CN107325976A - 高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107325976A CN107325976A CN201710493830.6A CN201710493830A CN107325976A CN 107325976 A CN107325976 A CN 107325976A CN 201710493830 A CN201710493830 A CN 201710493830A CN 107325976 A CN107325976 A CN 107325976A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- saccharomyces cerevisiae
- glucose
- engineering bacteria
- fermentation
- gene engineering
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 59
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 title claims abstract description 51
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 title claims abstract description 37
- 239000008103 glucose Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 51
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 51
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 50
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 15
- 108030006413 Thiazole synthases Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 13
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 claims description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 6
- 241000793189 Saccharomyces cerevisiae BY4741 Species 0.000 claims description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- -1 initially PH5.2~5.5 Substances 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 6
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 15
- 101100425082 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) thiA gene Proteins 0.000 description 12
- 101150063803 thi4 gene Proteins 0.000 description 12
- 101150011158 THI1 gene Proteins 0.000 description 11
- 101100036901 Arabidopsis thaliana RPL40B gene Proteins 0.000 description 9
- 101100123443 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HAP4 gene Proteins 0.000 description 9
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 4
- 150000003544 thiamines Chemical class 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 3
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 3
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000306 component Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 3
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- LNQVTSROQXJCDD-KQYNXXCUSA-N 3'-AMP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H]1O LNQVTSROQXJCDD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- MMKRXAARQITTBL-UHFFFAOYSA-N 5-ethoxy-4-methyl-1,3-thiazole Chemical class CCOC=1SC=NC=1C MMKRXAARQITTBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N Adenosine Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O NADP(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 125000000816 ethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 230000010429 evolutionary process Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000002803 fossil fuel Substances 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000010335 redox stress Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/13—Transferases (2.) transferring sulfur containing groups (2.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
