CN115340957B - 一种原人参二醇酵母细胞工厂的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种原人参二醇酵母细胞工厂的构建方法及其应用,以酿酒酵母BY4742为出发菌株,通过同源重组的方式,将不同物种来源的3‑羟基‑3‑甲基戊二酰辅酶A还原酶、法尼基焦磷酸合成酶、角鲨烯合酶、角鲨烯环氧酶、达玛烯二醇合酶、原人参二醇合酶以及提供还原力NADPH的辅酶,整合到BY4742染色体多拷贝位点区,构建得到原人参二醇底盘细胞,然后经过多途径代谢网络优化,促进内质网膜扩增,削弱竞争性代谢途径法尼醇和羊毛甾醇的代谢流。基于上述组合策略构建得到的PPD细胞工厂,摇瓶批次发酵产量达到563.60±1.65mg/L,以葡萄糖、木薯淀粉水解液、甘蔗汁、甘蔗糖蜜为碳源进行5L发酵罐补料发酵,PPD产量最高为23.92±0.96 g/L。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,特别涉及一种原人参二醇酵母细胞工厂的构建方法及其应用。
背景技术
天然产物以其多样独特的分子结构在生命活动中扮演着重要的角色,其生物活性在生命长期的进化过程中得以选择和优化,使之可以作为药物直接或间接用于疾病的治疗。据统计当前使用的药物中超过50%来自天然产物。1940-2014年间,国际上共有175个小分子药物被批准用于癌症治疗,其中有85个来源于天然产物或其衍生物;在过去30年制药行业的发展中,61%抗癌药物和49%的抗感染药物来源于天然产物。
原人参二醇(PPD)是三七/人参皂苷的共同前体,具有抗氧化、抗肿瘤和保护心血管等功效。市售的原人参二醇主要从植物组织中提取,然而该法严重依赖于大量生物资源的获取和消耗,人参属植物通过人工种植周期长,且原人参二醇含量极低,提取和纯化过程复杂,成本高昂,使得传统生产方法难以满足市场需求。
基于合成生物学设计和创建高效细胞工厂发酵生产天然药物,是高值或珍稀药用资源量产化的先进绿色生产方式,如青篙酸,紫杉醇,β-胡萝卜素等活性物质均可以通过高密度发酵法生产。另一方面,我国是甘蔗高产国家,但是糖业产品单一,原料成本比国际市场高出两倍多,深加工产业链短,综合利用率低,提高甘蔗及下游产业附加值具有重要的社会经济价值。利用合成生物学共性技术研究和产业链培育,利用甘蔗汁、糖蜜生产PPD等高附加值药用活性成分可以充分释放甘蔗糖业利用潜能,延伸产业链,有效提升我国糖业的综合实力和竞争力。
发明内容
针对现有原人参二醇(PPD)存在的获取渠道少、产品纯度低以及提取和纯化过程复杂的缺陷,本发明利用合成生物学技术,提供一种原人参二醇酵母细胞工厂及其构建方法,通过高通量筛选及定向改造平台,再利用甘蔗汁或者甘蔗副产物进行补料发酵生产原人参二醇,增加了原人参二醇的生产途径以及提高其产量。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种原人参二醇酵母细胞工厂的构建方法,以酵母基因组DNA为模板,设计引物分别扩增基因tHMG1、ERG20、ERG9、ERG1,而基因DS、CYP716A47、46ATR1则按照酿酒酵母密码子偏好性合成,合成后构建相关的中间工具质粒T1-T8,以下各步骤使用的相关引物信息见表1,具体的,包括以下步骤:
(1)以质粒T1为模板,在质粒T1上串联法尼基焦磷酸合成酶基因ERG20和角鲨烯合酶基因ERG9,构建T1-ERG20-ERG9重组质粒;
(2)以质粒T2为模板,质粒T2上串联料角鲨烯环氧酶基因ERG1和达玛烯二醇合酶基因DS,构建T2-ERG1-DS重组质粒;
(3)以质粒T3为模板,在质粒T3上串联原人参二醇合酶基因CYP716A47、NADPH的辅酶基因46ATR1和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1,构建T3-CYP716A47-46ATR1-tHMG1质粒;
(4)以质粒T4为模板,质粒T4上串联原人参二醇合酶CYP716A47和NADPH的辅酶基因46ATR1,构建T4-CYP716A47-46ATR1重组质粒;
(5)分别以质粒T1-ERG20-ERG9、质粒T2-ERG1-DS、质粒T3-CYP716A47-46ATR1-tHMG1和质粒T4-CYP716A47-46ATR1为模板,设计的相关引物见表2,扩增得到功能表达片段pADH1-ERG20-tPI1-tHXT8-ERG9-pPGI7、pPGI-ERG1-tADH1-pRPL8A-DS-tCYC1、pADH1-CYP716A47-46ATR1-tFBA1-pADH3-tHMG1-tPDC1和pGK1-CYP716A47-46ATR1-tTDH1;
(6)将功能表达片段pADH1-ERG20-tPI1-tHXT8-ERG9-pPGI7、pPGI-ERG1-tADH1-pRPL8A-DS-tCYC1、pADH1-CYP716A47-46ATR1-tFBA1-pADH3-tHMG1-tPDC1和pGK1-CYP716A47-46ATR1-tTDH1整合至酿酒酵母,高通筛选得到原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅰ;
(7)以质粒T6为模板,在质粒T6上串联甲羟戊酸激酶基因ERG12和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因ERG13,构建T6-ERG12-ERG13重组质粒;
(8)以质粒T7为模板,质粒T7上串联甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因MVD1和磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8,构建T7-MVD1-ERG8重组质粒;
(9)以质粒T8为模板,在质粒T8上串联异戊烯基焦磷酸合酶基因IDI1和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMG1和乙酰辅酶A酰基转移酶ERG10,构建T8-IDI1-tHMG1-ERG10重组质粒;
(10)分别以质粒T6-ERG12-ERG13、质粒T7-MVD1-ERG8、质粒T8-IDI1-tHMG1-ERG10为模板,扩增得到功能表达片段tCPS1-ERG12-pENO2-pTEF2-ERG13-tIDP1、tHIS5-MVD1-pGPM1-pTPI1-ERG8-tPRM5、tRPM9-IDI1-pGPD1-tTDH2-tHMG1-pTDH3-pTEF1-ERG10-tSPG5;
(11)将功能表达片段tCPS1-ERG12-pENO2-pTEF2-ERG13-tIDP1、tHIS5-MVD1-pGPM1-pTPI1-ERG8-tPRM5、tRPM9-IDI1-pGPD1-tTDH2-tHMG1-pTDH3-pTEF1-ERG10-tSPG5整合至原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅰ,高通量筛选得到原人参二醇酵母细胞工厂BY-ⅠI;
表1:
表2:
引物名称 | 引物序列(5’→3’) |
L1-tPI1-F | cgtctcccccggtccgtttg |
L2-PGIt-R | tagtccgcgagttggatagcc |
L2-tADH1-F | gacaaagcgccaaggaactgtaata |
L3-tCYC1-R | gcggacttagtccgtttct |
L3-tFBA1-F | aacgacggtagacgccaa |
L4-tPDC1-R | aggttccaactgctcttactgt |
L4-pPGK1-F | ccagacgatacagaggctaaga |
L5-tTDH1-R | cgacgaacgagatacgatagaac |
L6-tCPS1-F | atttgacacttgatttgacacttcttt |
L7-tIDP1-R | gttacgatggtaatgatccgaacttggg |
L7-tHIS5-F | gtaacaatatcatgagaccttttatag |
L8-tPRM5-R | atagaacccaaaaagagagactaaacaa |
L8-tRPM9-F | attttcaacatcgtattttccgaa |
L9-tSPG5-R | gcttattttctgccgaattttca |
同时,本发明还提供了对构建的原人参二醇细胞工厂BY-Ⅱ进行代谢网络优化,优化过程中使用的相关引物信息如表3所示,具体优化方法为:
(Ⅰ)通过强启动子PTDH3、PHXT8、PPGK1和PTEF1上调内质网调控因子INO2基因的表达;和/或(Ⅱ)利用葡萄糖诱导启动子PHXT1进行调控,下调羊毛甾醇合酶ERG7基因表达;和/或(Ⅲ)敲除焦磷酸酶LPP1基因,上调甾醇转录调控因子UPC2。
作为优化过程的进一步改进,过程(Ⅰ)具体包括以下步骤:
(1)设计引物,以质粒G418、质粒PYES3-CT、酵母基因组DNA为模板,扩增G418骨架、URA3标签、PHXT8、PTDH3、PTEF1和PPGK1启动子基因片段及INO2整合位点上下游同源臂500bp;
