CN117683651A - 基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117683651A CN117683651A CN202410108920.9A CN202410108920A CN117683651A CN 117683651 A CN117683651 A CN 117683651A CN 202410108920 A CN202410108920 A CN 202410108920A CN 117683651 A CN117683651 A CN 117683651A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plasmid
- primer
- seq
- nucleotide sequence
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 25
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 74
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims abstract description 74
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 241000220317 Rosa Species 0.000 claims abstract description 27
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 26
- WCGUUGGRBIKTOS-GPOJBZKASA-N (3beta)-3-hydroxyurs-12-en-28-oic acid Chemical compound C1C[C@H](O)C(C)(C)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C(O)=O)CC[C@@H](C)[C@H](C)[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C WCGUUGGRBIKTOS-GPOJBZKASA-N 0.000 claims abstract description 17
- MIJYXULNPSFWEK-GTOFXWBISA-N 3beta-hydroxyolean-12-en-28-oic acid Chemical compound C1C[C@H](O)C(C)(C)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C(O)=O)CCC(C)(C)C[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C MIJYXULNPSFWEK-GTOFXWBISA-N 0.000 claims abstract description 17
- JKLISIRFYWXLQG-UHFFFAOYSA-N Epioleonolsaeure Natural products C1CC(O)C(C)(C)C2CCC3(C)C4(C)CCC5(C(O)=O)CCC(C)(C)CC5C4CCC3C21C JKLISIRFYWXLQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- YBRJHZPWOMJYKQ-UHFFFAOYSA-N Oleanolic acid Natural products CC1(C)CC2C3=CCC4C5(C)CCC(O)C(C)(C)C5CCC4(C)C3(C)CCC2(C1)C(=O)O YBRJHZPWOMJYKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- MIJYXULNPSFWEK-UHFFFAOYSA-N Oleanolinsaeure Natural products C1CC(O)C(C)(C)C2CCC3(C)C4(C)CCC5(C(O)=O)CCC(C)(C)CC5C4=CCC3C21C MIJYXULNPSFWEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 229940100243 oleanolic acid Drugs 0.000 claims abstract description 17
- HZLWUYJLOIAQFC-UHFFFAOYSA-N prosapogenin PS-A Natural products C12CC(C)(C)CCC2(C(O)=O)CCC(C2(CCC3C4(C)C)C)(C)C1=CCC2C3(C)CCC4OC1OCC(O)C(O)C1O HZLWUYJLOIAQFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- PLSAJKYPRJGMHO-UHFFFAOYSA-N ursolic acid Natural products CC1CCC2(CCC3(C)C(C=CC4C5(C)CCC(O)C(C)(C)C5CCC34C)C2C1C)C(=O)O PLSAJKYPRJGMHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 229940096998 ursolic acid Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 120
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 103
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 57
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 57
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 16
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 10
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 240000002547 Rosa roxburghii Species 0.000 claims description 9
- 235000000640 Rosa roxburghii Nutrition 0.000 claims description 9
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 claims description 8
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 claims description 8
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 7
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-N isopentenyl diphosphate Chemical compound CC(=C)CCO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- CBIDRCWHNCKSTO-UHFFFAOYSA-N prenyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O CBIDRCWHNCKSTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 101000998379 Arabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450 reductase 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 101000762158 Catharanthus roseus Alstonine synthase Proteins 0.000 abstract description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 244000253724 Saccharomyces cerevisiae S288c Species 0.000 description 8
- 235000004905 Saccharomyces cerevisiae S288c Nutrition 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 8
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 7
- 150000003648 triterpenes Chemical class 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 241000863480 Vinca Species 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100039555 Galectin-7 Human genes 0.000 description 3
- 101000608772 Homo sapiens Galectin-7 Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- FSLPMRQHCOLESF-SFMCKYFRSA-N alpha-amyrin Chemical compound C1C[C@H](O)C(C)(C)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C)CC[C@@H](C)[C@H](C)[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C FSLPMRQHCOLESF-SFMCKYFRSA-N 0.000 description 3
- SJMCNAVDHDBMLL-UHFFFAOYSA-N alpha-amyrin Natural products CC1CCC2(C)CCC3(C)C(=CCC4C5(C)CCC(O)CC5CCC34C)C2C1C SJMCNAVDHDBMLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JFSHUTJDVKUMTJ-QHPUVITPSA-N beta-amyrin Chemical compound C1C[C@H](O)C(C)(C)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C)CCC(C)(C)C[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C JFSHUTJDVKUMTJ-QHPUVITPSA-N 0.000 description 3
