CN110229761A - 高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用 - Google Patents

高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用 Download PDF

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王兆慧
金大勇
段旭初
路志群
冯怡
江钰娜
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Abstract

本发明公开了高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用，在酿酒酵母木糖代谢菌株中分别过表达内源噻唑合酶THI4或木酮糖还原酶XYL2。该高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用，在过表达来源于热带假丝酵母的木糖还原酶XR(由XYL1编码)和木糖醇脱氢酶XDH(由XYL2编码)的过表达质粒pYX212‑XR‑XDH的基础上，进一步过表达酿酒酵母BY4741内源噻唑合酶THI4或木酮糖还原酶XYL2，转化单倍体酿酒酵母BY4741及二倍体酿酒酵母Kyokai No.6。该方法应用常用组成型高拷贝质粒pYX212，能够实现在混糖发酵过程中提高木糖、葡萄糖共利用过程中碳源的消耗速率和乙醇产量。

Description

高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用
技术领域
本发明涉及微生物、分子生物学技术领域，具体为高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用。
背景技术
酿酒酵母是工业化产乙醇的首选微生物，而酿酒酵母本身不能利用木糖。对酿酒酵母代谢木糖进行的研究主要集中在对细菌和真菌木糖利用基因的表达和对磷酸戊糖途径的操作上。微生物中木糖代谢的途径有三条，但是目前仅有两条被引入酿酒酵母中。其中一条是木糖异构酶(XI)途径。编码XI的基因广泛存在于细菌中，XI能将木糖直接转化为木酮糖。尽管XI途径不需要辅因子，但是许多细菌的XI(由xylA编码)在酿酒酵母中表达后都没有活性。这可以归因于许多原因，包括蛋白错误折叠、翻译后错误修饰、二硫键形成错误、内部pH不适和特定金属离子缺失。进一步的研究发现，一些厌氧真菌和一些细菌(比如粪便拟杆菌)中的XI能在酿酒酵母中功能性表达使其具有代谢木糖的能力。
另一条是木糖还原酶(XR)-木糖醇脱氢酶(XDH)途径。丝状真菌和一些酵母通过一个包含两步反应的氧化还原途径来代谢木糖。首先，由XYL1编码的XR将木糖还原成木糖醇；然后，由XYL2编码的XDH将木糖醇氧化成木酮糖。现有的研究中，XYL1和XYL2基因多来源于树干毕赤酵母，能够帮助酿酒酵母将木糖转变成木酮糖。但是XR偏好NADPH，XDH严格依赖NAD+。有研究对现有报道中分别引入这两种途径所得到的效果最好的两株菌进行了比较，发现以乙醇为目标产物时，和引入XI途径的重组菌株相比，引入XR-XDH途径的重组菌株的木糖消耗速率和乙醇浓度较高，但是因为会积累木糖醇，所以乙醇产率较低。
造成XR-XDH菌株积累木糖醇、乙醇产率低的主要原因之一是XR、XDH辅因子依赖性不同造成的辅因子不平衡，因为辅因子参与胞内大量代谢反应，辅因子浓度的改变，会对代谢产生广泛的影响。辅因子可以分为ATP/ADP、氧化还原辅因子以及官能团载体等。所有生物体系都需要氧化还原稳态来维持生长和代谢。氧化还原辅因子参与大量生物合成反应，在维持胞内氧化还原平衡方面起着关键作用。其中，NADH/NAD+主要参与分解代谢中的生物氧化还原反应，而NADPH/NADP+是生物合成代谢反应中的调节子。因此，辅因子依赖性不同的XR、XDH的引入会使重组菌株面临氧化还原的不平衡，进而整体代谢受到影响。为此，学者们针对引入XR-XDH途径的重组菌株胞内辅因子水平的调节开展了很多研究，他们采取的方法主要可以分为利用定点突变技术改变XR或者XDH的辅因子依赖性，和改变辅因子相关酶的表达量来进行调节两种。
现有的很多对XR或XDH进行定点突变的研究也结合了关键酶表达量的调节，从而获得更好的效果。因此，基于辅因子调节，从代谢和转录层面深入分析差异途径和基因，再以分析结果指导分子改造，并进一步分析调控机制，是构建高效重组菌株、阐明调控机制的有效途径。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用，解决了上述背景技术中提出的问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌，在酿酒酵母木糖代谢菌株中分别过表达内源噻唑合酶THI4或木酮糖还原酶XYL2，具体为，在导入了来源于热带假丝酵母的木糖还原酶XR和木糖醇脱氢酶XDH的质粒上进一步过表达S.cerevisiae BY4741内源噻唑合酶THI4或木酮糖还原酶XYL2，转化宿主菌株。
可选的，所述酿酒酵母宿主菌为单倍体S.cerevisiae BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)及二倍体S.cerevisiae Kyokai No.6，以二者代表酿酒酵母不同倍型菌株，所用表达载体为高拷贝组成型质粒pYX212，其中该载体上连接有催化木糖代谢的两步氧化还原反应的木糖还原酶XR和木糖醇脱氢酶XDH。
可选的，所述噻唑合酶THI4和木酮糖还原酶XYL2的编码基因为S.cerevisiaeBY4741内源基因，THI4的编码基因THI4序列如SEQ ID NO.：1所示，XYL2的编码基因XYL2序列如SEQ ID NO.：2所示。
可选的，连接至表达载体时，所述的噻唑合酶THI4和木酮糖还原酶XYL2由酿酒酵母内源启动子PGK1控制，所述PGK1启动子的编码基因序列如SEQ ID NO.：3所示。
可选的，连接至表达载体时，所述噻唑合酶THI4和木酮糖还原酶XYL2的基因的3’端连接有终止子CYC1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：4所示。
基于上述菌株，本发明还公开了高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建方法。
可选的，所述该构建方法包括如下步骤：
(1)通过overlap PCR获得由启动子、目的基因、终止子组成的DNA片段表达盒，将表达盒与线性化pYX212-XR-XDH质粒连接，得到重组质粒；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒首先转化大肠杆菌DH5α感受态，测序验证后将表达盒序列正确的质粒转化至酿酒酵母菌。
基于上述菌株及构建方法，本发明还公开了高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的应用。
可选的，进行发酵前的种子培养时，培养温度为30～32℃，培养容器为500mL锥形瓶，装液量为100mL，转速为200～240rpm，供氧条件为好氧，控制方式为瓶口扎八层纱布，培养时间为20～24h，其中，种子培养基成分为：葡萄糖20g/L，蛋白胨15～20g/L，酵母粉5～10g/L，初始pH5.2～5.5。
可选的，发酵时，培养条件为：培养温度为30～32℃，培养容器为500mL锥形瓶，装液量为100mL，转速为200～240rpm，供氧条件为好氧，控制方式为瓶口扎八层纱布，培养时间为40～108h，其中，发酵培养基成分为：葡萄糖10～50g/L，木糖10～50g/L(葡萄糖和木糖的质量比例为1:2)，蛋白胨15～20g/L，酵母粉5～10g/L，初始pH5.2～5.5。
本发明提供了高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用，具备以下有益效果：该高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用，在过表达来源于热带假丝酵母的木糖还原酶XR(由XYL1编码)和木糖醇脱氢酶XDH(由XYL2编码)的过表达质粒pYX212-XR-XDH的基础上，进一步过表达酿酒酵母BY4741内源噻唑合酶THI4或木酮糖还原酶XYL2，转化单倍体酿酒酵母BY4741及二倍体酿酒酵母Kyokai No.6。该方法应用常用组成型高拷贝质粒pYX212，能够实现在混糖发酵过程中提高木糖、葡萄糖共利用过程中碳源的消耗速率和乙醇产量。在酿酒酵母不同倍型菌株中显示出的共同的促进效果表明过表达THI4或XYL2的有效性及普遍性。本发明分子操作简单，无需经过长期的进化过程，是解决木糖利用重组酿酒酵母中普遍存在的木糖消耗速率和乙醇产率低下问题的一种尝试。
附图说明
图1为本发明以启动子PGK1p过表达THI4的质粒载体图谱示意图；
图2为本发明以启动子PGK1p过表达XYL2的质粒载体图谱示意图；
图3为本发明由酿酒酵母BY4741获得的重组菌株BY-CON，BY-XR-XDH，BY-XR-XDH-THI4，BY-XR-XDH-XYL2以葡萄糖、木糖混合糖为碳源时葡萄糖、木糖消耗(A)、菌体生长(B)、木糖醇积累(C)、乙醇产生(D)情况示意图(图中：■□BY-CON；●○BY-XR-XDH；▲△BY-XR-XDH-THI4；▼▽BY-XR-XDH-XYL2；其中实心符号代表剩余木糖，空心符号代表剩余葡萄糖)；
图4为本发明由酿酒酵母Kyokai No.6获得的重组菌株K-CON，K-XR-XDH，K-XR-XDH-THI4，K-XR-XDH-XYL2以葡萄糖、木糖混合糖为碳源时葡萄糖、木糖消耗(A)、菌体生长(B)、木糖醇积累(C)、乙醇产生(D)情况示意图(图中：■□K-CON；●○K-XR-XDH；▲△K-XR-XDH-THI4；▼▽K-XR-XDH-XYL2；其中实心符号代表剩余木糖，空心符号代表剩余葡萄糖)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
以酿酒酵母菌株BY4741为出发菌株，在表达有XR和XDH的组成型高拷贝质粒pYX212上分别过表达以PGK1p为启动子的THI4和XYL2，得到重组菌株BY-XR-XDH-THI4和BY-XR-XDH-XYL2；含有空质粒的酿酒酵母菌株BY4741为对照菌BY-CON；含有表达有XR和XDH的质粒的酿酒酵母菌株为对照菌BY-XR-XDH。
用上述四株菌做葡萄糖、木糖混合碳源好氧发酵实验：
用接种环或枪头从-80℃保藏的30％甘油管中的单菌落挑取适量接种于5mL YPD液体培养基中，30℃、200rpm条件下培养20～24h，此培养物为一级种子。
一级种子培养结束后，转接于装有100mL液体种子培养基的500mL锥形瓶中，接种量5～10％，30℃、200rpm条件下培养20～24h，此培养物为二级种子。
二级种子培养结束后，进行发酵培养基的接种。转接于装有100mL液体发酵培养基的500mL锥形瓶中，接种量5～10％。30～32℃，200rpm条件下进行发酵。发酵条件为好氧培养，控制方法为发酵过程中在500mL锥形瓶瓶口包扎八层纱布。
发酵过程中碳源消耗及产物组成利用HPLC和气相色谱进行分析。HPLC分析条件为：Bio-RadAminexHPX–87H色谱柱，柱温55℃，流动相为5mmolH2SO4，流速0.4mL/min，每个样品运行25min。气相色谱配有火焰离子化检测器和30-m毛细管柱(Equity1TM；30m×0.32mm×1.0μm film thickness；Supelco Co，Bellefonate，PA，USA)。
实验结果如图3所示。和对照菌株相比，BY-XR-XDH-THI4和BY-XR-XDH-XYL2菌株的木糖消耗速率较BY-XR-XDH有所提高，木糖醇产量降低，乙醇产量提高。BY-XR-XDH菌株积累木糖醇可能是由于XR和XDH辅因子依赖性不同导致的辅因子不同，过表达THI4或XYL2能够调节木糖利用酿酒酵母菌株的代谢。
实施例2
以酿酒酵母菌株Kyokai No.6为出发菌株，在表达有XR和XDH的组成型高拷贝质粒pYX212上分别过表达以PGK1p为启动子的THI4和XYL2，得到重组菌株K-XR-XDH-THI4和K-XR-XDH-XYL2；含有空质粒的酿酒酵母菌株Kyokai No.6为对照菌K-CON；含有表达有XR和XDH的质粒的酿酒酵母菌株为对照菌K-XR-XDH。
用上述四株菌做葡萄糖、木糖混合碳源好氧发酵实验。培养方法及样品分析方法同实施例1。
实验结果如图4所示。相比于实施例1中由单倍体酿酒酵母BY4741获得的重组菌株，由二倍体Kyokai No.6获得的过表达菌株的木糖消耗速率更快。和BY-XR-XDH相似，K-XR-XDH也产生大量木糖醇，过表达THI4或XYL2木糖醇产量减少，乙醇产量提高。
以上结果表明，对于过表达XR和XDH后能代谢木糖但主要产物为木糖醇的酿酒酵母重组菌株，进一步过表达内源THI4或XYL2能有效调节菌株代谢，减少木糖醇产量，提高乙醇产量。
实施例3
本发明以酿酒酵母BY4741和Kyokai No.6为出发菌株，在连接有XR和XDH的表达载体组成型高拷贝质粒pYX212上进一步导入THI4或XYL2，THI4和XYL2由PGK1p启动子控制(如图1，图2所示)，得到菌株BY-XR-XDH-THI4、BY-XR-XDH-XYL2和K-XR-XDH-THI4、K-XR-XDH-XYL2。用这些菌株做木糖、葡萄糖混合碳源好氧培养发酵，发酵过程中用高效液相色谱HPLC测定培养基中的葡萄糖、木糖、木糖醇含量，用气相色谱测定乙醇含量。
用接种环或枪头从-80℃保藏的30％甘油管中的单菌落挑取适量接种于5mL YPD液体培养基中，30℃、200rpm条件下培养20～24h，此培养物为一级种子。
一级种子培养结束后，转接于装有100mL液体种子培养基的500mL锥形瓶中，接种量5～10％，30℃、200rpm条件下培养20～24h，此培养物为二级种子。
二级种子培养结束后，进行发酵培养基的接种。转接于装有100mL液体发酵培养基的500mL锥形瓶中，接种量5～10％。30～32℃，200rpm条件下进行发酵。发酵条件为好氧培养，控制方法为发酵过程中在500mL锥形瓶瓶口包扎八层纱布。
发酵过程中葡萄糖消耗阶段每12h进行取样分析，木糖消耗阶段每24h进行取样分析，HPLC条件：Bio-RadAminexHPX–87H色谱柱，柱温55℃，流动相为5mmolH2SO4，流速0.4mL/min，每个样品运行25min。
本发明提供的菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法中所用原料及试剂均可由市场购得。其中，所用宿主菌株为酿酒酵母BY4741和Kyokai No.6。所用表达载体为组成型高拷贝质粒pYX212。XR的启动子为TEF1p，XDH、THI4和XYL2的启动子为PGK1p。
本发明所用的对照菌株，获得方式为：在BY4741中表达空质粒pYX212，命名为“BY-CON”；在BY4741中表达连接有XR和XDH的pYX212，命名为“BY-XR-XDH”；在Kyokai No.6中表达空质粒pYX212，命名为“K-CON”；在Kyokai No.6中表达连接有XR和XDH的pYX212，命名为“K-XR-XDH”。
在本发明中，氨基酸及核苷酸序列表如下：
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南通大学
<120> 高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用
<140> 2019102207540
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213> 噻唑合酶THI4(Thiazole biosynthetase gene THI4)
<400> 1
atgtctgcta cctctactgc tacttccaca agtgcctctc aattgcactt aaactctact 60
ccagttactc actgcttatc tgacatcgtt aagaaagaag attggtctga ctttaaattt 120
gctcccatcc gcgaatccac tgtctctcgt gctatgactt ctcgttattt caaggatctt 180
gacaagtttg ccgtttctga cgtgattatt gtcggtgcgg gctcttcagg tttatccgcc 240
gcttacgtca tcgccaagaa cagaccagac ttgaaggttt gtattatcga aagttcagtt 300
gcaccaggtg gtggtagttg gttgggtggt caattattta gtgccatggt tatgagaaaa 360
ccagctcatt tgttcttaca agagttggaa atcccttacg aagacgaagg tgactatgtt 420
gtcgttaagc atgccgcttt gttcatctct actgtccttt caaaggtctt gcaattacca 480
aatgttaaac tgttcaatgc tacctgtgtt gaagatttgg ttaccagacc acctaccgaa 540
aagggcgaag tcaccgttgc tggtgttgtc accaactgga cgttagttac ccaagctcac 600
ggtactcaat gttgcatgga ccctaacgta attgaattgg caggttacaa aaatgacgga 660
actcgtgact tgagtcaaaa gcatggtgtc attttatcca ctaccggtca tgatggtcca 720
tttggtgctt tctgcgccaa gagaatcgtc gacattgatc aaaaccaaaa attgggcggt 780
atgaagggtc tggacatgaa ccatgccgaa cacgatgtcg ttattcactc tggtgcatac 840
gccggtgttg acaacatgta ctttgctggt atggaagttg ctgaactgga tggattaaac 900
cgtatgggtc caacttttgg agctatggct ttgagtggtg ttcatgctgc tgagcaaatt 960
ttgaaacact ttgctgctta g 981
<210> 2
<211> 1071
<212> DNA
<213> 木酮糖还原酶XYL2(Carbonose reductase XYL2)
<400> 2
atgactgact taactacaca agaagctatt gttctagagc gacctggtaa aatcacccta 60
actaatgtca gcatcccaaa gatttcagat cctaacgaag taatcatcca gatcaaggcg 120
acaggaatat gcgggtcaga tatccattac tatacccatg gaagaatagc caattacgtg 180
gtagaatcac caatggtgct gggacatgaa tcatcaggaa tagtggccct cataggtgag 240
aacgtcaaga cacttaaagt aggagatagg gtggcacttg agcccggaat acctgacagg 300
ttttcaccgg agatgaaaga gggcagatac aacctggacc ccaatttaaa atttgctgcg 360
acacctccct ttgatgggac cttgacaaag tattataaga ccatgaaaga tttcgtctat 420
aaacttcctg atgatgtgtc attcgaggaa ggagcactaa tagagccatt atcagtggca 480
atccatgcta ataaattagc aaagatcaag tttggagccc gttgcgtcgt ctttggagct 540
gggcccatag gtttgctagc cgggaaagta gccagtgtct ttggtgctgc agatgttgtt 600
tttgtagatc tattagaaaa caagctggaa acggctaggc agtttggtgc cacccacatc 660
gtcaactcag gtgatctccc acatggcgtt actgtagata gtgttataaa aaaagcaatc 720
ggcaagaaag gtgctgacgt tgtgtttgaa tgttctggtg cagagccttg cgttcgagca 780
ggcatcgaag tctgtaaggc aggtggaacg atcgttcaag ttggaatggg acaagaggaa 840
atacaatttc ccatctcgat cattccaaca aaagaactga cattccaagg ctgtttccga 900
tactgtcaag gtgattatag tgactccatc gagctagtct ctagcagaaa actctcgctt 960
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agccaccacc cgttaaataa tatcaagacg atcattgagg gcccggaatg a 1071
<210> 3
<211> 750
<212> DNA
<213> PGK1启动子(PGK1)
<400> 3
acgcacagat attataacat ctgcataata ggcatttgca agaattactc gtgagtaagg 60
aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc gcgaatcctt 120
tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt ttccctcctt 180
cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga aattaccgtc 240
gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc tcgacttcct 300
gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag cgacggctca 360
caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt agtaccacat 420
gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg ttactctctc 480
tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca cacactcttt 540
tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac atttacatat 600
atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt tctaattcgt 660
agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc aaggaagtaa 720
ttatctactt tttacaacaa atataaaaca 750
<210> 4
<211> 248
<212> DNA
<213> CYC1终止子(CYC1)
<400> 4
tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg 60
aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt 120
tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt 180
acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt 240
taatttgc 248

Claims (9)

1.高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌，其特征在于：在酿酒酵母木糖代谢菌株中分别过表达内源噻唑合酶THI4或木酮糖还原酶XYL2，具体为，在导入了来源于热带假丝酵母的木糖还原酶XR和木糖醇脱氢酶XDH的质粒上进一步过表达S.cerevisiae BY4741内源噻唑合酶THI4或木酮糖还原酶XYL2，转化宿主菌株。
2.根据权利要求1所述的高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌，其特征在于：所述酿酒酵母宿主菌为单倍体S.cerevisiae BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)及二倍体S.cerevisiae Kyokai No.6，以二者代表酿酒酵母不同倍型菌株，所用表达载体为高拷贝组成型质粒pYX212，其中该载体上连接有催化木糖代谢的两步氧化还原反应的木糖还原酶XR和木糖醇脱氢酶XDH。
3.根据权利要求1所述的高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌，其特征在于：所述噻唑合酶THI4和木酮糖还原酶XYL2的编码基因为S.cerevisiae BY4741内源基因，THI4的编码基因THI4序列如SEQ ID NO.：1所示，XYL2的编码基因XYL2序列如SEQ ID NO.：2所示。
4.根据权利要求1所述的高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌，其特征在于：连接至表达载体时，所述的噻唑合酶THI4和木酮糖还原酶XYL2由酿酒酵母内源启动子PGK1控制，所述PGK1启动子的编码基因序列如SEQ ID NO.：3所示。
5.根据权利要求1所述的高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌，其特征在于：连接至表达载体时，所述噻唑合酶THI4和木酮糖还原酶XYL2的基因的3’端连接有终止子CYC1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：4所示。
6.高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建方法，其特征在于：所述该构建方法包括如下步骤：
(1)通过overlap PCR获得由启动子、目的基因、终止子组成的DNA片段表达盒，将表达盒与线性化pYX212-XR-XDH质粒连接，得到重组质粒；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒首先转化大肠杆菌DH5α感受态，测序验证后将表达盒序列正确的质粒转化至酿酒酵母菌。
7.高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的应用，其特征在于：内设有权利要求1-6任意一项所述能够高效利用木糖和葡萄糖作为混合碳源的酿酒酵母基因工程重组菌株在发酵中的应用。
8.根据权利要求7所述的高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的应用，其特征在于：进行发酵前的种子培养时，培养温度为30～32℃，培养容器为500mL锥形瓶，装液量为100mL，转速为200～240rpm，供氧条件为好氧，控制方式为瓶口扎八层纱布，培养时间为20～24h，其中，种子培养基成分为：葡萄糖20g/L，蛋白胨15～20g/L，酵母粉5～10g/L，初始pH5.2～5.5。
9.根据权利要求7所述的高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的应用，其特征在于：发酵时，培养条件为：培养温度为30～32℃，培养容器为500mL锥形瓶，装液量为100mL，转速为200～240rpm，供氧条件为好氧，控制方式为瓶口扎八层纱布，培养时间为40～108h，其中，发酵培养基成分为：葡萄糖10～50g/L，木糖10～50g/L(葡萄糖和木糖的质量比例为1:2)，蛋白胨15～20g/L，酵母粉5～10g/L，初始pH5.2～5.5。
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