(2)将扩增后的G418骨架、URA3标签、PHXT8、PTDH3、PTEF1和PPGK1启动子基因片段及整合位点上下游同源臂500bp通过同源重组技术进行连接,分别构建得到G418-upINO2-URA3-PHXT8-downINO2、G418-upINO2-URA3-PTDH3-downINO2、G418-upINO2-URA3-PTEF1-downINO2和G418-upINO2-URA3-PPGK1-downINO2四个重组质粒;
(3)将重组质粒G418-upINO2-URA3-PHXT8-downINO2、G418-upINO2-URA3-PTDH3-downINO2、G418-upINO2-URA3-PTEF1-downINO2和G418-upINO2-URA3-PPGK1-downINO2分别整合至原人参二醇酵母细胞工厂BY-II,得到原人参酵母细胞工厂BY-III。
所述的过程(Ⅱ)具体包括以下步骤:
(1)设计引物,以G418质粒、酵母基因组DNA为模板,扩增G418骨架、PHXT1启动子基因片段和整合位点上下游同源臂500bp;
(2)将G418骨架、PHXT1基因片段、整合位点上下游同源臂500bp通过同源重组技术连接,构建得到G418-upERG7-PHXT1-downERG7重组质粒;
(3)将重组质粒G418-upERG7-PHXT1-downERG7整合至原人参二醇酵母细胞工厂BY-ⅠII,得到原人参二醇酵母细胞工厂BY-IV。
过程(Ⅲ)具体包括以下步骤:
(1)设计引物,以G418质粒、酵母基因组DNA,分别扩增G418骨架、UPC2基因片段、LPP1上下游同源臂500bp;
(2)设计引物,将UPC2基因片段进行定点突变,构建UPC2.1片段;
(3)将G418骨架、LPP1上下游同源臂500bp、UPC2.1基因片段通过同源重组技术连接,构建得到G418-upLPP1-PPGK1-UPC2.1-TADH1-downLPP1重组质粒;
(4)将重组质粒G418-upLPP1-PPGK1-UPC2.1-TADH1-downLPP1整合至原人参二醇酵母细胞工厂BY-IV,得到原人参酵母细胞工厂BY-V。
表3:
同时,本发明还提供了所述的原人参二醇酵母细胞工厂的应用,具体为利用葡萄糖、木薯淀粉水解液、甘蔗汁和甘蔗糖蜜中的一种为初始碳源,经过补料发酵培养,合成原人参二醇。
所述的补料发酵具体方法如下:
(1)在生物反应器中添加1.5~2.5L的高密度培养基进行乙醇补料发酵,同时高密度培养基中添加葡萄糖20~30g/L,作为初始碳源;
所述的高密度培养基包含以下组分:
15g/L(NH4)2SO4、8g/L KH2PO4、5.65g/LMgSO4·7H2O、0.72g/L ZnSO4·7H2O、5g/L赖氨酸、0.2g/L尿嘧啶、0.2g/L亮氨酸、0.1g/L组氨酸;
12mL维生素溶液:0.05g/L生物素,1g/L泛酸钙,1g/L烟酸,25g/L肌醇,1g/L盐酸硫铵,1g/L盐酸吡哆醛,0.2g/L对氨基苯甲酸;
10mL微量金属溶液:5.75g/L ZnSO4·7H2O,0.32g/L MnCl2·4H2O,0.47g/LCoCl2·6H2O,0.48g/L Na2MoO4·2H2O,2.9g/L CaCl2·2H2O,2.8g/L FeSO4·7H2O和80ml/L0.5M EDTA,pH 8.0;
(2)取原人参二醇酵母底盘细胞在30℃和220rpm条件下活化培养,然后接种于生物反应器中进行发酵,设置发酵温度为28~32℃,pH控制在5.0~6.0,空气流速为1~4L/min,溶解氧为30%~40%,发酵液乙醇浓度控制在1~5g/L范围内;
所述的原人参二醇酵母底盘细胞为原人参二醇酵母细胞工厂BY-II、原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅲ、原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅳ、原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅴ中的一种;
(3)发酵过程中实时监测菌体密度、发酵液中葡萄糖和乙醇的浓度、原人参二醇的浓度,发酵结束后收集固形物,乙酸乙酯提取原人参二醇,挥发后甲醇重悬。
所述的初始碳源为木薯淀粉水解液时,加入量为300~500mL,糖浓度为120~130g/L;木薯淀粉水解液的预处理方法如下:
称量70g木薯粉,加入300mL自来水,调节pH至5.5~6.5,加入适量液化酶,灭菌锅121度预处理15min,破坏淀粉颗粒结构;补加液化酶母液15mL,于95℃、160rpm下液化1~2h;降温后调节pH至4.0~5.0,加入糖化酶母液25mL,55~60℃、160rpm下糖化24h;糖化结束后,调节pH至7.0左右,离心收集上清,得到糖化液。
所述的初始碳源为甘蔗汁时,加入量为150~200g/L高密度培养基。
所述的初始碳源为甘蔗糖蜜时,加入量为40~60g/L高密度培养基。
本发明的有益效果如下:
1、本发明以酿酒酵母BY4742为出发菌株,通过同源重组的方式,将不同物种来源的甲羟戊酸激酶基因(ERG12)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(MVD1)、磷酸甲羟戊酸激酶基因(MERG8)、异戊烯基焦磷酸合酶基因(IDI1)、乙酰辅酶A酰基转移酶基因(ERG10)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因(tHMG1)、法尼基焦磷酸合成酶基因(ERG20)、角鲨烯合酶基因(ERG9)、角鲨烯环氧酶基因(ERG1)、达玛烯二醇合酶基因(DS)、原人参二醇合酶基因(CYP716A47)以及提供还原力NADPH的辅酶基因(ATR1),整合到BY4742染色体多拷贝位点区,一次构建得到原人参二醇酵母细胞工厂BY-I、BY-Ⅱ;然后通过强启动子(PTD H3,PHXT8,PPGK1和PTEF1)上调内质网调控因子INO2的表达,促进内质网空间扩增,增强内质网蛋白的合成和折叠能力,为关键限速酶P450及其伴侣蛋白CPR酶提供更多的催化场地;再通过敲除焦磷酸酶LPP1基因,削弱竞争性旁路法尼醇的代谢途径,利用葡萄糖感应启动子PHXT1,下调羊毛甾醇合酶ERG7基因表达,削弱羊毛甾醇的代谢途径,提高PPD代谢通量,同时上调甾醇转录调控因子UPC2,提高了细胞的稳定性和代谢稳定性。
2、本发明将构建的原人参二醇酵母细胞工厂通过补料发酵的方式,以葡萄糖、木薯淀粉水解液以及甘蔗副产物甘蔗汁和甘蔗糖蜜为初始碳源进行发酵,合成原人参二醇,增加了原人参二醇的生产途径,同时构建的原人参二醇酵母细胞工厂具有更高的原人参二醇产量。
附图说明
图1为本发明原人参二醇酵母细胞工厂的代谢网络改造流程示意图。
图2为本发明利用启动子工程调节INO2和ERG7基因的流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明,以下实施例中的引物信息见说明书中的表1~3。
实施例1
本实施例中各个引物信息如下:
所述的引物T1-F序列为atcgaacaaatcgctcttaaatatatacc,T1-R序列为aaagtctacaagagatctaagtaagattaatataattatat。
所述的引物T2-F序列为gatctgatcatgtaattagttatgtca,T2-R序列为tcggtgaattgattggttaaagttataaaaaaaataagtg。
所述的引物T3-F序列为atcggcgatttaatctctaattatta,T3-R序列为acctaagcttgttaattcaaattaattg。
所述的引物T4-F序列为gaattcataaagcaatcttgatgag,T4-R序列为atcgaacaaatcgctcttaaatatatacc。
所述的引物ERG20-F序列为ttacttagatctcttgtagact,ERG20-R序列为tcatatacagatggcatccgaaaaagaaattag。
所述的引物ERG9-F序列为atgggtaaattgttgcaatt,ERG9-R序列为cgatttaagctctatgcaaagta。
所述的引物ERG1-F序列为ttaaccaatcaattcaccgaacaaaaatggagtaaagactct,ERG1-R序列为ctatttgtttcgtcccattgatgtcagccgttaacgtt。
所述的引物DS-F序列为ctattatcacatcgagctccatgtggaagttgaaagttgc,DS-R序列为tgacataactaattacatgatcagatcttcaattgctggt。
所述的引物CYP716A47-F序列为acctgaacctgaagaagtag,CYP716A47-R序列为atggtcctgttcttctctctg。
所述的引物tHMG1-F序列为aaacacacataaacaaacaaagatggaccaattggttaaaac,tHMG1-R序列为taataattagagattaaatcgccgatttaagatttaatacaagtaacaga。
所述引物L1-tPI1-F序列为cgtctcccccggtccgtttg,引物L2-PGIt-R序列为tagtccgcgagttggatagcc。
所述引物L2-tADH1-F序列为gacaaagcgccaaggaactgtaata,引物L3-tCYC1-R序列为gcggacttagtccgtttct。
所述引物L3-tFBA1-F序列为aacgacggtagacgccaa,引物L4-tPDC1-R序列为aggttccaactgctcttactgt。
所述引物L4-pPGK1-F序列为ccagacgatacagaggctaaga,引物L5-tTDH1-R序列为cgacgaacgagatacgatagaac。
原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅱ的构建方法,具体包括以下步骤:
(1)以质粒T1为模板,在质粒T1上串联法尼基焦磷酸合成酶基因ERG20和角鲨烯合酶基因ERG9,构建T1-ERG20-ERG9重组质粒;
(2)以质粒T2为模板,质粒T2上串联料角鲨烯环氧酶基因ERG1和达玛烯二醇合酶基因DS,构建T2-ERG1-DS重组质粒;
(3)以质粒T3为模板,在质粒T3上串联原人参二醇合酶基因CYP716A47、NADPH的辅酶基因46ATR1、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1,构建T3-CYP716A47-46ATR1-tHMG1重组质粒;
(4)以质粒T4为模板,质粒T4上串联原人参二醇合酶基因CYP716A47和NADPH的辅酶基因46ATR1,构建T4-CYP716A47-46ATR1重组质粒;
(5)分别以质粒T1-ERG20-ERG9、质粒T2-ERG1-DS、质粒T3-CYP716A47-46ATR1-tHMG1和质粒T4-CYP716A47-46ATR1为模板,扩增得到功能表达片段pADH1-ERG20-tPI1-tHXT8-ERG9-pPGI7、pPGI-ERG1-tADH1-pRPL8A-DS-tCYC1、pADH1-CYP716A47-46ATR1-tFBA1-pADH3-tHMG1-tPDC1和pGK1-CYP716A47-46ATR1-tTDH1。
(6)挑取酿酒酵母BY4742单菌落到YPD培养基中过夜摇培12h,用分光光度计测培养菌液的OD600的值,待其OD600值在0.8~0.9,于6000rpm下离心5min收集菌体,用无菌去离子水洗两次,再用900μL水重悬;
(7)将菌体转移到无菌1.5mL的离心管中,于13000rpm下离心30s收集菌体,再用900μL水重悬菌体后进行分装,每管100μL,离心弃上清,加入以下体系:
用ddH2O补齐至360μL。
(8)将混合好的转化体系重悬菌体,于30℃培养箱中保温20min,然后于42℃热激40min,最后涂布CM-His平板,培养2d,挑取单克隆测序验证,得到原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅰ。
实施例2
本实施例的引物信息如下:
所述引物T6-F序列为ccagacgatacagaggctaaga,引物T6-R序列为cgacgaacgagatacgatagaac;
所述引物T7-F序列为CGGATCATTACCATCGTAACAATATCATGAGAC,引物T7-R序列为tgaaaatatagaacccaaaaagagagac;
所述引物T8-F序列为gtcaccttgcgcgaaaagccaattagtgtga,引物T8-R序列为cttatattgcttattttctgccgaattttc;
所述引物ERG12-F序列为ttgactattcaatcattgcgcttatgaagtccatggtaaattcgtgt,引物ERG12-R序列为atactataacatacaataataatgtcattaccgttcttaacttctgc;
所述引物ERG13-F序列为cgaactataattaactaaacatgaaactctcaactaaactttgt,引物ERG13-R序列为tgggctacgtaaattcgattattttttaacatcgtaagatcttctaaatttg;
所述引物MVD1-F序列为gtttaaattaatctatttattcctttggtagaccagtctttg,引物MVD1-R序列为ccaaacaaacacacatattacaataatgaccgtttacacagcatc;
所述引物ERG8-F序列为cacatacataaactaaaaatgtcagagttgagagccttcagtg,引物ERG8-R序列为aaaaaaatattgcaaaatatcataaaagtttttatttatcaagataagtttccggatctttttcttt;
所述引物IDI1-F序列为gtgtctcccgtcttctgtttatagcattctatgaatttgcctgtc,引物IDI1-R序列为caaatattgataatataaagatgactgccgacaacaatagtatgc;
所述引物ERG10-F序列为gcatagcaatctaatctaagatgtctcagaacgtttacattgtatcg,引物ERG10-R序列为gcgatgaaacaacgtctttgtcatatcttttcaatgacaatagaggaa。
所述引物L6-tCPS1-F序列为atttgacacttgatttgacacttcttt,引物L7-tIDP1-R序列为gttacgatggtaatgatccgaacttggg。
所述引物L7-tHIS5-F序列为aacgacggtagacgccaa,引物L8-tPRM5-R序列为gtaacaatatcatgagaccttttatag。
所述引物L8-tRPM9-F序列为attttcaacatcgtattttccgaa,引物L9-tSPG5-R序列为gcttattttctgccgaattttca。
原人参二醇酵母细胞工厂BY-ⅠI的构建方法,具体包括以下步骤:
(1)设计上述引物,以质粒T6为模板,扩增T6骨架;再以酵母基因组DNA为模板,扩增EGR12和EGR13基因片段,胶回收目的片段;然后将T1骨架、EGR12和EGR13基因片段通过同源重组技术进行连接,得到T6-ERG12-ERG13质粒;
(2)设计上述引物,以质粒T7为模板,扩增T7骨架;再以酵母基因组DNA为模板,扩增MVD1和ERG8基因片段,胶回收目的片段;然后将T7骨架、MVD1和ERG8基因片段通过同源重组技术进行连接,得到T7-MVD1-ERG8质粒;
(3)设计上述引物,以质粒T8为模板,扩增T8骨架;再以酵母基因组DNA为模板,扩增IDI1、tHMG1和ERG10基因片段,胶回收目的片段;然后将T8骨架、IDI1、tHMG1和ERG10基因片段通过同源重组技术进行连接,得到T8-IDI1-tHMG1-ERG10质粒;
(5)分别以质粒T6-ERG12-ERG13、质粒T7-MVD1-ERG8、质粒T8-IDI1-tHMG1-ERG10为模板,设计上述引物,扩增功能表达片段tCPS1-ERG12-pENO2-pTEF2-ERG13、tHIS5-MVD1-pGPM1-pTPI1-ERG8-tPRM5、tRPM9-IDI1-pGPD1-tTDH2-tHMG1-pTDH3-pTEF1-ERG10-tSPG5,胶回收上述四个功能片段;
(6)挑取酿酒酵母BY4742单菌落到YPD培养基中过夜摇培12h,用分光光度计测培养菌液的OD600的值,待其OD600值在0.8~0.9,于6000rpm下离心5min收集菌体,无菌水洗两次,再用900μL水重悬;
(7)将菌体转移到无菌1.5mL的离心管中,于13000rpm下离心30s收集菌体,再用900μL水重悬菌体后进行分装,每管100μL,离心弃上清,加入以下体系:
用ddH2O补齐至360μL;
(8)将混合好的转化体系重悬菌体,于30℃培养箱中保温20min,然后于42℃热激40min,最后涂布CM-His平板,培养2d,挑取单克隆测序验证,得到原人参二醇酵母细胞工厂BY-II。
实施例3
本实施例对实施例2构建的原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅱ进行优化,通过强启动子PTDH3、PHXT8、PPGK1和PTEF1上调内质网调控因子INO2基因的表达,促进内质网空间扩增,增强内质网蛋白的合成和折叠能力,为关键限速酶P450及其伴侣蛋白CPR酶提供更多的催化场地,提高原人参二醇代谢的稳定性,具体如下:
a1:设计引物,以质粒G418、质粒PYES3-CT、酵母基因组DNA为模板,扩增G418骨架、URA3标签、PHXT8、PTDH3、PTEF1和PPGK1启动子基因片段及INO2整合位点上下游同源臂500bp;
a2:将扩增后的G418骨架、URA3标签、PHXT8、PTDH3、PTEF1和PPGK1启动子基因片段及整合位点上下游同源臂500bp通过同源重组技术进行连接,构建得到G418-upINO2-URA3-PHXT8-downINO2、G418-upINO2-URA3-PTDH3-downINO2、G418-upINO2-URA3-PTEF1-downINO2和G418-upINO2-URA3-PPGK1-downINO2四个重组质粒;
a3:挑取原人参二醇酵母细胞工厂BY-I单菌落到YPD培养基中过夜摇培12h,用分光光度计测培养液的OD600的值,待其OD600值在0.8~0.9,于6000rpm下离心5min收集菌体,无菌去离子水洗两次,再用900μL水重悬;
a4:将重悬菌体转移到1.5mL的无菌离心管中,于13000rpm下离心30s收集菌体,再用900μL水重悬菌体后进行分装,每管100μL,离心弃上清,分别加入以下体系:
质量浓度为50%的PEG3350 240μL;
1.0M LiAc 36μL;
10mg/mL的鲑鱼精DNA 10μL;
再将供体片段G418-upINO2-URA3-PHXT8-downINO2、G418-upINO2-URA3-PTDH3-downINO2、G418-upINO2-URA3-PTEF1-downINO2、G418-upINO2-URA3-PPGK1-downINO2各200ng分别加入到不同的离心管中,每管用ddH2O补齐至360μL,然后将混合好的转化体系重悬菌体于30℃培养箱中保温20min,42℃热激40min,涂布CM-Ura平板,培养2d,挑取单克隆测序验证,得到原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅲ。
所述引物upINO2-F序列为gcgtgtttatgcttaaatgcggtcactcctgtaagctcgtcc,引物upINO2-R序列为ttcccagttgcttgttgcatgtcaaggatatgagtttatggtgttca。
所述引物downINO2-F序列为cataaactcatatccttgacatgcaacaagcaactgggaac,引物downINO2-R序列为tggccatagaaaaattctgttttaattcggtatacctatgctgctt。
所述引物URA3-F序列为cataaactcatatccttgacttcaattcatcattttttttttattcttt,引物URA3-R序列为catacccctcatttccacgggggtaataactgatataattaaattgaagct。
所述引物PHXT8-F序列为aattatatcagttattacccccgtggaaatgaggggtatg,引物PHXT8-R序列为ttcccagttgcttgttgcatattttttgattaaaattaaaaaaact。
所述引物PTDH3-F序列为aattatatcagttattacccatactagcgttgaatgttagcgtca,引物PTDH3-R序列为ttcccagttgcttgttgcattttgtttgtttatgtgtgtttattcga。
所述引物PTEF1-F序列为aattatatcagttattacccagtgatcccccacacaccatag,引物PTEF1-R序列为cccagttgcttgttgcattttgtaattaaaacttagattagattgct。
所述引物PPGK1-F序列为aattatatcagttattacccacgcacagatattataacatctgcac,引物PPGK1-R序列为ttcccagttgcttgttgcattgttttatatttgttgtaaaaagtagataattact。
所述引物G4GJ-F序列为acagaatttttctatggccaatttatt,引物G4GJ-R序列为gcatttaagcataaacacgcactat。
所述引物G-upINO2-F序列为ggtcactcctgtaagctcgt,引物G-upINO2-R序列为cttcttgttgttgacgctaacattcaacgctagtatgtcaaggatatgagggtgttca。
所述引物P-PTEF1-F序列为ctttttcctttatgaacaccataaactcatatccttgacagtgatcccccacacaccat,引物P-PTEF1-R序列为cccagtaattcgttcccagttgcttgttgcattttgtaattaaaacttagat。
对构建的原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅲ进一步进行优化,利用葡萄糖感应启动子PHXT1,下调羊毛甾醇合酶ERG7基因表达,削弱羊毛甾醇代谢途径,提高原人参二醇的代谢通量,具体如下:
b1:设计引物,以G418质粒、酵母基因组DNA为模板,扩增G418骨架、PHXT1启动子基因片段和整合位点上下游同源臂500bp;
b2:将G418骨架、PHXT1基因片段、整合位点上下游同源臂500bp通过同源重组技术连接,然后把重组体系转化到大肠杆菌DH5α,构建得到G418-upERG7-PHXT1-downERG7重组质粒;
b3:挑取原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅲ单菌落到YPD培养基中过夜摇培12h,用分光光度计测培养菌液的OD600的值,待其OD600值在0.8~0.9,于6000rpm下离心5min收集菌体,无菌去离子水洗两次,再用900μL水重悬;
b4:将重悬菌体转移到1.5mL的无菌离心管中,于13000rpm下离心30s收集菌体,再用900μL水重悬菌体后进行分装,每管100μL,离心弃上清,加入以下体系:
用ddH2O补齐至360μL;然后将混合好的转化体系重悬菌体,于30℃培养箱中保温20min,42℃热激40min,涂布YPD+G418平板,培养2d,挑取单克隆测序验证,得到原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅳ。
所述的引物G4GJ-F序列为acagaatttttctatggccaatttatt,引物G4GJ-R序列为gcatttaagcataaacacgcac;
所述引物upERG7-F序列为taataccccttgaggagaatgt,引物upERG7-R序列为tgtattagtgttcctcgataaagtcgattcaattcatca。
所述引物PHXT1-F序列为taatcgtcaactagttgatatacgtaaaatcatgacagaattttattctgacacaatcg,引物PHXT1-R序列为ggtccttgggtagacccaata。
所述引物downERG7-F序列为agatgcggccagcaaaactaatctcatctggaatataattc,引物downERG7-R序列为gaccgattgtgtcagaataaaattctgtcatgattttacgtatatcaactagttgacga。
所述引物G-upERG7-F序列为agataataccccttgaggagaatgt,引物G-upERG7-R序列为ttcaggaggggggaattatattccagatgagatcgactttatcgaggaacact。
所述引物P-PHXT1-F序列为tcaagagttgtattagtgttcctcgataaagtcgatctcatctggaatataatt,引物P-PHXT1-R序列为gaccgattgtgtcagaataaaattctgtcatgattttacgtatatcaacta。
所述引物G-downERG7-F序列为taatcgtaactagttgatatacgtaaaatcatgacagaattttattctgacac,引物G-DownERG7-R序列为ggtccttgggtagacccaata。
对构建的原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅳ进行进一步优化,通过削弱竞争性代谢途径法尼醇,上调甾醇转录调控因子UPC2,提高细胞工厂的稳定性和代谢稳定性,具体如下:
c1:设计引物,以G418质粒、酵母基因组DNA,分别扩增G418骨架、UPC2基因片段、LPP1上下游同源臂500bp;
c2:设计引物,将UPC2基因片段进行定点突变,构建UPC2.1片段;
c3:将G418骨架、LPP1上下游同源臂500bp、UPC2.1基因片段通过同源重组技术连接,然后把重组体系转化至大肠杆菌DH5α,构建得到G418-upLPP1-PPGK1-UPC2.1-TADH1-downLPP1重组质粒;
c4:挑取原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅳ单菌落到YPD培养基中过夜摇培12h,用分光光度计测培养菌液的OD600的值,待其OD600值在0.8~0.9,于6000rpm下离心5min收集菌体,无菌去离子水洗两次,再用900μL水重悬;
c5:将重悬菌体转移到1.5mL的无菌离心管中,于13000rpm下离心30s收集菌体,再用900μL水重悬菌体后进行分装,每管100μL,离心弃上清,加入以下体系:
用ddH2O补齐至360μL,然后将混合好的转化体系重悬菌体,于30℃培养箱中保温20min,42℃热激40min,涂布YPD+G418平板,培养2d,挑取单克隆测序验证,得到原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅴ。
所述引物pLPP1-F序列为aaaggggcagaagcaagatt。
所述引物upLPP1-R序列为ttattgaccacacctctaccggcatgccgataacacttacagag。
所述引物UPC2(G-A)-F序列为gaggtggtgatatgcatatgatgctagatttcctcg,引物UPC2(G-A)-R序列为atgcatatcaccacctccactgtattcgtcaa。
所述引物PPGK1-Pro-F为tgtataccgacttcgctcattgttttatatttgttgtaaaaagta,引物PPGK1-Pro-R序列为cgcctaaggaaactcgtcatattctaccaaggacgcacagatattata。
所述引物TADH1-Ter-F序列为ctgataggactctgtaagtgttatcggcatgccggtagaggtg,引物TADH1-Ter-R序列为ttttcgttatgaagttataaaaaaaataagtgtatacaaattttaaag。
所述引物UPC2.1-F序列为cacttattttttttataacttcataacgaaaaatcagagaaatttgt,引物UPC2.1-R序列为tttacaacaaatataaaacaatgagcgaagtcggtatacagaatc。
所述引物downLPP1-F序列为tgttataatatctgtgcgtccttggtagaatatgacgagtttcc,引物downLPP1-R序列为ccaatcatggtttcatggtcactg。
应用例1
本实施例例以葡萄糖为初始碳源,利用实施例1构建的原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅰ合成原人参二醇,具体如下:
(1)发酵罐培养基以高密度培养基为基础进行乙醇补料发酵,培养基各组分及含量如下:
30g/L葡萄糖、15g/L(NH4)2SO4、8g/L KH2PO4、5.65g/L MgSO4·7H2O、0.72g/LZnSO4·7H2O、5g/L赖氨酸、0.2g/L尿嘧啶、0.2g/L亮氨酸、0.1g/L组氨酸。
12mL维生素溶液:0.05g/L生物素,1g/L泛酸钙,1g/L烟酸,25g/L肌醇,1g/L盐酸硫铵,1g/L盐酸吡哆醛,0.2g/L对氨基苯甲酸。
10mL微量金属溶液:(5.75g/L ZnSO4·7H2O,0.32g/L MnCl2·4H2O,0.47g/LCoCl2·6H2O,0.48g/L Na2MoO4·2H2O,2.9g/L CaCl2·2H2O,2.8g/L FeSO4·7H2O和80ml/L0.5M EDTA,pH8.0)。
(2)将菌株BY-Ⅰ在含有2.5L高密度培养基的生物反应器(5L)中发酵;首先取150mL种子溶液在30℃和220rpm的条件下培养18h,然后接种于2.5L的高密度培养基中。设置发酵温度32℃,pH控制6.0,空气流速4L/min;溶解氧40%,发酵液乙醇浓度控制在1~5g/L范围内。
(3)发酵过程中,使用岛津UV-1900i测定菌体密度的OD600,生物传感分析仪测定发酵液中葡萄糖和乙醇浓度,高效液相色谱仪测定PPD浓度。
(4)在5L发酵罐发酵过程中部分PPD会分泌到细胞外,附着在发酵罐内壁和搅拌器上,发酵结束后,收集菌体和固形物,乙酸乙酯提取原人参二醇,挥发乙酸乙酯后进行甲醇重悬和HPLC分析。
本实施例发酵时间为104h时,PPD产量为1.06±0.12g/L。
应用例2
本实施例以木薯淀粉水解液为初始碳源,利用实施例2构建的原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅱ合成原人参二醇,具体如下:
(1)木薯淀粉水解液预处理:
称量70g木薯粉,加入300mL自来水,调节pH至6.5,加入适量液化酶,灭菌锅121度预处理15min,破坏淀粉颗粒结构;
补加液化酶母液15mL,于95℃、160rpm下液化2h;
降温后调节pH 5.0,加入糖化酶母液25mL,于60℃、160rpm下糖化24h,糖化结束后,调节pH至7.0左右,离心收集上清,进行后续的发酵实验。
(2)按照上述处理之后得到糖化液的终体积约300mL,糖浓度约122g/L。
发酵罐培养基以高密度培养基为基础进行乙醇补料发酵,培养基各组分及含量如下:
300mL木薯淀粉水解液、15g/L(NH4)2SO4、8g/L KH2PO4、5.65g/L MgSO4·7H2O、0.72g/L ZnSO4·7H2O、5g/L赖氨酸、0.2g/L尿嘧啶、0.2g/L亮氨酸、0.1g/L组氨酸;
12mL维生素溶液:0.05g/L生物素、1g/L泛酸钙、1g/L烟酸、25g/L肌醇、1g/L盐酸硫铵、1g/L盐酸吡哆醛、0.2g/L对氨基苯甲酸;
10mL微量金属溶液:5.75g/L ZnSO4·7H2O、0.32g/L MnCl2·4H2O、0.47g/LCoCl2·6H2O、0.48g/L Na2MoO4·2H2O、2.9g/L CaCl2·2H2O、2.8g/L FeSO4·7H2O和80mL/L0.5M EDTA,pH8.0。
(3)将菌株BY-Ⅱ在含有1.5L高密度培养基的生物反应器(5L)中发酵,首先取150mL种子溶液在30℃和220rpm的条件下培养18h,随后接种于1.5L的高密度培养基中。设置发酵温度30℃,pH控制5.5,空气流速2L/min,溶解氧35%,发酵液乙醇浓度控制在1~5g/L范围内。
(4)发酵过程中使用岛津UV-1900i测定菌体密度OD600,生物传感分析仪测定发酵液中葡萄糖和乙醇浓度,高效液相色谱仪测定PPD浓度。
(5)在5L发酵罐发酵过程中部分PPD会分泌到细胞外,附着在发酵罐内壁和搅拌器上,发酵结束后收集菌体和固形物,乙酸乙酯提取原人参二醇,挥发乙酸乙酯后进行甲醇重悬和HPLC分析。
本实施例发酵时间为120h时,PPD产量为5.8±0.43g/L。
应用例3
本实施例以甘蔗汁为初始碳源,利用实施例3构建的原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅲ合成原人参二醇,具体如下:
(1)发酵罐培养基以高密度培养基为基础进行乙醇补料发酵,培养基各组分及含量如下:
300mL甘蔗汁(蔗糖含量15%)、15g/L(NH4)2SO4、8g/L KH2PO4、5.65g/L MgSO4·7H2O、0.72g/L ZnSO4·7H2O、5g/L赖氨酸、0.2g/L尿嘧啶、0.2g/L亮氨酸、0.1g/L组氨酸;
12mL维生素溶液:0.05g/L生物素、1g/L泛酸钙、1g/L烟酸、25g/L肌醇、1g/L盐酸硫铵、1g/L盐酸吡哆醛、0.2g/L对氨基苯甲酸;
10mL微量金属溶液:5.75g/L ZnSO4·7H2O、0.32g/L MnCl2·4H2O、0.47g/LCoCl2·6H2O、0.48g/L Na2MoO4·2H2O、2.9g/L CaCl2·2H2O、2.8g/L FeSO4·7H2O和80mL/L0.5M EDTA、pH8.0。
(2)菌株BY-Ⅲ在含有2.0L高密度培养基的生物反应器(5L)中发酵,首先取150mL种子溶液在30℃和220rpm条件下培养18h,随后接种于1.5L的高密度培养基中,设置发酵温度30℃,pH控制5.2,空气流速3L/min,溶解氧40%,发酵液乙醇浓度控制在1~5g/L范围内。
(3)发酵过程中使用岛津UV-1900i测定菌体密度OD600,生物传感分析仪测定发酵液中葡萄糖和乙醇浓度,高效液相色谱仪测定PPD浓度。在5L发酵罐发酵过程中部分PPD会分泌到细胞外,附着在发酵罐内壁和搅拌器上,发酵结束后收集菌体和固形物,乙酸乙酯提取原人参二醇,挥发乙酸乙酯后进行甲醇重悬和HPLC分析。
本实施例发酵时间为124h时,PPD产量为8.5±0.34g/L。
应用例4
本实施例以葡萄糖为初始碳源,利用实施例3构建的原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅳ合成原人参二醇,具体如下:
(1)发酵罐培养基以高密度培养基为基础进行乙醇补料发酵,培养基各组分及含量如下:
20g/L葡萄糖、15g/L(NH4)2SO4、8g/LKH2PO4、5.65g/LMgSO4·7H2O、0.72g/LZnSO4·7H2O、5g/L赖氨酸、0.2g/L尿嘧啶、0.2g/L亮氨酸、0.1g/L组氨酸;
12mL维生素溶液:0.05g/L生物素、1g/L泛酸钙、1g/L烟酸、25g/L肌醇、1g/L盐酸硫铵、1g/L盐酸吡哆醛、0.2g/L对氨基苯甲酸;
10mL微量金属溶液:5.75g/L ZnSO4·7H2O、0.32g/L MnCl2·4H2O、0.47g/LCoCl2·6H2O、0.48g/L Na2MoO4·2H2O、2.9g/L CaCl2·2H2O、2.8g/L FeSO4·7H2O和80mL/L0.5M EDTA、pH8.0。
(2)菌株BY-Ⅳ在含有1.5L高密度培养基的生物反应器(5L)中发酵,首先取15mL种子溶液在30℃和220rpm条件下培养18h,随后接种于1.5L的高密度培养基中,设置发酵温度28℃,pH控制5.0,空气流速1L/min,溶解氧30%,发酵液乙醇浓度控制在1~5g/L范围内。
(3)发酵过程中使用岛津UV-1900i测定菌体密度OD600,生物传感分析仪测定发酵液中葡萄糖和乙醇浓度,高效液相色谱仪测定PPD浓度。在5L发酵罐发酵过程中部分PPD会分泌到细胞外,附着在发酵罐内壁和搅拌器上,发酵结束后收集菌体和固形物,乙酸乙酯提取原人参二醇,挥发乙酸乙酯后进行甲醇重悬和HPLC分析。
本实施例发酵时间为136h时,PPD产量为14.6±0.63g/L。
应用例5
本实施例以木薯淀粉水解液为初始碳源,利用实施例3构建的原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅴ合成原人参二醇,具体如下:
(1)木薯淀粉水解液预处理:
称量95g木薯粉,加入420mL自来水,调节pH至5.5,加入适量液化酶,灭菌锅121℃预处理15min,破坏淀粉颗粒结构;
补加液化酶母液15mL,于95℃、160rpm下液化1h;
降温后调节pH 4.5,加入糖化酶母液25mL,于58℃、160rpm下糖化24h,糖化结束后,调节pH至7.0左右,离心收集上清,进行后续的发酵实验。
(2)按照上述处理之后得到糖化液的终体积约420mL,糖浓度约120g/L。
发酵罐培养基以高密度培养基为基础进行乙醇补料发酵,培养基各组分及含量如下:
420mL木薯淀粉水解液、15g/L(NH4)2SO4、8g/L KH2PO4、5.65g/L MgSO4·7H2O、0.72g/L ZnSO4·7H2O、5g/L赖氨酸、0.2g/L尿嘧啶、0.2g/L亮氨酸、0.1g/L组氨酸;
12mL维生素溶液:0.05g/L生物素、1g/L泛酸钙、1g/L烟酸、25g/L肌醇、1g/L盐酸硫铵、1g/L盐酸吡哆醛、0.2g/L对氨基苯甲酸;
10mL微量金属溶液:5.75g/L ZnSO4·7H2O、0.32g/L MnCl2·4H2O、0.47g/LCoCl2·6H2O、0.48g/L Na2MoO4·2H2O、2.9g/L CaCl2·2H2O、2.8g/L FeSO4·7H2O和80mL/L0.5M EDTA,pH8.0。
(3)将菌株BY-Ⅴ在含有2.5L高密度培养基的生物反应器(5L)中发酵,首先取150mL种子溶液在30℃和220rpm的条件下培养18h,随后接种于1.5L的高密度培养基中。设置发酵温度32℃,pH控制6.0,空气流速4L/min;溶解氧40%,发酵液乙醇浓度控制在1~5g/L范围内。
(4)发酵过程中使用岛津UV-1900i测定菌体密度OD600,生物传感分析仪测定发酵液中葡萄糖和乙醇浓度,高效液相色谱仪测定PPD浓度。
(5)在5L发酵罐发酵过程中部分PPD会分泌到细胞外,附着在发酵罐内壁和搅拌器上,发酵结束后收集菌体和固形物,乙酸乙酯提取原人参二醇,挥发乙酸乙酯后进行甲醇重悬和HPLC分析。
本实施例的发酵时间为112h时,PPD产量为18.56±0.49g/L。
应用例6
本实施例以甘蔗汁为初始碳源,利用实施例3构建的原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅴ合成原人参二醇,具体如下:
(1)发酵罐培养基以高密度培养基为基础进行乙醇补料发酵,培养基各组分及含量如下:
200mL甘蔗汁(蔗糖含量15%)、15g/L(NH4)2SO4、8g/L KH2PO4、5.65g/L MgSO4·7H2O、0.72g/L ZnSO4·7H2O、5g/L赖氨酸、0.2g/L尿嘧啶、0.2g/L亮氨酸、0.1g/L组氨酸;
12mL维生素溶液:0.05g/L生物素、1g/L泛酸钙、1g/L烟酸、25g/L肌醇、1g/L盐酸硫铵、1g/L盐酸吡哆醛、0.2g/L对氨基苯甲酸;
10mL微量金属溶液:5.75g/L ZnSO4·7H2O、0.32g/L MnCl2·4H2O、0.47g/LCoCl2·6H2O、0.48g/L Na2MoO4·2H2O、2.9g/L CaCl2·2H2O、2.8g/L FeSO4·7H2O和80mL/L0.5M EDTA、pH8.0。
(2)菌株BY-Ⅴ在含有1.5L高密度培养基的生物反应器(5L)中发酵,首先取150mL种子溶液在30℃和220rpm条件下培养18h,随后接种于1.5L的高密度培养基中,设置发酵温度30℃,pH控制5.0,空气流速2L/min,溶解氧32%,发酵液乙醇浓度控制在1~5g/L范围内。
(3)发酵过程中使用岛津UV-1900i测定菌体密度OD600,生物传感分析仪测定发酵液中葡萄糖和乙醇浓度,高效液相色谱仪测定PPD浓度。在5L发酵罐发酵过程中部分PPD会分泌到细胞外,附着在发酵罐内壁和搅拌器上,发酵结束后收集菌体和固形物,乙酸乙酯提取原人参二醇,挥发乙酸乙酯后进行甲醇重悬和HPLC分析。
本实施例的发酵时间为124h时,PPD产量为23.92±0.96g/L。
应用例7
本实施例以甘蔗糖蜜为初始碳源,利用实施例3构建的原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅴ合成原人参二醇,具体如下:
(1)发酵罐培养基以高密度培养基为基础进行乙醇补料发酵,培养基各组分及含量如下:
60g/L甘蔗糖蜜(总糖含量约50%)、15g/L(NH4)2SO4、8g/LKH2PO4、5.65g/L MgSO4·7H2O、0.72g/LZnSO4·7H2O、5g/L赖氨酸、0.2g/L尿嘧啶、0.2g/L亮氨酸、0.1g/L组氨酸;
12mL维生素溶液:0.05g/L生物素、1g/L泛酸钙、1g/L烟酸、25g/L肌醇、1g/L盐酸硫铵、1g/L盐酸吡哆醛、0.2g/L对氨基苯甲酸;
10mL微量金属溶液:5.75g/L ZnSO4·7H2O、0.32g/L MnCl2·4H2O、0.47g/LCoCl2·6H2O、0.48g/L Na2MoO4·2H2O、2.9g/L CaCl2·2H2O、2.8g/L FeSO4·7H2O和80mL/L0.5M EDTA、pH8.0。
(2)菌株BY-Ⅴ在含有2.0L高密度培养基的生物反应器(5L)中发酵,首先取150mL种子溶液在30℃和220rpm条件下培养18h,随后接种于1.5L的高密度培养基中,设置发酵温度30℃,pH控制5.8,空气流速2L/min;溶解氧35%,发酵液乙醇浓度控制在1-5g/L范围内。
(3)发酵过程中使用岛津UV-1900i测定菌体密度OD600,生物传感分析仪测定发酵液中葡萄糖和乙醇浓度,高效液相色谱仪测定PPD浓度。在5L发酵罐发酵过程中部分PPD会分泌到细胞外,附着在发酵罐内壁和搅拌器上,发酵结束后收集菌体和固形物,乙酸乙酯提取原人参二醇,挥发乙酸乙酯后进行甲醇重悬和HPLC分析。
本实施例发酵时间为126h时,PPD产量为15.88±0.65g/L。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例,不用于限制本发明,本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域人员可以在本发明的实质和保护范围内,对本发明做出各种修改或等同替换,这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种原人参二醇酵母细胞工厂的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)以质粒T1为模板,在质粒T1上串联法尼基焦磷酸合成酶基因ERG20和角鲨烯合酶基因ERG9,构建T1-ERG20-ERG9重组质粒;
(2)以质粒T2为模板,质粒T2上串联料角鲨烯环氧酶基因ERG1和达玛烯二醇合酶基因DS,构建T2-ERG1-DS重组质粒;
(3)以质粒T3为模板,在质粒T3上串联原人参二醇合酶基因CYP716A47、NADPH的辅酶基因46ATR1、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1,构建T3-CYP716A47-46ATR1-tHMG1重组质粒;
(4)以质粒T4为模板,质粒T4上串联原人参二醇合酶基因CYP716A47和NADPH的辅酶基因46ATR1,构建T4-CYP716A47-46ATR1重组质粒;
(5)分别以质粒T1-ERG20-ERG9、质粒T2-ERG1-DS、质粒T3-CYP716A47-46ATR1-tHMG1和质粒T4-CYP716A47-46ATR1为模板,扩增得到功能表达片段pADH1-ERG20-tPI1-tHXT8- ERG9-pPGI7、pPGI-ERG1-tADH1-pRPL8A-DS-tCYC1、pADH1-CYP716A47-46ATR1-tFBA1- pADH3-tHMG1-tPDC1和pGK1-CYP716A47-46ATR1-tTDH1;
(6)将功能表达片段pADH1-ERG20-tPI1-tHXT8-ERG9-pPGI7、pPGI-ERG1-tADH1- pRPL8A-DS-tCYC1、pADH1-CYP716A47-46ATR1-tFBA1-pADH3-tHMG1-tPDC1和pGK1- CYP716A47-46ATR1-tTDH1整合至酿酒酵母,高通筛选得到原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅰ;
(7)以质粒T6为模板,在质粒T6上串联甲羟戊酸激酶基因ERG12和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因ERG13,构建T6-ERG12-ERG13重组质粒;
(8)以质粒T7为模板,质粒T7上串联甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因MVD1和磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8,构建T7-MVD1-ERG8重组质粒;
(9)以质粒T8为模板,在质粒T8上串联异戊烯基焦磷酸合酶基因IDI1和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因tHMG1和乙酰辅酶A酰基转移酶ERG10,构建T8-IDI1-tHMG1- ERG10重组质粒;
(10)分别以质粒T6-ERG12-ERG13、质粒T7-MVD1-ERG8、质粒T8-IDI1-tHMG1-ERG10为模板,扩增得到功能表达片段tCPS1-ERG12-pENO2-pTEF2-ERG13-tIDP1、tHIS5-MVD1-pGPM1-pTPI1-ERG8-tPRM5、tRPM9-IDI1-pGPD1-tTDH2-tHMG1-pTDH3-pTEF1-ERG10-tSPG5;
(11)将功能表达片段tCPS1-ERG12-pENO2-pTEF2-ERG13-tIDP1、tHIS5-MVD1-pGPM1-pTPI1-ERG8-tPRM5、tRPM9-IDI1-pGPD1-tTDH2-tHMG1-pTDH3-pTEF1-ERG10-tSPG5整合至原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅰ,高通量筛选得到原人参二醇酵母细胞工厂BY-ⅠI;
以上各步骤中所使用的引物如下:
引物T1-F序列为atcgaacaaatcgctcttaaatatatacc,引物T1-R序列为aaagtctacaagagatctaagtaagattaatataattatat;
引物T2-F序列为gatctgatcatgtaattagttatgtca,引物T2-R序列为tcggtgaattgattggttaaagttataaaaaaaataagtg;
引物T3-F序列为atcggcgatttaatctctaattatta,引物T3-R序列为acctaagcttgttaattcaaattaattg;
引物T4-F序列为gaattcataaagcaatcttgatgag,引物T4-R序列为atcgaacaaatcgctcttaaatatatacc;
引物T6-F序列为ccagacgatacagaggctaaga,引物T6-R序列为cgacgaacgagatacgatagaac;
引物T7-F序列为cggatcattaccatcgtaacaatatcatgagac,引物T7-R序列为tgaaaatatagaacccaaaaagagagac;
引物T8-F序列为gtcaccttgcgcgaaaagccaattagtgtga,引物T8-R序列为cttatattgcttattttctgccgaattttc;
引物ERG9-F序列为atgggtaaattgttgcaatt,引物ERG9-R序列为cgatttaagctctatgcaaagta;
引物ERG1-F序列为ttaaccaatcaattcaccgaacaaaaatggagtaaagactct,引物ERG1-R序列为ctatttgtttcgtcccattgatgtcagccgttaacgtt;
引物DS-F序列为ctattatcacatcgagctccatgtggaagttgaaagttgc,引物DS-R序列为tgacataactaattacatgatcagatcttcaattgctggt;
引物CYP716A47-F序列为acctgaacctgaagaagtag,引物CYP716A47-R序列为atggtcctgttcttctctctg;
引物tHMG1-F序列为aaacacacataaacaaacaaagatggaccaattggttaaaac,引物tHMG1-R序列为taataattagagattaaatcgccgatttaagatttaatacaagtaacaga;
引物ERG12-F序列为ttgactattcaatcattgcgcttatgaagtccatggtaaattcgtgt,引物ERG12-R序列为atactataacatacaataataatgtcattaccgttcttaacttctgc;
引物ERG13-F序列为cgaactataattaactaaacatgaaactctcaactaaactttgt,引物ERG13-R序列为tgggctacgtaaattcgattattttttaacatcgtaagatcttctaaatttg;
引物MVD1-F序列为gtttaaattaatctatttattcctttggtagaccagtctttg,引物MVD1-R序列为ccaaacaaacacacatattacaataatgaccgtttacacagcatc;
引物ERG8-F序列为cacatacataaactaaaaatgtcagagttgagagccttcagtg,引物ERG8-R序列为aaaaaaatattgcaaaatatcataaaagtttttatttatcaagataagtttccggatctttttcttt;
引物IDI1-F序列为gtgtctcccgtcttctgtttatagcattctatgaatttgcctgtc,引物IDI1-R序列为caaatattgataatataaagatgactgccgacaacaatagtatgc;
引物ERG10-F序列为gcatagcaatctaatctaagatgtctcagaacgtttacattgtatcg,引物ERG10-R序列为gcgatgaaacaacgtctttgtcatatcttttcaatgacaatagaggaa;
引物L1-tPI1-F序列为cgtctcccccggtccgtttg;引物L2-tPGI-R序列为tagtccgcgagttggatagcc;
引物L2-tADH1-F序列为gacaaagcgccaaggaactgtaata;引物L3-tCYC1-R序列为gcggacttagtccgtttct;
引物L3-tFBA1-F序列为aacgacggtagacgccaa;引物L4-tPDC1-R序列为aggttccaactgctcttactgt;
引物L4-pPGK1-F序列为ccagacgatacagaggctaaga;引物L5-tTDH1-R序列为cgacgaacgagatacgatagaac;
引物L6-tCPS1-F序列为atttgacacttgatttgacacttcttt;引物L7-tIDP1-R序列为gttacgatggtaatgatccgaacttggg;
引物L7-tHIS5-F序列为gtaacaatatcatgagaccttttatag,引物L8-tPRM5-R序列为atagaacccaaaaagagagactaaacaa;
引物L8-tRPM9-F序列为attttcaacatcgtattttccgaa,引物L9-tSPG5-R序列为gcttattttctgccgaattttca。
2.根据权利要求1所述的原人参二醇酵母细胞工厂的构建方法,其特征在于:还包括对原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅱ进行代谢网络优化,具体为:
(Ⅰ)通过强启动子P TDH3 、P HXT8 、P PGK1 和P TEF1 上调内质网调控因子INO2基因的表达;和/或(Ⅱ)利用葡萄糖诱导启动子P HXT1 进行调控,下调羊毛甾醇合酶ERG7基因表达;和/或(Ⅲ)敲除焦磷酸酶LPP1基因,上调甾醇转录调控因子UPC2。
3.根据权利要求2所述的原人参二醇酵母细胞工厂的构建方法,其特征在于:所述的(Ⅰ)包括以下步骤:
(1)设计引物,以质粒G418、质粒PYES3-CT、酵母基因组DNA为模板,扩增G418骨架、URA3标签、P HXT8 、P TDH3 、P TEF1 和P PGK1 启动子基因片段及INO2整合位点上下游同源臂500 bp;
(2)将扩增后的G418骨架、URA3标签、P HXT8 、P TDH3 、P TEF1 和P PGK1 启动子基因片段及整合位点上下游同源臂500 bp通过同源重组技术进行连接,分别构建得到G418-upINO2-URA3-P HXT8 -downINO2、G418-upINO2-URA3-P TDH3 -downINO2、G418-upINO2-URA3-P TEF1 -downINO2和G418-upINO2-URA3-P PGK1 -downINO2四个重组质粒;
(3)将重组质粒G418-upINO2-URA3-P HXT8 -downINO2、G418-upINO2-URA3-P TDH3 -downINO2、G418-upINO2-URA3-P TEF1 -downINO2和G418-upINO2-URA3-P PGK1 -downINO2分别整合至原人参二醇酵母细胞工厂BY-II,得到原人参二醇酵母细胞工厂BY-III;
以上各步骤中所使用的引物如下:
引物upINO2-F序列为gcgtgtttatgcttaaatgcggtcactcctgtaagctcgtcc,引物upINO2-R序列为ttcccagttgcttgttgcatgtcaaggatatgagtttatggtgttca;
引物downINO2-F序列为cataaactcatatccttgacatgcaacaagcaactgggaac,引物downINO2-R序列为tggccatagaaaaattctgttttaattcggtatacctatgctgctt;
引物URA3-F序列为cataaactcatatccttgacttcaattcatcattttttttttattcttt,引物URA3-R序列为catacccctcatttccacgggggtaataactgatataattaaattgaagct;
引物P HXT8 -F序列为aattatatcagttattacccccgtggaaatgaggggtatg,引物P HXT8 -R序列为ttcccagttgcttgttgcatattttttgattaaaattaaaaaaact;
引物P TDH3 -F序列为aattatatcagttattacccatactagcgttgaatgttagcgtca,引物P TDH3 -R序列为ttcccagttgcttgttgcattttgtttgtttatgtgtgtttattcga;
引物P TEF1 -F序列为aattatatcagttattacccagtgatcccccacacaccatag,引物P TEF1 -R序列为cccagttgcttgttgcattttgtaattaaaacttagattagattgct;
引物P PGK1 -F序列为aattatatcagttattacccacgcacagatattataacatctgcac,引物P PGK1 -R序列为ttcccagttgcttgttgcattgttttatatttgttgtaaaaagtagataattact;
引物G4GJ-F序列为acagaatttttctatggccaatttatt,引物G4GJ-R序列为gcatttaagcataaacacgcactat;
引物G-upINO2-F序列为ggtcactcctgtaagctcgt,引物G-upINO2-R序列为cttcttgttgttgacgctaacattcaacgctagtatgtcaaggatatgagggtgttca;
引物P-P TEF1 -F序列为ctttttcctttatgaacaccataaactcatatccttgacagtgatcccccacacaccat,引物P-P TEF1 -R序列为cccagtaattcgttcccagttgcttgttgcattttgtaattaaaacttagat。
4.根据权利要求2所述的原人参二醇酵母细胞工厂的构建方法,其特征在于:所述的(Ⅱ)包括以下步骤:
(1)设计引物,以G418质粒、酵母基因组DNA为模板,扩增G418骨架、P HXT1 启动子基因片段和整合位点上下游同源臂500bp;
(2)将G418骨架、P HXT1 基因片段、整合位点上下游同源臂500bp通过同源重组技术连接,构建得到G418-upERG7-P HXT1 -downERG7重组质粒;
(3)将重组质粒G418-upERG7-P HXT1 -downERG7整合至原人参二醇酵母细胞工厂BY-ⅠII,得到原人参二醇酵母细胞工厂BY-IV;
以上各步骤中所使用的引物如下:
引物G4GJ-F序列为acagaatttttctatggccaatttatt,引物G4GJ-R序列为gcatttaagcataaacacgcac;
引物upERG7-F序列为taataccccttgaggagaatgt,引物upERG7-R序列为tgtattagtgttcctcgataaagtcgattcaattcatca;
引物P HXT1 -F序列为taatcgtcaactagttgatatacgtaaaatcatgacagaattttattctgacacaatcg,引物P HXT1 -R序列为ggtccttgggtagacccaata;
引物downERG7-F序列为agatgcggccagcaaaactaatctcatctggaatataattc,引物downERG7-R序列为gaccgattgtgtcagaataaaattctgtcatgattttacgtatatcaactagttgacga;
引物G-upERG7-F序列为agataataccccttgaggagaatgt,引物G-upERG7-R序列为ttcaggaggggggaattatattccagatgagatcgactttatcgaggaacact;
引物P-P HXT1 -F序列为tcaagagttgtattagtgttcctcgataaagtcgatctcatctggaatataatt,引物P-P HXT1 -R序列为gaccgattgtgtcagaataaaattctgtcatgattttacgtatatcaacta;
引物G-downERG7-F序列为taatcgtaactagttgatatacgtaaaatcatgacagaattttattctgacac,引物G-DownERG7-R序列为ggtccttgggtagacccaata。
5.根据权利要求2所述的原人参二醇酵母细胞工厂的构建方法,其特征在于:所述的(Ⅲ)包括以下步骤:
(1)设计引物,以G418质粒、酵母基因组DNA,分别扩增G418骨架、UPC2基因片段、LPP1上下游同源臂500bp;
(2)设计引物,将UPC2基因片段进行定点突变,构建UPC2.1片段;
(3)将G418骨架、LPP1上下游同源臂500bp、UPC2.1基因片段通过同源重组技术连接,构建得到G418-upLPP1-P PGK1- UPC2.1-T ADH1 -downLPP1重组质粒;
(4)将重组质粒G418-upLPP1-P PGK1- UPC2.1-T ADH1 -downLPP1整合至原人参二醇酵母细胞工厂BY-IV,得到原人参二醇酵母细胞工厂BY-V;
以上各步骤中所使用的引物如下:
引物pLPP1-F序列为aaaggggcagaagcaagatt;
引物upLPP1-R序列为ttattgaccacacctctaccggcatgccgataacacttacagag;
引物UPC2(G-A)-F序列为gaggtggtgatatgcatatgatgctagatttcctcg,引物UPC2(G-A)-R序列为atgcatatcaccacctccactgtattcgtcaa;
引物P PGK1 -Pro-F序列为tgtataccgacttcgctcattgttttatatttgttgtaaaaagta,引物P PGK1 -Pro-R序列为cgcctaaggaaactcgtcatattctaccaaggacgcacagatattata;
引物T ADH1 -Ter-F序列为ctgataggactctgtaagtgttatcggcatgccggtagaggtg,引物T ADH1 -Ter-R序列为ttttcgttatgaagttataaaaaaaataagtgtatacaaattttaaag;
引物UPC2.1-F序列为cacttattttttttataacttcataacgaaaaatcagagaaatttgt,引物UPC2.1-R序列为tttacaacaaatataaaacaatgagcgaagtcggtatacagaatc;
引物downLPP1-F序列为tgttataatatctgtgcgtccttggtagaatatgacgagtttcc,引物downLPP1-R序列为ccaatcatggtttcatggtcactg。
6.如权利要求1-5任一所述的构建方法所获得的原人参二醇酵母细胞工厂的应用,其特征在于:利用葡萄糖、木薯淀粉水解液、甘蔗汁和甘蔗糖蜜中的一种为初始碳源,经过补料发酵培养,合成原人参二醇。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述的补料发酵具体方法如下:
(1)在生物反应器中添加1.5~2.5L的高密度培养基进行乙醇补料发酵,同时高密度培养基中添加葡萄糖20~30g/L,作为初始碳源;
所述的高密度培养基包含以下组分:
15g/L (NH4)2SO4、8g/L KH2PO4、5.65g/L MgSO4·7H2O、0.72g/L ZnSO4·7H2O、5g/L赖氨酸、0.2g/L尿嘧啶、0.2g/L亮氨酸、0.1g/L组氨酸;
12mL维生素溶液:0.05 g/L生物素,1g/L泛酸钙,1 g/L烟酸,25 g/L肌醇,1 g/L盐酸硫铵,1 g/L盐酸吡哆醛,0.2 g/L对氨基苯甲酸;
10mL微量金属溶液:5.75 g/L ZnSO4·7H2O,0.32 g/L MnCl2·4H2O,0.47 g/L CoCl2·6H2O,0.48 g/L Na2MoO4·2H2O,2.9 g/L CaCl2·2H2O,2.8 g/L FeSO4·7H2O和80 mL/L 0.5M EDTA,pH 8.0;
(2)取原人参二醇酵母底盘细胞在30℃和220 rpm条件下活化培养,然后接种于生物反应器中进行发酵,设置发酵温度为28~32℃,pH控制在5.0~6.0,空气流速为1~4 L/min,溶解氧为30%~40%,发酵液乙醇浓度控制在1~5g/L范围内;
所述的原人参二醇酵母底盘细胞为原人参二醇酵母细胞工厂BY-II、原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅲ、原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅳ、原人参二醇酵母细胞工厂BY-Ⅴ中的一种;
(3)发酵过程中实时监测菌体密度、发酵液中葡萄糖和乙醇的浓度、原人参二醇的浓度,发酵结束后收集固形物,乙酸乙酯提取原人参二醇,挥发后用甲醇重悬,得到原人参二醇。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于:利用木薯淀粉水解液为初始碳源合成原人参二醇时,木薯淀粉水解液的加入量为300~500mL,糖浓度为120~130g/L;
所述的木薯淀粉水解液的预处理方法如下:
称量70 g木薯粉,加入300 mL自来水,调节pH至5.5~6.5,加入适量液化酶,灭菌锅121度预处理15min,破坏淀粉颗粒结构;补加液化酶母液15 mL,于95℃、160 rpm下液化1~2h;降温后调节pH至4.0~5.0,加入糖化酶母液25 mL,55~60℃、160 rpm下糖化24 h;糖化结束后,调节pH至7.0左右,离心收集上清,得到糖化液。
9. 根据权利要求7所述的应用,其特征在于:利用甘蔗汁为初始碳源合成原人参二醇时,甘蔗汁加入量为150~200 g/L高密度培养基。
10. 根据权利要求7所述的应用,其特征在于:利用甘蔗糖蜜为初始碳源合成原人参二醇时,甘蔗糖蜜的加入量为40~60 g/L高密度培养基。
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