CN114540395A - 希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法，采用biobrick的构建策略，利用同尾酶SpeI与XbaI，处理后产生相同的粘性末端，在T4连接酶的作用将木糖转运蛋白基因和木糖Weimberg代谢路径相关基因构建于同一个重组质粒表达载体上，将重组质粒通过转化、接合转移的方式导入到两种宿主菌MR‑1和S114中获得重组希瓦氏工程菌株S129和S135的构建方法。有氧生长发酵60h后到达生长平台期，S135和S129生物量分别是WT的21.03倍、12.94倍；培养基中的木糖利用率为S135在48h后消耗木糖约47.69％，S129在96h后消耗木糖约45.03％。

Description

希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法
技术领域
本发明属于基因工程和生物代谢技术领域，更具体的说是设计重组质粒以改造希瓦氏菌的代谢通路，使其以木糖底物为唯一碳源进行生长代谢。
背景技术
基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，使外源基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
希瓦氏菌属是一种兼性厌氧菌，遗传背景清楚，且易于操作。模式产电微生物-奥达奈希瓦氏菌(Shewanella oneidensis MR-1，简称MR-1，ATCC编号：700550)是希瓦氏菌属中在基因组序列注释和遗传特性方面研究最广泛的菌株。该菌株能够在不添加外源媒介的情况下，将氧化还原反应过程中产生的电子转移到微生物燃料电池(Microbial FuelCell，简称MFC)中的阳极，成为研究微生物如何在MFC中产生电流的模式生物之一。希瓦氏菌一般以乳酸为底物进行生长代谢，不能利用木糖、葡萄糖等储量更为丰富、分布更为广泛的糖类，这限制了希瓦氏菌的底物利用范围和胞外电子传递效率。
木糖(Xylose)(化学式C5H10O5)，别称：五碳醛糖。是木聚糖的一个组分，木聚糖广泛存在于植物中，一般可由木屑、稻草、玉米芯等富含半纤维素的植物经水解而得的一种五碳糖，储量丰，也存在于动物肝素、软骨素和糖蛋白中，它是某些糖蛋白中糖链与丝氨酸(或苏氨酸)的连接单位。白色细小结晶或粉末，易溶于热乙醇和嘧啶，可溶于水。木糖与葡萄糖的化学性质相似，可以还原为相应的醇，主要用于制取木糖醇，作为底物发酵生产生物乙醇，在食品加工、制药工业也有广泛应用，可用于染色和制革，由于人体无法消化，不能利用，也被用作无热量甜味剂。能够利用木糖的微生物体内一般包含4种木糖代谢路径：木糖氧化还原酶路径、木糖异构酶路径、Weimberg路径和Dahms路径等，此外，还有两条近期在大肠杆菌中建立的木糖-1-磷酸酯(Xylulose-1-phosphate，X-1-P)及核糖-1-磷酸酯(Ribulose-1-phosphate，R-1-P)途径。
其中，作为原核和真核生物中代谢利用木糖能力比较强的菌株Escherichia coli(简称，E.coli)和Schefersomyces stipites(简称，S.stipites)，分别利用木糖异构酶路径和木糖氧化还原酶路径代谢木糖。在大肠杆菌的木糖异构酶路径中，木糖首先被基因xylA编码的木糖异构酶(xylose isomerase，XI)转化为木酮糖，随后被基因xylB编码的木酮糖激酶(xylulokinase，XK)磷酸化，产生5-磷酸木酮糖进入磷酸戊糖路径进一步代谢。类似于木糖异构酶路径，在S.stipites的木糖氧化还原酶路径中，木糖先被基因XYL1编码的NAD(P)H-依赖的木糖还原酶(xylose reductase，XR)转化为木糖醇，进一步在XYL2编码的木糖醇脱氢酶作用下转化为木酮糖，随后木酮糖在基因XKS1编码的木酮糖激酶的催化下生成5-磷酸木酮糖，进入磷酸戊糖路径代谢。木糖氧化还原路径及异构酶路径在生物乙醇的制备具有非常高的应用价值，是发酵工程利用木糖或木糖-葡萄糖混糖制备生物乙醇的重要研究方法之一。
来自于新月丙杆菌(Caulobacter crescentus，简称Cc)的Weimberg木糖代谢路径(见图2)中D-木糖在五个酶促步骤中被氧化成三羧酸(TCA)循环中间体α-酮戊二酸。首先，D-木糖在XylB(来自Cc)基因编码的D-木糖脱氢酶(D-xylose dehydrogenase，XDH)的作用下被氧化生成D-木糖-γ-内酯，然后在XlyC(来自Cc)基因编码的D-木糖-γ-内酯内酯酶(xylonolactonase，XLA)的催化下进一步转化为中间体D-木糖酸盐，D-木糖酸盐通过D-木糖酸脱水酶(D-xylonate dehydratase，XAD，由XylD(来自Cc)编码)和2-酮-3-脱氧-d-木糖酸脱水酶(KDX dehydratase，KDXD，由XylX(来自Cc)编码)进行两次脱水反应，产生2-酮-3-脱氧-d-木糖酸(2-keto-3-deoxy-D-xylonate，KDX)，然后产生α-酮戊二酸半醛(α-ketoglutarate semialdehyde，KGSA)。在最后一步，半醛被α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KGSAdehydrogenase，KGSADH，由XylA(来自Cc)编码)以NAD(P)+依赖的方式被氧化成α-酮戊二酸进入三羧酸循环，参与代谢。
相比于前两种路径，Weimberg木糖代谢路径反应步骤的放热过程具有较大的热力学吉布斯自由能差值，使得反应更容易自发进行，同时终产物α-酮戊二酸可以直接进入三羧酸循环，可以绕开磷酸戊糖途径，代谢流程相对较短，代谢过程不产生二氧化碳，没有碳损失。因此，本发明选择木糖Weimberg代谢路径作为重组希瓦氏工程菌株木糖代谢利用模块的路径。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明提出如下技术方案：
一种希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法，采用biobrick的构建策略，利用同尾酶SpeI与XbaI，处理后产生相同的粘性末端，在T4连接酶的作用将木糖转运蛋白基因和木糖Weimberg代谢路径相关基因构建于同一个重组质粒表达载体上，将重组质粒通过转化、接合转移的方式导入到两种宿主菌Shewanella oneidensis MR-1和S114中获得重组希瓦氏工程菌株S129和S135的构建方法。
所述重组工程菌株构建方法，利用同尾酶SpeI酶切位点为ctag。
所述重组工程菌株构建方法XbaI酶切位点为ctag。
所述重组工程菌株构建方法，T4连接酶的作用下将分别来自中间假丝酵母的木糖转运蛋白的基因gxf1(SEQ ID NO.5)和来自新月丙杆菌的木糖Weimberg代谢路径相关基因xylB(SEQ ID NO.6)，xylC(SEQ ID NO.7)，xylD(SEQ ID NO.8)，xylX(SEQ ID NO.9)，xylA(SEQ ID NO.10)，经过密码子优化后，按照如下顺序：gxf1-xylB-xylC-xylD-xylX-xylA逐个连接到基础质粒PYYDT(SEQ ID NO.1)上,然后通过PYYDT上tac启动子(SEQ ID NO.2)和T1终止子(SEQ ID NO.3)表达，得到重组质粒(SEQ ID NO.11)。
所述重组工程菌株构建方法，重组质粒扩增菌株为Escherichia coli DAP营养缺陷型菌株。
所述重组工程菌株构建方法，重组质粒导入扩增菌株E.coli WM3064的转化方法采用常规的物理转化法，然后通过将携带重组质粒的E.coli WM3064与宿主菌MR-1和S114进行接合转移，最终将合成后的重组质粒转移到MR-1和S114中，分别得到目标工程菌S129和S135。
利用摇床摇瓶培养，分光光度计，高效液相色谱仪(HPLC)，典型双室微生物燃料电池，电化学工作站进行实验验证构建菌株利用木糖代谢利用生长情况及MFC产电效果。
本发明为了克服天然野生希瓦氏菌MR-1不能够利用木糖生长和产电的限制，采用biobrick的构建策略，通过异源表达技术，结合基因工程等手段，将木糖转运蛋白基因和Weimberg代谢路径关键基因引入MR-1中构建重组希瓦氏工程菌，获得的重组希瓦氏工程菌株S129和S135；能利用含有木糖唯一碳源的改良后M9液体培养基进行生长代谢并产电，从而达到拓宽希瓦氏菌的底物利用谱目的，同时开辟了木糖资源化利用的新用途。
本发明构建1种重组质粒(SEQ ID NO.11)，以MR-1和S114(在MR-1基因组水平敲除转录抑制因子基因NagR SEQ ID NO.4)为底盘宿主菌，将重组质粒分别导入MR-1及S114中，重构希瓦氏菌的代谢通路，克服野生型希瓦氏菌不能利用木糖生长代谢的限制，使其能够以木糖为唯一碳源进行生长代谢并产电，从而拓宽希瓦氏的底物利用谱，提高木糖的资源化利用效率及应用范围。
以PYYDT(SEQ ID NO.1，见图1)为基础质粒构建1种重组质粒(SEQ ID NO.11)，在基础质粒上包括tac启动子(SEQ ID NO.2)、T1终止子(SEQ ID NO.3)，通过酶切连接方式依次将目的基因连接到包含tac启动子和T1终止子的基础质粒PYYDT(见图3)，分别包括：重组质粒：PYYDT-gxf1-xylB-xylC-xylD-xylX-xylA(SEQ ID NO.11)，获得2种工程菌株为：
S129：PYYDT-gxf1-xylB-xylC-xylD-xylX-xylA(in MR-1)
S135：PYYDT-gxf1-xylB-xylC-xylD-xylX-xylA(in S114)
木糖转运蛋白基因及Weimberg代谢路径关键基因：
NagR:来自枯草芽孢杆菌的转录抑制因子基因(Gene ID：64305260，SEQ ID NO.4)
gxf1：来自中间假丝酵母的木糖转运蛋白的基因(GenBank ID：AJ937350.1，SEQID NO.5)
xylB：来自新月丙杆菌的D-木糖脱氢酶基因(GenBank ID：MG681087.1，SEQ IDNO.6)
xylC：来自新月丙杆菌的D-木糖-γ-内酯内酯酶基因(GenBank ID：MG681088.1，SEQ ID NO.7)
xylD：来自新月丙杆菌的D-木糖酸脱水酶基因(GenBank ID：MG681089.1，SEQ IDNO.8)
xylX：来自新月丙杆菌的2-酮-3-脱氧-d-木糖酸脱水酶基因(GenBank ID：MG681090.1，SEQ ID NO.9)
xylA：来自新月丙杆菌的α-酮戊二酸半醛脱氢酶基因(GenBank ID：MG681091.1，SEQ ID NO.10)
具体说明如下：
步骤一：重组质粒的设计与合成：基础质粒为PYYDT(SEQ ID NO.1)，其上包含tac启动子(SEQ ID NO.2)和T1终止子(SEQ ID NO.3)，将本发明所述目的基因gxf1、xylB、xylC、xylD、xylX、xylA经密码子优化后，通过tac启动子和T1终止子表达，采用biobrick的构建策略，将使用Snapgene设计好的重组质粒，送公司进行核苷酸序列合成，利用同尾酶SpeI(酶切位点：ctag)与XbaI(酶切位点：ctag)，处理后留下相同的粘性末端，在T4连接酶的作用下将所需要的外源基因逐个连接到基础质粒上，并且保证已连接的外源基因不受后续内切酶的影响。在这两个启动子之间连接不同的基因，由此构建重组质粒，从而发挥不同的功能，合成重组质粒(SEQ ID NO.11)；
步骤二：重组大肠杆菌E.coli WM3064和重组希瓦氏菌株的构建：选取Escherichia coli DAP营养缺陷型菌株(简称E.coli WM3064，NTCC编号：690048)为重组质粒扩增的工程菌用于质粒复制或连接实验，DAP：2，6-二氨基庚二酸)；选取MR-1及S114为最终宿主菌，将重组质粒(SEQ ID NO.11)转化进入E.coli WM3064菌株的转化方法采用本领域常规的物理转化法；然后，利用接合转移技术将E.coli WM3064菌株携带的重组质粒(SEQID NO.11)转移到MR-1和S114中，得到构建的目的工程菌。导入基础质粒(PYYDT，SEQ IDNO.1)的野生型菌株命名为WT作为空白对照，导入重组质粒到MR-1和S114两种宿主菌的工程菌株分别命名为：S129和S135。
步骤三：进行菌落PCR验证实验：琼脂糖凝胶电泳结果表明，阳性克隆存在，证明目的基因在宿主菌中成功扩增，工程菌株中重组质粒的成功导入和扩增(见图6)；
步骤四：有氧摇瓶培养发酵及残糖测定实验验证：四株重组希瓦氏工程菌WT，S114，S129，S135在含有浓度为150mM木糖溶液的改良后M9培养液中摇瓶发酵，每隔6h(后期每隔12h)在超净工作台中取发酵液利用紫外分光光度计测定各菌株的OD600并记录用于绘制工程菌株生长曲线，高效液相液相色谱仪(HPLC)测定每个时间点样品中木糖含量用于绘制木糖消耗曲线，数据表明：生长发酵60h后到达生长平台期，S135生物量(OD600＝2.103)是WT(OD600＝0.100)的21.03倍，培养基中的木糖在48h后消耗约47.69％；S129生物量(OD600＝1.294)是WT(OD600＝0.100)的12.94倍，发酵96h后培养基中木糖消耗了约45.03％(见图4)；
步骤四：工程菌MFC产电实验验证，四株重组希瓦氏工程菌WT，S114，S129，S135在含有浓度为150mM木糖溶液作为唯一碳源的改良后M9培养液上电池验证其产电能力，数据表明：电压稳定后，输出电压和功率密度最高的菌株为S135：输出电压(25.59mV)是WT(10.84mV)的2.36倍，功率密度(34.0137mW/m2)是WT功率密度(3.8263mW/m2)的8.89倍；菌株S129：输出电压(24.18mV)是WT(10.84mV)的2.23倍，功率密度(20.1615mW/m2)是WT功率密度(3.8263mW/m2)的5.27倍(见图5)。
应用领域：在上述构建方法中，本发明通过该重组质粒表达所实现的技术效果构建成功的重组希瓦氏工程菌S129和S135，能够克服野生型MR-1不能够利用木糖生长代谢并产电的限制，希瓦氏菌株能够以木糖唯一碳源进行生长代谢，从而拓宽希瓦氏的底物利用谱，同时提高木糖的资源化利用率并扩展了其应用范围,也可以应用于生产或生活过程中，以纤维素为原料的水解液中木糖成分的利用和产电相关领域。
附图说明
图1所示为PYYDT质粒图谱,包括质粒表达载体中启动子、终止子等关键组件及名称；
图2所示为本发明构建的工程希瓦氏菌木糖设计原理图；
图3所示为本发明重组质粒构建示意图；
图4所示为本发明工程菌株在有氧条件下，以加入150mM木糖为唯一碳源的改良后M9液体培养基中生长曲线及糖消耗曲线：生长曲线为深色，糖耗曲线为浅色,表明改造后的工程菌株都可利用木糖作为唯一碳源生长，且S135木糖利用能力更强，生长效果更佳，而转入基础质粒PYYDT的对照组菌株则不能利用木糖为唯一碳源生长；
图5所示为本发明工程菌株工程菌株以加入150mM木糖为唯一碳源的改良后M9液体培养基MFC产电效果：左图为微生物燃料电池输出电压效果图，右图为微生物燃料电池功率密度和电流密度效果图颜色由深至浅依次表示：WT，S114，S129，S135，结果表明工程菌株S129和S135均具有利用木糖为唯一碳源产电能力，且S135产电效果更为优异，而导入基础质粒PYYDT的对照组菌株则没有表现出利用木糖作为碳源产电的优势；
图6所示为工程菌菌落PCR验证图：M为MAKER，泳道1，2，3，4为WT，基础质粒验证标志基因为LacI(1083bp)；5和6为S129，7和8为S135，重组质粒验证标志目的基因选择xylX(1155bp)。
具体实施方式
本发明中设计的质粒是本实验室设计，菌株可市售获得。在全合成的本发明所需要的各外源基因过程中，需要将其连接到质粒载体上表达和保存。下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：重组质粒的构建(SEQ ID NO.11)
步骤一：合成tac启动子序列(SEQ ID NO.2)，合成并优化上述能够促进希瓦氏摄取木糖代谢利用的的基因序列gxf1-xylB-xylC-xylD-xylX-xylA(gxf1基因来自中间假丝酵母，其余基因均来源于新月丙杆菌的木糖Weimberg代谢路径)。
步骤二：在这些目的基因的5’端添加XbaI酶切位点(ctag)，3’端添加SbfI酶切位点(tgca)。然后分别将这六个基因通过XbaI和SbfI酶切后，连入添加有SpeI酶(酶切位点：ctag)的PYYDT质粒中，得到过渡质粒：PYYDT-gxf1质粒、PYYDT-xylB质粒、PYYDT-xylC质粒、PYYDT-xylD质粒、PYYDT-xylX质粒、PYYDT-xylA质粒。
步骤三：分别将PYYDT-xylB质粒、PYYDT-xylC质粒、PYYDT-xylD质粒、PYYDT-xylX质粒、PYYDT-xylA质粒通过XbaI和SbfI酶切后，获得目的基因：xylB(SEQ ID NO.6)，xylC(SEQ ID NO.7)，xylD(SEQ ID NO.8)，xylX(SEQ ID NO.9)，xylA(SEQ ID NO.10)。
步骤四：先将xylB基因与进行SpeI酶和SbfI酶切的PYYDT-gxf1质粒用T4连接酶连接，获得对应的PYYDT-gxf1-xylB质粒，然后再将xylC基因与进行SpeI酶和SbfI酶切的PYYDT-gxf1-xylB质粒用T4连接酶连接获得PYYDT-gxf1-xylB-xylC质粒，随后再将xylD基因与进行SpeI酶和SbfI酶切的PYYDT-gxf1-xylB-xylC质粒用T4连接酶连接获得PYYDT-gxf1-xylB-xylC-xylD，之后再将xylX基因与进行SpeI酶和SbfI酶切的PYYDT-gxf1-xylB-xylC-xylD质粒用T4连接酶连接获得PYYDT-gxf1-xylB-xylC-xylD-xylX质粒，最后再将xylA基因与进行SpeI酶和SbfI酶切的PYYDT-gxf1-xylB-xylC-xylD-xylX质粒用T4连接酶连接获得PYYDT-gxf1-xylB-xylC-xylD-xylX-xylA(SEQ ID NO.11)。
上述构建的质粒转化入大肠杆菌感受态E.coli WM3064中，菌落PCR筛选，提质粒进行单双酶切验证以及测序验证，以保证目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
实施例2：重组大肠杆菌E.coli WM3064和重组希瓦氏菌株的构建
步骤一：转化：将上述得到的重组质粒通过物理转化法导入E.coli WM3064中，转化后采用LB+DAP+Kana平板(5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl、0.059g/L 2，6-二氨基庚二酸、50μg/L卡那霉素、15g/L琼脂粉)进行筛选，在平板上挑出单菌落后，接种到LB+DAP+K液体培养基(5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/LNaCl、0.059g/L 2，6-二氨基庚二酸、50μg/L卡那霉素)进行培养，甘油管保菌(500μL菌液，500μL甘油)
步骤二：接合转移：将转化后的各重组大肠杆菌E.coli WM3064分别接种到3mL液体培养基LB+DAP+Kana(5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl、0.059g/L 2，6-二氨基庚二酸、50μg/L卡那霉素)中培养，37℃，220rpm 10-12h；将MR-1或S114宿主菌株接种到3mL液体LB培养基(5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl)中培养，30℃，200rpm10-12h。
步骤三：将得到的重组大肠杆菌E.coli WM3064各种子液和MR-1、S114等宿主菌株种子液各取500μL混合到一个1.5mL无菌EP管中，5000rpm下离心10min，倒掉上清液。用1mLLB+DAP(5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl、0.059g/L 2，6-二氨基庚二酸)重悬，在30℃下静置2h。静置完成后5000rpm离心10min，倒掉上清液，用500μL LB液体(5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl)重悬，取50μL接种于LB+Kana固体平板上(5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl、0.059g/L 2，6-二氨基庚二酸、15g/L琼脂粉)30℃培养箱中培养12小时以上，得到重组希瓦氏工程菌。
步骤四：菌落PCR进行验证：接合转移涂板的菌长出明显单菌落(直径大约0.5-1mm)后，准备菌落PCR，需要准备LB+Kana平板，并画好格子做好标记。配制PCR体系，分装入96孔PCR板，可以比实际需要的多配2-5个体系，防止因枪头沾有溶液造成损失。准备足量的灭菌牙签。在超净台，一根牙签挑取一个单菌落，放入一个体系的孔中；挑完后，每根牙签在新平板-对应的格中划线接种，丢弃牙签。全部划完后，96孔PCR板用封板垫严密封口，放入PCR仪，设定参数，开始运行。平板放入30℃恒温培养箱(生长不少于10h，具体看菌落长势，长到一定程度可以用保鲜膜包好放4℃)。
引物设计并合成：
XylX引物：
上游引物：5’-ATGGGTGTTTCTGAATTCTTACC-3’
下游引物：5’-TTATAATAAACCACGACCAGCT-3’
LacI引物：
上游引物：5’-GTGAAACCAGTAACGTTATACG-3’
下游引物：5’-TCACTGCCCGCTTTCCA-3’
PCR反应体系配置(trans fast Taq)：ddH20 8μL；上、下游引物各1μL；Taq酶mix:10μL；一个反应体系共20μL。
PCR条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸X s(1kb需30s，只能时间富裕不能不足)，30cycles，最后72℃再延伸7min，4℃保温。
然后配好琼脂糖凝胶(1％)，等待凝固后用于DNA电泳鉴定。
大胶(100mL)：1XTAE缓冲液100mL，琼脂糖1.0g，适当冷却后加核酸染料8μL，摇匀倒入放好透明垫和梳子的槽。中胶50mL，小胶25mL，按比例加。
PCR结束后，加DNA loading buffer，点样，每孔各10μL，电泳10-15min。
观察有无目的条带并记录对应编号(见图6)。
将验证成功的重组希瓦氏工程菌保菌备用。
导入基础质粒(PYYDT，SEQ ID NO.1)的野生型菌株命名为WT，向MR-1和S114两种宿主菌中导入重组质粒后的工程菌株命名为①S129，②S135。
实施例3：四株重组希瓦氏工程菌WT，S114，S129，S135在含有浓度为150mM木糖溶液的改良后M9培养液中摇瓶发酵(有氧)
将所述工程菌WT，S114，S129，S134接种到种子培养基活化培养，然后在发酵瓶中进一步分别进行有氧发酵，并加入适量IPTG诱导表达，每隔6h(后期每隔12h)在超净工作台中取发酵液用于测各菌株的OD600并记录；用HPLC(型号DGU-20A，示差检测器：RID-20A，色谱柱：Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm，9μm)，流动相：5mM H2SO4，流速0.3mL/min，柱温：65℃，进样量20μL)检测每次取样发酵液中的残糖含量，并选取导入基础质粒(PYYDT SEQ IDNO.1)的野生型菌株WT和S114作为对照，每株菌做三组平行实验(见图4)。
木糖代谢生长曲线及残糖测定：
步骤一：菌种活化：取经过高压蒸汽灭菌的10mL EP管若干，在超净工作台分别加入3mL LB+Kana的液体培养基，从长有目的菌株的固体培养基平板上挑取单菌落，接菌，30℃，200rpm/min，培养10-12h。
步骤二：摇瓶发酵：测定活化后菌液OD600，并将各菌株调至同一生长状态，按1％接种至含有20mL 5×M9+50mL 300mM的Xylose溶液+100μLKana+50μL IPTG，用无菌水补齐至100mL，将配置好的液体培养基在无菌操作台中装入250mL三角瓶中，30℃，200rpm/min进行发酵培养。
步骤三：测定0-96h发酵液的OD600，记录数据，并每组留1mL发酵样液离心取上清过液相测残糖(预处理方法：12000rpm，离心15min，过0.22μm水系滤膜)。
步骤四：使用高效液相色谱分析预处理完毕的预留的每个时间节点的培养液中残余糖含量。
实例4：四株重组希瓦氏工程菌WT，S114，S129，S135在含有浓度为150mM木糖溶液作为唯一碳源的改良后M9培养液上电池验证其产电能力：
步骤一：一级种子菌液：在无菌超净台中分别挑取四株重组希瓦氏工程菌WT，S114，S129，S135接菌于装有3mL LB+Kana液体培养基的10mL离心管中，30℃，200rpm，摇床培养10-12h。
步骤二：二级种子菌液：分别取装有100mL LB液体培养基的250mL锥形瓶，将四种重组希瓦氏工程菌一级菌液分别取出1mL菌液按1％接种至4个同样的锥形瓶中(若菌液不足，可每个菌株准备两瓶该种锥形瓶，制备200mL二级菌液即可)、每瓶加入50μl IPTG(1：2000)、加入100μl Kana(1：1000)，30℃，200rpm，摇床培养10-12h。
步骤三：电池装置及试剂准备：
(1)电池装置：电池瓶身、盖子、垫圈*2、夹子、碳布、塞子(这7个需要高温高压灭菌:121℃，20min)、质子交换膜(通过1M HCl溶液浸泡，及超净台中紫外灯照射过夜灭菌，在超净台中组装)、电阻等(电池为100mL玻璃材质典型双室微生物燃料电池)
(2)试剂准备：阴极液、阳极液、5*M9、ddH2O、300mM木糖溶液等
1.碳布处理：阳极1×1cm，阴极2.5×3cm，用1M HCl浸泡8-12h，离子水冲洗三遍，使用丙酮浸泡过夜，ddH2O冲洗，在烘箱中烘干。
2.质子交换膜:用1M HCl浸泡8-12h，紫外灯灭菌过夜，ddH2O冲洗三遍
3.阳极液(1L):200mL 5*M9、500mL 300mM木糖溶液、1mL 1M MgSO4·7H2O、1mL0.1MCaCl2、1mL 4M NaOH、IPTG(1:2000)、Kana(1:1000)，用ddH2O补齐至1L。
4.阴极液(1L):16.45g K[Fe(CN)3]、6.8g KH2PO3、11.4g K2HPO3
5.1M HCl溶液(1L)：83mL 37％HCl溶液定容至1L，室温储存。(放置于通风橱中)
6.1M乳酸钠溶液(100mL)：18.68g 60％乳酸钠溶液，ddH20定容至100mL，灭菌后降至室温，至于4℃冰箱存储。
7.1M MgSO4溶液(100mL)：24.65g MgSO4·7H2O，ddH20定容至100mL，灭菌后降至室温，至于4℃冰箱存储。
8、0.1M CaCl2溶液(100mL)：1.109g CaCl2，ddH20定容至100mL，灭菌后降至室温，至于4℃冰箱存储。
9.5×M9母液(1L)：2.5g NaCl、5g NH4Cl、15g KH2PO4、30g Na2HPO4，灭菌。
10.4M NaOH溶液(100mL)：16g NaOH固体溶解，并定容至100mL，0.22μm滤膜除菌。
11.卡那霉素母液(50mg/mL)：0.5g Kana粉末，ddH2O定容至10mL，用0.22μm滤膜除菌，分装为1mL/管，-20℃保存。
12.IPTG母液(1M)：1.9064g IPTG、ddH2O定容至8mL，用0.22μm滤膜除菌，分装为100μL/管和200μL/管，-20℃保存。
上述实验中，配制300mM的木糖溶液足量，在高温高压灭菌锅中115℃，灭菌15min，4℃保存待用；配制5×M9溶液足量，经过高压蒸汽灭菌(121℃，20min)，冷却后4℃保存待用。
步骤四：微生物电池组装完毕后，放入辰华CHI1000C电化学工作站的30℃培养箱中运行，连接好数据采集卡进行电压数据采集。等待电池启动，待电压稳定后进行LSV曲线扫描，获得数据从而计算电池功率密度(见图5)。
本发明的有益效果是：
利用异源表达技术，结合基因工程等手段，构建1种重组质粒(SEQ ID NO.11)，将木糖摄取进入细胞并利代谢的关键基因:gxf1(SEQ ID NO.5)，xylB(SEQ ID NO.6)，xylC(SEQ ID NO.7)，xylD(SEQ ID NO.8)，xylX(SEQ ID NO.9)，xylA(SEQ ID NO.10)引入MR-1及S114中，重构MR-1的代谢通路，使工程希瓦氏能够在以木糖为唯一碳源的改良后M9液体培养基中进行生长代谢，从而拓宽希瓦氏菌底物利用谱。将改造菌株进行有氧发酵，并分别测定其在150mM木糖为唯一碳源的改良M9液体培养基中的生长曲线及残糖量。数据显示，有氧发酵过程中，导入基础质粒PYYDT(SEQ ID NO.1)的对照菌株WT及S114几乎不摄取代谢木糖；构建的2株工程菌株：①S129，②S135均能摄取一定量的木糖，其中菌株S135：PYYDT-gxf1-xylB-xylC-xylD-xylX-xylA(in S114)在150mM木糖为唯一碳源的改良M9液体培养基中的有氧发酵生物量相对较高，且摄取利用的木糖量最多。S135有氧发酵60h后到达生长平台期，生物量(OD600＝2.103)是WT(OD600＝0.100)的21.03倍，是S114(OD600＝0.132)的15.93倍，培养基中的木糖在48h后消耗约47.69％(培养基中起始木糖浓度为150mM，即22.5195g/L，发酵48h后剩余木糖浓度为11.78g/L)；S129:PYYDT-gxf1-xylB-xylC-xylD-xylX-xylA(in MR-1)有氧发酵60h后到达生长平台期，生物量(OD600＝1.294)是WT(OD600＝0.100)的12.94倍，是S114(OD600＝0.132)的9.80倍，发酵96h后培养基中木糖消耗了约45.03％(见图4)。
重组工程菌株产电池数据表明：电压稳定后，输出电压和功率密度最高的菌株为S135：输出电压(25.59mV)，是WT(10.84mV)的2.36倍，是S114(11.7mV)的2.19倍，功率密度(34.0137mW/m2)是WT功率密度(3.8263mW/m2)的8.89倍，是S114功率密度(4.9676mW/m2)的6.85倍；菌株S129：输出电压(24.18mV)是WT(10.84mV)的2.23倍，是S114(11.7mV)的2.07倍，功率密度(20.1615mW/m2)是WT功率密度(3.8263mW/m2)的5.27倍，是S114功率密度(4.9676mW/m2)的4.06倍(见图5)。可见：
1、本发明利用异源表达技术，结合基因工程等手段，构建重组质粒(SEQ IDNO.11)，将木糖代谢的关键基因引入MR-1及S114中，得到能较好摄取利用木糖代谢的工程菌株:
S129:PYYDT-gxf1-xylB-xylC-xylD-xylX-xylA(in MR-1)
S135:PYYDT-gxf1-xylB-xylC-xylD-xylX-xylA(in S114)
从而拓宽希瓦氏菌的底物利用谱。
2、本发明拓宽了产电微生物MR-1的底物利用谱，木糖作为木质纤维的水解产物，同时提高了木糖的资源化利用率及应用范围，为微生物燃料电池底物共利用的设计提供了现实依据，有利于提高菌株的胞外电子传递效率。
本发明公开和提出的技术方案，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。本发明未尽事宜属于公知技术。
序列表
<110> 天津大学（青岛）海洋工程研究院有限公司
<120> 希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5885
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacctcgcta acggattcac cgtttttatc aggctctggg aggcagaata aatgatcata 60
tcgtcaatta ttacctccac ggggagagcc tgagcaaact ggcctcaggc atttgagaag 120
cacacggtca cactgcttcc ggtagtcaat aaaccggtca gaatttcaga taaaaaaaat 180
ccttagcttt cgctaaggat gatttctgtg gtacctcgga tcccggggag ctagcacgaa 240
ttcgcggccg cttctagacc gacaccatcg aatggtgcaa aacctttcgc ggtatggcat 300
gatagcgccc ggaagagagt caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg 360
atgtcgcaga gtatgccggt gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca 420
gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca 480
ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca 540
cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg 600
atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta 660
aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc 720
tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc 780
ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc 840
gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc 900
cattaagttc tgtctcggcg cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca 960
atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac 1020
aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc 1080
agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata 1140
tctcggtagt gggatacgac gataccgaag acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca 1200
ccatcaaaca ggattttcgc ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct 1260
ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa 1320
ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc 1380
agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgta 1440
agttagctca ctcattaggc acaattctca tgtttgacag cttatcatcg actgcacggt 1500
gcaccaatgc ttctggcgtc aggcagccat cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt 1560
aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc 1620
gccgacatca taacggttct ggcaaatatt ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcg 1680
gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagccagtcc 1740
gtttaggtgt tttcacgagc acttcaccaa caaggaccat agcatatgcc aggtggtcga 1800
ccactcgagg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt 1860
tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt 1920
gggcctttct gcgtttataa ccggtaaacc agcaatagac ataagcggct atttaacgac 1980
cctgccctga accgacgacc gggtcgaatt tgctttcgaa ccccagagtc ccgctcagaa 2040
gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta 2100
aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc 2160
caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga 2220
aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag 2280
atcctcgccg tcgggcatgc gcgccttgag cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc 2340
ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc 2400
tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg 2460
cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga 2520
caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac 2580
aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc 2640
ctcgtcctgc agttcattca gggcaccgga caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg 2700
cccctgcgct gacagccgga acacggcggc atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca 2760
gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg 2820
ttcaatcatg cgaaacgatc ctcatcctgt ctcttgatca gatcttgatc ccctgcgcca 2880
tcagatcctt ggcggcaaga aagccatcca gtttactttg cagggcttcc caaccttacc 2940
agagggcgcc ccagctggca attccggttc gcttgctgtc cataaaaccg cccagtctag 3000
ctatcgccat gtaagcccac tgcaagctac ctgctttctc tttgcgcttg cgttttccct 3060
tgtccagata gcccagtagc tgacattcat cccaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 3120
cgcccgcgtt cctgctggcg ctgggcctgt ttctggcgct ggacttcccg ctgttccgtc 3180
agcagctttt cgcccacggc cttgatgatc gcggcggcct tggcctgcat atcccgattc 3240
aacggcccca gggcgtccag aacgggcttc aggcgctccc gaaggtctcg ggccgtctct 3300
tgggcttgat cggccttctt gcgcatctca cgcgctcctg cggcggcctg tagggcaggc 3360
tcatacccct gccgaaccgc ttttgtcagc cggtcggcca cggcttccgg cgtctcaacg 3420
cgctttgaga ttcccagctt ttcggccaat ccctgcggtg cataggcgcg tggctcgacc 3480
gcttgcgggc tgatggtgac gtggcccact ggtggccgct ccagggcctc gtagaacgcc 3540
tgaatgcgcg tgtgacgtgc cttgctgccc tcgatgcccc gttgcagccc tagatcggcc 3600
acagcggccg caaacgtggt ctggtcgcgg gtcatctgcg ctttgttgcc gatgaactcc 3660
ttggccgaca gcctgccgtc ctgcgtcagc ggcaccacga acgcggtcat gtgcgggctg 3720
gtttcgtcac ggtggatgct ggccgtcacg atgcgatccg ccccgtactt gtccgccagc 3780
cacttgtgcg ccttctcgaa gaacgccgcc tgctgttctt ggctggccga cttccaccat 3840
tccgggctgg ccgtcatgac gtactcgacc gccaacacag cgtccttgcg ccgcttctct 3900
ggcagcaact cgcgcagtcg gcccatcgct tcatcggtgc tgctggccgc ccagtgctcg 3960
ttctctggcg tcctgctggc gtcagcgttg ggcgtctcgc gctcgcggta ggcgtgcttg 4020
agactggccg ccacgttgcc cattttcgcc agcttcttgc atcgcatgat cgcgtatgcc 4080
gccatgcctg cccctccctt ttggtgtcca accggctcga cgggggcagc gcaaggcggt 4140
gcctccggcg ggccactcaa tgcttgagta tactcactag actttgcttc gcaaagtcgt 4200
gaccgcctac ggcggctgcg gcgccctacg ggcttgctct ccgggcttcg ccctgcgcgg 4260
tcgctgcgct cccttgccag cccgtggata tgtggacgat ggccgcgagc ggccaccggc 4320
tggctcgctt cgctcggccc gtggacaacc ctgctggaca agctgatgga caggctgcgc 4380
ctgcccacga gcttgaccac agggattgcc caccggctac ccagccttcg accacatacc 4440
caccggctcc aactgcgcgg cctgcggcct tgccccatca atttttttaa ttttctctgg 4500
ggaaaagcct ccggcctgcg gcctgcgcgc ttcgcttgcc ggttggacac caagtggaag 4560
gcgggtcaag gctcgcgcag cgaccgcgca gcggcttggc cttgacgcgc ctggaacgac 4620
ccaagcctat gcgagtgggg gcagtcgaag gcgaagcccg cccgcctgcc ccccgagcct 4680
cacggcggcg agtgcggggg ttccaagggg gcagcgccac cttgggcaag gccgaaggcc 4740
gcgcagtcga tcaacaagcc ccggaggggc cactttttgc cggaggggga gccgcgccga 4800
aggcgtgggg gaaccccgca ggggtgccct tctttgggca ccaaagaact agatataggg 4860
cgaaatgcga aagacttaaa aatcaacaac ttaaaaaagg ggggtacgca acagctcatt 4920
gcggcacccc ccgcaatagc tcattgcgta ggttaaagaa aatctgtaat tgactgccac 4980
ttttacgcaa cgcataattg ttgtcgcgct gccgaaaagt tgcagctgat tgcgcatggt 5040
gccgcaaccg tgcggcaccc taccgcatgg agataagcat ggccacgcag tccagagaaa 5100
tcggcattca agccaagaac aagcccggtc actgggtgca aacggaacgc aaagcgcatg 5160
aggcgtgggc cgggcttatt gcgaggaaac ccacggcggc aatgctgctg catcacctcg 5220
tggcgcagat gggccaccag aacgccgtgg tggtcagcca gaagacactt tccaagctca 5280
tcggacgttc tttgcggacg gtccaatacg cagtcaagga cttggtggcc gagcgctgga 5340
tctccgtcgt gaagctcaac ggccccggca ccgtgtcggc ctacgtggtc aatgaccgcg 5400
tggcgtgggg ccagccccgc gaccagttgc gcctgtcggt gttcagtgcc gccgtggtgg 5460
ttgatcacga cgaccaggac gaatcgctgt tggggcatgg cgacctgcgc cgcatcccga 5520
ccctgtatcc gggcgagcag caactaccga ccggccccgg cgaggagccg cccagccagc 5580
ccggcattcc gggcatggaa ccagacctgc cagccttgac cgaaacggag gaatgggaac 5640
ggcgcgggca gcagcgcctg ccgatgcccg atgagccgtg ttttctggac gatggcgagc 5700
cgttggagcc gccgacacgg gtcacgctgc cgcgccggta gcacttgggt tgcgcagcaa 5760
cccgtaagtg cgctgttcca gactatcggc tgtagccgcc tcgccgccct ataccttgtc 5820
tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca cctcgacctg aatggaagcc 5880
ggcgg 5885
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgacaatta atcatcggct cgtataatg 29
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg 60
gtgaacgctc tc 72
<210> 4
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaagatcg ataaacaatc gcctattccg atttattatc agattatgga acaattaaaa 60
gcccaaataa agagcggaga gctgctgccg gatatgcctc ttccctctga gcgtgaatat 120
gccgaacaat ttgggatcag ccggatgacg gttcgccagg ctctttctaa tttagtcaat 180
gaaggctttc tctatcgcct aaaagggcgg ggcacctttg tcagcaagcc aaaaatggaa 240
caagcactcc aagggctgac aagctttacc gaggatatga aaagccgcgg gatgacaccg 300
ggcagcaggc tcattgatta ccagcttatt gattcaacgg aggggctcgc cgctatatta 360
ggttgcaggc acccctcccc tatccataaa atcactcggg tgcgactggc aaatgatatt 420
ccgatggcga tcgaatcctc gcatattccg tttgaacttg cgggtgaatt aaacgaatcg 480
cattttcagt cttcgattta cgagcatatt gaaaggtaca acagtatacc gatttccagt 540
gcaaaacagg agcttgaacc aagcgctgca acagctgaag aagcaagtat tctcggcatt 600
caaaaggggg cgcctgtcct gttaatcaaa cgaacaacat atttacagaa cggaactgct 660
tttgaacacg ccaaatcagt atacagaggc gaccgttata catttgtcca ctatatggat 720
cggctttcat aa 732
<210> 5
<211> 1641
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgtctcaag attctcactc ttctggtgct gctactccag ttaacggttc tatcttagaa 60
aaagaaaaag aagattctcc agttttacaa gttgatgctc cacaaaaagg tttcaaagat 120
tacatcgtta tctctatctt ctgtttcatg gttgctttcg gtggtttcgt tttcggtttc 180
gatactggta ctatctctgg tttcgttaac atgtctgatt ttaaggatag gttcggtcaa 240
caccatgctg atggtactcc atacttatct gatgttcgtg ttggtttaat gatctctatc 300
ttcaacgttg gttgtgctgt tggtggtatc ttcttatgta aagttgctga tgtttggggt 360
cgtcgtatcg gtttaatgtt ctctatggct gtttacgttg ttggtatcat catccaaatc 420
tcttcttcta ctaaatggta ccaattcttc atcggtcgtt taatcgctgg tttagctgtt 480
ggtactgttt ctgttgtttc tccattattc atctctgaag tttctccaaa acaaatccgt 540
ggtactttag tttgttgttt ccaattatgt atcactttag gtatcttctt aggttactgt 600
actacttacg gtactaaaac ttacactgat tctcgtcaat ggcgtatccc attaggttta 660
tgtttcgctt gggctatctt attagttgtt ggtatgttaa acatgccaga atctccacgt 720
tacttagttg aaaaacaccg tatcgatgaa gctaaacgtt ctatcgctcg ttctaacaaa 780
atcccagaag aagatccatt cgtttacact gaagttcaat taatccaagc tggtatcgaa 840
cgtgaagctt tagctggtca agcttcttgg aaagaattaa tcactggtaa accaaaaatc 900
ttccgtcgtg ttatcatggg tatcatgtta caatctttac aacaattaac tggtgataac 960
tacttcttct actacggtac tactatcttc caagcggtag gtctcaaaga ttcttttcaa 1020
acttctatca tcttaggtat cgttaacttc gcttctactt tcgttggtat ctacgttata 1080
gagcgtctcg gtcgtcgtct ctgtttatta actggttctg ctgctatgtt catctgtttc 1140
atcatctact ctttaatcgg tactcaacac ttatacaaac aaggttactc taacgaaact 1200
tctaacactt acaaagcttc tggtaacgct atgatcttca tcacttgttt atacatcttc 1260
ttcttcgctt ctacttgggc tggtggtgtt tactgtatca tctctgaatc ttacccatta 1320
cgtatccgtt ctaaagctat gtctatcgct actgctgcta actggttatg gggtttctta 1380
atctctttct tcactccatt catcacttct gctatccact tctactacgg tttcgttttc 1440
actggttgtt tagctttctc tttcttctac gtttacttct tcgtttacga aactaaaggt 1500
ttatctttag aagaagttga tgaaatgtac gcttctggtg ttttaccatt aaaatctgct 1560
tcttgggttc caccaaactt agaacacatg gctcactctg ctggttacgc tggtgctgat 1620
aaagctactg atgaacaagt t 1641
<210> 6
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgtcttctg ctatctaccc atctttaaaa ggtaaacgtg ttgttatcac tggtggtggt 60
tctggtatcg gtgctggttt aactgctggt ttcgctcgtc aaggtgctga agttatcttc 120
ttagatatcg ctgatgaaga ttctcgtgct ttagaagctg aattagctgg ttctccaatc 180
ccaccagttt acaaacgttg tgatttaatg aacttagaag ctatcaaagc tgttttcgct 240
gaaatcggtg atgttgatgt tttagttaac aacgctggta acgatgatcg tcacaaatta 300
gctgatgtta ctggtgctta ctgggatgaa cgtatcaacg ttaacttacg tcacatgtta 360
ttctgtactc aagctgttgc tccaggtatg aaaaaacgtg gtggtggtgc tgttatcaac 420
ttcggttcta tctcttggca cttaggttta gaagatttag ttttatacga aactgctaaa 480
gctggtatcg aaggtatgac tcgtgcttta gctcgtgaat taggtccaga tgatatccgt 540
gttacttgtg ttgttccagg taacgttaaa actaaacgtc aagaaaaatg gtacactcca 600
gaaggtgaag ctcaaatcgt tgctgctcaa tgtttaaaag gtcgtatcgt tccagagaac 660
gttgctgcgt tagttttatt cctcgctagt gatgacgcta gcttatgtac tggtcatgaa 720
tactggatcg atgctggttg gcgttaa 747
<210> 7
<211> 870
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgactgctc aagttacatg tgtctgggac ttaaaagcta ctttaggtga aggtccaatc 60
tggcacggtg atactttatg gttcgttgat atcaaacaac gtaaaatcca caactaccac 120
ccagctactg gcgaaaggtt ctctttcgat gcgccagatc aagttacttt cttagctcca 180
atcgttggtg ctactggttt cgttgttggt ttaaaaactg gtatccaccg tttccaccca 240
gctacgggct tctctctctt attagaagtt gaagatgctg ctttaaacaa ccgtccaaac 300
gatgctactg ttgatgctca aggtcgttta tggttcggta ctatgcacga tggtgaagaa 360
aacaactctg gttctttata ccgtatggat ttaactggtg ttgctcgtat ggatcgtgat 420
atctgtatca ctaacggtcc atgtgtttct ccagatggta aaactttcta ccacactgat 480
actttagaaa aaactatcta cgctttcgat ttagctgaag atggtttatt atctaacaaa 540
cgtgttttcg ttcaattcgc tttaggtgat gatgtttacc cagatggttc tgttgttgat 600
tctgaaggtt acttatggac tgctttatgg ggtggtttcg gtgctgttcg tttctctcca 660
caaggtgatg ctgttactcg tatcgaatta ccagctccaa acgttactaa accatgtttc 720
ggtggtccag atttaaaaac tttatacttc actactgctc gtaaaggttt atctgatgaa 780
actttagctc aatacccatt agctggtggt gttttcgctg ttccagttga tgttgctggt 840
caaccacaac acgaagttcg tttagtttaa 870
<210> 8
<211> 1776
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgtctaacc gtactccacg tcgtttccgt tctcgtgatt ggttcgataa cccagatcac 60
atcgatatga ctgctttata cttagaacgt ttcatgaact acggtatcac tccagaagaa 120
ttacgttctg gtaaaccaat catcggtatc gctcaaactg gttctgatat ctctccatgt 180
aaccgtatcc acttagattt agttcaacgt gttcgtgatg gtatccgtga tgctggtggt 240
atcccaatgg aattcccagt tcacccaatc ttcgaaaact gtcgtcgtcc aactgctgct 300
ttagatcgta acttatctta cttaggttta gttgaaactt tacacggtta cccaatcgat 360
gctgttgttt taactactgg ttgtgataaa actactccag ctggtatcat ggctgctact 420
actgttaaca tcccagctat cgttttatct ggtggtccaa tgttagatgg ttggcacgaa 480
aacgaattag ttggttctgg tactgttatc tggcgttctc gtcgtaaatt agctgctggt 540
gaaatcactg aagaagaatt catcgatcgt gctgcttctt ctgctccatc tgctggtcac 600
tgtaacacta tgggtactgc ttctactatg aacgctgttg ctgaagcttt aggtttatct 660
ttaactggtt gtgctgctat cccagctcca taccgtgaac gtggtcaaat ggcttacaaa 720
actggtcaac gtatagttga tctcgcttac gatgacgtta aaccattaga tatcttaact 780
aaacaagctt tcgaaaacgc tatcgcttta gttgctgctg ctggtggttc tactaacgct 840
caaccacaca tcgttgctat ggctcgtcac gctggtgttg aaatcactgc tgatgattgg 900
cgtgctgctt acgatatccc attaatcgtt aacatgcaac cagctggtaa atacttaggt 960
gaacgtttcc accgtgccgg cggtgctcca gctgtgctct gggaattatt acaacaaggt 1020
cgtttacacg gtgatgtttt aactgttact ggtaaaacta tgtctgaaaa cttacaaggt 1080
cgtgaaactt ctgatcgtga agttatcttc ccataccacg aaccattagc tgaaaaagct 1140
ggtttcttag ttttaaaagg taacttattc gatttcgcta tcatgaaatc ttctgttatc 1200
ggtgaagaat tccgtaaacg ttacttatct caaccaggtc aagaaggtgt tttcgaagct 1260
cgtgctatcg ttttcgatgg ttctgatgat taccacaaac gtatcaacga tccagcttta 1320
gaaatcgatg aacgttgtat cttagttatc cgtggtgctg gtccaatcgg ttggccaggt 1380
tctgctgaag ttgttaacat gcaaccacca gatcacttat taaaaaaagg tatcatgtct 1440
ttaccaactt taggtgatgg tcgtcaatct ggtactgctg attctccatc tatcttaaac 1500
gcttctccag aatctgctat cggtggtggt ttatcttggt tacgtactgg tgacactata 1560
cgtatcgatc tcaacactgg tcgttgtgat gctttagttg atgaagctac tatcgctgct 1620
cgtaaacaag atggtatccc agctgttcca gctactatga ctccatggca agaaatctac 1680
cgtgctcacg cttctcaatt agatactggt ggtgttttag aattcgctgt taaataccaa 1740
gatttagctg ctaaattacc acgtcacaac cactaa 1776
<210> 9
<211> 1155
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgggtgttt ctgaattctt accagaagat tggaaagctg ctactttatt aggtcgtatc 60
gatttcggtg aaggtccaac tccagtttta gttcgtggtg gtcgtgttga agatgtttct 120
aaaatcgctc caactgttgc tgatttaatg aacgctttcc aaccaggtgc tgttatccca 180
cgtggtgaag ataaaggtcc attagaagct ttagatatcc gtccagtttg ggaagatcca 240
gatggtgctg ctccagttaa attattagct ccagttgatt tacaatgttt aaaagctgct 300
ggtgttactt tcgctgtttc tactttagaa cgtgttatcg aagaacgtgc tcgtggtgat 360
gctggtgaag ctttaaaaat ccgtacttta ttagctgaac gtatgggtgg tgatttaaaa 420
tctgttgaac caggttctca aggtgctcaa cgtttaaaag atgctttaat cgctgatggt 480
ttatggtctc aatacttaga agttgctatc ggtccagatg ctgaaatctt cactaaaggt 540
ccaactttat cttctatggg ttggggtgat caagttggtg ttcgttacga ttctcactgg 600
aacaacccag aaccagaagt tgttttatta tgtgatggtt ctggtttaat ccgtggtgct 660
gctttaggta acgatgttaa cttacgtgat ttcgaaggtc gttctgcttt attattatct 720
aaagctaaag ataacaacgc ttcttgtgct atcggtccat tcttccgttt attcgatgaa 780
actttcggtt tagatgatgt tcgttctgct gaagttgaat taaaaatcac tggtcgtgat 840
aacttcgttt tagatggtaa atctaacatg tctttaatct ctcgtgatcc agctgtttta 900
gctggtcaag cttacggtaa acaacaccaa tacccagatg gtttcgcttt attcttaggt 960
actatgttcg ctccaatcca agatcgtgat actccaggtc aaggtttcac tcacaaagtt 1020
ggtgatcgtg ttcgtgtttc tactccaaaa ttaggtgttt tagaaaacga agttactact 1080
tgtgataaag ctaaaccatg gactttcggt atctctgctt taatccgtaa cttagctggt 1140
cgtggtttat tataa 1155
<210> 10
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgactgata ctttacgtca ctacatcggt ggtgaacgtg ttgctgctga tgctcccgcg 60
gaaagcttaa acccatctaa tactaacgat gttgttgcta aagttccaat gggtggtcaa 120
gctgaagttg atgctgctgt tgatgctgct cgtaaagctt tcccagcttg ggctgatgct 180
tctccagagg ttcgttctga cttattagat aaagttggtt ctactatcat cgctcgttct 240
gctgatatcg gtcgtttatt agctcgtgaa gaaggtaaaa ctttagctga aggtatcggt 300
gaaactgttc gtgctggtcg tatcttcaaa tacttcgcgg gggaagctct ccgtcgtcac 360
ggccaaaact tagaatctac tcgtccaggt gttgaaatcc aaacttaccg tcaagctgtt 420
ggtgtttacg gtttaatcac tccatggaac ttcccaatcg ctatcccagc ttggaaggct 480
gcccccgctc tcgcgttcgg taatactgtt gttatcaaac cagctggtcc aactccagct 540
actgctaacg ttttagctga tatcatggct gaatgtggtg ctccagctgg tgttttcaac 600
atgttattcg gtcgtggttc tatgggtgat gctttaatca aacacaaaga tgttgatggt 660
gtttctttca ctggttctca aggtgttggt gctcaagttg ctgctgctgc tgttgctcgt 720
caagctcgtg ttcaattaga aatgggtggt aaaaacccat taatcgtttt agatgatgct 780
gatttagaac gtgctgttgc tatcgcttta gatggttctt tcttcgctac tggtcaacgt 840
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ggtccagctg tttctgaaga tcaaatggaa acttcttacc gttacatcga tatcgctgct 1020
tctgaaggtg gtcgtgttgt tactggtggt gatcgtatca aattagataa cccaggttgg 1080
tacgttcgtc caactttaat cgctgatact caagctggta tgcgtatcaa caacgaagaa 1140
gttttcggtc cagttgcttc tactatccgt gttaaatctt acgaagaagc tttagaaatc 1200
gctaacggtg ttgaattcgg tttatctgct ggtatcgcta ctacttcttt aaaacacgct 1260
cgtcacttcc aacgttacgc tcgtgctggt atgactatgg ttaacttagc tactgctggt 1320
gttgattacc acgttccatt cggtggtact aaatcttctt cttacggtgc tcgtgaacaa 1380
ggtttcgctg ctgttgaatt cttcactcaa actaaaactt cttactcttg gtcttaa 1437
<210> 11
<211> 14050
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cacctcgcta acggattcac cgtttttatc aggctctggg aggcagaata aatgatcata 60
tcgtcaatta ttacctccac ggggagagcc tgagcaaact ggcctcaggc atttgagaag 120
cacacggtca cactgcttcc ggtagtcaat aaaccggtca gaatttcaga taaaaaaaat 180
ccttagcttt cgctaaggat gatttctgtg gtacctcgga tcccggggag ctagcacgaa 240
ttcgcggccg cttctagacc gacaccatcg aatggtgcaa aacctttcgc ggtatggcat 300
gatagcgccc ggaagagagt caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg 360
atgtcgcaga gtatgccggt gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca 420
gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca 480
ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca 540
cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg 600
atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta 660
aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc 720
tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc 780
ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc 840
gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc 900
cattaagttc tgtctcggcg cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca 960
atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac 1020
aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc 1080
agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata 1140
tctcggtagt gggatacgac gataccgaag acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca 1200
ccatcaaaca ggattttcgc ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct 1260
ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa 1320
ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc 1380
agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgta 1440
agttagctca ctcattaggc acaattctca tgtttgacag cttatcatcg actgcacggt 1500
gcaccaatgc ttctggcgtc aggcagccat cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt 1560
aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc 1620
gccgacatca taacggttct ggcaaatatt ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcg 1680
gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagccagtcc 1740
gtttaggtgt tttcacgagc acttcaccaa caaggaccat agcatatgcc actagagtac 1800
tagagaaaga ggagaaatac tagagatgtc tcaagattct cactcttctg gtgctgctac 1860
tccagttaac ggttctatct tagaaaaaga aaaagaagat tctccagttt tacaagttga 1920
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tttcggtggt ttcgttttcg gtttcgatac tggtactatc tctggtttcg ttaacatgtc 2040
tgattttaag gataggttcg gtcaacacca tgctgatggt actccatact tatctgatgt 2100
tcgtgttggt ttaatgatct ctatcttcaa cgttggttgt gctgttggtg gtatcttctt 2160
atgtaaagtt gctgatgttt ggggtcgtcg tatcggttta atgttctcta tggctgttta 2220
cgttgttggt atcatcatcc aaatctcttc ttctactaaa tggtaccaat tcttcatcgg 2280
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tgaagtttct ccaaaacaaa tccgtggtac tttagtttgt tgtttccaat tatgtatcac 2400
tttaggtatc ttcttaggtt actgtactac ttacggtact aaaacttaca ctgattctcg 2460
tcaatggcgt atcccattag gtttatgttt cgcttgggct atcttattag ttgttggtat 2520
gttaaacatg ccagaatctc cacgttactt agttgaaaaa caccgtatcg atgaagctaa 2580
acgttctatc gctcgttcta acaaaatccc agaagaagat ccattcgttt acactgaagt 2640
tcaattaatc caagctggta tcgaacgtga agctttagct ggtcaagctt cttggaaaga 2700
attaatcact ggtaaaccaa aaatcttccg tcgtgttatc atgggtatca tgttacaatc 2760
tttacaacaa ttaactggtg ataactactt cttctactac ggtactacta tcttccaagc 2820
ggtaggtctc aaagattctt ttcaaacttc tatcatctta ggtatcgtta acttcgcttc 2880
tactttcgtt ggtatctacg ttatagagcg tctcggtcgt cgtctctgtt tattaactgg 2940
ttctgctgct atgttcatct gtttcatcat ctactcttta atcggtactc aacacttata 3000
caaacaaggt tactctaacg aaacttctaa cacttacaaa gcttctggta acgctatgat 3060
cttcatcact tgtttataca tcttcttctt cgcttctact tgggctggtg gtgtttactg 3120
tatcatctct gaatcttacc cattacgtat ccgttctaaa gctatgtcta tcgctactgc 3180
tgctaactgg ttatggggtt tcttaatctc tttcttcact ccattcatca cttctgctat 3240
ccacttctac tacggtttcg ttttcactgg ttgtttagct ttctctttct tctacgttta 3300
cttcttcgtt tacgaaacta aaggtttatc tttagaagaa gttgatgaaa tgtacgcttc 3360
tggtgtttta ccattaaaat ctgcttcttg ggttccacca aacttagaac acatggctca 3420
ctctgctggt tacgctggtg ctgataaagc tactgatgaa caagtttact agagtactag 3480
agtactagag aaagaggaga aatactagag atgtcttctg ctatctaccc atctttaaaa 3540
ggtaaacgtg ttgttatcac tggtggtggt tctggtatcg gtgctggttt aactgctggt 3600
ttcgctcgtc aaggtgctga agttatcttc ttagatatcg ctgatgaaga ttctcgtgct 3660
ttagaagctg aattagctgg ttctccaatc ccaccagttt acaaacgttg tgatttaatg 3720
aacttagaag ctatcaaagc tgttttcgct gaaatcggtg atgttgatgt tttagttaac 3780
aacgctggta acgatgatcg tcacaaatta gctgatgtta ctggtgctta ctgggatgaa 3840
cgtatcaacg ttaacttacg tcacatgtta ttctgtactc aagctgttgc tccaggtatg 3900
aaaaaacgtg gtggtggtgc tgttatcaac ttcggttcta tctcttggca cttaggttta 3960
gaagatttag ttttatacga aactgctaaa gctggtatcg aaggtatgac tcgtgcttta 4020
gctcgtgaat taggtccaga tgatatccgt gttacttgtg ttgttccagg taacgttaaa 4080
actaaacgtc aagaaaaatg gtacactcca gaaggtgaag ctcaaatcgt tgctgctcaa 4140
tgtttaaaag gtcgtatcgt tccagagaac gttgctgcgt tagttttatt cctcgctagt 4200
gatgacgcta gcttatgtac tggtcatgaa tactggatcg atgctggttg gcgttaatac 4260
tagagtacta gagtactaga gaaagaggag aaatactaga gatgactgct caagttacat 4320
gtgtctggga cttaaaagct actttaggtg aaggtccaat ctggcacggt gatactttat 4380
ggttcgttga tatcaaacaa cgtaaaatcc acaactacca cccagctact ggcgaaaggt 4440
tctctttcga tgcgccagat caagttactt tcttagctcc aatcgttggt gctactggtt 4500
tcgttgttgg tttaaaaact ggtatccacc gtttccaccc agctacgggc ttctctctct 4560
tattagaagt tgaagatgct gctttaaaca accgtccaaa cgatgctact gttgatgctc 4620
aaggtcgttt atggttcggt actatgcacg atggtgaaga aaacaactct ggttctttat 4680
accgtatgga tttaactggt gttgctcgta tggatcgtga tatctgtatc actaacggtc 4740
catgtgtttc tccagatggt aaaactttct accacactga tactttagaa aaaactatct 4800
acgctttcga tttagctgaa gatggtttat tatctaacaa acgtgttttc gttcaattcg 4860
ctttaggtga tgatgtttac ccagatggtt ctgttgttga ttctgaaggt tacttatgga 4920
ctgctttatg gggtggtttc ggtgctgttc gtttctctcc acaaggtgat gctgttactc 4980
gtatcgaatt accagctcca aacgttacta aaccatgttt cggtggtcca gatttaaaaa 5040
ctttatactt cactactgct cgtaaaggtt tatctgatga aactttagct caatacccat 5100
tagctggtgg tgttttcgct gttccagttg atgttgctgg tcaaccacaa cacgaagttc 5160
gtttagttta atactagagt actagagttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg 5220
gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcca gtccgtttag gtgttttcac 5280
gagcacttca ccaacaagga ccatagcata tgccatacta gagaaagagg agaaatacta 5340
gagatgtcta accgtactcc acgtcgtttc cgttctcgtg attggttcga taacccagat 5400
cacatcgata tgactgcttt atacttagaa cgtttcatga actacggtat cactccagaa 5460
gaattacgtt ctggtaaacc aatcatcggt atcgctcaaa ctggttctga tatctctcca 5520
tgtaaccgta tccacttaga tttagttcaa cgtgttcgtg atggtatccg tgatgctggt 5580
ggtatcccaa tggaattccc agttcaccca atcttcgaaa actgtcgtcg tccaactgct 5640
gctttagatc gtaacttatc ttacttaggt ttagttgaaa ctttacacgg ttacccaatc 5700
gatgctgttg ttttaactac tggttgtgat aaaactactc cagctggtat catggctgct 5760
actactgtta acatcccagc tatcgtttta tctggtggtc caatgttaga tggttggcac 5820
gaaaacgaat tagttggttc tggtactgtt atctggcgtt ctcgtcgtaa attagctgct 5880
ggtgaaatca ctgaagaaga attcatcgat cgtgctgctt cttctgctcc atctgctggt 5940
cactgtaaca ctatgggtac tgcttctact atgaacgctg ttgctgaagc tttaggttta 6000
tctttaactg gttgtgctgc tatcccagct ccataccgtg aacgtggtca aatggcttac 6060
aaaactggtc aacgtatagt tgatctcgct tacgatgacg ttaaaccatt agatatctta 6120
actaaacaag ctttcgaaaa cgctatcgct ttagttgctg ctgctggtgg ttctactaac 6180
gctcaaccac acatcgttgc tatggctcgt cacgctggtg ttgaaatcac tgctgatgat 6240
tggcgtgctg cttacgatat cccattaatc gttaacatgc aaccagctgg taaatactta 6300
ggtgaacgtt tccaccgtgc cggcggtgct ccagctgtgc tctgggaatt attacaacaa 6360
ggtcgtttac acggtgatgt tttaactgtt actggtaaaa ctatgtctga aaacttacaa 6420
ggtcgtgaaa cttctgatcg tgaagttatc ttcccatacc acgaaccatt agctgaaaaa 6480
gctggtttct tagttttaaa aggtaactta ttcgatttcg ctatcatgaa atcttctgtt 6540
atcggtgaag aattccgtaa acgttactta tctcaaccag gtcaagaagg tgttttcgaa 6600
gctcgtgcta tcgttttcga tggttctgat gattaccaca aacgtatcaa cgatccagct 6660
ttagaaatcg atgaacgttg tatcttagtt atccgtggtg ctggtccaat cggttggcca 6720
ggttctgctg aagttgttaa catgcaacca ccagatcact tattaaaaaa aggtatcatg 6780
tctttaccaa ctttaggtga tggtcgtcaa tctggtactg ctgattctcc atctatctta 6840
aacgcttctc cagaatctgc tatcggtggt ggtttatctt ggttacgtac tggtgacact 6900
atacgtatcg atctcaacac tggtcgttgt gatgctttag ttgatgaagc tactatcgct 6960
gctcgtaaac aagatggtat cccagctgtt ccagctacta tgactccatg gcaagaaatc 7020
taccgtgctc acgcttctca attagatact ggtggtgttt tagaattcgc tgttaaatac 7080
caagatttag ctgctaaatt accacgtcac aaccactaat actagagtac tagagtacta 7140
gagaaagagg agaaatacta gagatgggtg tttctgaatt cttaccagaa gattggaaag 7200
ctgctacttt attaggtcgt atcgatttcg gtgaaggtcc aactccagtt ttagttcgtg 7260
gtggtcgtgt tgaagatgtt tctaaaatcg ctccaactgt tgctgattta atgaacgctt 7320
tccaaccagg tgctgttatc ccacgtggtg aagataaagg tccattagaa gctttagata 7380
tccgtccagt ttgggaagat ccagatggtg ctgctccagt taaattatta gctccagttg 7440
atttacaatg tttaaaagct gctggtgtta ctttcgctgt ttctacttta gaacgtgtta 7500
tcgaagaacg tgctcgtggt gatgctggtg aagctttaaa aatccgtact ttattagctg 7560
aacgtatggg tggtgattta aaatctgttg aaccaggttc tcaaggtgct caacgtttaa 7620
aagatgcttt aatcgctgat ggtttatggt ctcaatactt agaagttgct atcggtccag 7680
atgctgaaat cttcactaaa ggtccaactt tatcttctat gggttggggt gatcaagttg 7740
gtgttcgtta cgattctcac tggaacaacc cagaaccaga agttgtttta ttatgtgatg 7800
gttctggttt aatccgtggt gctgctttag gtaacgatgt taacttacgt gatttcgaag 7860
gtcgttctgc tttattatta tctaaagcta aagataacaa cgcttcttgt gctatcggtc 7920
cattcttccg tttattcgat gaaactttcg gtttagatga tgttcgttct gctgaagttg 7980
aattaaaaat cactggtcgt gataacttcg ttttagatgg taaatctaac atgtctttaa 8040
tctctcgtga tccagctgtt ttagctggtc aagcttacgg taaacaacac caatacccag 8100
atggtttcgc tttattctta ggtactatgt tcgctccaat ccaagatcgt gatactccag 8160
gtcaaggttt cactcacaaa gttggtgatc gtgttcgtgt ttctactcca aaattaggtg 8220
ttttagaaaa cgaagttact acttgtgata aagctaaacc atggactttc ggtatctctg 8280
ctttaatccg taacttagct ggtcgtggtt tattataata ctagagtact agattgacaa 8340
ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 8400
cagccagtcc gtttaggtgt tttcacgagc acttcaccaa caaggaccat agcatatgcc 8460
agtactagag aaagaggaga aatactagag atgactgata ctttacgtca ctacatcggt 8520
ggtgaacgtg ttgctgctga tgctcccgcg gaaagcttaa acccatctaa tactaacgat 8580
gttgttgcta aagttccaat gggtggtcaa gctgaagttg atgctgctgt tgatgctgct 8640
cgtaaagctt tcccagcttg ggctgatgct tctccagagg ttcgttctga cttattagat 8700
aaagttggtt ctactatcat cgctcgttct gctgatatcg gtcgtttatt agctcgtgaa 8760
gaaggtaaaa ctttagctga aggtatcggt gaaactgttc gtgctggtcg tatcttcaaa 8820
tacttcgcgg gggaagctct ccgtcgtcac ggccaaaact tagaatctac tcgtccaggt 8880
gttgaaatcc aaacttaccg tcaagctgtt ggtgtttacg gtttaatcac tccatggaac 8940
ttcccaatcg ctatcccagc ttggaaggct gcccccgctc tcgcgttcgg taatactgtt 9000
gttatcaaac cagctggtcc aactccagct actgctaacg ttttagctga tatcatggct 9060
gaatgtggtg ctccagctgg tgttttcaac atgttattcg gtcgtggttc tatgggtgat 9120
gctttaatca aacacaaaga tgttgatggt gtttctttca ctggttctca aggtgttggt 9180
gctcaagttg ctgctgctgc tgttgctcgt caagctcgtg ttcaattaga aatgggtggt 9240
aaaaacccat taatcgtttt agatgatgct gatttagaac gtgctgttgc tatcgcttta 9300
gatggttctt tcttcgctac tggtcaacgt tgtactgctt cttctcgttt aatcgttcaa 9360
gatggtatcc acgataaatt cgttgcttta ttagctgaaa aagttgctgc tttacgtgtt 9420
ggtgatgctt tagatccaaa cactcaaatc ggtccagctg tttctgaaga tcaaatggaa 9480
acttcttacc gttacatcga tatcgctgct tctgaaggtg gtcgtgttgt tactggtggt 9540
gatcgtatca aattagataa cccaggttgg tacgttcgtc caactttaat cgctgatact 9600
caagctggta tgcgtatcaa caacgaagaa gttttcggtc cagttgcttc tactatccgt 9660
gttaaatctt acgaagaagc tttagaaatc gctaacggtg ttgaattcgg tttatctgct 9720
ggtatcgcta ctacttcttt aaaacacgct cgtcacttcc aacgttacgc tcgtgctggt 9780
atgactatgg ttaacttagc tactgctggt gttgattacc acgttccatt cggtggtact 9840
aaatcttctt cttacggtgc tcgtgaacaa ggtttcgctg ctgttgaatt cttcactcaa 9900
actaaaactt cttactcttg gtcttaatac tagagtacta gtagcggccg cctgcaggtg 9960
gtcgaccact cgaggccagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct 10020
ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctctacta gagtcacact ggctcacctt 10080
cgggtgggcc tttctgcgtt tataaccggt aaaccagcaa tagacataag cggctattta 10140
acgaccctgc cctgaaccga cgaccgggtc gaatttgctt tcgaacccca gagtcccgct 10200
cagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata 10260
ccgtaaagca cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg 10320
gtagccaacg ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat 10380
ccagaaaagc ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg 10440
acgagatcct cgccgtcggg catgcgcgcc ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg 10500
agcccctgat gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta 10560
cgtgctcgct cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc 10620
gtatgcagcc gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga 10680
gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct tcccgcttca 10740
gtgacaacgt cgagcacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc 10800
gctgcctcgt cctgcagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc 10860
gggcgcccct gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt 10920
gcccagtcat agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca 10980
tcttgttcaa tcatgcgaaa cgatcctcat cctgtctctt gatcagatct tgatcccctg 11040
cgccatcaga tccttggcgg caagaaagcc atccagttta ctttgcaggg cttcccaacc 11100
ttaccagagg gcgccccagc tggcaattcc ggttcgcttg ctgtccataa aaccgcccag 11160
tctagctatc gccatgtaag cccactgcaa gctacctgct ttctctttgc gcttgcgttt 11220
tcccttgtcc agatagccca gtagctgaca ttcatcccag gtggcacttt tcggggaaat 11280
gtgcgcgccc gcgttcctgc tggcgctggg cctgtttctg gcgctggact tcccgctgtt 11340
ccgtcagcag cttttcgccc acggccttga tgatcgcggc ggccttggcc tgcatatccc 11400
gattcaacgg ccccagggcg tccagaacgg gcttcaggcg ctcccgaagg tctcgggccg 11460
tctcttgggc ttgatcggcc ttcttgcgca tctcacgcgc tcctgcggcg gcctgtaggg 11520
caggctcata cccctgccga accgcttttg tcagccggtc ggccacggct tccggcgtct 11580
caacgcgctt tgagattccc agcttttcgg ccaatccctg cggtgcatag gcgcgtggct 11640
cgaccgcttg cgggctgatg gtgacgtggc ccactggtgg ccgctccagg gcctcgtaga 11700
acgcctgaat gcgcgtgtga cgtgccttgc tgccctcgat gccccgttgc agccctagat 11760
cggccacagc ggccgcaaac gtggtctggt cgcgggtcat ctgcgctttg ttgccgatga 11820
actccttggc cgacagcctg ccgtcctgcg tcagcggcac cacgaacgcg gtcatgtgcg 11880
ggctggtttc gtcacggtgg atgctggccg tcacgatgcg atccgccccg tacttgtccg 11940
ccagccactt gtgcgccttc tcgaagaacg ccgcctgctg ttcttggctg gccgacttcc 12000
accattccgg gctggccgtc atgacgtact cgaccgccaa cacagcgtcc ttgcgccgct 12060
tctctggcag caactcgcgc agtcggccca tcgcttcatc ggtgctgctg gccgcccagt 12120
gctcgttctc tggcgtcctg ctggcgtcag cgttgggcgt ctcgcgctcg cggtaggcgt 12180
gcttgagact ggccgccacg ttgcccattt tcgccagctt cttgcatcgc atgatcgcgt 12240
atgccgccat gcctgcccct cccttttggt gtccaaccgg ctcgacgggg gcagcgcaag 12300
gcggtgcctc cggcgggcca ctcaatgctt gagtatactc actagacttt gcttcgcaaa 12360
gtcgtgaccg cctacggcgg ctgcggcgcc ctacgggctt gctctccggg cttcgccctg 12420
cgcggtcgct gcgctccctt gccagcccgt ggatatgtgg acgatggccg cgagcggcca 12480
ccggctggct cgcttcgctc ggcccgtgga caaccctgct ggacaagctg atggacaggc 12540
tgcgcctgcc cacgagcttg accacaggga ttgcccaccg gctacccagc cttcgaccac 12600
atacccaccg gctccaactg cgcggcctgc ggccttgccc catcaatttt tttaattttc 12660
tctggggaaa agcctccggc ctgcggcctg cgcgcttcgc ttgccggttg gacaccaagt 12720
ggaaggcggg tcaaggctcg cgcagcgacc gcgcagcggc ttggccttga cgcgcctgga 12780
acgacccaag cctatgcgag tgggggcagt cgaaggcgaa gcccgcccgc ctgccccccg 12840
agcctcacgg cggcgagtgc gggggttcca agggggcagc gccaccttgg gcaaggccga 12900
aggccgcgca gtcgatcaac aagccccgga ggggccactt tttgccggag ggggagccgc 12960
gccgaaggcg tgggggaacc ccgcaggggt gcccttcttt gggcaccaaa gaactagata 13020
tagggcgaaa tgcgaaagac ttaaaaatca acaacttaaa aaaggggggt acgcaacagc 13080
tcattgcggc accccccgca atagctcatt gcgtaggtta aagaaaatct gtaattgact 13140
gccactttta cgcaacgcat aattgttgtc gcgctgccga aaagttgcag ctgattgcgc 13200
atggtgccgc aaccgtgcgg caccctaccg catggagata agcatggcca cgcagtccag 13260
agaaatcggc attcaagcca agaacaagcc cggtcactgg gtgcaaacgg aacgcaaagc 13320
gcatgaggcg tgggccgggc ttattgcgag gaaacccacg gcggcaatgc tgctgcatca 13380
cctcgtggcg cagatgggcc accagaacgc cgtggtggtc agccagaaga cactttccaa 13440
gctcatcgga cgttctttgc ggacggtcca atacgcagtc aaggacttgg tggccgagcg 13500
ctggatctcc gtcgtgaagc tcaacggccc cggcaccgtg tcggcctacg tggtcaatga 13560
ccgcgtggcg tggggccagc cccgcgacca gttgcgcctg tcggtgttca gtgccgccgt 13620
ggtggttgat cacgacgacc aggacgaatc gctgttgggg catggcgacc tgcgccgcat 13680
cccgaccctg tatccgggcg agcagcaact accgaccggc cccggcgagg agccgcccag 13740
ccagcccggc attccgggca tggaaccaga cctgccagcc ttgaccgaaa cggaggaatg 13800
ggaacggcgc gggcagcagc gcctgccgat gcccgatgag ccgtgttttc tggacgatgg 13860
cgagccgttg gagccgccga cacgggtcac gctgccgcgc cggtagcact tgggttgcgc 13920
agcaacccgt aagtgcgctg ttccagacta tcggctgtag ccgcctcgcc gccctatacc 13980
ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg ggccacctcg acctgaatgg 14040
aagccggcgg 14050

Claims (7)

1.一种希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法，其特征在于：采用biobrick的构建策略，利用同尾酶SpeI与XbaI，处理后产生相同的粘性末端，在T4连接酶的作用将木糖转运蛋白基因和木糖Weimberg代谢路径相关基因构建于同一个重组质粒表达载体上，将重组质粒通过转化、接合转移的方式导入到两种宿主菌Shewanella oneidensis MR-1和S114中获得重组希瓦氏工程菌株S129和S135的构建方法。
2.根据权利要求1所述重组工程菌株构建方法，其特征在于：利用同尾酶SpeI酶切位点为ctag。
3.根据权利要求1所述重组工程菌株构建方法，其特征在于：XbaI酶切位点为ctag。
4.根据权利要求1所述重组工程菌株构建方法，其特征在于：T4连接酶的作用下将分别来自中间假丝酵母的木糖转运蛋白的基因gxf1(SEQ ID NO.5)和来自新月丙杆菌的木糖Weimberg代谢路径相关基因xylB(SEQ ID NO.6)，xylC(SEQ ID NO.7)，xylD(SEQ IDNO.8)，xylX(SEQ ID NO.9)，xylA(SEQ ID NO.10)，经过密码子优化后，按照如下顺序：gxf1-xylB-xylC-xylD-xylX-xylA逐个连接到基础质粒PYYDT(SEQ ID NO.1)上,然后通过PYYDT上tac启动子(SEQ ID NO.2)和T1终止子(SEQ ID NO.3)表达，得到重组质粒(SEQ IDNO.11)。
5.根据权利要求1所述重组工程菌株构建方法，其特征在于：重组质粒扩增菌株为Escherichia coli DAP营养缺陷型菌株。
6.根据权利要求1所述重组工程菌株构建方法，其特征在于：重组质粒导入扩增菌株E.coli WM3064的转化方法采用常规的物理转化法，然后通过将携带重组质粒的E.coliWM3064与宿主菌MR-1和S114进行接合转移，最终将合成后的重组质粒转移到MR-1和S114中，分别得到目标工程菌S129和S135。
7.根据权利要求1所述重组工程菌株构建方法，其特征在于：利用摇床摇瓶培养，分光光度计，高效液相色谱仪(HPLC)，典型双室微生物燃料电池，电化学工作站进行实验验证构建菌株利用木糖代谢利用生长情况及MFC产电效果。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410672A (zh) * 2022-01-12 2022-04-29 天津大学（青岛）海洋工程研究院有限公司 希瓦氏菌中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103429751A (zh) * 2010-12-22 2013-12-04 马斯科马公司 经工程化以发酵木糖的遗传修饰的热纤梭菌
US20150225745A1 (en) * 2012-08-07 2015-08-13 Codexis, Inc. Glucose and xylose co-utilization in e. coli
US20150240247A1 (en) * 2012-09-28 2015-08-27 The Regents Of The University Of California Trophic conversion of photoautotrophic bacteria for improved diurnal properties
US20150337340A1 (en) * 2012-11-20 2015-11-26 Codexis, Inc. Pentose fermentation by a recombinant microorganism
CN106282040A (zh) * 2016-11-04 2017-01-04 南京工业大学 一株能共利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用
CN106754589A (zh) * 2015-11-20 2017-05-31 天津大学 混合菌群及其用途、含有该混合菌群的微生物产电体系和微生物燃料电池
CN107916235A (zh) * 2017-11-15 2018-04-17 天津大学 一种重组酵母菌株以及微生物混菌产电的方法
CN108866090A (zh) * 2017-05-11 2018-11-23 华东理工大学 一种共发酵葡萄糖和木糖生产d-乳酸的乳酸片球菌构建方法
CN110229761A (zh) * 2019-06-19 2019-09-13 南通大学 高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用
CN110713966A (zh) * 2019-11-26 2020-01-21 江南大学 一种利用GlcN6P感应元器件促进N-乙酰氨基葡萄糖合成的方法
US20200270647A1 (en) * 2019-02-22 2020-08-27 National Chiao Tung University Transgenic strain for producing succinate and method for producing succinate
CN111979167A (zh) * 2020-08-17 2020-11-24 大连理工大学 一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用
CN114410672A (zh) * 2022-01-12 2022-04-29 天津大学（青岛）海洋工程研究院有限公司 希瓦氏菌中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法
CN114540396A (zh) * 2022-02-24 2022-05-27 天津大学 希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103429751A (zh) * 2010-12-22 2013-12-04 马斯科马公司 经工程化以发酵木糖的遗传修饰的热纤梭菌
US20150225745A1 (en) * 2012-08-07 2015-08-13 Codexis, Inc. Glucose and xylose co-utilization in e. coli
US20150240247A1 (en) * 2012-09-28 2015-08-27 The Regents Of The University Of California Trophic conversion of photoautotrophic bacteria for improved diurnal properties
US20150337340A1 (en) * 2012-11-20 2015-11-26 Codexis, Inc. Pentose fermentation by a recombinant microorganism
CN106754589A (zh) * 2015-11-20 2017-05-31 天津大学 混合菌群及其用途、含有该混合菌群的微生物产电体系和微生物燃料电池
CN106282040A (zh) * 2016-11-04 2017-01-04 南京工业大学 一株能共利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用
CN108866090A (zh) * 2017-05-11 2018-11-23 华东理工大学 一种共发酵葡萄糖和木糖生产d-乳酸的乳酸片球菌构建方法
CN107916235A (zh) * 2017-11-15 2018-04-17 天津大学 一种重组酵母菌株以及微生物混菌产电的方法
US20200270647A1 (en) * 2019-02-22 2020-08-27 National Chiao Tung University Transgenic strain for producing succinate and method for producing succinate
CN110229761A (zh) * 2019-06-19 2019-09-13 南通大学 高效利用木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌的构建及应用
CN110713966A (zh) * 2019-11-26 2020-01-21 江南大学 一种利用GlcN6P感应元器件促进N-乙酰氨基葡萄糖合成的方法
CN111979167A (zh) * 2020-08-17 2020-11-24 大连理工大学 一种高效转化秸秆生物质碳源的重组丙丁梭菌及其构建方法与应用
CN114410672A (zh) * 2022-01-12 2022-04-29 天津大学（青岛）海洋工程研究院有限公司 希瓦氏菌中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法
CN114540396A (zh) * 2022-02-24 2022-05-27 天津大学 希瓦氏菌株中葡萄糖代谢通路的构建方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FENG LI等: "Engineering Shewanella oneidensis enables xylose‑fed microbial fuel cell", 《BIOTECHNOL BIOFUELS》, vol. 10, no. 196, pages 6 - 10 *
LISA WASSERSTROM等: "Exploring d‑xylose oxidation in Saccharomyces cerevisiae through the Weimberg pathway", 《AMB EXPR》, vol. 2018, pages 234 - 16 *
LON M. CHUBIZ等: "Growth Trade-Offs Accompany the Emergence of Glycolytic Metabolism in Shewanella oneidensis MR-1", 《J BACTERIOL》, vol. 199, no. 11, pages 1 - 15 *
REN Y等: "Structure and function of aldopentose catabolism enzymes involved in oxidative non-phosphorylative pathways", 《BIOTECHNOL BIOFUELS BIOPROD》, vol. 15, no. 147, pages 1 - 21 *
李媛媛等: "黄素介导的胞外电子转移研究与工程改造", 《中国生物工程杂志》, vol. 41, no. 10, pages 89 - 99 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410672A (zh) * 2022-01-12 2022-04-29 天津大学（青岛）海洋工程研究院有限公司 希瓦氏菌中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法
CN114410672B (zh) * 2022-01-12 2023-11-07 天津大学（青岛）海洋工程研究院有限公司 希瓦氏菌中木糖和葡萄糖共利用代谢的构建方法

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