CN104845948B - 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体p474n及其应用 - Google Patents

一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体p474n及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体P474N及其应用，属于遗传工程和发酵工程领域。本发明将米根霉的丙酮酸羧化酶的P474位点突变成了天冬酰胺，得到的突变体酶活提高了12.8％。在敲除PDC1和ADH1的基础上敲除基因FUM1，同时过量丙酮酸羧化酶突变体P474N，发现延胡索酸产量提高了13.3％。同时通过添加64μg/L的生物素，延胡索酸产量达到357mg/L，较不添加生物素时(256.7±3.0mg/L)提高了37％。该发明有效强化了碳代谢流由丙酮酸进入延胡索酸的合成途径，为构建工程酵母高效生产延胡索酸及其它二元羧酸创造了条件，具有很好的工业应用价值和前景。

Description

一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体P474N及其应用
技术领域
本发明涉及一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体P474N及其应用，属于遗传工程和发酵工程领域。
背景技术
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为一种真核模式微生物，因具有：遗传信息丰富，代谢改造操作方便；营养需求简单，分离提取工艺成本低廉；在低pH条件下(甚至pH<3.0)生长良好；能够耐受高浓度的底物；被FDA认证为GRAS(General Regarded AsSafe)微生物，发酵产品具有安全性等优点而成为发酵生产羧酸(乳酸、丙酮酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等)的潜在最适微生物。然而，酿酒酵母在高浓度糖及通风的条件分批发酵产生大量的乙醇，对于以羧酸为目标产物来说，乙醇的大量积累使得碳流大量的损失，且酿酒酵母本身不具备羧酸的合成途径。通过弱化乙醇途径中的关键酶的活性，可以减少通往乙醇的碳代谢流，从而减少碳流的损失；在此基础上，可通过阻止或弱化目标羧酸的进一步代谢，来构建目标羧酸的合成途径。丙酮酸羧化酶的作用是将丙酮酸转化为草酰乙酸，进而可将碳流引入到目标羧酸的合成途径，因此，丙酮酸羧化酶的作用可形象地描述为“生物阀门”，如何强化丙酮酸羧化反应，将碳流更有效地引入到目标羧酸的合成途径，成为代谢工程改造酿酒酵母生产羧酸的一个关键问题。已有研究表明细胞中丙酮酸羧化酶活性的高低对苹果酸、琥珀酸、谷氨酸的积累有着重要作用。任何以二元羧酸为目标产物的酿酒酵母发酵工艺，都将面临同样一个问题：如何强化丙酮酸羧化反应，促进碳流由丙酮酸流向目标羧酸的合成途径？通过对丙酮酸羧化酶进行定向改造来提高延胡索酸等二元羧酸的产量目前未见报道，因此，本发明所提供的方案，对于利用酿酒酵母生产羧酸的研究具有普遍的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提高丙酮酸羧化酶活性的方法及基因工程菌，为代谢工程改造酿酒酵母高效生产延胡索酸及其它二元羧酸打下基础(注：丙酮酸羧化酶在酿酒酵母高效生产二元羧酸中的共同作用是将碳流由丙酮酸引入到目标产物的合成途径)。本发明在构建乙醇减少、可积累延胡索酸的工程菌的基础上，通过过量表达源于米根霉(Rhizopus oryzae)丙酮酸羧化酶基因RoPYC，并通过荧光定位确认该酶定位在酿酒酵母细胞的胞质中，进而对该酶的Proline474位点进行饱和突变，结合生物素浓度添加，提高了丙酮酸羧化酶的活性，明显促进了延胡索酸的积累。
本发明的第一个目的是提供一种丙酮酸羧化酶突变体，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亲本米根霉丙酮酸羧化酶的基础上，对第474位的氨基酸进行了突变。
所述突变，在本发明的一种实施方式中，是进行了饱和突变。
所述突变体，在本发明的一种实施方式中，是将第474位的脯氨酸突变成为天冬酰胺。
所述亲本米根霉丙酮酸羧化酶，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列是SEQID NO.2所示的序列。
本发明的第二个目的是提供一种表达所述突变体的基因工程菌。
所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，是酿酒酵母。
所述酿酒酵母，在本发明的一种实施方式中，同时缺失了丙酮酸脱羧酶PDC1、乙醇脱氢酶ADH1、延胡索酸酶FUM1。
本发明的第三个目的是提供一种利用表达所述突变体的基因工程菌发酵生产二元羧酸的方法。
所述二元羧酸，包括延胡索酸、苹果酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，是用于促进延胡索酸的积累。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，是在丙酮酸脱羧酶PDC1、乙醇脱氢酶ADH1和延胡索酸酶FUM1同时缺失的酵母菌中，过表达所述丙酮酸羧化酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸脱羧酶基因PDC1的核苷酸序列如GeneID:850733所示，乙醇脱氢酶基因ADH1的核苷酸序列如Gene ID:854068所示，延胡索酸酶基因FUM1的核苷酸序列如Gene ID:855866所示。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，还包括在发酵培养过程中添加生物素。所述生物素添加量可以是0-128μg/L。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，是：将过表达丙酮酸羧化酶突变体的三基因缺失菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C△PDC1△ADH1△FUM1的种子液，接种至发酵培养基，与28-32℃、150-250rpm条件下进行培养。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是将30℃、220rpm下培养24h的基因工程菌种子以5％的接种量转入发酵培养基于30℃、220rpm条件下培养96h。
本发明还要求保护所述突变体以及所述突变体得到的延胡索酸在食品、饲料、化工、药物制备等方面的应用。
本发明的突变体命名：是以SEQ ID NO.1所示氨基酸序列为基准，采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。比如P474N代表将位置474的氨基酸由亲本的脯氨酸(Pro，P)替换为天冬酰胺(Asn，N)。
本发明的有益效果：(1)对米根霉的丙酮酸羧化酶的P474位点进行饱和突变，得到了比酶活提高的丙酮酸羧化酶突变体P474N，其比酶活较亲本提高了12.8％；(2)构建了过表达丙酮酸羧化酶突变体的酿酒酵母，能够有效提高二元羧酸的产量，为高效生产延胡索酸及其它二元羧酸创造了条件，具有很好的工业应用价值和前景；在丙酮酸脱羧酶PDC1、乙醇脱氢酶ADH1和延胡索酸酶FUM1同时缺失的酵母菌的延胡索酸产量提高了13.3％；(3)通过在发酵过程中添加生物素，可使延胡索酸产量达到357mg/L。
附图说明
图1：RoPYC-GFP蛋白定位观察；
图2：丙酮酸羧化酶突变菌株的富马酸产量对比图；
图3：RoPYC P474位点定点突变对丙酮酸羧化酶活性的影响；
图4：不同浓度生物素添加对表达P474N的工程菌的延胡索酸积累的影响。
具体实施方式
乙醇、残糖含量及延胡索酸的测定方法：采用高效液相色谱仪(HPLC)检测。发酵液经处理且上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，利用RID(示差折光检测器)检测乙醇和残糖含量，利用VWD(紫外检测器)检测延胡索酸含量，液相色谱方法如下：高效液相色谱仪为美国Waters公司产品，型号为1515，色谱柱为Aminex HPX-87H column(Bio-Rad)。柱温：35℃；流动相：0.0275％(v/v)稀硫酸，经0.22μm滤膜过滤并除气；流速：0.6mL/min；检测时间：25min；进样量：20μL。
生物量的测定方法(Bio-Rid核酸仪)：用0.1M HCl稀释适当的倍数，设定波长为600nm，取200μL测定其吸光值。
种子培养基：葡萄糖2％，酵母提取物1％，蛋白胨2％，去离子水容，pH自然，高压灭菌(115℃，20min)。
发酵培养基：无氨基酵母氮源3.4g/L,硫酸铵5g/L,葡萄糖40g/L，按要求分别添加亮氨酸100mg/L、色氨酸20mg/L、组氨酸20mg/L、尿嘧啶20mg/L，添加碳酸钙5g/L，装液量为40mL/250mL。可添加0-128μg/L的生物素。
酵母转化方法(质粒)：(1)在3mLYPD液体培养基中接入平板活化的酿酒酵母单菌落，30℃、220rpm培养过夜；(2)倒满EP管菌液，在4000rpm条件下进行室温1min离心；(3)适量无菌水水洗，在4000rpm条件下进行室温1min离心；(4)依次加入1.0M LiAc 36μL，10mg/mL ssDNA 10μL(ssDNA提前沸水浴5min，冰上放置5min)，质粒500ng，50％PEG240μL，温和混匀；(5)42℃热激30分钟；(6)在4000rpm条件下进行室温1min离心，加1mL无菌水水洗；(7)4000rpm离心1min，留适量水吹吸细胞，涂布选择性平板，30℃培养3-5d。
实施例1：突变位点的选择
如何通过定点突变技术来提高丙酮酸羧化酶的活性，难点在于突变位点的确定。
本发明将来源于假单胞菌、芽孢杆菌、根瘤菌、分支杆菌、葡萄球菌、古细菌以及真核细胞等不同种属的丙酮酸羧化酶进行氨基酸序列比对，最终选择对RoPYC的P474进行19个饱和突变，并将突变菌株进行发酵实验考察突变对延胡索酸积累的影响。
实施例2：RoPYC在酿酒酵母中的定位研究
1、TEF1promoter和RoPYC基因ORF克隆到pGFP33载体
按照同源重组试剂盒原理，设计两端带有15个碱基以上与载体同源的引物，如表1，小写字母为同源臂，大写字母为PCR引物。
表1扩增RoPYC基因的引物
以pY15TEF1-RoPYC为模板(Xu et al.Fumaric acid production inSaccharomyces cerevisiae by in silico aided metabolic engineering,2012)，RoPYC-F、RoPYC-R(序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示)为引物扩增出TEF1p以及RoPYC的ORF框(得到的PCR产物含有氨基酸序列SEQ ID NO.1的序列)，将扩增产物连接到pGFP33载体，转化大肠感受态细胞，涂布添加有氨苄青霉素的LB平板。菌落PCR验证长出的转化子以及提质粒酶切验证，将正确的转化子进行保菌并测序，质粒名称命名为pGFP33-RoPYC。
2、RoPYC在酿酒酵母中的表达
构建三基因缺失菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C△PDC1△ADH1△FUM1(构建方法可参考中国专利201410340560.1)，将上述构建的重组质粒pGFP33-RoPYC转化到三基因缺失菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C△PDC1△ADH1△FUM1，转化方法见具体实施方式，以期在该菌中过表达氨基酸序列为SEQ ID NO.1的RoPYC，进而研究其定位。
3、RoPYC定位研究
从SD-Ura平板上取活化的基因工程菌菌落接种于3mL SD-Ura液体培养基中，30℃，220rpm培养过夜。取菌液500μL接入新的4.5mL SD-Ura液体培养基中。培养4h，使细胞处于对数生长期。取1mL菌液倒入1.5mL EP管中，加入1μL DAPI染液，充分混匀，冰上避光染色10min。4000rpm离心1min，弃掉部分上清。取适量细胞制片，滴上松柏油，用Nikon80i荧光显微镜观察。放大100倍，增益值为2.0，曝光时间1s，进行荧光检测，拍下DIC和绿色荧光、蓝色荧光激发下的照片。每个菌株随机选取3个转化子，用荧光显微镜100×物镜观察DIC视野、绿光及蓝光下的细胞形态，结果如图1所示，结果表明该酶定位在酿酒酵母细胞的胞质中。
实施例3：RoPYC定点突变及表达
用PCR方法进行定点突变，对RoPYC的P474位点进行饱和突变，将第474位点的脯氨酸突变成其他19个氨基酸。以pY15TEF1-RoPYC质粒为模板、含有突变位点的F和R为引物、Takara公司高保真酶PrimeSTAR GXL进行PCR扩增出整个质粒。酶切体系包含1μL PCR产物以及1μLDpn I酶，总体积20μL，37℃酶切过夜。酶切产物进行片段纯化。取纯化产物5μL转化30μL感受态细胞Trans1-T1，涂布LA平板，长出的转化子接种LA培养基，提质粒送去上海生工测序。
其中，用于P474N突变的引物F(Asn)、R(Asn)(序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6所示)，如表2所示。
表2定点突变引物
注：斜体加下划线的为突变碱基，它们对应的氨基酸在右侧。
选择测序正确的质粒，转化到在三基因缺失菌株Saccharomyces cerevisiaeCEN.PK2-1C△PDC1△ADH1△FUM1中过表达相应的突变体，得到了一系列基因工程菌。将基因工程菌菌株，在同条件下，进行了发酵实验，比较了来源于米根霉中PYC的P474位点的氨基酸饱和突变对酿酒酵母产延胡索酸的影响，结果如图2所示，结果显示发酵生产延胡索酸的产量可达200mg/L以上，其中表达P474N的工程菌产量达到了285±5.7mg/L，比表达亲本RoPYC的工程菌的252±17.0mg/L提高了13.3％。
实施例4：突变体P474N的表达及延胡索酸的生产
比较了丙酮酸羧化酶突变体P474N及亲本酶的比酶活，以及不同浓度生物素添加对表达P474N的基因工程菌的延胡索酸积累的影响，结果如图3和图4所示。
培养条件：将30℃、220rpm下培养24h的基因工程菌种子以5％的接种量转入发酵培养基于30℃、220rpm条件下培养96h。
由图3可以看出，突变体P474N的酶活增加，分别比亲本增加了12.8％。
由图4可以看出，添加生物素有利于延胡索酸的积累，添加64μg/L的生物素，延胡索酸产量达到357mg/L，较不添加生物素时(256.7±3.0mg/L)提高了37％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种丙酮酸羧化酶突变体，其特征在于，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的米根霉丙酮酸羧化酶的基础上，对第474位的氨基酸进行了突变，所述突变体是将第474位的脯氨酸突变成为天冬酰胺。
2.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。
3.权利要求1所述突变体在有机酸生产方面的应用。
4.一种利用权利要求1所述突变体促进延胡索酸积累的方法，其特征在于，所述方法是在丙酮酸脱羧酶PDC1、乙醇脱氢酶ADH1和延胡索酸酶FUM1同时缺失的酵母菌中，过表达如权利要求1所述的丙酮酸羧化酶突变体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述丙酮酸脱羧酶基因PDC1的核苷酸序列如Gene ID:850733所示，乙醇脱氢酶基因ADH1的核苷酸序列如Gene ID:854068所示，延胡索酸酶基因FUM1的核苷酸序列如Gene ID:855866所示。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在发酵培养过程中添加生物素。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法是：将过表达丙酮酸羧化酶突变体的三基因缺失菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C△PDC1△ADH1△FUM1的种子液，接种至发酵培养基，与28-32℃、150-250rpm条件下进行培养；所述发酵培养基中含有0-128μg/L的生物素。
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