CN117233338A - 降低刺梨汁涩味的发酵菌种筛选方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了降低刺梨汁苦涩味的发酵菌种挑选法及应用，本发明将目前对改善涩味有效的嗜酸乳杆菌、戊糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、米曲霉、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、保加利亚乳杆菌、酿酒酵母10种可食用微生物将刺梨榨汁进行发酵，以感官评价为指标，筛选出能有效改善刺梨涩味的菌种，将有效的戊糖乳杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌微生物应用于刺梨汁的发酵，可以有效改善刺梨严重的涩感且充分保留刺梨原来的风味和更高的营养价值，可以大大提高刺梨鲜汁的保质期、营养成分和感官质量，解决刺梨成品的口感及外观品质问题，进一步保障了刺梨资源的有效利用。
Description
技术领域
本发明涉及一种降低刺梨汁涩味的发酵菌种筛选方法及应用，属于食品饮料技术领域。
背景技术
刺梨(Rosa roxburghii Tratt.)属蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)植物，是集药用、保健、食用、观赏为一体的绿色特新水果，芳香味独特，营养丰富，尤其是Vc、Vp（芦丁）和超氧化物歧化酶含量高，有“三王水果”之称。具有抗衰老、解毒、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抑菌、防治糖尿病、辐射防护、抗凋亡、镇静、治疗失眠等功效。除作为健胃消食功效的中药应用在方剂中，现已有多种以刺梨为原料制成的药品、食品、化妆品，包括刺梨冻干粉胶囊、刺梨茶、刺梨酒、刺梨酸乳、刺梨果醋、刺梨罐头、刺梨饮料、刺梨果奶、刺梨果脯、刺梨果酱、刺梨糕和特殊医学用途食品等。许多对刺梨药理作用的研究是利用刺梨的果汁或以刺梨果汁为主要成分的制剂。但刺梨果实中含有大量的单宁，是刺梨果实产生涩味的风味物质，极大的影响了刺梨产品的开发。现有刺梨产品大多存在口感涩、稳定性差、不易储存的问题，或因加入大量香精和胶体物质失去了刺梨原本的风味，导致刺梨产业未得到更好的发展。
随着社会的发展，人们生活水平的提高，大家越来越重视食品的感官体验，食养、食疗的观念越来越受到关注。中药材经过传统的炮制后，口感相对不太理想。涩味是口腔感官质量最重要的组成部分之一，定义为口腔中感觉到的干燥、粗糙和发涩的感觉，它是消费者对食品接受度的关键感觉。目前对涩味的评价方法主要有人体感官评价、化学评价、口腔摩擦学评估、动物行为学偏好评价、多酚-蛋白相互作用评价、电子舌仿生评价等，其中感官分析是应用最早也是最常用的涩味评价方法。目前，改善涩味的方法主要有通过微囊化处理防止或减少多酚在口腔中的释放、环糊精包合、粒子复合处理、添加苯酞类化合物、添加果胶多糖类物质、添加甜味剂、芳香剂与辅助甜味剂等，但是这些减涩技术不仅会改变产品原有的风味，还可能导致产品的品质下降。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供降低刺梨汁涩味的发酵菌种筛选方法及应用，筛选出能降低刺梨汁涩味的菌种，有效改善刺梨的涩感，提高大家对刺梨汁口感的接受度，利于今后刺梨资源的深度开发利用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
降低刺梨汁涩味的发酵菌种筛选方法，该方法包括以下步骤：
（1）将刺梨果榨汁灭菌后分别与嗜酸乳杆菌、戊糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、米曲霉、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、保加利亚乳杆菌、酿酒酵母进行共培养发酵，与未发酵的刺梨汁进行对比，通过感官评价筛选出能改善刺梨涩味的微生物；
（2）将改善刺梨涩味效果较好的4株发酵菌种进行混菌复配试验，以发酵改善效果最好的戊糖乳杆菌作为主菌种，与其余3株（枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌）辅发酵菌种进行2菌、3菌和4菌组合，各菌种的接种比例为1:1、1:1:1和1:1:1:1，在转速为200rpm、发酵温度为20 ℃条件，发酵24 h后离心取上清液，与未发酵的空白灭菌和空白不灭菌刺梨汁进行对比，通过感官评价筛选出能改善刺梨涩味的菌种组合，结果降低刺梨涩味的菌种组合为：戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌=1:1:1；
（3）在200 ml锥形瓶中加入50 ml料液比为2:1的刺梨汁，巴氏灭菌（70 ℃, 10min），接种量2 %、各组比例按照戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌分别为1:1:1、1:2:2、1:3:3、2:1:2、2:2:3、2:3:1、3:1:3、3:2:1、3:3:2、1:0:0、0:1:0、0:0:1进行混菌发酵，在转速为200 rpm、发酵温度为20 ℃，发酵24 h后离心取上清液，与未发酵的空白灭菌和空白不灭菌刺梨汁进行对比，通过感官评价筛选出能改善刺梨涩味的最优菌种组合及比例。
作为一种优选方案，上述的降低刺梨汁涩味的发酵菌种筛选方法，具体包括以下步骤：
（1）取以下十株菌种：嗜酸乳杆菌、戊糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、米曲霉、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、保加利亚乳杆菌、酿酒酵母，备用；
（2）对步骤（1）中的十株菌种进行扩大培养
a.菌种培养基的制备
营养肉汁培养基：蛋白胨5.0 g，牛肉浸取物3.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水 1.0 L，pH 7.0，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30 min，用于枯草芽孢杆菌斜面、平板培养和菌种复壮保存；
PDA培养基：马铃薯提取液 1.0 L，葡萄糖20.0 g，琼脂 15.0 g，pH自然，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30 min，用于黑曲霉、保加利亚乳杆菌斜面、平板培养和菌种复壮；
MRS培养基：酪蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二铵2.0 g，Tween 80 1.0 g，K2HPO4 2.0 g，MgSO4.7H2O 0.2 g，MnSO4.H2O0.05 g，CaCO3 20.0 g，琼脂 15.0 g，蒸馏水 1.0 L，pH 6.8，121 ℃，0 .1 Mpa灭菌30min，用于嗜酸乳杆菌、戊糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、米曲霉的斜面、平板培养和菌种复壮；
5 °Bé麦芽汁琼脂培养基：5 °Bé麦芽汁 1.0 L（或用MEB代替），琼脂 15.0 g，自然pH。121 ℃，0 .1 Mpa灭菌30 min，用于酿酒酵母的斜面、平板培养和菌种复壮保存；
b.液体种子培养基的制备
营养肉汁培养基：蛋白胨5.0 g，牛肉浸取物 3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1.0 L，pH7.0，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30 min，用于枯草芽孢杆菌的扩大培养；
PDA培养基：马铃薯提取液1.0 L，葡萄糖20.0 g，pH自然，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30min，用于黑曲霉、保加利亚乳杆菌的扩大培养；
MRS培养基：酪蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二铵 2.0 g，Tween80 1.0 g，K2HPO4 2.0 g，MgSO4.7H2O 0.2 g，MnSO4.H2O0.05 g，CaCO3 20.0 g，蒸馏水1.0 L，pH 6.8，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30 min，用于培养嗜酸乳杆菌、戊糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、米曲霉菌种活化及扩大培养；
5 °Bé麦芽汁培养基：5 °Bé麦芽汁 1.0 L，自然pH，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30 min，用于培养酿酒酵母菌种活化及扩大培养；
（3）选择新鲜成熟的刺梨果，清洗后去除花萼、籽，将果肉进行榨汁，三层纱布过滤，收集滤液，得到刺梨原汁；
（4）把步骤（3）得到的刺梨原汁置于-20 ℃冰箱里冰冻之后再放入-80 ℃冷冻保存备用；
（5）将步骤（4）中解冻后的刺梨原汁按2:1重量比加入纯净水，混匀后量取50 mL放入200 ml三角烧瓶中，用封口膜封闭；
（6）取步骤（5）中得到的刺梨果汁进行巴氏灭菌：70 ℃，10 min；
（7）取步骤（6）灭菌后的刺梨果汁置于超净工作台，将步骤（1）的十个菌种分别按2%的接菌量进行接菌；
（8）将步骤（7）接种完毕的混合液放入摇床进行发酵，转速为200 rpm、发酵温度20℃，发酵24 h后，取上清液样品进行感官评价；
（9）将步骤（8）得到的改善刺梨涩味效果较好的4株发酵菌种进行混菌复配试验，以发酵改善效果最好的戊糖乳杆菌作为主菌种，与其余3株 (枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌)作为辅发酵菌进行2菌、3菌和4菌组合，各菌种的接种比例为1:1、1:1:1和1:1:1:1，在转速为200 rpm、发酵温度20 ℃条件下，发酵24 h后以鲜汁和灭菌作为空白，离心取上清液样品进行感官评价，确定降低刺梨涩味菌种组合，结果降低刺梨涩味的菌种组合为：戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌=1:1:1。；
（10）将步骤（9）中得到的最优菌种组合的混菌进行不同比例发酵，将发酵液取上清液样品进行感官评价，确定最优混菌比例，各菌种间的添加比例为戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌1:1:1、1:2:2、1:3:3、2:1:2、2:2:3、2:3:1、3:1:3、3:2:1、3:3:2、1:0:0、0:1:0、0:0:1，在转速为200 rpm、发酵温度为20 ℃条件下发酵24 h，以鲜汁和灭菌作为空白，取上清液样品进行感官评价，筛选出能改善刺梨涩味的最优菌种比例。
戊糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌在制备刺梨产品中的应用，可以将戊糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌应用在刺梨产品的开发制备中。
作为一种优选方案，可以将戊糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌作为食品添加剂应用在刺梨产品的开发中，用于改善刺梨的涩味。
本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明创新性的将目前通过化学评价或者感官评价报道的对改善涩味有效的10种可食用微生物将刺梨榨汁进行发酵，以感官评价为指标，筛选出能有效改善刺梨涩味的菌种，将最有效的微生物应用于刺梨汁的发酵，使发酵的刺梨汁口感柔顺，具有刺梨的特殊风味和更高的营养价值，即保留了刺梨特有风味外，还引入菌种特有的口感特征，有效地解决了刺梨产品涩感重和特有风味减弱的问题，对后期刺梨汁涩味的研究奠定了基础。
利用本发明的方法筛选出来的菌种将刺梨汁进行发酵，可以有效改善刺梨严重的涩感且充分保留刺梨原来的风味，有效地解决了在刺梨饮料加工中难以除去且影响制成品口感的问题，而且得到的发酵液可经过干燥等方式保存起来作为食品添加剂，对今后刺梨资源的深度开发利用有重要作用。另外，与其他刺梨产品加工相比，本发明筛选出来的菌种将刺梨进行发酵，不需要加入大量香精和胶体物质，不但节约费用，也不易掩盖刺梨自身特有风味，利用可食用益生菌还能有益于机体健康，消费者也容易对产品进行显著区分。
本发明将刺梨榨汁后与微生物共培养发酵对刺梨汁进行脱涩，通过微生物将涩味成分代谢为其他不同成分，改变其结构，进一步改变与口腔成分的相互作用，可以大大提高刺梨鲜汁的保质期、营养成分和感官质量，进而解决刺梨成品的口感及外观品质问题，为后续作为食品添加剂开发新产品扩大市场，进一步保障了刺梨资源的有效利用和开发。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
实施例1：如图1所示，用于发酵改善刺梨汁涩味的微生物筛选方法及应用，包括以下步骤：
（1）取以下十株菌种：米曲霉(CICC 40786)、黑曲霉(CICC 41594)、酿酒酵母(CICC1793)、枯草芽孢杆菌(CICC 20522)、戊糖乳杆菌(CICC 21798)、瑞士乳杆菌(CICC 22171)、植物乳杆菌(CICC 21809)、保加利亚乳杆菌(CICC 20247)、嗜酸乳杆菌(CICC 22162)、嗜热链球菌(CICC 25079)，备用；
（2）对步骤（1）中的十株菌种进行扩大培养
a.菌种培养基的制备
营养肉汁培养基：蛋白胨5.0 g，牛肉浸取物3.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水 1.0 L，pH 7.0，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30 min，用于枯草芽孢杆菌斜面、平板培养和菌种复壮保存；
PDA培养基：马铃薯提取液 1.0 L，葡萄糖20.0 g，琼脂 15.0 g，pH自然，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30 min，用于黑曲霉、保加利亚乳杆菌斜面、平板培养和菌种复壮；
MRS培养基：酪蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二铵2.0 g，Tween 80 1.0 g，K2HPO4 2.0 g，MgSO4.7H2O 0.2 g，MnSO4.H2O0.05 g，CaCO3 20.0 g，琼脂 15.0 g，蒸馏水 1.0 L，pH 6.8，121 ℃，0 .1 Mpa灭菌30min，用于嗜酸乳杆菌、戊糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、米曲霉的斜面、平板培养和菌种复壮；
5 °Bé麦芽汁琼脂培养基：5 °Bé麦芽汁 1.0 L（或用MEB代替），琼脂 15.0 g，自然pH。121 ℃，0 .1 Mpa灭菌30 min，用于酿酒酵母的斜面、平板培养和菌种复壮保存；
b.液体种子培养基的制备
营养肉汁培养基：蛋白胨5.0 g，牛肉浸取物 3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1.0 L，pH7.0，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30 min，用于枯草芽孢杆菌的扩大培养；
PDA培养基：马铃薯提取液1.0 L，葡萄糖20.0 g，pH自然，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30min，用于黑曲霉、保加利亚乳杆菌的扩大培养；
MRS培养基：酪蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸二铵 2.0 g，Tween80 1.0 g，K2HPO4 2.0 g，MgSO4.7H2O 0.2 g，MnSO4.H2O0.05 g，CaCO3 20.0 g，蒸馏水1.0 L，pH 6.8，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30 min，用于培养嗜酸乳杆菌、戊糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、米曲霉菌种活化及扩大培养；
5 °Bé麦芽汁培养基：5 °Bé麦芽汁 1.0 L，自然pH，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30 min，用于培养酿酒酵母菌种活化及扩大培养；
（3）选择新鲜成熟的刺梨果，清洗后去除花萼、籽，将果肉进行榨汁，三层纱布过滤，收集滤液，得到刺梨原汁；
（4）把步骤（3）得到的刺梨原汁置于-20 ℃冰箱里冰冻之后再放入-80 ℃冷冻保存备用；
（5）将步骤（4）中解冻后的刺梨原汁按2:1重量比加入纯净水，混匀后量取50 mL放入200 ml三角烧瓶中，用封口膜封闭；
（6）取步骤（5）中得到的刺梨果汁进行巴氏灭菌：70 ℃，10 min；
（7）取步骤（6）灭菌后的刺梨果汁置于超净工作台，将步骤（1）的十个菌种分别按2%的接菌量进行接菌；
（8）将步骤（7）接种完毕的混合液放入摇床进行发酵，转速为200 rpm、发酵温度20℃，发酵24 h后，取上清液样品请专业人员进行感官评价，评价标准见表一，评价结果见表二。
表一：感官评价标准
表二：刺梨单菌发酵微生物筛选
| 口感 | 色泽 | 气味 | 总分 | |
| 黑曲霉 | 27.3 | 15.1 | 18.9 | 61.3 |
| 米曲霉 | 25.1 | 14.3 | 20.5 | 59.9 |
| 酿酒酵母 | 20.5 | 17.2 | 13.7 | 51.4 |
| 枯草芽孢杆菌 | 28.0 | 16.6 | 18.0 | 62.6 |
| 戊糖乳杆菌 | 29.8 | 14.5 | 19.7 | 64.0 |
| 瑞士乳杆菌 | 26.4 | 13.7 | 16.6 | 56.7 |
| 植物乳杆菌 | 29.7 | 13.9 | 19.2 | 62.8 |
| 保加利亚乳杆菌 | 24.0 | 14.9 | 17.4 | 56.3 |
| 嗜酸乳杆菌 | 26.6 | 13.8 | 19.9 | 60.3 |
| 嗜热链球菌 | 29.8 | 14.4 | 19.4 | 63.6 |
| 灭菌 | 21.5 | 14.5 | 22.7 | 58.7 |
| 鲜汁 | 19.9 | 16.9 | 22.0 | 58.8 |
（9）将步骤（8）得到的改善刺梨涩味效果较好的4株发酵菌种进行混菌复配试验，以发酵改善效果最好的戊糖乳杆菌作为主菌种，与其余3株（枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌）作为辅发酵菌进行2菌、3菌和4菌组合，各菌种的接种比例为1:1、1:1:1和1:1:1:1，在转速为200 rpm、发酵温度20℃条件下，发酵24 h后以鲜汁和灭菌作为空白，离心取上清液样品进行感官评价，确定最优菌种组合；评价结果见表三。戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌=1:1:1效果最好。
表三：混菌复配试验结果
| 菌种 | 比例 | 口感 | 色泽 | 气味 | 总分 |
| 鲜汁 | 0 | 24.9 | 14.5 | 20.6 | 60.0 |
| 灭菌 | 0 | 25.5 | 16.2 | 19.1 | 60.8 |
| 枯草芽孢杆菌：戊糖乳杆菌 | 1:1 | 28.3 | 16.6 | 19.4 | 64.3 |
| 戊糖乳杆菌：嗜热链球菌 | 1:1 | 25.9 | 16.3 | 20.7 | 62.9 |
| 戊糖乳杆菌：植物乳杆菌 | 1:1 | 30.4 | 16.9 | 22.5 | 69.8 |
| 枯草芽孢杆菌：戊糖乳杆菌：嗜热链球菌 | 1:1:1 | 33.0 | 14.3 | 22.4 | 69.7 |
| 枯草芽孢杆菌：戊糖乳杆菌：植物乳杆菌 | 1:1:1 | 32.1 | 16.7 | 21.4 | 70.2 |
| 戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌 | 1:1:1 | 33.8 | 14.2 | 23.6 | 71.6 |
| 枯草芽孢杆菌：戊糖乳杆菌：嗜热链球菌:植物乳杆菌 | 1:1:1:1 | 29.0 | 14.9 | 22.6 | 66.5 |
（10）将步骤（9）中得到的最优菌种组合的混菌进行不同比例发酵，将发酵液取上清液样品进行感官评价，确定最优混菌比例，各菌种间的添加比例为戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌1:1:1、1:2:2、1:3:3、2:1:2、2:2:3、2:3:1、3:1:3、3:2:1、3:3:2、1:0:0、0:1:0、0:0:1，在转速为200 rpm、发酵温度为20 ℃条件下发酵24 h，以鲜汁和灭菌作为空白，取上清液样品进行感官评价，筛选出能改善刺梨涩味的最优菌种比例，评价结果见表四。
表四 混菌发酵菌种比例筛选
| 菌种 | 比例 | 口感 | 色泽 | 气味 | 总分 |
| 鲜汁 | 0 | 26.7 | 16.3 | 20.2 | 63.2 |
| 灭菌 | 0 | 28.1 | 14.0 | 20.2 | 62.3 |
| 戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌 | 1:1:1 | 32.2 | 14.8 | 19.6 | 66.6 |
| 戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌 | 1:2:2 | 31.9 | 14.6 | 18.4 | 64.9 |
| 戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌 | 1:3:3 | 34.3 | 14.7 | 20.6 | 69.6 |
| 戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌 | 2:1:2 | 33.2 | 14.3 | 19.6 | 67.1 |
| 戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌 | 2:2:3 | 32.7 | 14.2 | 21.3 | 68.2 |
| 戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌 | 2:3:1 | 32.9 | 14.9 | 21.4 | 69.2 |
| 戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌 | 3:1:3 | 32.7 | 15.0 | 22.1 | 69.8 |
| 戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌 | 3:2:1 | 33.1 | 14.7 | 20.9 | 68.7 |
| 戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌 | 3:3:2 | 33.0 | 14.6 | 22.0 | 69.6 |
| 戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌 | 1:0:0 | 33.3 | 15.4 | 21.1 | 69.8 |
| 戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌 | 0:1:0 | 34.0 | 15.0 | 21.2 | 70.2 |
| 戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌 | 0:0:1 | 34.3 | 14.6 | 21.6 | 70.5 |
本发明中筛选出来的四种发酵菌种：戊糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌可以用于改善刺梨汁的涩味。混菌发酵以戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌为1:3:3和0:0:1口感改善较好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.降低刺梨汁涩味的发酵菌种筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将刺梨果榨汁灭菌后分别与嗜酸乳杆菌、戊糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、米曲霉、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、保加利亚乳杆菌、酿酒酵母进行共培养发酵，与未发酵的刺梨汁进行对比，通过感官评价筛选出能改善刺梨汁涩味的微生物；
（2）将改善刺梨涩味效果较好的戊糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌4株发酵菌种进行混菌复配试验，以发酵改善效果最好的戊糖乳杆菌作为主菌种，与其余枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌3株辅发酵菌种进行2菌、3菌和4菌组合，各菌种的接种比例为1:1、1:1:1和1:1:1:1，在转速为200 rpm、发酵温度为20 ℃条件，发酵24 h后离心取上清液，与未发酵的空白灭菌和空白不灭菌刺梨汁进行对比，通过感官评价筛选出能改善刺梨涩味的菌种组合；结果降低刺梨涩味的菌种组合为：戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌=1:1:1；
（3）在200 ml锥形瓶中加入50 ml料液比为2:1的刺梨汁，在70 ℃下巴氏灭菌 10 min，接种量2 %、各组比例按照戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌分别为1:1:1、1:2:2、1:3:3、2:1:2、2:2:3、2:3:1、3:1:3、3:2:1、3:3:2、1:0:0、0:1:0、0:0:1进行不同比例混菌发酵，在转速为200 rpm、发酵温度为20 ℃，发酵24 h后离心取上清液，与未发酵的空白灭菌和空白不灭菌刺梨汁进行对比，通过感官评价筛选出能改善刺梨汁涩味的最优菌种组合及比例。
2.根据权利要求1所述的降低刺梨汁涩味的发酵菌种筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取以下十株菌种：嗜酸乳杆菌、戊糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、米曲霉、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、保加利亚乳杆菌、酿酒酵母，备用；
（2）对步骤（1）中的十株菌种进行扩大培养
a.菌种培养基的制备
营养肉汁培养基：蛋白胨5.0 g，牛肉浸取物3.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1.0 L，pH 7.0，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30 min，用于枯草芽孢杆菌斜面、平板培养和菌种复壮保存；
PDA培养基：马铃薯提取液 1.0 L，葡萄糖20.0 g，琼脂 15.0 g，pH自然，121 ℃，0.1Mpa灭菌30 min，用于黑曲霉、保加利亚乳杆菌斜面、平板培养和菌种复壮；
MRS培养基：酪蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸钠 5.0g，柠檬酸二铵2.0 g，Tween 80 1.0 g，K2HPO4 2.0 g，MgSO4.7H2O 0.2 g，MnSO4.H2O 0.05g，CaCO3 20.0 g，琼脂 15.0 g，蒸馏水 1.0 L，pH 6.8，121 ℃，0 .1 Mpa灭菌30 min，用于嗜酸乳杆菌、戊糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、米曲霉的斜面、平板培养和菌种复壮；
5 °Bé麦芽汁琼脂培养基：5 °Bé麦芽汁 1.0 L或用MEB代替，琼脂 15.0 g，自然pH。121℃，0 .1 Mpa灭菌30 min，用于酿酒酵母的斜面、平板培养和菌种复壮保存；
b.液体种子培养基的制备
营养肉汁培养基：蛋白胨5.0 g，牛肉浸取物 3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1.0 L，pH7.0，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30 min，用于枯草芽孢杆菌的扩大培养；
PDA培养基：马铃薯提取液1.0 L，葡萄糖20.0 g，pH自然，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30 min，用于黑曲霉、保加利亚乳杆菌的扩大培养；
MRS培养基：酪蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸钠 5.0g，柠檬酸二铵 2.0 g，Tween80 1.0 g，K2HPO4 2.0 g，MgSO4.7H2O 0.2 g，MnSO4.H2O 0.05g，CaCO3 20.0 g，蒸馏水1.0 L，pH 6.8，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30 min，用于培养嗜酸乳杆菌、戊糖乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、米曲霉菌种活化及扩大培养；
5 °Bé麦芽汁培养基：5 °Bé麦芽汁 1.0 L，自然pH，121 ℃，0.1 Mpa灭菌30 min，用于培养酿酒酵母菌种活化及扩大培养；
（3）选择新鲜成熟的刺梨果，清洗后去除花萼、籽，将果肉进行榨汁，三层纱布过滤，收集滤液，得到刺梨原汁；
（4）把步骤（3）得到的刺梨原汁置于-20 ℃冰箱里冰冻之后再放入-80 ℃冷冻保存备用；
（5）将步骤（4）中解冻后的刺梨原汁按2:1重量比加入纯净水，混匀后量取50 mL放入200 ml三角烧瓶中，用封口膜封闭；
（6）取步骤（5）中得到的刺梨果汁进行巴氏灭菌：70 ℃，10 min；
（7）取步骤（6）灭菌后的刺梨果汁置于超净工作台，将步骤（1）的十个菌种分别按2 %的接菌量进行接菌；
（8）将步骤（7）接种完毕的混合液放入摇床进行发酵，转速为200 rpm、发酵温度20 ℃，发酵24 h后，取上清液样品进行感官评价；
（9）将步骤（8）得到的改善刺梨涩味效果较好的戊糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌4株发酵菌种进行混菌复配试验，以发酵改善效果最好的戊糖乳杆菌作为主菌种，与其余枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌3株作为辅发酵菌进行2菌、3菌和4菌组合，各菌种的接种比例为1:1、1:1:1和1:1:1:1，在转速为200 rpm、发酵温度20 ℃条件下，发酵24 h后以刺梨鲜汁和灭菌液作为空白，离心取上清液样品进行感官评价，确定降低刺梨涩味的菌种组合，结果降低刺梨涩味的菌种组合为：戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌=1:1:1；
（10）将步骤（9）中得到的降低刺梨涩味菌种组合进行不同比例发酵，将发酵液取上清液样品进行感官评价，确定最优混菌比例，各菌种间的添加比例为戊糖乳杆菌:嗜热链球菌:植物乳杆菌1:1:1、1:2:2、1:3:3、2:1:2、2:2:3、2:3:1、3:1:3、3:2:1、3:3:2、1:0:0、0:1:0、0:0:1，在转速为200 rpm、发酵温度为20 ℃条件下发酵24 h，以鲜汁和灭菌作为空白，取上清液样品进行感官评价，筛选出能改善刺梨涩味的最优菌种组合及比例。
3.戊糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌在制备刺梨产品中的应用。
4.戊糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌在改善刺梨涩味的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN117683651A (zh) * | 2024-01-26 | 2024-03-12 | 东北林业大学 | 基因工程菌及其构建方法和应用 |
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