- C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y208/00—Transferases transferring sulfur-containing groups (2.8)
- C12Y208/01—Sulfurtransferases (2.8.1)
- C12Y208/0101—Thiazole synthase (2.8.1.10)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌，该基因工程菌是在酿酒酵母菌中分别过表达噻唑合酶Thi4和全局转录因子Hap4，属于基因工程领域，本发明还公开了上述菌株的构建方法及其发酵应用。本发明使用高拷贝游离型质粒pYX212为载体，在酿酒酵母菌株中过表达内源的噻唑合酶Thi4和全局转录因子Hap4，得到能够提高葡萄糖消耗速率、菌体生长速率和乙醇产量的重组酿酒酵母菌株。
Description
技术领域
本发明涉及微生物、分子生物学领域，具体涉及一株高效利用葡萄糖的酿酒酵母菌株及其构建方法与应用。
背景技术
面对矿物燃料储备的迅速消耗、全球变暖等问题，可持续可再生能源成了全球性的研究热点。生物乙醇是替代传统燃料的首选。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有高乙醇耐受性、并且能在严格厌氧条件下发酵等优点，是工业化产乙醇的首选。
葡萄糖是生产生物乙醇的淀粉原料及糖类原料中含量最高的单糖。葡萄糖发酵过程中，酿酒酵母的生存能力、细胞比生长速率和糖吸收速率都直接和培养基条件相关。Nagodawithana和Steinkraus的研究发现在酿酒酵母的发酵过程中，除了乙醇，还有其他副产物会对代谢产生抑制作用，并导致产物的不纯。为了提高酿酒酵母乙醇生产过程中的发酵性能，学者们进行了各种尝试，发现微生物细胞的固定化发酵能够消除由高浓度的底物和产物产生的抑制作用，提高乙醇产量和产率。Najafpour等人利用固定化细胞反应器成功提高了酿酒酵母发酵产乙醇的能力。和传统游离分批发酵相比，利用固定化细胞反应器进行的发酵乙醇产量提高了27％，而且发酵时间由24h缩短到7h。陈勇等人将纤维置于反应器内对细胞进行固定化，由固定化细胞发酵得到的乙醇产率比游离细胞高了41.93％，且固定化的酵母细胞稳定性增强，分批发酵能够稳定进行22批次。
作为一种高效的细胞工厂，酿酒酵母的代谢能够被设计成满足特定的需求，而且酿酒酵母已经完成了全基因组的测序，高通量的分析手段比如基因芯片、含有细胞信息的数据库以及健全的基因操作技术极大地提高了酿酒酵母代谢工程的精确度。然而，对代谢网络的设计往往会遇到出乎意料的结果，这是因为胞内组分间高度关联，会趋向抵消或者扩大人为引起的突变。辅因子在代谢网络中属于关联度最高的代谢物，因此虽然是对单个反应进行操作，但是对参与该反应的辅因子浓度的改变会对代谢产生广泛的影响。
在代谢网络中，辅因子能持续供应吉布斯自由能、氧化还原当量和官能团。它们被认为是代谢网络中最紧密的连接节点。腺苷-3-磷酸(ATP)和还原型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)分别参与了酿酒酵母代谢网络中的188个和160个反应。这些辅因子在代谢网络的不同分支之间创建了一个紧密的联系，辅因子的不平衡可以引发一个不稳定的系统，这意味着改变局部反应的通量的影响可以扩散到代谢网络的其他部分，甚至产生全局响应。正因为辅因子对代谢网络有着这样重要的作用，因此辅因子调控具有成为调控生物催化强有力的手段的潜力。辅因子主要包括ATP、氧化还原辅因子(NAD(H),NADP(H))以及一些官能团载体。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供高效利用葡萄糖的的酿酒酵母基因工程菌，以提高酿酒酵母的发酵性能。
本发明还要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母基因工程菌在发酵中的应用。
高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌，该基因工程菌是分别在酿酒酵母菌中过表达噻唑合酶Thi4或全局转录因子Hap4。
噻唑合酶THI4催化腺苷二磷酸-5-(-乙烷基)-4-甲基噻唑-2-羧酸(ADT)生成5-羟乙基-4-甲基噻唑(HET)。
优选地，所述的酿酒酵母菌为S.cerevisiae BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)。
优选地，所述的噻唑合酶Thi4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：1所示。
优选地，所述的全局转录因子Hap4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：2所示。
上述高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将噻唑合酶Thi4的基因序列或全局转录因子Hap4的基因序列分别克隆到表达质粒上，得到重组质粒；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒转化酿酒酵母菌。
其中，步骤(1)中，所述表达质粒为pYX212。
其中，步骤(2)中，所述酿酒酵母菌为S.cerevisiae BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)。
上述高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌在发酵中的应用在本发明的保护范围之内。
上述高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌在发酵产乙醇中的应用在本发明的保护范围之内。
利用该菌株进行发酵的培养条件如下：
发酵前，种子培养培养条件如下：培养温度为30～32℃，培养时间为20～24h，转速为200～240rpm；
发酵时，发酵培养条件如下：培养温度为30～32℃，培养时间为26～50h，转速为200～240rpm。
利用该菌株进行发酵的培养基配方如下：
种子培养基的配方如下：葡萄糖20～30g/L，酵母粉10～20g/L，蛋白胨20～30g/L，初始pH5.2～5.5，溶剂为水；
发酵培养基的配方如下：葡萄糖90～120g/L，酵母粉10～20g/L，蛋白胨20～30g/L，初始pH5.2～5.5，溶剂为水。
本领域的技术人员可以对上述培养条件或培养基配方进行调整。
具体的培养方法如下：用接种环或枪头从-80℃保藏的30％甘油管中的单菌落挑取适量接种于5ml YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养20～24h，此培养物为一级种子。
一级种子培养结束后，转接于装有100ml YPD液体培养基的500ml锥形瓶中，接种量5～10％，30℃，200rpm培养20～24h，此培养物为二级种子。
二级种子培养结束后，进行发酵培养基的接种。转接于装有100ml液体发酵培养基的500ml锥形瓶中，接种量5～10％。30～32℃，200rpm条件下进行发酵。发酵条件为好氧培养，控制方法为发酵过程中在500ml锥形瓶瓶口包扎八层纱布。
培养基成分：
种子培养基的组分为：葡萄糖20～30g/L，酵母粉10～20g/L，蛋白胨20～30g/L，初始pH5.2～5.5。发酵培养基的组分为：葡萄糖90～120g/L，酵母粉10～20g/L，蛋白胨20～30g/L，初始pH5.2～5.5。
培养基灭菌条件：115℃，20min。
在酿酒酵母中过表达催化NADH氧化为NAD+的NADH氧化酶除了起到改变酵母胞内的氧化还原状态的作用，还能够加快葡萄糖消耗、减少胞内ROS积累、增加细胞耐高渗能力，这些改变都与压力响应有关，在转录水平上与之对应的参与氧化压力调节的硫胺的合成途径中的Thi基因以及与饥饿响应相关的hap4基因的表达上调。
硫胺是酿酒酵母代谢中一个重要的辅因子，能够减轻氧化还原压力。5-羟乙基-4-甲基噻唑(HET)是硫胺合成的前体，腺苷二磷酸-5-(-乙烷基)-4-甲基噻唑-2-羧酸(ADT)是HET的前体，该反应由噻唑合酶THI4催化，NAD+是ADT的碳水化合物前体。过表达NADH氧化酶能提高NAD+的再生，ADT的合成受到调节，继而影响硫胺的合成。
在发酵过程中，当酵母细胞耗尽发酵性碳源后，会经历一个双峰转换时期，将它的代谢转变为利用发酵液中的乙醇进行氧化分解代谢，也就是说NADH氧化酶过表达菌株会比对照菌株更早的经历双峰转换时期。过表达全局转录调控因子Hap4能够引起在双峰转换时期发生的变化。NADH氧化酶过表达菌株中Hap4的表达在对数生长期末期上调。Hap4调控的基因涉及氧化磷酸化、锌代谢、糖转运和糖异生等。
有益效果：
与现有技术相比，本发明在单倍体酿酒酵母菌株BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)中以表达载体组成型高拷贝质粒pYX212分别过表达酿酒酵母内源的噻唑合酶Thi4(由thi4编码)和全局转录调控因子Hap4(由hap4编码)，得到高效利用葡萄糖的菌株。能够实现在发酵过程中提高葡萄糖消耗速率、菌体生长速率和乙醇产量。本发明分子操作简单，无需经过长期的进化过程，是提高酿酒酵母乙醇发酵性能的一种尝试。
附图说明
图1过表达Thi4质粒载体图谱，所用表达质粒为组成型高拷贝质粒pYX212。
图2过表达Hap4质粒载体图谱，所用表达质粒为组成型高拷贝质粒pYX212。
图3CON，THI4与HAP4以葡萄糖为碳源时葡萄糖消耗(A)、菌体生长(B)、乙醇产生(C)情况。
具体实施方式
本发明公开了两种菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明以酿酒酵母BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)为出发菌株，以表达载体组成型高拷贝质粒pYX212分别过表达噻唑合酶Thi4(图1)和全局转录调控因子Hap4(图2)，得到菌株THI4与HAP4。用该菌株做葡萄糖好氧培养发酵，发酵过程中用高效液相色谱HPLC测定培养基中的葡萄糖、乙醇、甘油含量。
用接种环或枪头从-80℃保藏的30％甘油管中的单菌落挑取适量接种于5ml YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养20～24h，此培养物为一级种子。
一级种子培养结束后，转接于装有100ml液体种子培养基的500ml锥形瓶中，接种量5～10％，30℃，200rpm培养20～24h，此培养物为二级种子。
二级种子培养结束后，进行发酵培养基的接种。转接于装有100ml液体发酵培养基的500ml锥形瓶中，接种量5～10％。30～32℃，200rpm条件下进行发酵。发酵条件为好氧培养，控制方法为发酵过程中在500ml锥形瓶瓶口包扎八层纱布。
发酵过程中每4h进行取样分析，HPLC条件：Benson BP-100Pb++色谱柱，柱温80℃，流动相为超纯水，流速0.4ml/min，每个样品运行30min。菌体生长采用分光光度计在波长600nm下测定吸光值。
本发明提供的菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法中所用原料及试剂均可由市场购得。其中，所用宿主菌株为酿酒酵母BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)。所用表达载体为组成型高拷贝质粒pYX212。
本专利所用的对照菌株，获得方式为：在BY4741中表达空质粒pYX212，命名为“CON”。
实施例1：
以酿酒酵母菌株BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)为出发菌株，以表达载体组成型高拷贝质粒pYX212过表达Thi4，得到重组菌株THI4；以表达载体组成型高拷贝质粒pYX212过表达Hap4，得到重组菌株HAP4；含有空质粒的酿酒酵母菌株
BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)为对照菌CON。
用上述三株菌做葡萄糖好氧发酵实验：
种子培养基为合成培养基YPD，发酵培养基为初糖浓度为100g/L的YPD培养基。用接种环或枪头从-80℃保藏的30％甘油管中的单菌落挑取适量接种于5ml YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养20～24h，此培养物为一级种子。
一级种子培养结束后，转接于装有100ml YPD液体培养基的500ml锥形瓶中，接种量5～10％，30℃，200rpm培养20～24h，此培养物为二级种子。
二级种子培养结束后，进行发酵培养基的接种。转接于装有100ml液体发酵培养基的500ml锥形瓶中，接种量5～10％。30～32℃，200rpm条件下进行发酵。发酵条件为好氧培养，控制方法为发酵过程中在500ml锥形瓶瓶口包扎八层纱布。
发酵过程中进行取样分析，HPLC条件：Benson BP-100Pb++色谱柱，柱温80℃，流动相为超纯水，流速0.4ml/min，每个样品运行30min。菌体生长采用分光光度计在波长600nm下测定吸光值。
实验结果图3所示，图3中酿酒酵母对照菌株CON，Thi4过表达菌株THI4，Hap4过表达菌株HAP4。
结果显示，THI4和HAP4的发酵性能都优于CON。发酵26h后，THI4和HAP4菌株发酵液中的残糖已经低于0.5g/L，而此时CON的发酵液中还剩38.24g/L葡萄糖。THI4菌株发酵30h后OD600达到最大值27.9，HAP4菌株发酵34h后OD600达到最大值29.05，而CON菌株发酵40h后OD600仅为10.05。过表达Thi4和Hap4后改变了酿酒酵母菌株代谢通量的分布。THI4和HAP4菌株发酵26h后乙醇产量达到最大值，分别为30.12和34.63g/L，CON发酵40h后乙醇产量为28.78g/L。发酵40h后，THI4和HAP4菌株甘油产量分别为1.35和1.40g/L，而CON的甘油产量为8.87g/L。在CON的代谢过程中，副产物甘油的产量很高，过表达Thi4和Hap4后，甘油支路活性大大降低，碳源流向菌体生长和乙醇产生。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京工业大学
<120> 高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用
<130> SG20170621001
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213> Thi4基因序列
<400> 1
atgtctgcta cctctactgc tacttccaca agtgcctctc aattgcactt aaactctact 60
ccagttactc actgcttatc tgacatcgtt aagaaagaag attggtctga ctttaaattt 120
gctcccatcc gcgaatccac tgtctctcgt gctatgactt ctcgttattt caaggatctt 180
gacaagtttg ccgtttctga cgtgattatt gtcggtgcgg gctcttcagg tttatccgcc 240
gcttacgtca tcgccaagaa cagaccagac ttgaaggttt gtattatcga aagttcagtt 300
gcaccaggtg gtggtagttg gttgggtggt caattattta gtgccatggt tatgagaaaa 360
ccagctcatt tgttcttaca agagttggaa atcccttacg aagacgaagg tgactatgtt 420
gtcgttaagc atgccgcttt gttcatctct actgtccttt caaaggtctt gcaattacca 480
aatgttaaac tgttcaatgc tacctgtgtt gaagatttgg ttaccagacc acctaccgaa 540
aagggcgaag tcaccgttgc tggtgttgtc accaactgga cgttagttac ccaagctcac 600
ggtactcaat gttgcatgga ccctaacgta attgaattgg caggttacaa aaatgacgga 660
actcgtgact tgagtcaaaa gcatggtgtc attttatcca ctaccggtca tgatggtcca 720
tttggtgctt tctgcgccaa gagaatcgtc gacattgatc aaaaccaaaa attgggcggt 780
atgaagggtc tggacatgaa ccatgccgaa cacgatgtcg ttattcactc tggtgcatac 840
gccggtgttg acaacatgta ctttgctggt atggaagttg ctgaactgga tggattaaac 900
cgtatgggtc caacttttgg agctatggct ttgagtggtg ttcatgctgc tgagcaaatt 960
ttgaaacact ttgctgctta g 981
<210> 2
<211> 1665
<212> DNA
<213> Hap4基因序列
<400> 2
atgaccgcaa agacttttct actacaggcc tccgctagtc gccctcgtag taaccatttt 60
aaaaatgagc ataataatat tccattggcg cctgtaccga tcgccccaaa taccaaccat 120
cataacaata gttcgctgga attcgaaaac gatggcagta aaaagaagaa gaagtctagc 180
ttggtggtta gaacttcaaa acattgggtt ttgcccccaa gaccaagacc tggtagaaga 240
tcatcttctc acaacactct acctgccaac aacaccaata atattttaaa tgttggccct 300
aacagcagga acagtagtaa taataataat aataataaca tcatttcgaa taggaaacaa 360
gcttccaaag aaaagaggaa aataccaaga catatccaga caatcgatga aaagctaata 420
aacgactcga attacctcgc atttttgaag ttcgatgact tggaaaatga aaagtttcat 480
tcttctgcct cctccatttc atctccatct tattcatctc catctttttc aagttataga 540
aatagaaaaa aatcagaatt catggacgat gaaagctgca ccgatgtgga aaccattgct 600
gctcacaaca gtctgctaac aaaaaaccat catatagatt cttcttcaaa tgttcacgca 660
ccacccacga aaaaatcaaa gttgaacgac tttgatttat tgtccttatc ttccacatct 720
tcatcggcca ctccggtccc acagttgaca aaagatttga acatgaacct aaattttcat 780
aagatccctc ataaggcttc attccctgat tctccagcag atttctctcc agcagattca 840
gtctcgttga ttagaaacca ctccttgcct actaatttgc aagttaagga caaaattgag 900
gatttgaacg agattaaatt ctttaacgat ttcgagaaac ttgagttttt caataagtat 960
gccaaagtca acacgaataa cgacgttaac gaaaataatg atctctggaa ttcttactta 1020
cagtctatgg acgatacaac aggtaagaac agtggcaatt accaacaagt ggacaatgac 1080
gataatatgt ctttattgaa tctgccaatt ttggaggaaa ccgtatcttc agggcaagat 1140
gataaggttg agccagatga agaagacatt tggaattatt taccaagttc aagttcacaa 1200
caagaagatt catcacgtgc tttgaaaaaa aatactaatt ctgagaaggc gaacatccaa 1260
gcaaagaacg atgaaaccta tctgtttctt caggatcagg atgaaagcgc tgattcgcat 1320
caccatgacg agttaggttc agaaatcact ttggctgaca ataagttttc ttatttgccc 1380
ccaactctag aagagttgat ggaagagcag gactgtaaca atggcagatc ttttaaaaat 1440
ttcatgtttt ccaacgatac cggtattgac ggtagtgccg gtactgatga cgactacacc 1500
aaagttctga aatccaaaaa aatttctacg tcgaagtcga acgctaacct ttatgactta 1560
aacgataaca acaatgatgc aactgccacc aatgaacttg atcaaagcag tttcatcgac 1620
gaccttgacg aagatgtcga ttttttaaag gtacaagtat tttga 1665
Claims (10)
1.高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌是在酿酒酵母菌中过表达噻唑合酶Thi4或全局转录因子Hap4。
2.根据权利要求1所述的高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述的酿酒酵母菌为S.cerevisiae BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)。
3.根据权利要求1所述的高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述的噻唑合酶Thi4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：1所示。
4.根据权利要求1所述的高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，所述的全局转录因子Hap4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：2所示。
5.权利要求1～4任一所述的高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将噻唑合酶Thi4的基因序列或全局转录因子Hap4的基因序列分别克隆到表达质粒上，得到重组质粒；
(2)将步骤(1)得到的重组质粒转化酿酒酵母菌。
6.根据权利要求5所述高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述表达质粒为pYX212。
7.根据权利要求5所述高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酿酒酵母菌为S.cerevisiae BY4741(MATa；ura3；his3；leu2；met15)。
8.权利要求1～5任一所述高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌在发酵中的应用。
9.权利要求1～5任一所述高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌在发酵产乙醇中的应用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，发酵前，种子培养培养条件如下：培养温度为30～32℃，培养时间为20～24h，转速为200～240rpm；
发酵时，发酵培养条件如下：培养温度为30～32℃，培养时间为26～50h，转速为200～240rpm。
种子培养基的配方如下：葡萄糖20～30g/L，酵母粉10～20g/L，蛋白胨20～30g/L，初始pH5.2～5.5，溶剂为水；
发酵培养基的配方如下：葡萄糖90～120g/L，酵母粉10～20g/L，蛋白胨20～30g/L，初始pH5.2～5.5，溶剂为水。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710493830.6A CN107325976B (zh) | 2017-06-26 | 2017-06-26 | 高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710493830.6A CN107325976B (zh) | 2017-06-26 | 2017-06-26 | 高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107325976A true CN107325976A (zh) | 2017-11-07 |
| CN107325976B CN107325976B (zh) | 2020-10-02 |
Family
ID=60195681
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710493830.6A Active CN107325976B (zh) | 2017-06-26 | 2017-06-26 | 高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107325976B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110229761A (zh) * | 2019-06-19 | 2019-09-13 | 南通大学 | 高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004113004A (ja) * | 2002-09-24 | 2004-04-15 | National Research Inst Of Brewing | 有機酸高含有酒類及び食品の製造方法 |
| CN102812124A (zh) * | 2009-08-26 | 2012-12-05 | 器官平衡有限责任公司 | 用于产生脂质的经遗传改造的生物 |
-
2017
- 2017-06-26 CN CN201710493830.6A patent/CN107325976B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004113004A (ja) * | 2002-09-24 | 2004-04-15 | National Research Inst Of Brewing | 有機酸高含有酒類及び食品の製造方法 |
| CN102812124A (zh) * | 2009-08-26 | 2012-12-05 | 器官平衡有限责任公司 | 用于产生脂质的经遗传改造的生物 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ROMEO LASCARIS ET AL.: "Hap4p overexpression in glucose-grown Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae", 《GENOME BIOLOGY》 * |
| 黄彩红: "哈茨木霉 Chit37 基因与 Thi4 基因的克隆与表达", 《中国博士学位论文全文数据库》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110229761A (zh) * | 2019-06-19 | 2019-09-13 | 南通大学 | 高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107325976B (zh) | 2020-10-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shen et al. | Syngas fermentation of Clostridium carboxidivoran P7 in a hollow fiber membrane biofilm reactor: Evaluating the mass transfer coefficient and ethanol production performance | |
| Johnson et al. | The role of 1, 3-propanediol production in fermentation of glycerol by Clostridium pasteurianum | |
| Wang et al. | Mixed culture of Saccharomyces cerevisiae and Acetobacter pasteurianus for acetic acid production | |
| ES2431644T3 (es) | Cepa BG1 de Thermoanaerobacter mathranii | |
| CN106544284B (zh) | 一种重组解脂耶氏酵母工程菌株及其构建方法和应用 | |
| CN104651287B (zh) | 一种用于合成甘油葡糖苷的工程菌和应用 | |
| Maina et al. | Improvement on bioprocess economics for 2, 3-butanediol production from very high polarity cane sugar via optimisation of bioreactor operation | |
| CN109207373A (zh) | 一株高产柠檬酸的微生物菌株及其发酵淀粉糖质生产柠檬酸的方法 | |
| CN103597087B (zh) | 丁酸、丁醇及丁酯的制备方法 | |
| CN107384847A (zh) | 一种高效转化木糖生产乙二醇的重组菌及其应用 | |
| CN107325976A (zh) | 高效利用葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN102618479B (zh) | 一种能耐受高浓度丁醇的梭菌及其构建方法与应用 | |
| CN102250821A (zh) | 一种改造大肠杆菌产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法 | |
| CN105062981B (zh) | 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体n315f及其应用 | |
| CN109161514B (zh) | 一种重组d-甘露糖异构酶及其在d-甘露糖生产中的应用 | |
| CN107043792A (zh) | 一种高温菌和中温菌共同发酵合成气产乙醇的新工艺 | |
| CN104204206B (zh) | 一种用于生产丁醇的方法 | |
| CN109628336A (zh) | 一株敲除fbp1基因的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| Shah et al. | Ethanol production kinetics by a thermo-tolerant mutant of Saccharomyces cerevisiae from starch industry waste (Hydrol) | |
| CN105132388B (zh) | 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体r485p及其应用 | |
| CN102816780A (zh) | 山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇abcden的组合基因 | |
| CN110229761A (zh) | 高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用 | |
| CN104845948B (zh) | 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体p474n及其应用 | |
| CN107022499A (zh) | 调控酿酒酵母社会行为提高生物乙醇发酵速率效率的方法 | |
| CN112877229B (zh) | 一株敲除Sok2的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |