌株进行两相发酵，为了解除柠檬烯对工程菌株的毒性，增加工程菌株的鲁棒性的同时进一步提高柠檬烯的产量，通过添加十二烷进行柠檬烯的原位萃取，通过优化其产量达5g/L。该基因工程菌株能用于大规模商业化生产，且前景良好。

本申请能产生的有益效果包括：

(1)本申请所提供的柠檬烯合酶LS基因/橙花基焦磷酸合酶NPPS基因，为经过优化的基因，可以在宿主细胞中异源表达，从而达到产柠檬烯的目的。

(2)本申请所提供的重组载体，可以将柠檬烯合成相关酶的基因整合到宿主细胞中，提高了产柠檬烯工程菌的稳定性和产量。

(3)本申请所提供的工程菌，基因组中整合有柠檬烯合成相关酶的基因，不仅产量高，而且菌株鲁棒性好，适合工业使用。

(4)本申请所提供的产柠檬烯的方法，工艺简单、产量高，适合扩大化生产。

附图说明

图1为本申请引入柠檬烯合成基因后红酵母合成柠檬烯的代谢途径。

图2为含有柠檬烯合成基因LS和NPPS的质粒Xyl-LN-Ntc的质粒结构图。

图3为含有过表达HMGR基因的质粒XYL-20190821-Ble的质粒结构图。

图4为含有过表达异源MVA途径基因的质粒XYL-KSE-Ntc的质粒结构图。

图5为菌株Xyl-LN-Ntc-np11-9、pZPK-20190821-Ntc-ΔCrt-np11-16和pZPK-201908212-KSE-

Ntc-ΔCrt-np11-6发酵生产柠檬烯的结果图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

其中，实施例中的出发菌株红酵母(圆红冬孢酵母R.toruloides)从大连化物所获得，为本领域常规红酵母np11，在Fems Yeast Research(Lin X,Wang Y,Zhang S,etal.Functional integration of multiple genes into the genome of the oleaginousyeast Rhodosporidium toruloides.Fems Yeast Research,2014(4):547-555.)已有公开。

本发明实施例尽管采用菌株np11作为出发菌株，但常规的红酵母(R.toruloides)均能作为出发菌株，用以转化，以进行实施例中的试验。

另外，红酵母属Rhodotorula中的粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、瘦果红酵母(Rhodotorula acheniorum)和禾本红酵母(Rhodotorula graminis)也可以作为出发菌株。

敲除类胡萝卜素合成途径的红酵母np11按照Sun W,Yang X,Wang X,etal.Homologous gene targeting of a carotenoids biosynthetic gene inRhodosporidium toruloides by Agrobacterium-mediated transformation.BiotechnolLett,2017,39:1001-1007中的制备方法制备。

本申请的重组载体、工程菌，可以重复本申请所公开的方法获得。

本申请所述优化的基因LS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.l所示；所述优化的基因NPPS核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

ECoRV内切酶购自Takara；

SpeI内切酶购自Takara；

本申请构建重组载体所用的骨架载体为Gateway Vector pB4GWnY。

本申请中，接种比例指的是菌种液：发酵培养基和菌种液体体积之和，例如15％的接种比例，指的是菌种液的体积为15，发酵培养基体积为85，发酵培养基和菌种液体体积之和为100。

图1为本申请引入柠檬烯合成基因后红酵母合成柠檬烯的代谢途径，其中，Glucose为葡萄糖、Acetyl-coA为乙酰辅酶A、HMG-CoA为羟甲基戊二酰辅酶A、Mevalonate为甲羟戊酸、Mevalonate-5P为5-磷酸甲羟戊酸、IPP为异戊烯基焦磷酸、DMAPP为二甲基烯焦磷酸、NPP为橙花基焦磷酸、GPP为香叶基焦磷酸、FPP为法尼基焦磷酸、Carotenoids为类胡萝卜素、Limonene为柠檬烯、EfMvaE为来自粪肠球菌的乙酰乙酰辅酶A硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶、EfMvaS为来自粪肠球菌的甲羟戊酸合酶、MmMK为来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶、ACCT为乙酰辅酶A C-酰基转移酶、HMGS为羟甲基戊二酰辅酶A合酶、HMG-R为羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、MK为甲羟戊酸激酶、IDI为异戊烯基二磷酸Δ异构酶、NPPS为橙花基二磷酸合酶、FPPS为法尼基二磷酸合酶、CrtI为类胡萝卜素去饱和酶、LS1为柠檬烯合酶1。

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中缺乏高产柠檬烯的基因工程菌的不足，提供一种产柠檬烯的红酵母基因工程菌及其应用。

发明人付出创造性劳动后发现，针对红酵母引入柠檬烯合成相关基因，将两个柠檬烯合成相关基因——即来源于柠檬，可将橙花基二磷酸转化为柠檬烯的LS基因；和来源于番茄，可将异戊烯基焦磷酸和二甲烯丙基焦磷酸缩合为橙花基二磷酸的NPPS基因分别进行优化后，将这两个优化后的基因转化敲除类胡萝卜途径的红酵母能够使其产生柠檬烯。发明人进一步发现，在优化两个基因的基础上过表达将羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原为甲羟戊酸的基因HMGR，能够提高柠檬烯的产量(见图1)。且发明人还发现，在优化两个基因的基础上，引入异源MVA途径相关基因(缩写为KSE)，即来自粪肠球菌的双功能酶乙酰乙酰辅酶A硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(EfMvaE)，可将乙酰辅酶A还原为乙酰乙酰辅酶A，和将HMG-CoA还原为甲羟戊酸；来自粪肠球菌的将乙酰乙酰辅酶A转化为HMG-CoA的甲羟戊酸合酶(EfMvaS)；和来自马氏甲烷八叠球菌的将甲羟戊酸转化为磷酸甲羟戊酸的甲羟戊酸激酶(MmMK)，能够极大的提高柠檬烯的产量。此外，发明人发现在发酵时添加十二烷作为覆盖层，能够更好的促进基因工程菌株合成柠檬烯。

本发明提供的技术方案如下：

本发明的技术方案之一为：一种产柠檬烯的红酵母基因工程菌，其是将含有优化的基因LS和优化的基因NPPS的重组载体转化敲除类胡萝卜途径的红酵母(R.toruloides)构建而成，所述优化的基因LS的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.l所示；所述优化的基因NPPS核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

本发明中，所述野生型红酵母(R.toruloides)为本领域常规红酵母np11，并按照Sun W,Yang X,Wang X,et al.Homologous gene targeting of a carotenoidsbiosynthetic gene in Rhodosporidium toruloides by Agrobacterium-mediatedtransformation.Biotechnol Lett,2017,39:1001-1007中的制备方法制备敲除类胡萝卜素合成途径的红酵母np11，从大连化学物理研究所获得。

所述的优化的基因LS将来源于柠檬的LS基因的核苷酸序列进行优化后得到；所述优化的基因NPPS将来源于番茄的NPPS基因的核苷酸序列进行优化后得到。

本发明中，较佳地，所述的重组载体含有ECoRV和SpeI的酶切位点。较佳地，所述重组载体还含有启动子和/或终止子序列。更佳地，所述重组载体还含有强启动子XYL。

本发明所述的重组载体所用的骨架载体为本领域常规的骨架载体，其能够转化红酵母，并含有上述的优化的基因LS和基因NPPS即可。

所述的重组载体为将上述的优化的基因LS和优化的基因NPPS导入骨架载体Gateway Vector pB4GWnY而得的重组质粒Xyl-LN-Ntc，所述质粒Xyl-LN-Ntc的目的基因模块的序列如序列表SEQ ID No.3所示，所述Ntc为诺尔丝菌素(Nourseothricin)作为抗性标记，用于筛选转化子。

本发明中，将上述的质粒Xyl-LN-Ntc转化上述红酵母(R.toruloides)得到能够产柠檬烯的基因工程菌株，将其命名为Xyl-LN-Ntc-np11-9。

本发明的技术方案之二为：一种产柠檬烯的红酵母基因工程菌株，更佳地，本发明所述的产柠檬烯的红酵母基因工程菌是将质粒XYL-20190821-Ble转化上述敲除类胡罗卜合成途径的红酵母(R.toruloides)得到能够产柠檬烯的基因工程菌株，将其命名为pZPK-20190821-Ntc-ΔCrt-np11-16。所述质粒XYL-20190821-Ble的目的基因模块和his标签融合得到的序列如序列表SEQ ID No.4所示，所述Ble为博来霉素(Bleomycin)作为抗性标记，用于筛选转化子。

其中，所述质粒XYL-20190821-Ble中含有来源于红酵母的内源基因HMGR(NCBI中登录号为XP_016270872.1，2012年7月12日)。

本发明中，将上述的质粒XYL-20190821-Ble转化上述的红酵母(R.toruloides)构建而成的红酵母基因工程菌株pZPK-20190821-Ntc-ΔCrt-np11-16，能够产生更多的柠檬烯。

本发明的技术方案之三为：一种产柠檬烯的红酵母基因工程菌株，最佳地，本发明所述的产柠檬烯的红酵母基因工程菌是将质粒XYL-KSE-Ntc转化菌株得更高产柠檬烯的基因工程菌株，将其命名为pZPK-201908212-KSE-Ntc-ΔCrt-np11-6。所述质粒XYL-KSE-Ntc的目的基因模块序列如序列表SEQ ID No.5所示。

其中，所述质粒XYL-KSE-Ntc中含有来源于马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶(MmMK)、来源于粪肠球菌的甲羟戊酸合酶(EfMvaS)、来源于粪肠球菌的乙酰辅酶A硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(EfMvaE)。

本发明中，将上述的质粒XYL-KSE-Ntc转化菌株构建而成的红酵母基因工程菌株pZPK-201908212-KSE-Ntc-ΔCrt-np11-6，能产生更多的柠檬烯。

本发明的技术方案之四为：一种产柠檬烯的方法，其包括以下的步骤：对上述产柠檬烯的红酵母基因工程菌株分别进行两相发酵。

本发明中，所述培养基为本领域常用的培养基，较佳的为种子培养基及发酵培养基为YPD培养基。所述YPD培养基由20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨和10g/L酵母提取物组成。

本发明中，由于柠檬烯具有高度挥发性及对底盘细胞较大的毒性作用，发酵时需要在培养基中添加十二烷进行原位萃取，将细胞释放到培养基中的柠檬烯萃取到有机相中，不仅可以减轻其对细胞的毒性还可以减少柠檬烯挥发。从而增加细胞的鲁棒性及得到更多的柠檬烯。较佳的，添加所述十二烷的时间为发酵8小时。添加所述十二烷的浓度为1:2～5，较佳的为1:3，所述比例为添加的十二烷与培养基的比例。

本发明的技术方案之五为：上述的产柠檬烯红酵母基因工程菌在制备柠檬烯中的应用。

在符合本领域常识的基础上，可将上述优选条件进行任意组合，即得本发明各较佳实例。

除非特别说明，本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明通过将来源于柠檬的LS基因和来源于番茄的NPPS基因的核苷酸序列优化后导入敲除类胡萝卜素途径的红酵母；然后过表达基因HMGR，获得能显著提高柠檬烯产量的红酵母基因工程菌株；再进一步异源过表达MVA途径基因，获得更显著提高柠檬烯产量的红酵母基因工程菌株。该产柠檬烯的红酵母基因工程菌株能使柠檬烯的产量达到407.23mg/L，超过仅导入基因LS和NPPS菌株所产柠檬烯产量的78.3倍；超过过表达HMGR菌株所产柠檬烯产量的10.8倍。

通过对发酵方式进行比较后，确定适合产柠檬烯的红酵母基因工程菌株发酵的方式，进一步提高柠檬烯产量。此外，利用本发明提供的红酵母基因工程菌株产柠檬烯的方法，操作简单，发酵设备相容性好，菌株稳定性好，适合用于商业化生产，所得的柠檬烯能够安全的用于食品、药品、化妆品等领域，具有很好的前景。

质粒Xyl-LN-Ntc、XYL-20190821-Ble及XYL-KSE-Ntc利用双酶切连接方法制备。

实施例1构建菌株Xyl-LN-Ntc-np11-9

(1)将柠檬烯生物合成的两个基因LS1和NPPS的优化序列(其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1和2所示)利用P2A的基因序列连接形成基因模块LS-NPPS，核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示，其中，SEQ ID No.3的第1～1668位碱基为LS，第1669～1734位碱基为P2A，第1735～2514位碱基为NPPS。

利用Takara In-fusion无缝克隆试剂盒将SEQ ID No.3核苷酸序列、启动子pPGK、Ntc抗性基因、终止子Tnos、启动子pXYL、终止子Thsp按照图2所示的顺序连接，插入骨架载体Gateway Vector pB4GWnY，得到质粒Xyl-LN-Ntc，质粒结构参见图2(Kan为骨架载体自带)。其中，Ntc为博来霉素抗性基因，其编码蛋白氨基酸序列为GenBank:AAS47018.1；LB为整合载体pB4GWnY左臂，RB为其右臂，其核酸序列为骨架载体上序列；启动子(pPGK、pXYL)和终止子(Tnos、Thsp)为已报道序列(Lin XP,Wang YN,Zhang SF,Zhu ZW,Zhou YJ,Yang F,Sun WY,Wang XY,Zhao ZK.Functional integration of multiple genes into thegenome of the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides.FEMS Yeast Res.2014,14(6),547–555.)

(2)将步骤(1)所得的质粒Xyl-LN-Ntc通过农杆菌介导(ATMT)的方法整合到敲除类胡萝卜素合成基因的红酵母(R.toruloides)基因组中(具体操作方法参考Lin X,Gao N,Liu S,et al.Characterization the carotenoid productions and profiles of threeRhodosporidium toruloides mutants from Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation.Yeast,2017,34(8):335-342.)，获得能够产生柠檬烯的工程菌株Xyl-LN-Ntc-np11-9。

实施例2构建菌株pZPK-20190821-Ntc-ΔCrt-np11-16

(1)将来源于圆红冬孢酵母截短的HMGR基因(NCBI登录号为XP_016270872.1)通过T2A的基因序列连接到基因模块LS1-NPPS上，得到基因模块LS1-NPPS-HMGR，核苷酸序列如序列表SEQ ID No.4的第1～4128位碱基所示，其中，SEQ ID No.4的第1～1668位碱基为LS，第1669～1734位碱基为P2A，第1735～2514位碱基为NPPS，第2515～2577位碱基为T2A，第2578～4128位碱基为HMGR，第4129～4146位碱基为His标签基因。

利用Takara In-fusion无缝克隆试剂盒将SEQ ID No.4核苷酸序列、启动子pPGK、Ble抗性基因、终止子Tnos、启动子pXYL、终止子Thsp按照图3所示的顺序连接，插入骨架载体Gateway Vector pB4GWnY，得到质粒XYL-20190821-Ble，质粒结构参见图3(Kan为骨架载体自带)。其中，Ble为印度斯坦链异壁菌Streptoalloteichus hindustanus来源的博来霉素抗性基因(PDB:1BYL_A)。

Ble抗性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

(2)将步骤(1)所得的质粒XYL-20190821-Ble通过ATMT的方法整合到敲除类胡萝卜素合成基因的红酵母np11中(具体操作方法参考Lin X,Gao N,Liu S,etal.Characterization the carotenoid productions and profiles of threeRhodosporidium toruloides mutants from Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation.Yeast,2017,34(8):335-342.，获得能高产柠檬烯的工程菌株pZPK-20190821-Ntc-ΔCrt-np11-16。

实施例3构建菌株pZPK-20190821-KSE-Ntc-ΔCrt-np11-6

(1)将异源MVA途径的三个基因EfMvaE，EfMvaS和MmMK利用T2A/P2A的基因序列连接(具体为MmMK-P2A-EfMvaS-T2A-EfMvaE)形成基因模块KSE，核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.5所示，其中，SEQ ID No.5的第1～903位碱基为MmMK，第904～969位碱基为P2A，第970～2118位碱基为EfMvaS，第2119～2181位碱基为T2A，第2182～4590位碱基为EfMvaE。

利用Takara In-fusion无缝克隆试剂盒将SEQ ID No.5核苷酸序列、启动子pPGK、Ntc抗性基因、终止子Tnos、启动子pXYL、终止子Thsp按照图4所示的顺序连接成插入骨架载体Gateway Vector pB4GWnY，得到质粒XYL-KSE-Ntc，质粒结构参见图4(Kan为骨架载体自带)。

(2)将步骤(1)所得的质粒XYL-KSE-Ntc通过ATMT的方法整合到实施例2得到的高产柠檬烯工程菌株pZPK-20190821-Ntc-ΔCrt-np11-16染色体中(具体操作方法参考LinX,Gao N,Liu S,et al.Characterization the carotenoid productions and profilesof three Rhodosporidium toruloides mutants from Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation.Yeast,2017,34(8):335-342.，得到更高产柠檬烯工程菌株pZPK-20190821-KSE-Ntc-ΔCrt-np11-6。

实施例4测定菌株产柠檬烯的产量

将菌株红酵母np11、敲除类胡萝卜素途径的红酵母np11(ΔCrt-np11)、实施例1制备的菌株Xyl-LN-Ntc-np11-9、实施例2制备的菌株pZPK-20190821-Ntc-ΔCrt-np11-16和实施例3制备的菌株pZPK-20190821-KSE-Ntc-ΔCrt-np11-6利用50mL离心管进行发酵。具体的将菌株单菌落分别接种于5mL YPD培养基(20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨和10g/L酵母提取物，加水定容至1L)中28℃下200rpm/min培养，发酵8h后按照十二烷比培养基1:5的体积比加入十二烷。

两相发酵5天后，加入1mL正己烷进行二次萃取，4℃下离心分离得有机层，利用GC(岛津GC-2014C)检测柠檬烯含量，检测方法如下：色谱柱KB-1(60m×0.25mm×0.25μm，Kromat，美国)，氮气作为载气，流速1.0mL/min，进样量为1μL。程序：145℃保持27min；进样器保持在240℃，检测器温度为260℃；分流比为20：1。通过建立柠檬烯标准曲线，利用标准曲线对柠檬烯定量。

检测的结果参见图5和表1。表1的结果说明，菌株pZPK-20190821-Ntc-ΔCrt-np11-16和pZPK-20190821-KSE-Ntc-ΔCrt-np11-6产柠檬烯的能力大幅度提升。

表1不同菌株的柠檬烯产量

实施例5工程菌菌株高密度发酵产柠檬烯

将实施例3制备的菌株pZPK-20190821-KSE-Ntc-ΔCrt-np11-6利用250mL摇瓶进行种子液培养。具体的将pZPK-20190821-KSE-Ntc-ΔCrt-np11-6菌株单菌落接种于50mLYPD培养基(20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨和10g/L酵母提取物，加水定容至1L)中，于28℃下200rpm/min培养12h后，按照10％体积比接种到新的摇瓶中，制备二级种子，培养条件与一级种子相同。二级种子培养12h后按15％的接种比例(即，二级种子液和发酵培养基的体积比为15:85)接种到3L发酵罐中，控制pH为6.0，通气量2L/min，搅拌速度350rpm，并按十二烷比培养基1:2的体积比加入十二烷进行原位萃取发酵。每12h监测一次葡萄糖浓度和柠檬烯产量，柠檬烯检测方法同实施例4中所述，葡萄糖检测采用DNS法(二硝基水杨酸法)检测。当葡萄糖低于2g/L时，补加葡萄糖20g/L，酵母浸粉10g/L，硫酸铵2g/L，通过5次补料，柠檬烯产量达到3g/L。

实施例6技术方法及合成的基因在其他红酵母中的应用

分别以红酵母属Rhodotorula中的粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、瘦果红酵母(Rhodotorula acheniorum)和禾本红酵母(Rhodotorula graminis)为出发菌株，按照红酵母柠檬烯工程菌株的构建方法构建产柠檬烯的粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、瘦果红酵母(Rhodotorula acheniorum)和禾本红酵母(Rhodotorula graminis)工程菌株，粘红酵母(Rhodotorula glutinis)命名为Ru-1(制备方法如实施例1所述)、Ru-2(制备方法如实施例2所述)和Ru-3(制备方法如实施例3所述)；瘦果红酵母(Rhodotorula acheniorum)命名为Rh-1(制备方法如实施例1所述)、Rh-2(制备方法如实施例2所述)和Rh-3(制备方法如实施例3所述)；禾本红酵母(Rhodotorula graminis)Ra-1(制备方法如实施例1所述)、Ra-2((制备方法如实施例2所述)和Ra-3(制备方法如实施例3所述)。

得到的工程菌株于装有5mL YPD培养基(20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨和10g/L酵母提取物，加水定容至1L)的50mL离心管中，于28℃下200rpm/min培养，发酵8h后按照十二烷比培养基1:5的体积比加入十二烷。

发酵5天后，加入1mL正己烷进行二次萃取，4℃下离心分离得有机层，有几层按照实施例4的柠檬烯检测方法进行检测。

检测的结果参见表2。表2的结果说明，其他红酵母也具有产生柠檬烯的能力。

表2其他工程红酵母柠檬烯的柠檬烯产量

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，任何熟悉本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种基因、重组载体、工程菌及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1671

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaccgac gctcggctaa ctaccagccc tcgatctggg accacgactt cctccagtcg 60

ctcaactcga actacaccga cgagacctac cgacgccgag ccgaggagct caagggcaag 120

gtcaagatcg ccatcaagga cgtcaccgag ccgctcgacc agctcgagct catcgacaac 180

ctccagcgct tgggcctcgc ttaccgcttc gagaccgaga tccgcaacat cctccacaac 240

atctacaaca acaacaagga ctacgtctgg cgcaaggaga acctctacgc cacctcgctc 300

gagttccgcc tcttgcgcca gcacggctac ccggtctcgc aggaggtctt caacggcttc 360

aaggacgacc agggaggctt catcttcgac gacttcaagg gcatcctctc gctccacgag 420

gcgtcgtact actcgctcga gggcgagtcg atcatggagg aggcgtggca gttcacctcg 480

aagcacctca aggaggtcat gatctcgaag tcgatggagg aggacgtctt cgtcgccgag 540

caggctaagc gcgctctcga gctccctctc cactggaagg tcccgatgct cgaggcacgc 600

tggttcatcc acgtctacga gaagcgcgag gacaagaacc acctcctcct cgagctcgcc 660

aagatggagt tcaacaccct ccaggccatc taccaggagg agctcaagga gatctcgggc 720

tggtggaagg acacgggact cggcgagaag ctctcgttcg ctcgcaaccg cctcgtcgct 780

tcgttcctct ggtcgatggg catcgccttc gagccgcagt tcgcctactg ccgacgcgtc 840

ctcaccatct cgatcgccct catcaccgtc atcgacgaca tctacgacgt ctacggcacc 900

ctcgacgagc tcgagatctt caccgacgca gtcgcacgct gggacatcaa ctacgccctc 960

aagcacctcc cgggctacat gaagatgtgc ttcctcgccc tctacaactt cgtcaacgag 1020

ttcgcctact acgtcctcaa gcagcaggac ttcgacatgc tcctctcgat caagaacgcc 1080

tggctcggcc tcatccaggc gtacctcgtc gaggccaagt ggtatcactc gaagtacacc 1140

ccgaagctcg aggagtacct cgagaacggc ctcgtctcga tcaccggacc actcatcatc 1200

gccatctcgt acctctcagg caccaacccg atcatcaaga aggagctcga gttcctcgag 1260

tcgaacccag acatcgtcca ctggtcgtcg aagatcttcc gcctccagga cgacctcggc 1320

acctcgtcgg acgagatcca gcgaggcgac gtcccgaagt cgatccagtg ctacatgcac 1380

gagaccggcg cttcggagga ggtcgcacgc gagcacatca aggacatgat gcgccagatg 1440

tggaagaagg tcaacgccta caccgccgac aaggactcgc ctctcacccg caccaccacc 1500

gagttcctcc tcaacctcgt ccgcatgtcg cacttcatgt acctccacgg cgacggccac 1560

ggcgtccaga accaggagac catcgacgtc ggcttcaccc tcctcttcca gccgatccca 1620

ctcgaggaca aggacatggc cttcaccgcc tcgccaggca ccaagggata g 1671

<210> 2

<211> 783

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtcagcac gtggcctcaa caagatctcc tgctcgctca acctccagac cgagaagctc 60

tgctacgagg acaacgacaa cgacctcgac gaagaactca tgcccaagca catcgccctc 120

atcatggacg gcaaccgacg ctgggcgaag gacaagggac tcgaagtcta cgaaggccat 180

aagcacatca tcccgaagct caaggagatc tgcgacatct cgtcgaagct cggcatccag 240

atcatcaccg ctttcgcttt ctcgaccgag aactggaagc gctcgaagga ggaggtcgac 300

ttcctcctcc agatgttcga ggagatctac gacgagttct cacgctcggg agtccgcgtc 360

tcgatcatcg gctgcaagtc ggacctccca atgaccctcc agaagtgcat cgctctcacc 420

gaagaaacca ccaagggcaa caagggactc cacctcgtca tcgccctcaa ctacggaggc 480

tactacgaca tcctccaggc taccaagtcg atcgtcaaca aggcgatgaa cggcctcctc 540

gacgtcgagg acatcaacaa gaacctcttc gaccaggagc tcgagtccaa gtgcccgaac 600

ccagacctcc tcatccgcac cggaggtgag cagcgcgtct cgaacttcct cctctggcag 660

ctcgcctaca ccgagttcta cttcaccaac accctcttcc ccgacttcgg cgaagaagac 720

ctcaaggagg cgatcatgaa cttccagcag cgccaccgcc gcttcggagg acacacctac 780

tag 783

<210> 3

<211> 2517

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggaccgac gctcggctaa ctaccagccc tcgatctggg accacgactt cctccagtcg 60

ctcaactcga actacaccga cgagacctac cgacgccgag ccgaggagct caagggcaag 120

gtcaagatcg ccatcaagga cgtcaccgag ccgctcgacc agctcgagct catcgacaac 180

ctccagcgct tgggcctcgc ttaccgcttc gagaccgaga tccgcaacat cctccacaac 240

atctacaaca acaacaagga ctacgtctgg cgcaaggaga acctctacgc cacctcgctc 300

gagttccgcc tcttgcgcca gcacggctac ccggtctcgc aggaggtctt caacggcttc 360

aaggacgacc agggaggctt catcttcgac gacttcaagg gcatcctctc gctccacgag 420

gcgtcgtact actcgctcga gggcgagtcg atcatggagg aggcgtggca gttcacctcg 480

aagcacctca aggaggtcat gatctcgaag tcgatggagg aggacgtctt cgtcgccgag 540

caggctaagc gcgctctcga gctccctctc cactggaagg tcccgatgct cgaggcacgc 600

tggttcatcc acgtctacga gaagcgcgag gacaagaacc acctcctcct cgagctcgcc 660

aagatggagt tcaacaccct ccaggccatc taccaggagg agctcaagga gatctcgggc 720

tggtggaagg acacgggact cggcgagaag ctctcgttcg ctcgcaaccg cctcgtcgct 780

tcgttcctct ggtcgatggg catcgccttc gagccgcagt tcgcctactg ccgacgcgtc 840

ctcaccatct cgatcgccct catcaccgtc atcgacgaca tctacgacgt ctacggcacc 900

ctcgacgagc tcgagatctt caccgacgca gtcgcacgct gggacatcaa ctacgccctc 960

aagcacctcc cgggctacat gaagatgtgc ttcctcgccc tctacaactt cgtcaacgag 1020

ttcgcctact acgtcctcaa gcagcaggac ttcgacatgc tcctctcgat caagaacgcc 1080

tggctcggcc tcatccaggc gtacctcgtc gaggccaagt ggtatcactc gaagtacacc 1140

ccgaagctcg aggagtacct cgagaacggc ctcgtctcga tcaccggacc actcatcatc 1200

gccatctcgt acctctcagg caccaacccg atcatcaaga aggagctcga gttcctcgag 1260

tcgaacccag acatcgtcca ctggtcgtcg aagatcttcc gcctccagga cgacctcggc 1320

acctcgtcgg acgagatcca gcgaggcgac gtcccgaagt cgatccagtg ctacatgcac 1380

gagaccggcg cttcggagga ggtcgcacgc gagcacatca aggacatgat gcgccagatg 1440

tggaagaagg tcaacgccta caccgccgac aaggactcgc ctctcacccg caccaccacc 1500

gagttcctcc tcaacctcgt ccgcatgtcg cacttcatgt acctccacgg cgacggccac 1560

ggcgtccaga accaggagac catcgacgtc ggcttcaccc tcctcttcca gccgatccca 1620

ctcgaggaca aggacatggc cttcaccgcc tcgccaggca ccaagggagg ctcgggagct 1680

accaacttct cgctcctcaa gcaggcagga gacgtcgagg agaacccagg acctatgtca 1740

gcacgtggcc tcaacaagat ctcctgctcg ctcaacctcc agaccgagaa gctctgctac 1800

gaggacaacg acaacgacct cgacgaagaa ctcatgccca agcacatcgc cctcatcatg 1860

gacggcaacc gacgctgggc gaaggacaag ggactcgaag tctacgaagg ccataagcac 1920

atcatcccga agctcaagga gatctgcgac atctcgtcga agctcggcat ccagatcatc 1980

accgctttcg ctttctcgac cgagaactgg aagcgctcga aggaggaggt cgacttcctc 2040

ctccagatgt tcgaggagat ctacgacgag ttctcacgct cgggagtccg cgtctcgatc 2100

atcggctgca agtcggacct cccaatgacc ctccagaagt gcatcgctct caccgaagaa 2160

accaccaagg gcaacaaggg actccacctc gtcatcgccc tcaactacgg aggctactac 2220

gacatcctcc aggctaccaa gtcgatcgtc aacaaggcga tgaacggcct cctcgacgtc 2280

gaggacatca acaagaacct cttcgaccag gagctcgagt ccaagtgccc gaacccagac 2340

ctcctcatcc gcaccggagg tgagcagcgc gtctcgaact tcctcctctg gcagctcgcc 2400

tacaccgagt tctacttcac caacaccctc ttccccgact tcggcgaaga agacctcaag 2460

gaggcgatca tgaacttcca gcagcgccac cgccgcttcg gaggacacac ctactag 2517

<210> 4

<211> 4149

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggaccgac gctcggctaa ctaccagccc tcgatctggg accacgactt cctccagtcg 60

ctcaactcga actacaccga cgagacctac cgacgccgag ccgaggagct caagggcaag 120

gtcaagatcg ccatcaagga cgtcaccgag ccgctcgacc agctcgagct catcgacaac 180

ctccagcgct tgggcctcgc ttaccgcttc gagaccgaga tccgcaacat cctccacaac 240

atctacaaca acaacaagga ctacgtctgg cgcaaggaga acctctacgc cacctcgctc 300

gagttccgcc tcttgcgcca gcacggctac ccggtctcgc aggaggtctt caacggcttc 360

aaggacgacc agggaggctt catcttcgac gacttcaagg gcatcctctc gctccacgag 420

gcgtcgtact actcgctcga gggcgagtcg atcatggagg aggcgtggca gttcacctcg 480

aagcacctca aggaggtcat gatctcgaag tcgatggagg aggacgtctt cgtcgccgag 540

caggctaagc gcgctctcga gctccctctc cactggaagg tcccgatgct cgaggcacgc 600

tggttcatcc acgtctacga gaagcgcgag gacaagaacc acctcctcct cgagctcgcc 660

aagatggagt tcaacaccct ccaggccatc taccaggagg agctcaagga gatctcgggc 720

tggtggaagg acacgggact cggcgagaag ctctcgttcg ctcgcaaccg cctcgtcgct 780

tcgttcctct ggtcgatggg catcgccttc gagccgcagt tcgcctactg ccgacgcgtc 840

ctcaccatct cgatcgccct catcaccgtc atcgacgaca tctacgacgt ctacggcacc 900

ctcgacgagc tcgagatctt caccgacgca gtcgcacgct gggacatcaa ctacgccctc 960

aagcacctcc cgggctacat gaagatgtgc ttcctcgccc tctacaactt cgtcaacgag 1020

ttcgcctact acgtcctcaa gcagcaggac ttcgacatgc tcctctcgat caagaacgcc 1080

tggctcggcc tcatccaggc gtacctcgtc gaggccaagt ggtatcactc gaagtacacc 1140

ccgaagctcg aggagtacct cgagaacggc ctcgtctcga tcaccggacc actcatcatc 1200

gccatctcgt acctctcagg caccaacccg atcatcaaga aggagctcga gttcctcgag 1260

tcgaacccag acatcgtcca ctggtcgtcg aagatcttcc gcctccagga cgacctcggc 1320

acctcgtcgg acgagatcca gcgaggcgac gtcccgaagt cgatccagtg ctacatgcac 1380

gagaccggcg cttcggagga ggtcgcacgc gagcacatca aggacatgat gcgccagatg 1440

tggaagaagg tcaacgccta caccgccgac aaggactcgc ctctcacccg caccaccacc 1500

gagttcctcc tcaacctcgt ccgcatgtcg cacttcatgt acctccacgg cgacggccac 1560

ggcgtccaga accaggagac catcgacgtc ggcttcaccc tcctcttcca gccgatccca 1620

ctcgaggaca aggacatggc cttcaccgcc tcgccaggca ccaagggagg ctcgggagct 1680

accaacttct cgctcctcaa gcaggcagga gacgtcgagg agaacccagg acctatgtca 1740

gcacgtggcc tcaacaagat ctcctgctcg ctcaacctcc agaccgagaa gctctgctac 1800

gaggacaacg acaacgacct cgacgaagaa ctcatgccca agcacatcgc cctcatcatg 1860

gacggcaacc gacgctgggc gaaggacaag ggactcgaag tctacgaagg ccataagcac 1920

atcatcccga agctcaagga gatctgcgac atctcgtcga agctcggcat ccagatcatc 1980

accgctttcg ctttctcgac cgagaactgg aagcgctcga aggaggaggt cgacttcctc 2040

ctccagatgt tcgaggagat ctacgacgag ttctcacgct cgggagtccg cgtctcgatc 2100

atcggctgca agtcggacct cccaatgacc ctccagaagt gcatcgctct caccgaagaa 2160

accaccaagg gcaacaaggg actccacctc gtcatcgccc tcaactacgg aggctactac 2220

gacatcctcc aggctaccaa gtcgatcgtc aacaaggcga tgaacggcct cctcgacgtc 2280

gaggacatca acaagaacct cttcgaccag gagctcgagt ccaagtgccc gaacccagac 2340

ctcctcatcc gcaccggagg tgagcagcgc gtctcgaact tcctcctctg gcagctcgcc 2400

tacaccgagt tctacttcac caacaccctc ttccccgact tcggcgaaga agacctcaag 2460

gaggcgatca tgaacttcca gcagcgccac cgccgcttcg gaggacacac ctacggctcg 2520

ggagagggcc gcggctcgct cctcacctgc ggcgacgtcg aggagaaccc aggcccgatc 2580

ctcatccgca ctcgcaaggc tctcaacggc gcaccgtcct cgtcgaccct taccgtccct 2640

tcgaccgacg aggtcaccgc cccgcagctc aagctctcgc cttcgaccgt cgccctcgtc 2700

tcgcagaacg gcattcccga cacccctcgc gacctcgaca cctgcgtcaa gatcttcaac 2760

ggcggtgagg gagcgatgct cctcaacgac gaggagatca tcaccctcgt ccagaagggc 2820

aagctcgccg cctatgcgct cgagaagctt ctcaaggact acgtccgcgc cgtctcgatc 2880

cgccgtgctc tcatctcgcg cgcctcggct cgcaaaaccc tcgaggcgtc cgacctgccg 2940

ttcctccact tcgactactc gcgcgtcatg ggccagtgct gtgagaacgt cgtcggctac 3000

atgcccatcc ccgtcggtat cgcgggaccg ctccgaatcg acggcaacgt cctccccatc 3060

ccgatggcta cgaccgaagg cgcgctcgtc gcctctacct cgcgtggttg caaggccctt 3120

aacgtctcgg gcggcgtcac gaccgtcgtc acgcaggacg cgatgacccg tggcccggct 3180

ctcgacttcc cgagcgtcat catgtgcgcc gccgccaagc gctgggtcga ctcggacgag 3240

ggcagcaaca tcctcaaggc cgcgttcaac tcgacttcga gattcgccag gctcaagagc 3300

ctcaagactg ccatggctgg tcgcacgctc tttgtccgct tcgccaccca gactggcgac 3360

gcgatgggca tgaacatgat ctccaagggc tgcgagcgcg ctctcgatgt catgatgacg 3420

gagcacttcc ccgagatgaa gatcgcgtcg ctctcgggca actactgcac ggacaagaag 3480

ccggccgcga tcaactggat cgagggacga gggaagagtg tcgtcgccga gggcatcatc 3540

cctggcgagg cggtcaagtc gatcctcaag acgaccgtca gcgacctcgt ccgcctcaac 3600

atcaccaaga acctcatcgg ctcggcgatg gccggctccg tcggcggcaa caacgcccac 3660

gcgtccaaca tcctcacggc catctacctc gcgaccggcc aggaccccgc ccagaacgtc 3720

gagtcgagca actgcatgac gctcatggag gccatcaacg acggaaagga cctcttgatc 3780

acctgctcga tgccgtcgat cgaggttggc accgtcggag gcggcaccat cctcctcccg 3840

caggccgcca tgctggacat gctcggcgtc aaaggtccgc acccgacctc gcccggccag 3900

aacgcgcagc agctcgctcg cgtcgtctgc gccgccgtca tggccggcga gctctcgctc 3960

atgtcggccc tcgcggccgg ctcgctcgtt cagagccact tggcgcacaa ccgctcggca 4020

cctgcgacgc ctgccgccca gacaccccag atcggctcgc gcgccgcgac gcctgtcttg 4080

aacggcacgc agcgcctcgc gccgttgacg gtgaccaagg gcaaggacca ccaccaccac 4140

caccactag 4149

<210> 5

<211> 4593

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggtctcgt gctcggctcc aggcaagatc tacctcttcg gcgagcacgc cgtcgtctac 60

ggcgagaccg ctatcgcttg cgccgtcgag ctccgcaccc gagtccgagc cgagctcaac 120

gactcgatca ccatccagtc gcagatcggc cgcaccggcc tcgacttcga gaagcacccg 180

tacgtctcgg ccgtcatcga gaagatgcgc aagtcgatcc cgatcaacgg cgtcttcctc 240

accgtcgact cggacatccc ggtcggatcg ggactcggat cgtcggcagc cgtcaccatc 300

gcctcgatcg gtgccctcaa cgagctcttc ggcttcggcc tctcgctcca ggagatcgcc 360

aagctcggcc acgagatcga gatcaaggtc cagggcgccg cttcgcctac cgacacctac 420

gtctcgacct tcggcggcgt cgtcaccatc ccagagcgcc gcaagctcaa gacaccagac 480

tgcggcatcg tcatcggcga cacaggagtc ttctcgtcga ccaaggagct cgtcgccaac 540

gtacgccagc tccgcgagtc gtacccggac ctcatcgagc cgctcatgac ctcgatcggc 600

aagatctcgc gcatcggcga gcagctcgtc ctctcgggag actacgcctc gatcggccgc 660

ctcatgaacg tcaaccaggg cctcctcgac gccctcggcg tcaacatcct cgagctctcg 720

cagctcatct actcggctcg cgcagcagga gctttcggcg ctaagatcac cggagcggga 780

ggaggaggct gcatggtcgc tctcaccgca ccagagaagt gcaaccaggt cgccgaggca 840

gtcgcaggag ccggaggaaa ggtcaccatc accaagccga ccgagcaggg cctcaaggtc 900

gacggatcgg gcgccaccaa cttctcgctc ctcaagcagg ccggcgacgt cgaggagaac 960

ccgggaccaa tgaccatcgg catcgacaag atctcgttct tcgtcccgcc gtactacatc 1020

gacatgaccg ccctcgccga ggctcgcaac gtcgacccgg gcaagttcca catcggcatc 1080

ggccaggacc agatggccgt caacccgatc tcgcaggaca tcgtcacctt cgccgccaac 1140

gccgccgagg ctatcctcac caaggaggac aaggaggcca tcgacatggt catcgtcggc 1200

accgagtcgt cgatcgacga gtcgaaggca gctgcagtcg tcctccaccg cctcatggga 1260

atccagccgt tcgcacgctc gttcgagatc aaggaggctt gctacggcgc caccgccgga 1320

ctccagctcg ccaagaacca cgtcgccctc cacccggaca agaaggtcct cgtcgtcgcc 1380

gccgacatcg ccaagtacgg cctcaactcg ggcggagagc ctacccaggg agcgggagct 1440

gtcgctatgc tcgtcgcctc ggagcctcgc atcctcgccc tcaaggagga caacgtcatg 1500

ctcacccagg acatctacga cttctggcgc ccgaccggcc acccttaccc tatggtcgac 1560

ggcccgctct cgaacgagac ctacatccag tcgttcgccc aggtctggga cgagcacaag 1620

aagcgcaccg gcctcgactt cgccgactac gacgccctcg ccttccacat cccgtacacc 1680

aagatgggca agaaggccct cctcgccaag atctcggacc agaccgaggc cgagcaggag 1740

cgcatcctcg cccgctacga ggagtcgatc atctactcgc gaagagtcgg caacctctac 1800

accggctcgc tctacctcgg cctcatctcg ctcctcgaga acgctaccac cctcaccgcc 1860

ggcaaccaga tcggcctctt ctcgtacggc tcgggagccg tcgcggagtt cttcaccggc 1920

gagctcgtcg cgggctacca gaaccacctc cagaaggaga cccacctcgc cctcctcgac 1980

aaccgcaccg agctctcgat cgccgagtac gaggccatgt tcgccgagac cctcgacacc 2040

gacatcgacc agaccctcga ggacgagctc aagtactcga tctcggccat caacaacacc 2100

gtccgctcgt accgcaacgg atcgggagag ggacgcggat cgctcctcac ctgcggagac 2160

gtcgaggaga acccaggacc aatgaagacc gtcgtcatca tcgacgccct ccgcaccccg 2220

atcggcaagt acaagggctc gctctcgcag gtctcggccg tcgacctcgg aacccacgtc 2280

accacccagc tcctcaagcg ccactcgacc atctcggagg agatcgacca ggtcatcttc 2340

ggcaacgtcc tccaggccgg caacggacag aacccagcac gtcagatcgc catcaactcg 2400

ggcctctcgc acgagatccc ggccatgacc gtcaacgagg tctgcggctc gggcatgaag 2460

gccgtcatcc tcgccaagca gctcatccag ctcggcgagg ccgaggtcct catcgccgga 2520

ggcatcgaga acatgtcgca ggcaccaaag ctccagcgct tcaactacga gaccgagtcg 2580

tacgacgtcc agttctcgtc gatgatgtac gacggcctca ccgacgcctt ctcgggacag 2640

gctatgggcc tcaccgccga gaacgtcgcc gagaagtacc acgtcacccg cgaggagcag 2700

gaccagttct cggtccactc gcagctcaag gccgctcagg ctcaggccga gggaatcttc 2760

gccgacgaga tcgcaccact cgaggtctcg ggcacgctcg tcgagaagga cgagggcatc 2820

cgcccgaact cgtcggtcga gaagctcggc accctcaaga cggtcttcaa ggaggacggc 2880

accgtcaccg ccggaaacgc ctcgaccatc aacgacggcg cttcggccct catcatcgcc 2940

tcgcaggagt acgccgaggc tcacggactc ccgtacctcg ccatcatccg cgactcggtc 3000

gaggtcggca tcgacccagc ctacatgggc atctcgccga tcaaggccat ccagaagctc 3060

ctcgcacgca accagctcac caccgaggag atcgacctct acgagatcaa cgaggcgttc 3120

gccgccacct cgatcgtcgt ccagcgcgag ctcgccctac cggaggagaa ggtcaacatc 3180

tacggcggag gcatctcgct cggacacgct atcggcgcta ccggagctcg cctcctcacc 3240

tcgctctcgt accagctcaa ccagaaggag aagaagtacg gcgtcgcctc gctctgcatc 3300

ggaggcggcc tcggactcgc tatgctcctc gagcgcccgc agcagaagaa gaactcgcgc 3360

ttctaccaga tgtcgccgga ggagcgtctc gcttcgctcc tcaacgaggg ccagatctcg 3420

gccgacacca agaaggagtt cgagaacacc gccctctcat cgcagatcgc caaccacatg 3480

atcgagaacc agatctcgga gacggaggtc ccgatgggag tcggactcca cctcaccgtc 3540

gacgagaccg actacctcgt cccgatggcc accgaggagc cttcggtcat cgccgctctc 3600

tcgaacggcg ccaagatcgc ccagggcttc aagaccgtca accagcagcg cctcatgcga 3660

ggccagatcg tcttctacga cgtcgccgac ccggagtcgc tcatcgacaa gctccaggtc 3720

cgcgaggccg aggtcttcca gcaggccgag ctctcgtacc cgtcgatcgt caagcgcgga 3780

ggaggactcc gcgacctcca gtaccgcacc ttcgacgagt cgttcgtctc ggtcgacttc 3840

ctcgtcgacg tcaaggacgc gatgggcgcc aacatcgtca acgccatgct cgagggcgtc 3900

gccgagctct tccgcgagtg gttcgccgag cagaagatcc tcttctcgat cctctcgaac 3960

tacgccaccg aatcggtcgt caccatgaag accgctatcc cggtctcgcg cctctcgaag 4020

ggatcgaacg gccgcgagat cgccgagaag atcgtcctcg cctcgcgcta cgcttcgctc 4080

gacccttacc gagcagtcac ccacaacaag ggcatcatga acggcatcga ggccgtcgtc 4140

ctcgctaccg gaaacgacac ccgagcagtc tcggcttcgt gccacgcttt cgccgtcaag 4200

gagggccgct accagggact cacctcgtgg accctcgacg gcgagcagct catcggcgag 4260

atctcggtcc cgctcgctct cgctaccgtc ggaggcgcca ccaaggtcct ccctaagtcg 4320

caggccgccg ccgacctcct cgccgtcacc gacgctaagg agctctcacg cgtcgtcgca 4380

gctgtcggac tcgctcagaa cctcgccgct ctacgagctc tcgtctcgga gggcatccag 4440

aagggccaca tggccctcca ggctcgctcg ctcgctatga ccgtcggcgc taccggcaag 4500

gaggtcgagg ccgtcgctca gcagctcaag cgccagaaga ccatgaacca ggaccgcgcg 4560

atggccatcc tcaacgacct ccgcaagcaa tag 4593

<210> 6

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ala Lys Leu Thr Ser Ala Val Pro Val Leu Thr Ala Arg Asp Val

1 5 10 15

Ala Gly Ala Val Glu Phe Trp Thr Asp Arg Leu Gly Phe Ser Arg Asp

20 25 30

Phe Val Glu Asp Asp Phe Ala Gly Val Val Arg Asp Asp Val Thr Leu

35 40 45

Phe Ile Ser Ala Val Gln Asp Gln Val Val Pro Asp Asn Thr Leu Ala

50 55 60

Trp Val Trp Val Arg Gly Leu Asp Glu Leu Tyr Ala Glu Trp Ser Glu

65 70 75 80

Val Val Ser Thr Asn Phe Arg Asp Ala Ser Gly Pro Ala Met Thr Glu

85 90 95

Ile Gly Glu Gln Pro Trp Gly Arg Glu Phe Ala Leu Arg Asp Pro Ala

100 105 110

Gly Asn Cys Val His Phe Val Ala Glu Glu Gln Asp

115 120

Claims (10)

1.一种柠檬烯合酶LS基因，其特征在于，所述柠檬烯合酶LS基因选自如下a1)或a2)所示的DNA片段；

a1)编码链的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

a2)与a1)限定的DNA片段具有90％或以上同一性且编码具有相同功能的蛋白质的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的柠檬烯合酶LS基因，其特征在于，所述a1)为：

a1)序列是SEQ ID NO.1所示的DNA片段。

3.一种橙花基焦磷酸合酶NPPS基因，其特征在于，所述橙花基焦磷酸合酶NPPS基因选自如下A1)或A2)所示的DNA片段；

A1)编码链的编码序列是SEQ ID NO.2所示的DNA片段；

A2)与A1)限定的DNA片段具有90％或以上同一性且编码具有相同功能的蛋白质的DNA片段。

4.根据权利要求3所述的橙花基焦磷酸合酶NPPS基因，其特征在于，所述A1)为：

A1)序列是SEQ ID NO.2所示的DNA片段。

5.一种重组载体I，其特征在于，所述重组载体I为在整合型骨架载体I中插入片段I；

所述片段I含有目的基因模块I；

所述目的基因模块I的核苷酸序列含有权利要求1～2任一项所述的柠檬烯合酶LS基因的核苷酸序列和权利要求3～4任一项所述的橙花基焦磷酸合酶NPPS基因的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的重组载体I，其特征在于，顺着表达方向，所述目的基因模块I的核苷酸序列依次含有柠檬烯合酶LS基因的核苷酸序列和橙花基焦磷酸合酶NPPS基因的核苷酸序列；所述柠檬烯合酶LS基因的核苷酸序列和所述橙花基焦磷酸合酶NPPS基因的核苷酸序列之间通过连接肽基因连接；

优选地，所述目的基因模块I的核苷酸序列还含有N-端跨膜区截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR基因的核苷酸序列；

优选地，顺着表达方向，所述目的基因模块I的核苷酸序列依次含有柠檬烯合酶LS基因的核苷酸序列、橙花基焦磷酸合酶NPPS基因的核苷酸序列和N截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR基因的核苷酸序列；

所述柠檬烯合酶LS基因的核苷酸序列和所述橙花基焦磷酸合酶NPPS基因的核苷酸序列之间、所述橙花基焦磷酸合酶NPPS基因的核苷酸序列和所述N截短的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶HMGR基因的核苷酸序列之间分别通过连接肽基因连接；

优选地，所述目的基因模块I的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示或如SEQ ID No.4的第1～4128位碱基所示；

优选地，所述片段I中，在所述目的基因模块I的核苷酸序列的上游还含有启动子I的核苷酸序列；

优选地，所述启动子I选自ARA、GPD、TEF2、XYL中的任一种；

优选地，所述插入为利用片段I替换所述整合型载体I的ECoRV识别位点和SpeI识别位点间的较小片段，保持整合型载体I的其它核苷酸序列不变；

优选地，所述整合型骨架载体I为农杆菌介导的双元表达载体；

优选地，所述整合型骨架载体I选自Gateway Vector pB4GWnY和Takara pRI中的任一种。

7.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌通过将重组载体A转化到宿主细胞中得到；

所述重组载体A包括权利要求5～6任一项所述的重组载体I。

8.根据权利要求7所述的工程菌，其特征在于，所述重组载体A还包括重组载体II；

所述重组载体II为在整合型骨架载体II中插入片段II；

所述片段II含有目的基因模块II；

所述目的基因模块II的核苷酸序列含有MVA途径基因中的至少一种的核苷酸序列；

优选地，所述MVA途径基因包括马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶MmMK基因、粪肠球菌的甲羟戊酸合酶EfMvaS基因、粪肠球菌乙酰乙酰辅酶A硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶EfMvaE基因中的至少一种；

优选地，顺着表达方向，所述目的基因模块II的核苷酸序列依次含有马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶MmMK基因核苷酸序列、粪肠球菌的甲羟戊酸合酶EfMvaS基因核苷酸序列、粪肠球菌乙酰乙酰辅酶A硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶EfMvaE基因核苷酸序列；

所述MVA途径基因包括马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶MmMK基因核苷酸序列和所述粪肠球菌的甲羟戊酸合酶EfMvaS基因核苷酸序列之间、所述粪肠球菌的甲羟戊酸合酶EfMvaS基因核苷酸序列和粪肠球菌乙酰乙酰辅酶A硫解酶/3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶EfMvaE基因核苷酸序列之间分别通过连接肽连接；

优选地，所述目的基因模块II的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5所示；

优选地，所述片段II中，在所述目的基因模块II的核苷酸序列的上游还含有启动子II的核苷酸序列；

优选地，所述启动子II选自ARA、GPD、TEF2、XYL中的任一种；

优选地，所述插入为利用片段II替换所述整合型骨架载体II的ECoRV识别位点和SpeI识别位点间的较小片段，保持整合型骨架载体II的其它核苷酸序列不变；

优选地，所述整合型骨架载体II为农杆菌介导的双元表达载体，所述转化通过农杆菌介导介导转化；

优选地，所述整合型骨架载体II选自Gateway Vector pB4GWnY和Takara pRI中的任一种；

优选地，所述宿主细包括红酵母属真菌中的至少一种；

优选地，所述红酵母属真菌包括圆红冬孢酵母、粘红酵母、瘦果红酵母、禾本红酵母中的任一种；

优选地，所述红酵母属真菌为敲除类胡萝卜素合成途径的红酵母属真菌。

9.一种产柠檬烯的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：培养权利要求7～8任一项所述工程菌，得到所述柠檬烯。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

将工程菌在培养基I中发酵I得到发酵液I，加入十二烷I，继续发酵，得到所述柠檬烯；

优选地，所述发酵I的条件包括：

温度为15～35℃；

转数为100～200rpm；

时间为8～144h；

优选地，所述继续发酵的条件为：

温度为15～35℃；

转数为100～200rpm；

时间为4～7d；

优选地，所述十二烷I和所述培养基I的体积比为1:2～5；

优选地，用正己烷对继续发酵得到的发酵液进行二次萃取，得到所述柠檬烯；

优选地，所述方法包括以下步骤：

将种子液、十二烷II加入培养基II中，发酵II，得到所述柠檬烯；

优选地，所述种子液和所述培养基II的体积比为1～15：85～99；

所述十二烷II和所述培养基II的体积比为1:2～5；

所述发酵II的条件包括：

pH为3.0～6.5；

通气量为0.5～3L/min；

搅拌速度为50～350rpm；

葡萄糖浓度高于2g/L；

优选地，发酵II过程中，当葡萄糖浓度降低至2g/L以下时进行以下补料：

补充葡萄糖20～50g/L，补充酵母浸粉10～20g/L，补充硫酸铵2～10g/L；

经过补料5～10次，结束发酵II；

优选地，所述种子液经过如下步骤得到：

单菌落在培养基A中培养A，得到第一种子液，第一种子液在培养基B中培养B，得到所述种子液；

优选地，所述第一种子液和所述培养基B的体积比为1～10：50～100；

优选地，所述培养A和培养B的条件独立地包括：

温度为15～35℃；

转数为100～200rpm；

时间为12～48h。

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