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- QYIMSPSDBYKPPY-RSKUXYSASA-N (S)-2,3-epoxysqualene Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC[C@@H]1OC1(C)C QYIMSPSDBYKPPY-RSKUXYSASA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100026422 Carbamoyl-phosphate synthase [ammonia], mitochondrial Human genes 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710140859 E3 ubiquitin ligase TRAF3IP2 Proteins 0.000 description 2
- 102100026620 E3 ubiquitin ligase TRAF3IP2 Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 2
- 101000855412 Homo sapiens Carbamoyl-phosphate synthase [ammonia], mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 101000983292 Homo sapiens N-fatty-acyl-amino acid synthase/hydrolase PM20D1 Proteins 0.000 description 2
- 101000861263 Homo sapiens Steroid 21-hydroxylase Proteins 0.000 description 2
- QYIMSPSDBYKPPY-UHFFFAOYSA-N OS Natural products CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC1OC1(C)C QYIMSPSDBYKPPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- FSLPMRQHCOLESF-UHFFFAOYSA-N alpha-amyrenol Natural products C1CC(O)C(C)(C)C2CCC3(C)C4(C)CCC5(C)CCC(C)C(C)C5C4=CCC3C21C FSLPMRQHCOLESF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- QQFMRPIKDLHLKB-UHFFFAOYSA-N beta-amyrin Natural products CC1C2C3=CCC4C5(C)CCC(O)C(C)(C)C5CCC4(C)C3(C)CCC2(C)CCC1(C)C QQFMRPIKDLHLKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PDNLMONKODEGSE-UHFFFAOYSA-N beta-amyrin acetate Natural products CC(=O)OC1CCC2(C)C(CCC3(C)C4(C)CCC5(C)CCC(C)(C)CC5C4=CCC23C)C1(C)C PDNLMONKODEGSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 229930000223 plant secondary metabolite Natural products 0.000 description 2
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 2
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 2
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 102100038910 Alpha-enolase Human genes 0.000 description 1
- 101150051438 CYP gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- 101150093680 ERG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150051269 ERG10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150071502 ERG12 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150014913 ERG13 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150084072 ERG20 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150045041 ERG8 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101000882335 Homo sapiens Alpha-enolase Proteins 0.000 description 1
- 102100032011 Lanosterol synthase Human genes 0.000 description 1
- 108010059597 Lanosterol synthase Proteins 0.000 description 1
- 229910009891 LiAc Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150079299 MVD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 102220531050 Nociceptin receptor_C18W_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101100439777 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CIT2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100451954 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HXT1 gene Proteins 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940040526 anhydrous sodium acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- VLMZMRDOMOGGFA-WDBKCZKBSA-N festuclavine Chemical compound C1=CC([C@H]2C[C@H](CN(C)[C@@H]2C2)C)=C3C2=CNC3=C1 VLMZMRDOMOGGFA-WDBKCZKBSA-N 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 101150081406 idi1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 101150044508 key gene Proteins 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000745 plant chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 triterpene compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229940054967 vanquish Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于合成生物技术领域，具体公开了提供了基因工程菌及其构建方法和应用。本发明首次实现了刺梨酸在真核生物中的全合成，通过对从刺梨中筛选得到的RrCYP450‑5基因、RrCYP450‑4基因、RrCYP450‑3基因在酿酒酵母中的表达进行研究，先选用基因拟南芥AtCPR1和长春花CrAS、CrAO构建了能够产熊果酸和齐墩果酸的酵母底盘菌株DYK02；接着以菌株DYK02作为底盘，将RrCYP450‑4基因与RrCYP450‑5基因在酿酒酵母菌株DYK02中进行异源表达，最终得到一株能够产生刺梨酸的酿酒酵母菌株DYK08，经过摇瓶发酵得到刺梨酸，产量为104±2μg/L。
Description
技术领域
本发明属于合成生物技术领域，具体涉及基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
植物天然产物经过长期的分子进化，以其多样独特的分子结构，不仅在宿主体内发挥着信号转导、抗逆、防御等作用，在异源表达时也具有各种的活性，是药物和食品研发的重要来源。但植物中特有的植物次生代谢产物往往含量很少，且生物合成途径并不明晰，很大程度上阻碍了这些次生代谢产物通过合成生物学的方法进行大规模的生物制造。
刺梨中富含的三萜类化合物具有很好的药理活性，通过解析其生物合成途径可以更好的开发和应用刺梨三萜。由于植物次级代谢产物生物合成途径的关键基因与原核生物中天然产物的合成途径不同，其关键基因簇往往离散的分布在植物染色体的不同部位，导致其遗传表达体系的建立也十分困难，这极大的阻碍了利用基因敲除和突变的传统策略进行植物次级代谢产物生物合成途径的解析。
目前，已在酵母中进行功能验证的大多数 P450 属于双子叶植物 CYP716 家族。大多数 CYP450 表现出混合的底物和产物，不仅作用于各种结构类似物，还氧化底物的不同位置。CYP450 的混杂催化活性有助于植物中三萜类化合物的多样化，但可能导致酵母中不理想的结构类似物。异源表达的植物 P450 在微生物中表现出较差的化学和区域选择性，限制了相关天然产物的有效生物合成。
