KR20090065933A

KR20090065933A - 프로토파낙사디올 생합성에 관여하는 인삼 유래의ｐｐｄｓ유전자

Info

Publication number: KR20090065933A
Application number: KR1020070133483A
Authority: KR
Inventors: 최동욱; 최용의; 유장렬
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2007-12-18
Filing date: 2007-12-18
Publication date: 2009-06-23
Also published as: KR100931845B1

Abstract

본 발명은 프로토파낙사디올 생합성에 관여하는 인삼 유래의 PPDS 유전자에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 프로토파낙사디올 생합성에 관여하는 인삼 유래의 PPDS(Protopanaxadiol synthase) 단백질; 상기 PPDS 단백질을 코딩하는 유전자; 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터; 상기 벡터가 형질전환된 형질전환 효모 및 형질전환 쌍자엽 식물에 관한 것이다.

프로토파낙사디올, PPDS, 인삼, 진세노사이드, 유전자

Description

프로토파낙사디올 생합성에 관여하는 인삼 유래의 ＰＰＤＳ유전자{Ginseng PPDS gene involved in protopanaxadiol biosynthetic pathway}

본 발명은 프로토파낙사디올 생합성에 관여하는 인삼 유래의 PPDS 유전자에 관한 것이다.

사포닌(Saponin)이란 수용액에서 비누처럼 미세한 거품을 내는데서 붙여진 이름이다. 일반적으로 사포닌 성분은 물의 표면장력을 낮추므로 쉽게 거품을 내고 용혈작용을 나타낸다. 그러나 인삼 사포닌은 약성이 온화하고 독성이 없을 뿐만 아니라 용혈작용이 거의 없다는 것이 밝혀졌다. 또한 인삼사포닌 성분은 타 식물에서 발견되는 사포닌과는 화학구조가 전혀 다르다. 그래서 인삼사포닌은 타 식물계 사포닌과 구별하기 위해서 인삼(ginseng) 배당체(glycoside)란 의미로 "진세노사이드(ginsenoside)"라고 부른다.

지금까지 고려인삼중에 함유된 30여종의 ginsenosides 중에 현재 10여종 이상의 개별 ginsenosides에 대한 약리작용이 밝혀지고 있다. 이들 ginsenosides들은 서로 비슷한 작용을 하거나 또는 서로 반대되는 작용을 나타내기도 한다. 따라서 고려인삼중에는 서로 유사 또는 상반되는 작용성분이 함께 들어 있다. 예를 들면 중추신경계에 대해 PD계 사포닌의 대표적인 gnsenoside-Rb1은 억제적 효과를 나타내고, PT계 사포닌의 대표적인 ginsenoside-Rg1은 자극적 효과를 가지고 있다. 그러나 이러한 성분들은 서로 길항작용을 나타내지 않는 것으로 알려지고 있다.

화학구조를 간단히 정의하면 당 부분"sugar"(glycone), 비당 부분"nonsugar"(aglycone 또는 genin이라고도 함), 특히 사포닌의 비당부분(aglycone)을 sapogenin이라고 부른다. 사포닌은 비당부분(aglycone)의 골격 구조에 따라 담마란(dammarane)계와 올레아난(oleanane)계의 2가지로 크게 분류된다.

인삼 사포닌(ginsenoside)은 주로 비당부분에 따라 4환성(環性)의 담마린계 사포닌과 5환성의 올레아난계 사포닌의 2종류로 대별된다. 담마란계 사포닌은 다시 비당부분에 붙어 있는 수산기(-OH)의 수에 따라 2개인 경우 protopanaxadiol계 사포닌(PPD), 3개인 경우 protopanaxatriol계 사포닌(PPT)으로 나누어진다. Protopanaxadiol계 사포닌은 19종으로, G-Ra1, G-Ra2, G-Ra3, G-Rb1, G-Rb2, G-Rb3, G-Rc, G-Rd, 20(S)G-Ra3, 20(R)G-Rg3, G-Rh2, G-Rs1, G-Rs2, Quinquenoside-R1, Notoginsenoside-R4, Malonyl-G-Rb1, Malonyl-G-Rb2, Malonyl-G-Rc, Malonyl-G-Rd가 있고, Protopanaxatriol계 사포닌은 10종으로, G-Rc, G-Rf, G-Rg2, G-Rh1, 20-Glc-G-Rf, Notoginsenoside-R1, 20(R)G-Rg2, 20(R)G-Rh1, Rh4 등이 있고, Oleanane계 사포닌은 G-Ro가 있다.

그러나, 프로토파낙사디올 생합성에 관여하는 프로토파낙사디올 합성효소(PPDS) 유전자에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명은 그 자체로 생리 활성이 있는 프로토파낙사디올의 생합성 뿐만 아니라 프로토파낙사디올계열 인삼 사포닌 생합성에 관여하는 PPDS 유전자의 유용성을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 프로토파낙사디올 생합성에 관여하는 인삼 유래의 PPDS(Protopanaxadiol synthase) 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 PPDS 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 벡터가 형질전환된 형질전환 효모 및 형질전환 쌍자엽 식물을 제공한다.

본 발명에 따른 프로토파낙사디올 생합성에 관여하는 인삼 유래의 PPDS 유전자는 프로토파낙사디올을 대량 합성하거나 프로토파낙사디올 계열 인삼 사포닌 생합성을 증가시키기 위한 방법에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 프로토파낙사디올 생합성에 관여하는 인삼 유래의 PPDS(Protopanaxadiol synthase) 단백질을 제공한다

본 발명에 따른 PPDS 단백질의 범위는 인삼으로부터 분리된 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 프로토파낙사디올 생합성에 관여하는 활성을 의미한다.

본 발명은 상기 PPDS 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 PPDS 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 PPDS 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 효모 발현 벡터 또는 재조합 식물 발현 벡터이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 재조합 효모 발현 벡터는 도 2에 기재된 pYeDP60_PPDS인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 재조합 식물 발현 벡터는 도 3에 기재된 pPZP211_PPDS 벡터인 것을 특징으로 한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가 능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

효모 발현 벡터는 프로모터 유전자, 해독개시 및 종결코돈이 제거된 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 터미네이터를 포함하며, 프로모터 유전자는 GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1 및 GAL10으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 PPDS 유전자는 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 이것은 발현된 단백질의 배출(export)을 가능하게 한다. 여기에서 신호 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 발현되는 이형 유전자의 5'에 직접적으로 결합되는 것이 바람직하다. 많은 진핵 세포 단백질의 분비 및 변형에 있어서, 폴리펩타이드를 분비 기구(secretion apparatus) 속으로 배출하기(steer) 위해서는 N-말단에 신호 서열을 가지는 단백질 서열과의 융합이 필요하다.

상기 벡터는 조합 효모 플라스미드(YIp : integrative yeast plasmid) 및 염색체외 플라스미드 벡터(extrachromosomal plasmid vector)가 모두 가능하다. 상기 염색체외 플라스미드 벡터는 에피솜 효모 플라스미드(YEp : episomal yeast plasmid), 복제 효모 플라스미드(YRp : replicative yeast plasmid) 및 효모 중심체 플라스미드(YCp : yeast centromer plasmid)로 나뉘어진다. 더 나아가, 인위적 효모 염색체들(YACs : artificial yeast chromosomes)도 본 발명에 따른 발현 벡터로서 가능하다.

또한, 특히 바람직한 효모 벡터는 복제 원점 ori 및 항생물질 저항성 카세 트(antibiotic resistance cassette)를 함유하여 E. coli 에서 증식되고 선택될 수 있는 효모 복제 플라스미드(yeast replication plasmid)이다. 더 나아가, 이들은 H. polymorpha로부터의 HARS1과 같이 효모 세포에서 염색체와 관계없이 독립적 복제를 할 수 있는 ARS 서열, 그리고 URA3 또는 HLEU2와 같은 대사성 효모 선택 마커(metabolic yeast selection marker)를 가진다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(포스피노트리신)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명은 본 발명의 PPDS 유전자를 포함하는 재조합 효모 벡터가 형질전환된 형질전환 효모를 제공하며, 바람직하게는 도 2에 기재된 pYeDP60_PPDS 벡터가 형질전환된 형질전환 효모이다.

바람직하게는, 상기 효모가 Pichia, Hansenula, Candida, Torulopsis, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces 및 Yarrowia 중에서 선택되는 속(genus)에 속하는 것이다. 특히 바람직하게는, 상기 미생물이 Hansenula polymorpha, Saccharomyces Cervisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis 및 Yarrowia lipolytica 중에서 선택되는 종에 속하는 것이다.

효모의 형질전환은 핵산 분자 또는 벡터를 당업자에게 공지된 표준 방법, 바람직하게는 전기천공, 화학적 형질전환, 원형질 융합에 의한 형질전환, 또는 입자 봄바드먼트 (bombardment)에 의해 세포내로 도입되게 한다 (참조: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Edited by: Fred M. Ausubel et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) , J. Sambrook and D. Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

본 발명은 본 발명의 PPDS 유전자를 포함하는 재조합 식물 벡터가 형질전환된 식물을 제공하며, 바람직하게는 도 3에 기재된 pPZP211_PPDS 벡터가 형질전환된 형질전환 쌍자엽 식물을 제공한다.

상기 식물은 담배, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 바람직하게는 애기장대이다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1; PPDS 클로닝 방법>

도 1에서와 같이, 담마렌디올(Dammarenediol)로부터 프로토파낙사디올 합성을 위해서는 OH기의 첨가 반응이 요구되며, 따라서 담마렌디올를 기질로 프로토파낙사디올을 생합성하는 효소는 P450 계열일 것으로 추측되었다. PPDS 유전자 클로닝을 위해 인삼(Panax Ginseng)으로부터 약 20,000개의 ESTs를 생산하였고, 생산된 ESTs로부터 총 69개의 인삼 P450 유전자를 선별하였다. 선별한 총 인삼 P450 유전자들 중 담마렌디올과 구조적으로 유사한 triterpene 계열을 기질로 사용하는 P450 과 아미노산 서열 유사도가 높고 또 진세노사이드 합성이 증가된 생리적 조건에서 그 발현이 증가되는 P450 유전자들을 PPDS 유전자 후보로 선별하였다. 선별된 유전자의 기능은 인삼 P450 유전자를 효모에서 발현시키고 기질인 담마렌디올을 처리한 후 대사물질을 LC/MS로 분석해 담마렌디올 기질을 프로토파낙사디올로 전환 시키는 P450 유전자를 스크린하는 방법으로 프로토파낙사디올 합성효소 (PPDS) 유전자를 클로닝 하였다.

<실시예 2; 벡터 제조>

도 2에서 보는바와 같이, 인삼 PPDS 유전자를 효모에서 발현시키기 위해 선별한 인삼 P450 유전자의 ORF 만을 PCR 증폭하고 효묘 발현 벡터 pYeDP60 벡터의 EcoRI과 BamHI site에 삽입하였다. PPDS 증폭을 위해 사용한 프라이머는 아래와 같다; 5'-ATGGTTGTTTTCATATTTGTGCT-3'(서열번호3), 5'-GTAAGCTGAAACCCTAAGGTGTA-3'(서열번호4). PPDS가 삽입된 재조합 DNA는 대장균에 형질전환시켜 재조합 DNA로 형질전환된 대장균을 선별하였다. PPDS 유전자가 도입된 재조합 DNA는 염기서열 결정을 통해 변이를 확인한 후 효모, WAT21에 도입하였다.

도 3에서 보는바와 같이, 인삼 PPDS 유전자를 식물에서 발현시키기 위해 인삼 P450 유전자(PPDS)의 ORF 만을 PCR 증폭하고 식물 발현 벡터 pZPP211의 KpnI과 SalI site에 삽입하였다. PPDS 증폭을 위해 사용한 프라이머는 아래와 같다; 5'-ATGGCTGTTTTCATAGTTGTG-3'(서열번호 5) 5' - TTAGTAAGCTGAAACCCTAAG 3'(서열번호6). PCR 산물은 pGEMT-Easy 벡터에 클로닝한 후 염기서열 결정을 통해 변이 여부를 조사하고, 제한효소 KpnI과 SalI으로 절단하여 PPDS 유전자만을 식물 발현 벡터 pPZP211에 삽입하여 pPZP211_PPDS을 완성하였다.

인삼 PPDS가 삽입된 재조합 DNA (pPZP211_PPDS)는 전기 천공법을 이용하여 Agrobacterium tumefaciens GV3101에 도입하였다. 최종적으로 인삼 PPDS 유전자는 Agrobacterium 형질전환 방법을 이용하여 애기장대 (Arabidopsis thaliana, ecotype Col_0)에 도입시켰다.

<실시예 3; 형질전환체 제조방법>

PPDS 유전자가 삽입된 재조합 DNA에 의한 효모의 형질전환은 "Clontech"사의 "Yeastmaker Yeast Transformation System2 kit"를 사용하여 제공된 방법에 따라 수행하였다. PPDS 유전자가 삽입된 재조합체 pYeDP60 벡터가 삽입된 효모 형질전환체는 SD/Ura-, Ade- 배지에서 선별하였다. 형질전환된 효모에 재조합 DNA의 도입 여부는 선별배지에서의 생존 및 PPDS 특이 프라이머를 이용한 PCR를 통해 확인하였다.

인삼 PPDS 유전자가 삽입된 애기장대 형질전환체는 카나마이신이 첨가된 배지에서 선별하였다. 카나마이신이 첨가된 배지에서 발아, 생장한 형질전환체내에 인삼 PPDS 유전자의 도입 및 발현은 PCR 및 RT-PCR 방법을 이용하여 확인하였다.

<실시예 4; 형질전환체에서 PPDS 분리 및 활성 평가 >

효모 형질전환체는 기질인 담마렌디올이 포함된 배지에서 배양 후 원심분리 를 이용하여 수확하였다. 수확한 효모는 20% KOH/50% EtOH 용액을 이용하여 세포내 대사물질을 추출하였다. 세포 추출물은 다시 헥산(hexan)으로 재추출한 후 TLC를 위한 시료로 사용하였다. TLC를 위한 용매로는 물과 아세토니트릴(acetonitrile)을 5:95 비율로 혼합하여 사용하였다. 세포 추출물의 TLC 결과 프로토파낙사디올로 추정되는 물질을 검출할 수 있었으며, PPDS 유전자 도입을 통해 형질전환 효소 추출물의 TLC상에 나타난 proropanaxadiol 예상 물질은 다시 TLC판으로부터 추출한 후 LC/MS 분석을 수행하였다.

LC/MS 분석 결과, 인삼 PPDS 유전자가 삽입된 효모 형질전환체로부터 프로토파낙사디올과 같은 위치에 PPDS 유전자가 도입되지 않는 대조구 효모에서는 합성되지 않는 물질이 존재함을 확인할 수 있었다. (도4). 이 물질의 질량 분석 결과 이물질은 표준품(standard)으로 사용한 프로토파낙사디올과 동일한 물질로 판단된다. (도5). 이 결과로부터 인삼 유전자 PPDS는 담마렌디올을 기질로 프로토파낙사디올을 생합성하는 효소를 암호하고 있다고 판단된다.

도 1은 진세노사이드 생합성 경로를 나타내는 그림이다.

도 2는 PPDS 유전자가 삽입된 재조합 효모 발현 벡터 pYePD60_PPDS이다.

도 3은 PPDS 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터 pPZP211_PPDS 이다.

도4은 대조구 효모(A) 그리고 PPDS 유전자 (pYePD60_PPDS) 가 삽입된 형질전환된 효모 (B)로부터 추출한 물질의 액체 크로마토그램이다. 도 4C는 프로토파낙사디올 표준물질의 LC 크로마토그램이다.

도5는 PPDS 유전자 (pYePD60_PPDS)가 삽입된 형질전환된 효모로부터 추출물의 TLC를 통해 분리한 물질(위 그림)과 프로토파낙사디올 표준물질의 LC/APCIMS를 통해 얻은 질량 스펙트럼 결과이다. PPDS 유전자 (pYePD60_PPDS)가 삽입된 형질전환된 효모로부터 추출물이 프로토파낙사디올로 유전자 PPDS는 이 프로토파낙사디올 생합성 유전자임을 보여준다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Ginseng PPDS gene involved in protopanaxadiol biosynthetic pathway <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1590 <212> DNA <213> Panax ginseng <400> 1 ggtctctctc tctctctgtg aagtgtattg gagcttttag gaagaatcaa tggttgtttt 60 catatttgtg cttggtgtgg ttttggaact cagtctcgta agtacagctt tgttgagatg 120 gaatgaggtg aggtacagga agaagggttt gcctccaggt accatgggtt ggccagtttt 180 tggtgagacc actgagttcc tcaaacaagg cccaagcttc atgaaaaacc agagagccag 240 gttcggaagt tttttcaaat cccacatatt gggttgtcct acaattgttt ccatggatcc 300 agagctcaac aaatatatcc ttatgaatga agcaaaaggg cttgtacctg gctatccaca 360 atccatgctt gacattttag ggaaatgcaa cattgccgct gtccatggtt ctactcacaa 420 gaacatgaga ggggcattgc ttgcacttgt tagccacacc atgatcaaag accaactttt 480 gccaaaaatc gatcatttca tgagatctca cctgagcaat tgggataaca aagtcattga 540 tattcaagaa aaaaccaaag agatggcact actgtcctca cttaagcaaa ttgctggtat 600 agaatctggc tcaatgtgcc aggaattcat gcctgaattt ttcaagttag ttttaggaac 660 tctttcattg ccaatcaacc ttccgggtac agattatcat catggctttc aggcaaggca 720 gaacattgtc aggatgttga gacaacttat tgaggacaga agatcttccc aaaaaaccca 780 tcatgacatg cttggttatc ttatgaacag tgaaggaaac agatataaga taactgatga 840 agagataatt gatcaaatta tcacaattct ctactctgga tatgaaactg tttcaacaac 900 ttcaatgatg gctgtcaagt atcttcatga tcatccaagg gttcttgaag aactcagaaa 960 agaacatatg gcaattagag agaagaaaag gccagaggat ccaatcaact ggaatgacta 1020 taagtccatg cgcttcactc gagctgtgat ctttgagacc tcaagattag ctacaattgt 1080 taatggggtt ttgaggaaaa ctactcgaga gatggaactg aatggttata ttattcccga 1140 aggatggaga atatatgttt atacaagaga aattaattat gacccacggc tatatccaga 1200 accacaaacc tttaatccct ggagatggct ggataagagc atagatgccc aaaactactt 1260 cttcatattt ggaggaggaa ctaggcaatg tcctggaaag gaactaggga tagcagaaat 1320 ctcaactttt ctgcattact tcgtcactag atatagatgg aatgaagttg ggggagataa 1380 actgatgaaa tttccaagag ttgaagcacc aaatgggtta caccttaggg tttcagctta 1440 ctaaccaacc tggtatacat atgtacagaa gagatctagg atataagcat aacaaggatg 1500 taaaataatg ttctaacaaa gttttagaaa ttgattgaaa ttaaggttct gcgttcaaaa 1560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1590 <210> 2 <211> 464 <212> PRT <213> Panax ginseng <400> 2 Met Val Val Phe Ile Phe Val Leu Gly Val Val Leu Glu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Val Ser Thr Ala Leu Leu Arg Trp Asn Glu Val Arg Tyr Arg Lys Lys 20 25 30 Gly Leu Pro Pro Gly Thr Met Gly Trp Pro Val Phe Gly Glu Thr Thr 35 40 45 Glu Phe Leu Lys Gln Gly Pro Ser Phe Met Lys Asn Gln Arg Ala Arg 50 55 60 Phe Gly Ser Phe Phe Lys Ser His Ile Leu Gly Cys Pro Thr Ile Val 65 70 75 80 Ser Met Asp Pro Glu Leu Asn Lys Tyr Ile Leu Met Asn Glu Ala Lys 85 90 95 Gly Leu Val Pro Gly Tyr Pro Gln Ser Met Leu Asp Ile Leu Gly Lys 100 105 110 Cys Asn Ile Ala Ala Val His Gly Ser Thr His Lys Asn Met Arg Gly 115 120 125 Ala Leu Leu Ala Leu Val Ser His Thr Met Ile Lys Asp Gln Leu Leu 130 135 140 Pro Lys Ile Asp His Phe Met Arg Ser His Leu Ser Asn Trp Asp Asn 145 150 155 160 Lys Val Ile Asp Ile Gln Glu Lys Thr Lys Glu Met Ala Leu Leu Ser 165 170 175 Ser Leu Lys Gln Ile Ala Gly Ile Glu Ser Gly Ser Met Cys Gln Glu 180 185 190 Phe Met Pro Glu Phe Phe Lys Leu Val Leu Gly Thr Leu Ser Leu Pro 195 200 205 Ile Asn Leu Pro Gly Thr Asp Tyr His His Gly Phe Gln Ala Arg Gln 210 215 220 Asn Ile Val Arg Met Leu Arg Gln Leu Ile Glu Asp Arg Arg Ser Ser 225 230 235 240 Gln Lys Thr His His Asp Met Leu Gly Tyr Leu Met Asn Ser Glu Gly 245 250 255 Asn Arg Tyr Lys Ile Thr Asp Glu Glu Ile Ile Asp Gln Ile Ile Thr 260 265 270 Ile Leu Tyr Ser Gly Tyr Glu Thr Val Ser Thr Thr Ser Met Met Ala 275 280 285 Val Lys Tyr Leu His Asp His Pro Arg Val Leu Glu Glu Leu Arg Lys 290 295 300 Glu His Met Ala Ile Arg Glu Lys Lys Arg Pro Glu Asp Pro Ile Asn 305 310 315 320 Trp Asn Asp Tyr Lys Ser Met Arg Phe Thr Arg Ala Val Ile Phe Glu 325 330 335 Thr Ser Arg Leu Ala Thr Ile Val Asn Gly Val Leu Arg Lys Thr Thr 340 345 350 Arg Glu Met Glu Leu Asn Gly Tyr Ile Ile Pro Glu Gly Trp Arg Ile 355 360 365 Tyr Val Tyr Thr Arg Glu Ile Asn Tyr Asp Pro Arg Leu Tyr Pro Glu 370 375 380 Pro Gln Thr Phe Asn Pro Trp Arg Trp Leu Asp Lys Ser Ile Asp Ala 385 390 395 400 Gln Asn Tyr Phe Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Arg Gln Cys Pro Gly 405 410 415 Lys Glu Leu Gly Ile Ala Glu Ile Ser Thr Phe Leu His Tyr Phe Val 420 425 430 Thr Arg Tyr Arg Trp Asn Glu Val Gly Gly Asp Lys Leu Met Lys Phe 435 440 445 Pro Arg Val Glu Ala Pro Asn Gly Leu His Leu Arg Val Ser Ala Tyr 450 455 460 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atggttgttt tcatatttgt gct 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtaagctgaa accctaaggt gta 23 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atggctgttt tcatagttgt g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttagtaagct gaaaccctaa g 21

Claims

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 프로토파낙사디올 생합성에 관여하는 인삼 유래의 PPDS(Protopanaxadiol synthase) 단백질.
제1항의 PPDS 단백질을 코딩하는 유전자.
제2항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
제2항 또는 제3항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제4항에 있어서, 상기 벡터는 재조합 효모 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제5항에 있어서, 상기 벡터는 도 2에 기재된 pYeDP60_PPDS 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제5항의 벡터로 형질전환된 형질전환 효모.
제4항에 있어서, 상기 벡터는 재조합 식물 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제8항에 있어서, 상기 벡터는 도 3에 기재된 pPZP211_PPDS 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제8항의 벡터로 형질전환된 형질전환 쌍자엽 식물.