因此，从自然界中获取刺梨三萜的来源很有限，而且现有技术中缺少生产刺梨酸的基因工程菌。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供了基因工程菌及其构建方法和应用，通过将RrCYP450-4与RrCYP450-5在酿酒酵母中进行异源表达，得到能够以熊果酸为底物产生刺梨酸的菌株 DYK08。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明的第一目的是提供一种生产刺梨酸的基因工程菌，以产熊果酸和齐墩果酸的酿酒酵母为底盘菌株，将RrCYP450-5基因和RrCYP450-4基因依次整合至所述底盘菌株的基因组上，得到生产刺梨酸的基因工程菌，所述RrCYP450-5基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述RrCYP450-4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述产熊果酸和齐墩果酸的酿酒酵母构建过程包括以下步骤：
S1、以酿酒酵母CEN.PK2-1D 菌株为底盘，构建过表达IPP和DMAPP的质粒载体，利用 CRISPR/Cas9 技术将相应的基因表达盒整合至酿酒酵母CEN.PK2-1D 中，得过表达 MVA途径的底盘菌株，记为酿酒酵母菌株 D3；
S2、利用CRISPR/Cas9 技术将CrAS基因、AtCPR1基因和CrAO基因整合至酿酒酵母菌株 D3 基因组中，即得到产熊果酸和齐墩果酸的酿酒酵母菌株 DYK02。
进一步的，步骤S1中，所述的过表达IPP和DMAPP的质粒载体包括 pD1 质粒、pD2质粒和pD3 质粒，所述pD1质粒含有tHMG1、ERG10和ERG13基因表达盒，所述pD2 质粒含有tHMG1、ERG12和IDI1基因表达盒，所述pD3 质粒含有ERG20、ERG8和MVD1基因表达盒。
进一步的，步骤S2中，整合的具体过程是通过将构建的pD4、pDYK01和pDYK02质粒导入到菌株 D3中；所述pD4质粒含有CrAS和ERG1基因表达盒，所述pDYK01质粒含有CrAO和AtCPR1基因表达盒，所述pDYK02质粒含有pHXT1基因表达盒。
本发明的第二目的是提供上述的基因工程菌的构建方法，包括以下具体步骤：
S1、以酿酒酵母DYK02 菌株为宿主，将RrCYP450-5基因表达盒整合至 ybr128C 位点，得到菌株 DYK03；
S2、以菌株 DYK03为底盘菌株，将RrCYP450-4基因表达盒整合至 DYK03酿酒酵母基因组上，得到所述基因工程菌，记为菌株 DYK08。
进一步的，所述RrCYP450-5基因表达盒的质粒载体为pDYK03质粒，所述pDYK03质粒的构建过程为：以酿酒酵母 CEN.PK2-1D 基因组为模板，用引物 1701-F 和1701-R，1705-F 和 1705-R，PCR 扩增整合位点同源左臂和同源右臂片段；以pDYK01质粒为模板，用引物1702-F和1702- R，PCR扩增得到GAL1启动子片段；以刺梨cDNA为模板，用引物1703-F和1703-R，PCR扩增得到RrCYP450-5基因片段；以43802质粒为模板，用引物1704-F和1704-R，PCR扩增得到CYC1终止子片段；以pRS426-URA质粒为模板，用引物1706-F和1706-R，PCR扩增得到质粒骨架片段；将上述片段预处理后，经酵母醋酸锂转化，组装成 pDYK03 质粒；
所述引物1701-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，
所述引物1701-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，
所述引物1702-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，
所述引物1702-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，
所述引物1703-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，
所述引物1703-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，
所述引物1704-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，
所述引物1704-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，
所述引物1705-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，
所述引物1705-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，
所述引物1706-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，
所述引物1706-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
进一步的，所述RrCYP450-4基因表达盒的质粒载体为pDYK05质粒，所述pDYK05质粒的构建过程为：以酿酒酵母 CEN.PK2-1D 基因组为模板，用引物 1901-F 和1901-R，1905-F 和 1905-R，PCR 扩增整合位点同源左臂和同源右臂片段；以pDYK01质粒为模板，用引物1902-F和1902-F，PCR扩增得到GAL1启动子片段；以刺梨cDNA为模板，用引物1903-F和1903-R，PCR扩增得到RrCYP450-4基因片段；以43802质粒为模板，用引物1904-F和1904-R，PCR扩增得到CYC1终止子片段；以pRS426-URA质粒为模板，用引物1906-F和1906-R，PCR扩增得到质粒骨架片段；将上述片段预处理后，经酵母醋酸锂转化，组装成 pDYK05 质粒；
所述引物1901-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，
所述引物1901-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，
所述引物1902-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，
所述引物1902-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，
所述引物1903-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，
所述引物1903-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，
所述引物1904-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，
所述引物1904-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，
所述引物1905-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，
所述引物1905-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，
所述引物1906-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，
所述引物1906-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。
本发明的第三目的是提供上述的基因工程菌在制备刺梨酸中的应用。
本发明的第四目的是提供一种生产刺梨酸的方法，将上述的基因工程菌发酵培养，从培养物中获得刺梨酸。
进一步的，所述发酵培养过程为在YPDG 培养基中进行摇瓶发酵培养 至少120 h。
现有技术比较，本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
（1）本发明以刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）为研究对象，对从刺梨中筛选得到的三个 RrCYP450 基因（RrCYP450-5基因、RrCYP450-4基因、RrCYP450-3基因）在真核生物中的表达进行研究，首先选用基因拟南芥AtCPR1和长春花CrAS、CrAO构建了一株能够产熊果酸和齐墩果酸的酵母底盘菌株 DYK02，经发酵检测该菌株能够生产熊果酸的产量为3.25± 0.35 mg/L，齐墩果酸 1.78 ±1.05 mg/L；接着以菌株 DYK02 作为底盘，将RrCYP450-4基因 与RrCYP450-5基因在酿酒酵母菌株 DYK02中进行异源表达，最终得到一株能够产生刺梨酸的酿酒酵母菌株 DYK08，经过摇瓶发酵得到刺梨酸的产量为 104 ±2μg/L。
（2）本发明首次实现了刺梨酸在酿酒酵母中的全合成。
附图说明
图1为质粒pD1、pD2、pD3基因表达盒示意图；
图2为质粒pD4、pDYK01、pDYK02基因表达盒示意图；
图3为质粒pDYK03、pDYK04、pDYK05基因表达盒示意图；
图4为菌株DYK02、DYK08、DYK11发酵产物含量对比图，图中刺梨酸（Roxburicacid），熊果酸（Ursolic acid），齐墩果酸（Oleanolic acid）；
图5为菌株DYK08发酵产物HPLC检测图谱，图中1：刺梨酸；2：齐墩果酸；3：熊果酸；
图6为构建质粒pD1用到的引物序列表；
图7为构建质粒pD2用到的引物序列表；
图8为构建质粒pD3用到的引物序列表；
图9为构建质粒pD4用到的引物序列表；
图10为构建质粒pDYK01、pDYK02用到的引物序列表；
图11为构建质粒pDYK03用到的引物序列表；
图12为构建质粒pDYK04、pDYK05用到的引物序列表；
图13为构建质粒sgRNA质粒、sgRNA-D1D2、sgRNA-D3D4、sgRNA-△ DPP1、sgRNA-△pERG7、sgRNA-△ ybr128c、sgRNA-△ CIT2、sgRNA-△ ydr448w用到的引物序列表。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和附图，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明中提供的RrCYP450-5基因和RrCYP450-4基因来自于刺梨叶片，于2019年在贵州省黔南布依族苗族自治州，贵定县昌明镇采集获得。
RrCYP450-5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，RrCYP450-4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，RrCYP450-3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明中用到的质粒详细信息如表1和表2所示：
表1.
表2.
本发明中用到的菌株详细信息如表3所示：
表3.
本发明中使用的CRISPR/Cas9 基因编辑方法过程为：
本发明中Cas9质粒（addgene#43802）和sgRNA（addgene#43803）。由于要在不同位点进行基因的敲入和敲除，引导Cas9蛋白切割的sgRNA质粒是需要根据位点的变换而进行变化的。具体实施方式中sgRNA质粒的制备方法：以addgene#43803为基础，用PCR扩增的方式，替换gRNA scaffold序列前20bp序列，整合位点的相应序列如表4所示，随后，将43802质粒，经过变换的43803sgRNA质粒和经过NotⅠ线性化的质粒片段（pD1，pD2等），使用醋酸锂转化法转入酿酒酵母菌株，经过筛选验证得到正确整合的菌株。
表4.
本发明中用的溶液及培养基的配制：
（1）5’FOA固体培养基
准确称取无氨基酸酵母氮源 YNB 6.7 g，葡萄糖 20 g，相应氨基酸粉末 1.3 g，琼脂粉 18 g，上述组分在加入琼脂粉之前定容至 1L，使用 NaOH 溶液调节 pH=6.5。加入琼脂粉混匀后经 115 ℃高压蒸汽灭菌 30 min。等待培养基稍冷却，避光条件下加入无菌5’ FOA 溶液，混匀后倒平板，避光 4 ℃保存。
（2）酵母组装中 DNA 片段预处理溶液
3 M 乙酸钠的配制：准确称取 24.61 g 无水乙酸钠，蒸馏水溶解并定容至 100mL，经 115℃高压蒸汽灭菌 30 min，于 4 ℃保存。
10 mg/mL 糖原的配制：准确称取 100 mg 糖原，蒸馏水混匀并定容至 10 mL，经115℃高压蒸汽灭菌 30 min，室温保存。
（3）酿酒酵母感受态细胞及酵母醋酸锂转化时所需的溶液的制备
10×TE 溶液：准确称取 Tris base 12.114 g，乙二胺四乙酸二钠 3.7224 g，用蒸馏水溶解并定容至 1L，用稀 HCl 调节 pH=7.5，经 115℃高压蒸汽灭菌 30 min，室温保存。
10×LiAc 溶液：准确称取醋酸锂 10.2 g，用蒸馏水充分溶解，用冰醋酸调节pH=7.5，再用蒸馏水定容至 100 mL，使用 0.22 μm 无菌滤膜过滤除菌，4℃保存。
40% PEG4000 溶液：准确称取 PEG4000 80 g，蒸馏水溶解并定容至 160 mL。经115℃高压蒸汽灭菌 30 min，4℃保存。
（4）酿酒酵母细胞基因组提取的破壁缓冲液
准确称取 Triton-100 20 g，SDS 10 g，氯化钠 5.844 g，Tris-Hcl 1.211 g，乙二胺四乙酸 0.3695 g，蒸馏水充分溶解并定容至 1L，用盐酸调 pH=8.0，常温保存。
（5）用于酿酒酵母细胞基因组提取的 4 M 乙酸铵溶液
准确称取乙酸铵 30.83 g，蒸馏水充分溶解后，定容至 100 mL，混合均匀后，于115℃高压蒸汽灭菌 30 min，4℃保存。
本发明构建酵母底盘所用的引物包括：pD1 组装、pD2 组装、pD3
组装、pD4 组装、pDYK 01 组装、pDYK 02 组装、pDYK 03 组装、pDYK 04 组装、pDYK 05 组装、sgRNA 质粒构建通用引物、sgRNA-D1D2 组装、sgRNA-D3D4 组装、sgRNA-△DPP1 组装、sgRNA-△ pERG7 组装、sgRNA-△ ybr128c 组装、sgRNA-△ CIT2 组装和sgRNA-△ ydr448w 组装，引物序列的详细信息如图6-图13所示。
本发明中用到的长春花CrAS基因、长春花CrAO基因的核苷酸序列可参考文献：JINK, SHI X, LIU J, et al. Combinatorial metabolic engineering enables theefficient production of ursolic acid and oleanolic acid in Saccharomycescerevisiae [J]. Bioresour Technol, 2023, 374: 128819。
本发明中用到的拟南芥AtCPR1基因的核苷酸序列可参考文献：YU Y, CHANG P,YU H, et al. Productive Amyrin Synthases for Efficient alpha Amyrin Synthesisin Engineered Saccharomyces cerevisiae [J]. Acs Synth Biol, 2018, 7(10):2391-2402。
实施例1
本实施例提供生产刺梨酸的基因工程菌的构建。
1、产熊果酸和齐墩果酸的酿酒酵母底盘菌株的构建
1.1以酿酒酵母CEN.PK2-1D 菌株为底盘，构建过表达 MVA 途径基因的质粒载体pD1，pD2，pD3和pD4，具体信息详见表1所示。
pD1 质粒构建过程：以酿酒酵母 CEN.PK2-1D 基因组为模板，用引物 1101-F 和1101-R，1110-F 和 1110-R，PCR 扩增整合位点同源左臂和同源右臂片段；以酿酒酵母S288C 基因组为模板，用引物 1102-F 和 1102-R，PCR 扩增 ACT1 终止子片段；以酿酒酵母 S288C 基因组为模板，用引物 1103-F 和 1103-R，1105-F 和 1105-R，1107-F 和1107-R，1108-F 和 1108-R，1109-F 和 1109-R，PCR 扩增得到 tHMG1 基因片段、ERG10 基因片段、GAL7 启动子片段、ERG13 基因片段、ENO1 终止子片段；以 43802
质粒为模板，用引物 1104-F 和 1108-R，PCR 扩增得到 CYC1 终止子片段；以pESCURA 质粒为模板，用引物 1104-F 和 1104-R，PCR 扩增得到双向启动子 pGAL1pGAL10片段；以 pRS426-URA 质粒为模板，用引物 1111-F 和 1111-R，PCR 扩增得到质粒骨片段；将上述片段预处理后，经酵母醋酸锂转化，组装成 pD1 质粒，其相应的基因表达盒示意图如图1所示。
pD2 质粒构建过程：以酿酒酵母 CEN.PK2-1D 基因组为模板，用引物 1201-F 和1201-R，1208-F 和 1208-R，PCR 扩增整合位点同源左臂和同源右臂片段；以pD1质粒为模板，用引物1202-F和1202-R，PCR扩增得到ACT1t-tHMG1-pGAL1pGAL10片段；以酿酒酵母S288C 基因组为模板，用引物 1203-F 和 1203-R，1206-F和1206-R，PCR 扩增 得到ERG12基因和IDI1基因片段；以质粒43802为模板，用引物1204-F和1204-R，PCR扩增得到CYC1终止子片段；以酿酒酵母S288C 基因组为模板，用引物1205-F和1205-R, 引物1207-F和1207-R，分别PCR扩增得到GAL7启动子片段和CPS1终止子片段；以pRS426-URA质粒为模板，用引物1209-F和1209-R，PCR扩增得到质粒骨架片段；将上述片段预处理后，经酵母醋酸锂转化，组装成 pD2 质粒，其相应的基因表达盒示意图如图1所示。
pD3 质粒构建过程：以酿酒酵母 CEN.PK2-1D 基因组为模板，用引物 1301-F 和1301-R，1310-F 和 1310-R，PCR 扩增整合位点同源左臂和同源右臂片段；以酿酒酵母S288C 基因组为模板，用引物 1302-F 和 1302-R，PCR 扩增 ACT1 终止子片段；以酿酒酵母 S288C 基因组为模板，用引物 1303-F 和 1303-R，1305-F 和 1305-R，1307-F 和1307-R，1308-F 和 1308-R，1309-F 和 1309-R，PCR 扩增得到 ERG20 基因片段、ERG8 基因片段、GAL7 启动子片段、MVD1 基因片段、CPS1 终止子片段；以 43802质粒为模板，用引物1306-F 和 1306-R，PCR 扩增得到 CYC1 终止子片段；以 pESC-URA 质粒为模板，用引物1304-F 和 1304-R，PCR 扩增得到双向启动子 pGAL1pGAL10片段；以 pRS426-URA 质粒为模板，用引物 1311-F 和 1311-R，PCR 扩增得到质粒骨片段；将上述片段预处理后，经酵母醋酸锂转化，组装成 pD3 质粒，其相应的基因表达盒示意图如图1所示。
pD4 质粒构建过程：以酿酒酵母 CEN.PK2-1D 基因组为模板，用引物 1401-F 和1401-R，1407-F 和 1407-R，PCR 扩增整合位点同源左臂和同源右臂片段；以43802质粒为模板，用引物1402-F和1402-R, PCR扩增得到CYC1终止子片段；以长春花cDNA为模板，用引物1403-F和1403-R，PCR扩增得到CrAS基因片段；以pESC-URA质粒为模板，用引物1404-F和1404-R，和1406-F和1406-R，分别PCR扩增得到双向启动子pGAL1pGAL10片段和ADH1终止子片段；以酿酒酵母 S288C 基因组为模板，用引物1405-F和1405-R，PCR扩增得到ERG1基因片段；以pRS426-URA质粒为模板，用引物1408-F和1408-R, PCR扩增得到质粒骨架；将上述片段预处理后，经酵母醋酸锂转化，组装成 pD4 质粒，其相应的基因表达盒示意图如图1所示。
1.2 将构建的pD1基因表达盒、pD2基因表达盒和pD3基因表达盒，通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术依次整合至酿酒酵母CEN.PK2-1D 中，得到菌株 D3，即为过表达 MVA途径的底盘菌株。菌株 D3对MVA 途径中的全部基因进行过表达，使其确保三萜的生物合成，供应充足的前体IPP 与 DMAPP。
1.3 构建pDYK 01质粒和pDYK 02质粒
pDYK 01质粒构建过程：以酿酒酵母 CEN.PK2-1D 基因组为模板，用引物 1501-F和1501-R，1506-F 和 1506-R，PCR 扩增整合位点同源左臂和同源右臂片段；以酿酒酵母S288C基因组为模板，用引物1502-F和1502-R，PCR扩增得到GAL1启动子片段；以长春花cDNA为模板，用引物1503-F和1503-R，PCR扩增得到CrAO基因片段；以拟南芥cDNA为模板，用引物1504-F和1504-R，PCR扩增得到AtCPR1基因片段；以43802质粒为模板，用引物1505-F和1505-R，PCR扩增得到CYC1终止子片段；以pRS426-URA质粒为模板，用引物1507-F和1507-R，PCR扩增得到质粒骨架；将上述片段预处理后，经酵母醋酸锂转化，组装成 pDYK01 质粒，其相应的基因表达盒示意图如图2所示。
pDYK 02质粒构建过程：以酿酒酵母 CEN.PK2-1D 基因组为模板，用引物 1601-F和1601-R，1603-F 和 1603-R，PCR 扩增整合位点同源左臂和同源右臂片段；以酿酒酵母S288C基因组为模板，用引物1602-F和1602-R，PCR扩增得到HXT1启动子片段；以pRS426-URA质粒为模板，用引物1604-F和1604-R，PCR扩增得到质粒骨架；将上述片段预处理后，经酵母醋酸锂转化，组装成 pDYK02 质粒，其相应的基因表达盒示意图如图2所示。
将构建的pD4基因表达盒，pDYK 01基因表达盒和pDYK 02基因表达盒通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术依次整合至酿酒酵母菌株 D3 中，得到菌株 DYK02。
通过过表达ERG1角鲨烯单加氧酶有利于促进角鲨烯的转化和 2,3-氧化角鲨烯的形成，同时引入长春花中的CrAS基因，可以产生两种五环三萜产物：α- Amyrin 和 β-Amyrin；此外，由于甾醇和三萜共享同一生物合成途径，甾醇的合成会与三萜的生物合成之间存在底物的竞争。在酵母中有ERG7羊毛甾醇合酶的存在，会与本发明中的五环三萜合成通路竞争中间产物 2,3-氧化角鲨烯，因此选择用pHXT1启动子对其进行抑制表达，在低葡萄糖浓度下抑制其表达，实现对竞争旁路基因进行表达抑制目的。同时，引入长春花CrAO基因可以使酿酒酵母利用 α-Amyrin 和 β-Amyrin产生熊果酸和齐墩果酸，同时引入拟南芥AtCPR1基因可以使CrAO基因的催化效率提升。
将菌株 DYK02 在 YPDG 培养基中进行摇瓶发酵培养 120 h 后，采用 HPLC对发酵产物进行含量检测，具体方法：利用赛默飞 Vanquish 液相色谱仪对样品进行分析。流动相为水(A)：色谱乙腈(C)，色谱柱选择 HiQ sil C18W 色谱柱(4.6 mmΦ×250 mm)，进样量为 10 μL；流速为 1mL/min；柱温为 30 ℃；检测波长为 λ=210 nm；Chromeleon 7 工作站软件用于数据的采集与分析。
检测结果为：熊果酸产量为 3.25 ± 0.35 mg/L，齐墩果酸产量为 1.78 ±1.05mg/L。
2、构建RrCYP450 基因的 Donor DNA 质粒载体pDYK 03、pDYK 04、pDYK 05.
pDYK 03质粒构建过程：以酿酒酵母 CEN.PK2-1D 基因组为模板，用引物 1701-F和1701-R，1705-F 和 1705-R，PCR 扩增整合位点同源左臂和同源右臂片段；以pDYK01质粒为模板，用引物1702-F和1702-F，PCR扩增得到GAL1启动子片段；以刺梨cDNA为模板，用引物1703-F和1703-R，PCR扩增得到RrCYP450-5基因片段；以43802质粒为模板，用引物1704-F和1704-R，PCR扩增得到CYC1终止子片段；以pRS426-URA质粒为模板，用引物1706-F和1706-R，PCR扩增得到质粒骨架片段；将上述片段预处理后，经酵母醋酸锂转化，组装成 pDYK03 质粒，其相应的基因表达盒示意图如图3所示。
pDYK 04质粒构建过程：以酿酒酵母 CEN.PK2-1D 基因组为模板，用引物 1801-F和1801-R，1805-F 和 1805-R，PCR 扩增整合位点同源左臂和同源右臂片段；以pDYK 01质粒为模板，用引物1802-F和1802-F，PCR扩增得到GAL1启动子片段；以刺梨cDNA为模板，用引物1803-F和1803-R，PCR扩增得到RrCYP450-3基因片段；以43802质粒为模板，用引物1804-F和1804-R，PCR扩增得到CYC1终止子片段；以pRS426-URA质粒为模板，用引物1806-F和1806-R，PCR扩增得到质粒骨架片段；将上述片段预处理后，经酵母醋酸锂转化，组装成 pDYK04质粒，其相应的基因表达盒示意图如图3所示。
pDYK 05质粒构建过程：以酿酒酵母 CEN.PK2-1D 基因组为模板，用引物 1901-F和1901-R，1905-F 和 1905-R，PCR 扩增整合位点同源左臂和同源右臂片段；以pDYK01质粒为模板，用引物1902-F和1902-F，PCR扩增得到GAL1启动子片段；以刺梨cDNA为模板，用引物1903-F和1903-R，PCR扩增得到RrCYP450-4基因片段；以43802质粒为模板，用引物1904-F和1904-R，PCR扩增得到CYC1终止子片段；以pRS426-URA质粒为模板，用引物1906-F和1906-R，PCR扩增得到质粒骨架片段；将上述片段预处理后，经酵母醋酸锂转化，组装成 pDYK05 质粒，其相应的基因表达盒示意图如图3所示。
以菌株 DYK02 为宿主，将RrCYP450-5(pDYK03)基因表达盒整合至 ybr128C 位点，得到菌株 DYK03；以菌株 DYK02 为宿主，将RrCYP450-3(pDYK04)基因表达盒整合至CIT2 位点，得到菌株 DYK04；以菌株 DYK02 为宿主，将RrCYP450-4(pDYK05)基因表达盒整合至 ydr448W 位点，得到菌株 DYK05。对上述菌株进行摇瓶发酵，均未检测到刺梨酸的生产。
以菌株 DYK03 为底盘菌株，将RrCYP450-4和RrCYP450-3基因分别整合至酿酒酵母DYK03基因组上，得到菌株 DYK08 和DYK11。
对菌株 DYK08 和 DYK11摇瓶发酵培养：挑取3-5颗长于YPD固体培养基（胰蛋白胨20 g/L，酵母抽提物 10 g/L，葡萄糖20 g/L, 琼脂粉16 g/L）的酿酒酵母菌株至含有5 mLYPD液体培养基（胰蛋白胨20 g/L，酵母抽提物 10 g/L，葡萄糖20 g/L）中，30 ℃ 220 rpm过夜培养（14-16 h），为种子液；种子液接种至含有200 mL YPDG液体培养基（胰蛋白胨20g/L，酵母抽提物 10 g/L，葡萄糖20 g/L,半乳糖10 g/L）中，接种前测定OD600值，保证接种后初始OD600在0.3-0.5之间。30 ℃ 220 rpm培养120 h。
对发酵产物进行HPLC检测，结果如图4和5所示，DYK08 菌株与 DYK02 菌株相比，其熊果酸产量明显减少，但齐墩果酸含量与对照菌株 DYK02 相同，同时在刺梨酸所在的保留时间有产物产生，经计算刺梨酸产量为 104 ±2μg/L。而菌株 DYK11 的发酵结果经检测并没有刺梨酸的产生。该部分实验结果也印证了体外酶活实验结果中齐墩果酸无法参与刺梨酸的产生的结论。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1. 一种生产刺梨酸的基因工程菌，其特征在于，以产熊果酸和齐墩果酸的酿酒酵母为底盘菌株，将RrCYP450-5 基因和RrCYP450-4基因依次整合至所述底盘菌株的基因组上，得到生产刺梨酸的基因工程菌，所述RrCYP450-5 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述RrCYP450-4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述产熊果酸和齐墩果酸的酿酒酵母构建过程包括以下步骤：
S1、以酿酒酵母CEN.PK2-1D 菌株为底盘，构建过表达IPP和DMAPP的质粒载体，利用CRISPR/Cas9 技术将相应的基因表达盒整合至酿酒酵母CEN.PK2-1D 中，得过表达 MVA 途径的底盘菌株，记为酿酒酵母菌株 D3；
S2、利用CRISPR/Cas9 技术将CrAS基因、AtCPR1 基因和CrAO 基因整合至酿酒酵母菌株 D3 基因组中，即得到产熊果酸和齐墩果酸的酿酒酵母菌株 DYK02。
3. 如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，步骤S1中，所述的过表达IPP和DMAPP的质粒载体包括 pD1 质粒、pD2 质粒和pD3 质粒，所述pD1质粒含有tHMG1、ERG10和ERG13基因表达盒，所述pD2 质粒含有tHMG1、ERG12和IDI1基因表达盒，所述pD3 质粒含有ERG20、ERG8和MVD1基因表达盒。
4. 如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，步骤S2中，整合的具体过程是通过将构建的pD4、pDYK01和pDYK02质粒导入到菌株 D3中；所述pD4质粒含有CrAS和ERG1基因表达盒，所述pDYK01质粒含有CrAO和AtCPR1基因表达盒，所述pDYK02质粒含有pHXT1基因表达盒。
5.一种如权利要求4中所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
S1、以酿酒酵母DYK02菌株为宿主，将RrCYP450-5基因表达盒整合至 ybr128C 位点，得到菌株 DYK03；
S2、以菌株 DYK03为底盘菌株，将RrCYP450-4基因表达盒整合至 DYK03酿酒酵母基因组上，得到所述基因工程菌，记为菌株 DYK08。
6. 如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述RrCYP450-5基因表达盒的质粒载体为pDYK03质粒，所述pDYK03质粒的构建过程为：以酿酒酵母 CEN.PK2-1D 基因组为模板，用引物 1701-F 和1701-R，1705-F 和 1705-R，PCR 扩增整合位点同源左臂和同源右臂片段；以pDYK01质粒为模板，用引物1702-F和1702- R，PCR扩增得到GAL1启动子片段；以刺梨cDNA为模板，用引物1703-F和1703-R，PCR扩增得到RrCYP450-5基因片段；以43802质粒为模板，用引物1704-F和1704-R，PCR扩增得到CYC1终止子片段；以pRS426-URA质粒为模板，用引物1706-F和1706-R，PCR扩增得到质粒骨架片段；将上述片段预处理后，经酵母醋酸锂转化，组装成 pDYK03 质粒；
所述引物1701-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，
所述引物1701-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，
所述引物1702-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，
所述引物1702-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，
所述引物1703-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，
所述引物1703-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，
所述引物1704-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，
所述引物1704-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，
所述引物1705-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，
所述引物1705-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，
所述引物1706-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，
所述引物1706-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
7. 如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述RrCYP450-4基因表达盒的质粒载体为pDYK05质粒，所述pDYK05质粒的构建过程为：以酿酒酵母 CEN.PK2-1D 基因组为模板，用引物 1901-F 和1901-R，1905-F 和 1905-R，PCR 扩增整合位点同源左臂和同源右臂片段；以pDYK01质粒为模板，用引物1902-F和1902-F，PCR扩增得到GAL1启动子片段；以刺梨cDNA为模板，用引物1903-F和1903-R，PCR扩增得到RrCYP450-4基因片段；以43802质粒为模板，用引物1904-F和1904-R，PCR扩增得到CYC1终止子片段；以pRS426-URA质粒为模板，用引物1906-F和1906-R，PCR扩增得到质粒骨架片段；将上述片段预处理后，经酵母醋酸锂转化，组装成 pDYK05 质粒；
所述引物1901-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，
所述引物1901-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，
所述引物1902-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，
所述引物1902-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，
所述引物1903-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，
所述引物1903-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，
所述引物1904-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示，
所述引物1904-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，
所述引物1905-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，
所述引物1905-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，
所述引物1906-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，
所述引物1906-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。
8.如权利要求1-4中任一项所述的基因工程菌在制备刺梨酸中的应用。
9.一种生产刺梨酸的方法，其特征在于，将如权利要求1-4中任一项所述的基因工程菌发酵培养，从培养物中获得刺梨酸。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养过程为在YPDG 培养基中进行摇瓶发酵培养至少120 h 。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410108920.9A CN117683651A (zh) | 2024-01-26 | 2024-01-26 | 基因工程菌及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410108920.9A CN117683651A (zh) | 2024-01-26 | 2024-01-26 | 基因工程菌及其构建方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117683651A true CN117683651A (zh) | 2024-03-12 |
Family
ID=90139238
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410108920.9A Pending CN117683651A (zh) | 2024-01-26 | 2024-01-26 | 基因工程菌及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117683651A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009072187A (ja) * | 2007-08-31 | 2009-04-09 | National Agriculture & Food Research Organization | 優れたストレス耐性を有する酵母の分子育種法及び遺伝子改変酵母 |
| US20130244243A1 (en) * | 2012-03-15 | 2013-09-19 | Takashi Matsuyama | Method for producing expression product of exogenous gene in yeast, regulator of expression in yeast, and use thereof |
| CN106566779A (zh) * | 2016-10-28 | 2017-04-19 | 天津大学 | 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用 |
| CN115820783A (zh) * | 2022-11-18 | 2023-03-21 | 贵州佳义生物科技开发有限公司 | 一种刺梨发酵获得多种三萜的制备方法 |
| CN117233338A (zh) * | 2023-11-03 | 2023-12-15 | 贵州中医药大学 | 降低刺梨汁涩味的发酵菌种筛选方法及应用 |
-
2024
- 2024-01-26 CN CN202410108920.9A patent/CN117683651A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009072187A (ja) * | 2007-08-31 | 2009-04-09 | National Agriculture & Food Research Organization | 優れたストレス耐性を有する酵母の分子育種法及び遺伝子改変酵母 |
| US20130244243A1 (en) * | 2012-03-15 | 2013-09-19 | Takashi Matsuyama | Method for producing expression product of exogenous gene in yeast, regulator of expression in yeast, and use thereof |
| CN106566779A (zh) * | 2016-10-28 | 2017-04-19 | 天津大学 | 一种重组酵母菌株及其构建方法和应用 |
| CN115820783A (zh) * | 2022-11-18 | 2023-03-21 | 贵州佳义生物科技开发有限公司 | 一种刺梨发酵获得多种三萜的制备方法 |
| CN117233338A (zh) * | 2023-11-03 | 2023-12-15 | 贵州中医药大学 | 降低刺梨汁涩味的发酵菌种筛选方法及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ZHAI, BW等: "Triterpene acids from Rosa roxburghii Tratt fruits exert anti-hepatocellular carcinoma activity via ROS/JNK signaling pathway-mediated cell cycle arrest and mitochondrial apoptosis", 《PHYTOMEDICINE》, vol. 119, 8 July 2023 (2023-07-08), pages 1 - 11, XP087383625, DOI: 10.1016/j.phymed.2023.154960 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106635853B (zh) | 产甘草次酸的重组酿酒酵母、其构建方法以及用途 | |
| KR20200087220A (ko) | 생물 전환으로 타우로우루소데옥시콜산을 제조하는 방법 및 그 응용 | |
| Wang et al. | Efficient production of glycyrrhetinic acid in metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae via an integrated strategy | |
| CN112063647B (zh) | 酿酒酵母重组菌Cuol01的构建方法、酿酒酵母重组菌Cuol02及应用 | |
| CN110343678B (zh) | 一种珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因及在制备人参皂苷Ro上的应用 | |
| CN106566815B (zh) | 一种生产甘草次酸或其前体物的酿酒酵母工程菌及构建方法 | |
| CN114058525A (zh) | 一种高产角鲨烯基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN108929884B (zh) | 通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法 | |
| CN111088254B (zh) | 一种内源搭载的外源基因高效可控表达系统 | |
| CN115109787B (zh) | 一组糖基转移酶基因及其在制备三七/人参皂苷中的应用 | |
| CN112175848B (zh) | 一种广藿香醇生产酵母菌株及其构建方法和应用 | |
| CN111454871B (zh) | 一种高产雄烯二酮的重组分枝杆菌及构建方法及应用 | |
| WO2023208037A1 (zh) | 一种橙花叔醇合成酶及应用 | |
| CN117683651A (zh) | 基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN113956990B (zh) | 产二氢尼洛替星的重组酿酒酵母及其制备方法和应用 | |
| CN116396876A (zh) | 一种生产人参皂苷Rd的酿酒酵母工程菌及其构建方法 | |
| CN109880862B (zh) | 一种异源从头生物合成丹酚酸b的方法 | |
| CN114410492A (zh) | 一种以葡萄糖为底物生物合成葫芦二烯醇的工程菌、构建及其应用 | |
| CN112646834A (zh) | 一种羽扇豆醇衍生物及其合成方法和应用 | |
| CN115340957B (zh) | 一种原人参二醇酵母细胞工厂的构建方法及其应用 | |
| CN114196689B (zh) | 一种高产α-蛇麻烯的酵母重组菌株的构建方法及其应用 | |
| CN116515872A (zh) | 一种青钱柳三萜合成酶CpalOSC2基因及在制备β-香树脂醇中的应用 | |
| CN115772507A (zh) | 细胞色素p450酶在合成灵芝三萜中的应用 | |
| CN117187225A (zh) | 一种橙花叔醇合成酶及应用 | |
| CN117925589A (zh) | 氧化鲨烯环化酶基因NiOSC2及其产物杂环三萜 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |