CN116240232A - 木葡糖酸醋杆菌中Weimberg木糖代谢途径的构建方法 - Google Patents
木葡糖酸醋杆菌中Weimberg木糖代谢途径的构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116240232A CN116240232A CN202211638911.8A CN202211638911A CN116240232A CN 116240232 A CN116240232 A CN 116240232A CN 202211638911 A CN202211638911 A CN 202211638911A CN 116240232 A CN116240232 A CN 116240232A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- xylose
- acetobacter
- seq
- weinberg
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 title claims abstract description 26
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 230000037361 pathway Effects 0.000 title description 12
- 230000004127 xylose metabolism Effects 0.000 title description 9
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims abstract description 117
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 62
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 55
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 38
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 19
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims abstract description 19
- 241001136169 Komagataeibacter xylinus Species 0.000 claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 229920002749 Bacterial cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 239000005016 bacterial cellulose Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 3
- 235000002837 Acetobacter xylinum Nutrition 0.000 claims description 9
- 101100156995 Caulobacter vibrioides (strain ATCC 19089 / CB15) xylD gene Proteins 0.000 claims description 8
- 101100373391 Pseudomonas putida xylX gene Proteins 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 241000186429 Propionibacterium Species 0.000 claims description 6
- QXKAIJAYHKCRRA-FLRLBIABSA-N D-xylonic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O QXKAIJAYHKCRRA-FLRLBIABSA-N 0.000 claims description 5
- QXKAIJAYHKCRRA-UHFFFAOYSA-N D-lyxonic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)=O QXKAIJAYHKCRRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 101150011516 xlnD gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150052264 xylA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 241000183959 Phyciodes orseis Species 0.000 claims 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 12
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 6
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 abstract description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 abstract description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 5
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 abstract description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 18
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 5
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000529915 Xylophilus Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010002731 D-xylo-aldonate dehydratase Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 2
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 2
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 2
- 239000002029 lignocellulosic biomass Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000008104 plant cellulose Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 2-oxoglutarate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC(=O)C([O-])=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710177708 Alpha-ketoglutarate semialdehyde dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- 108010044520 D-xylose dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 101100156993 Pseudomonas putida xylC gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 1
- 238000012984 biological imaging Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- -1 carbon sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dodecahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000011121 hardwood Substances 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 101150110790 xylB gene Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/02—Acetobacter
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种木葡糖酸醋杆菌木糖利用代谢的构建方法。本发明将木糖Weimberg代谢途径相关基因构建于一个重组质粒表达载体上，将重组质粒整合到宿主菌木葡糖酸醋杆菌中获得重组木葡糖酸醋杆菌工程菌株CGMCC 26045(其于2022年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.26045)的构建方法。并通过发酵初步确定其利用木糖产细菌纤维素(bacterial cellulose,BC)的能力高于木葡糖酸醋杆菌原始菌。通过发酵参数测定，工程菌比野生菌BC膜产量提高了100％以上，木糖利用率提高了40％以上。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及木葡糖酸醋杆菌中异源表达木糖代谢途径及其应用。
背景技术
细菌纤维素(bacterial cellulose,BC)是由β-1,4糖苷键连接组成的一种独特的纳米聚合物。与植物纤维素相比，其不含半纤维素和木质素，且具有极高的纯度与生物降解性。经过功能化的细菌纤维素在化学传感、生物成像、生物医用材料等众多领域具有良好的应用前景。
木葡糖酸醋杆菌(Komagataeibacter xylinus,K.xylinus)是BC的主要生产菌株之一。目前在工业生产中所使用的HS培养基成本较高。为降低生产成本，廉价培养基的使用具有较高的研究前景。其中，木质纤维素是最首选的底物之一。木质纤维素是一种丰富的可再生资源，可以转化为多种生物能源和化学产品。其主要由纤维素、半纤维素、木质素组成，水解后的中间产物纤维二糖及终产物葡萄糖、木糖能够做为碳源供K.xylinus生长并产生BC。然而，相对于以葡萄糖为碳源生长生产BC时，野生型K.xylinus CGMCC2955(简称CGMCC2955)由于缺乏部分关键的木糖代谢通路酶，无法很好的利用木糖。所以对野生型CGMCC2955进行改造，异源表达木糖利用途径所需要的基因，有利于菌株对木糖的吸收利用，从而有利于BC的生产。
木质纤维素中纤维素和半纤维素通过化学或酶水解(糖化)等方式可以转化为发酵可用的五碳糖和六碳糖，如D-木糖。D-木糖是第二丰富的碳水化合物，其含量在草和硬木中特别高，在木质纤维素水解过程中会产生5-35％的D-木糖。有效利用木质纤维素生物质中释放的五碳糖和六碳糖进行大规模发酵是工业化应用的关键。因此，快速、高效地利用木糖是利用木质纤维素生物质生产生物燃料的先决条件。
目前，木糖分解代谢主要有三种途径，包括Weimberg途径、Dahms途径和氧化还原途径。Weimberg木糖代谢途径中，首先D-木糖在xylB基因编码的D-木糖脱氢酶的作用下被氧化成D-木糖-γ-内酯，然后在xylC基因编码的D-木糖-γ-内酯酶的催化下转化为D木糖酸盐，D-木糖酸脱水酶(由xylD编码)催化D木糖酸盐生成2-酮基-3-脱氧木酸盐，3-酮基-2-脱氧木酸脱水酶(由xylX编码)催化2-酮基-3-脱氧木酸盐生成a-酮戊二酸半醛。最后，a-酮戊二酸半醛脱氢酶(由xylA编码)催化a-酮戊二酸半醛生成a-酮戊二酸进入三羧酸循环，参与代谢。
总的来说，相比于其他两种途径，Weimberg途径将D-木糖在五个酶促步骤后被直接氧化成三羧酸(TCA)循环中间产物α-酮戊二酸直接进入三羧酸循环，代谢流程相对较短，整个过程不产生CO2，没有碳损失。并且因为木葡糖酸醋杆菌自身可以将木糖转化为木糖酸，因此，本发明选择木糖Weimberg代谢途径作为重组木葡糖酸醋杆菌工程菌株木糖代谢利用模块的路径。
发明内容
针对上述存在问题，本发明提出构建一种异源表达木糖代谢途径所需基因的工程菌及其应用：
一种木葡糖酸醋杆菌中Weimberg木糖代谢途径的构建方法，首次将木糖Weimberg代谢途径引入木葡糖酸醋杆菌中，将木糖Weimberg代谢途径相关基因构建于一个重组质粒表达载体上，将重组质粒通过高压电穿孔的方式导入到宿主菌CGMCC2955中获得重组木葡糖酸醋杆菌工程菌株CGMCC 26045的构建方法。
所述重组工程菌株构建方法，木葡糖酸醋杆菌可以自身将木糖转化成木糖酸，只需异源表达来自新月丙杆菌的木糖Weimberg代谢途径相关基因中的三个基因xylA(SEQ IDNO.4)、xylD(SEQ ID NO.5)、xylX(SEQ ID NO.6)。
所述重组工程菌株构建方法，将来自新月丙杆菌的木糖Weimberg代谢途径相关基因xylA(SEQ ID NO.4)、xylD(SEQ ID NO.5)、xylX(SEQ ID NO.6)，经过密码子优化，按照如下顺序：xylA-xylD-xylX逐个连接到基础质粒pBla(SEQ ID NO.1)上，然后通过pBla上bla启动子(SEQ ID NO.2)和rrnB T1终止子(SEQ ID NO.2)表达，得到重组质粒。
所述重组工程菌株构建方法，重组质粒导入扩增质粒菌株CGMCC2955的转化方法采用高压电穿孔法，最终得到目标菌株CGMCC26045。
本发明为了克服CGMCC2955以木糖为碳源产生BC量少的困难，通过基因工程等手段，将Weimberg代谢途径关键基因整合到CGMCC2955中构建木葡糖酸醋杆菌工程菌株，获得重组木葡糖酸醋杆菌工程菌株CGMCC 26045，能够利用木糖为碳源的HS液体培养基进行生长代谢并生产BC，开辟了木糖资源化利用的新途径。
本发明构建1种重组质粒(SEQ ID NO.7)，以CGMCC2955为底盘宿主菌，将重组质粒导入CGMCC2955中，重构木葡糖酸醋杆菌的代谢通路，提升了木葡糖酸醋杆菌利用木糖生产BC的能力，提高木糖的资源化利用效率及应用范围。
以pBla(SEQ ID NO.1)为基础质粒构建1种重组质粒(SEQ ID NO.7)，在基础质粒上包括bla启动子(SEQ ID NO.2)和rrnB T1终止子(SEQ ID NO.3)，得到重组质粒pBla-xylA-xylD-xylX(SEQ ID NO.7)，将重组质粒转入野生型木葡糖酸醋杆菌CGMCC2955中，获得工程菌株为：
CGMCC26045：pBla-xylA-xylD-xylX(in CGMCC2955)
Weimberg代谢途径关键基因：
所述α-酮戊二酸半醛脱氢酶基因xylA(GeneBank ID：MG681091.1)源自新月丙杆菌的，核酸序列如图SEQ ID N0.4所示。
所述D-木糖酸脱水酶基因xylD(GeneBank ID：MG681089.1)源自新月丙杆菌的，核酸序列如图SEQ ID N0.5所示。
所述2-酮-3-脱氧-d-木糖酸脱水酶基因xylX(GeneBank ID：MG681090.1)源自新月丙杆菌的，核酸序列如图SEQ ID N0.6所示。
具体说明如下：
步骤一：重组质粒的设计与合成：基础质粒为pBla(SEQ ID NO.1)，其上包括bla启动子(SEQ ID NO.2)和rrnB T1终止子(SEQ ID NO.3)，将本发明所述目的基因xylA、xylD、xylX经密码子优化后，通过bla启动子和rrnB T1终止子表达；
步骤二：重组大肠杆菌和重组木葡糖酸醋杆菌菌株的构建：选取Escherichiacoli DH5α菌株(简称E.coli DH5α)为重组质粒扩增的工程菌用于质粒复制连接；选取CGMCC2955为最终宿主菌，将重组质粒(SEQ ID NO.7)转化进入E.coli DH5α的转化方法采用本领域常规的热休克转化法；然后，利用高压电穿孔技术将重组质粒(SEQ ID NO.7)转移到CGMCC2955感受态中，得到构建的目的工程菌。野生型菌株CGMCC2955作为空白对照，导入重组质粒到CGMCC2955宿主菌的工程菌株命名为：CGMCC26045。
步骤三：进行菌落PCR验证实验：琼脂糖凝胶结果表明，阳性克隆存在，证明目的基因在宿主菌中成功扩增，工程菌株中重组质粒的成功导入和扩增；
步骤四：摇瓶静置发酵及残糖测定实验验证：两株菌CGMCC2955，CGMCC26045在含有浓度为5g/L的木糖为碳源的HS培养基中静置发酵，每隔48h进行取样，将产生的BC膜进行处理后称重。
本发明的有益效果是：上述木糖代谢途径首次在木葡糖酸醋杆菌中的进行功能表达；本发明构建成功的重组木葡糖酸醋杆菌CGMCC26045，所含木糖代谢途径短，不参与PPP途径，能够克服野生型CGMCC2955以木糖为碳源产生BC量低的限制，提高了木糖的资源化利用率并扩展了其应用范围，也可以应用于生产或生活过程中，以木质纤维素水解液中的木糖成分的利用和BC生产及利用相关领域。
附图说明
图1所示为工程菌菌落PCR验证图：M为MAKER，1、2均为CGMCC26045，重组质粒验证选择xylA和启动子的连接处(1183bp)；
图2所示为检测木糖含量时所需的标准曲线；
图3所示为本发明工程菌株以浓度为5g/L的木糖为碳源的HS培养基中木糖含量；
图4所示为本发明工程菌株以浓度为5g/L的木糖为碳源的HS培养基中BC产量。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。其中本发明使用的木葡糖酸醋杆菌CGMCC2955和CGMCC26045在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心有保藏(保藏号为CGMCC No.2955和CGMCCNo.26045)。木葡糖酸醋杆菌CGMCC26045的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间：2022年11月4日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；分类命名：木糖驹氏杆菌 Komagataeibacter xylinus。
实施例1：重组质粒的构建(SEQ ID NO.7)
步骤一：合成并优化上述能够促进木葡糖酸醋杆菌摄取木糖代谢利用的基因序列xylA-xylD-xylX(均来源于新月丙杆菌的木糖Weimberg代谢途径)。
步骤二：将上述三个基因通过BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，连入添加有BamHⅠ酶切位点，EcoRⅠ酶切位点的pBla质粒中，利用DNA无缝克隆技术得到质粒pBla-xylA-xylD-xylX(SEQID NO.7)。
上述构建的质粒转化入大肠杆菌感受态E.coli DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行单双酶切验证及测序验证，以保证目的片段连接正确且碱基序列未发生改变。
实施例2：重组大肠杆菌E.coli DH5α和木葡糖酸醋杆菌的构建
步骤一：转化：将上述得到的重组质粒通过热休克转化法导入E.coli DH5α感受态中，采用LB培养基5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl、50μg/L卡那霉素)进行筛选，在固体培养平板上挑出单菌落后，接种到LB液体培养基(5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl、50μg/L卡那霉素)中进行培养，甘油管保菌。
步骤二：将上述得到的重组质粒通过高压电穿孔法转入木葡糖酸醋杆菌感受态中，电转后采用HS固体培养平板(7.5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/L十二水磷酸氢二钠、25g/L葡萄糖、50μg/L卡那霉素)30℃培养箱培养，得到木葡糖酸醋杆菌工程菌。
步骤三：菌落PCR进行验证：转化子在含有50μg/L卡那霉素的HS固体培养平板中生长，待长出明显单菌落，进行菌落PCR，所需引物、反应体系和PCR条件如下：
引物设计并合成：
xylA和启动子的连接处引物：
上游引物：5’-GACGAAAGGGCCTCGTGATAC-3’
下游引物：5’-ATCTGGGTGTTCGGGTCCAG-3’
PCR反应体系配置(trans fast Taq):ddH2O 8μL；上、下游引物各1μL；Taq酶mix：10μL；一个体系共20μL。
PCR条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸X s(1kb需要30s，只能时间富裕不能不足)，32cycles，最后72℃延伸10min，4℃保温。
SDS-PAGE电泳检测上述菌落PCR的情况，观察有无目的条带并记录对应编号(见图1)
将验证成功的重组木葡糖酸醋杆菌工程菌保菌备用。
向CGMCC2955宿主菌中导入重组质粒后的工程菌命名为CGMCC26045。
实施例3：野生型菌株CGMCC2955和工程菌株CGMCC26045在含有5g/L木糖为碳源的HS培养基中静置发酵。
将所述野生型菌株CGMCC2955和工程菌株CGMCC26045接种到种子培养基活化培养，然后在发酵瓶中进一步进行静止培养，每隔48h取出一批，将发酵液取样离心取上清，用木糖试剂盒检测木糖含量；将每批取出的BC膜进行处理后称重并记录。每株菌做三组平行实验(见图4)
木糖代谢残糖测定：
步骤一：菌种活化：取经过高压蒸汽灭菌的培养基(100mL的摇瓶加30mLHS液体培养基)在超净台中加入加卡那霉素，从长有目的菌株的固体培养基平板上挑取单菌落，接菌，30℃，180rpm/min，培养12h左右，加入纤维素酶将纤维素丝溶解。
步骤二：摇瓶发酵：清洗菌体，将纤维素酶清洗干净，重悬菌体，测定菌体OD600，并将各菌株调至同一生长状态，按初始OD为0.02接种至30mL含有5g/L的木糖为碳源的HS培养基中，加入kana，30℃培养箱进行静置发酵培养。
步骤三：48h，96h，144h进行取样，每组留1mL发酵液离心取上清，利用北京索莱宝科技有限公司D-木糖含量检测试剂盒进行测定，具体操作步骤可参见D-木糖含量检测试剂盒说明书。简要操作步骤如下：
(1)标准液的处理：将标准品用蒸馏水倍比稀释至0.4、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625mg/mL的标准溶液备用。
(2)标准曲线的绘制
(3)混匀后沸水浴8min，冰浴处理将温度降至常温后测定其在554nm下的吸光度，以空白管标零，测定样品管吸光度。标准曲线见(见图2)。重组菌株和原始菌株的木糖利用情况见(见图3)。
实施例4：野生型菌株CGMCC2955和工程菌株CGMCC26045在含有5g/L的木糖为单一碳源的HS培养基中静置发酵产BC能力测定。
步骤一：一级种子菌液：取经过高压蒸汽灭菌的培养基(100mL的摇瓶加30mLHS液体培养基)在超净台中加入加kana，从长有目的菌株的固体培养基平板上挑取单菌落，接菌，30℃，180rpm/min，培养12h左右，加入纤维素酶将纤维素丝溶解12h左右。
步骤二：二级种子菌液：分别取装有30mLHS液体培养基的100mL锥形瓶，将野生型菌株CGMCC2955和工程菌株CGMCC26045分别取出3mL菌液按10％接种至相同的锥形瓶中，每瓶加入15μLkana(1：2000)、300μL纤维素酶按1％加入，30℃，180rpm/min，培养48h左右。
步骤三：48h，96h，144h进行取样，将BC膜取出，用0.1mol/L的NaOH，中途需要多次换新鲜NaOH浸泡，最终将膜浸泡至乳白色半透明状态。
步骤四：将浸泡至乳白色半透明状态的BC膜，继续用蒸馏水进行浸泡，中途需要多次换新鲜蒸馏水进行浸泡，最终将BC膜浸泡至PH为中性状态。
步骤五：将处理后的膜95℃压片干燥，进行称重，重组菌株和原始菌株的BC生产情况(见图4)。
本发明的有益效果是：
利用异源表达技术，结合基因工程等手段，构建一种重组质粒(SEQ ID NO.7)，将木糖利用代谢的关键基因：xylA(SEQ ID NO.4)，xylD(SEQ ID NO.5)，xylX(SEQ ID NO.6)引入CGMCC2955中，重构CGMCC2955的代谢途径，使工程木葡糖酸醋杆菌能够在以木糖为碳源的改良后HS液体培养基中生产BC的产量有极大提高。将改造菌株进行发酵，并测定其在以木糖为碳源的改良后HS液体培养基中的残糖量和BC膜的产量。数据显示，菌株CGMCC26045与CGMCC2955相比，木糖利用率和BC的产量均有较大提升(见图4)。
本发明利用异源表达技术，结合基因工程等手段，构建重组质粒(SEQ ID NO.7)，将木糖代谢的关键基因引入CGMCC2955中，得到能够以木糖为碳源提高BC产量的工程菌株：
CGMCC26045：pBla-XylA-XylD-XylX(in CGMCC2955)
从而增强了木糖利用的途径，降低BC生产的成本。
本发明公开和提出的技术方案，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对专利范围的限制。特别需要指出的是，对于本领域的技术人员来说,在不脱离本专利构思的前提下,上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进,这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
Claims (5)
1.一种木葡糖酸醋杆菌中Weimberg木糖代谢途径的构建方法，其特征在于：首次将Weimberg木糖代谢途径引入木葡糖酸醋杆菌中，将木糖Weimberg代谢途径相关基因构建于一个重组质粒表达载体上，将重组质粒整合到宿主菌木葡糖酸醋杆菌中获得重组木葡糖酸醋杆菌工程菌株CGMCC 26045的构建方法。
2.根据权利要求1所述重组工程菌株构建方法，其特征在于：木葡糖酸醋杆菌可以自身将木糖转化成木糖酸，只需异源表达来自新月丙杆菌的木糖Weimberg代谢途径相关基因中的三个基因xylA(SEQ ID NO.4)、xylD(SEQ ID NO.5)、xylX(SEQ ID NO.6)。
3.根据权利要求1所述重组工程菌株构建方法，其特征在于：将来自新月丙杆菌的木糖Weimberg代谢途径相关基因xylA、xylD、xylX，经过密码子优化，按照如下顺序：xylA-xylD-xylX逐个连接到基础质粒pBla(SEQ ID NO.1)上，然后通过pBla上bla启动子(SEQ IDNO.2)和rrnB T1终止子(SEQ ID NO.3)表达，得到重组质粒pBla-xylA-xylD-xylX(SEQ IDNO.7)。
4.根据权利要求1所述重组工程菌株构建方法，其特征在于：所述基因工程菌来源于木葡糖酸醋杆菌。
5.根据权利要求1所述菌株在发酵制备细菌纤维素中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211638911.8A CN116240232A (zh) | 2022-12-20 | 2022-12-20 | 木葡糖酸醋杆菌中Weimberg木糖代谢途径的构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211638911.8A CN116240232A (zh) | 2022-12-20 | 2022-12-20 | 木葡糖酸醋杆菌中Weimberg木糖代谢途径的构建方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116240232A true CN116240232A (zh) | 2023-06-09 |
Family
ID=86625062
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211638911.8A Pending CN116240232A (zh) | 2022-12-20 | 2022-12-20 | 木葡糖酸醋杆菌中Weimberg木糖代谢途径的构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116240232A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009081941A1 (ja) * | 2007-12-25 | 2009-07-02 | National University Corporation Tottori University | 木質系および草本系バイオマス糖化液からのバイオエタノール並行発酵菌 |
| US20200318146A1 (en) * | 2019-04-04 | 2020-10-08 | Braskem S.A. | Metabolic engineering for simultaneous consumption of xylose and glucose for production of chemicals from second generation sugars |
| CN114703185A (zh) * | 2022-03-16 | 2022-07-05 | 天津科技大学 | 木葡萄糖醋杆菌来源序列的启动子功能鉴定及在促进细菌纤维素合成中的应用 |
-
2022
- 2022-12-20 CN CN202211638911.8A patent/CN116240232A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009081941A1 (ja) * | 2007-12-25 | 2009-07-02 | National University Corporation Tottori University | 木質系および草本系バイオマス糖化液からのバイオエタノール並行発酵菌 |
| US20200318146A1 (en) * | 2019-04-04 | 2020-10-08 | Braskem S.A. | Metabolic engineering for simultaneous consumption of xylose and glucose for production of chemicals from second generation sugars |
| CN114703185A (zh) * | 2022-03-16 | 2022-07-05 | 天津科技大学 | 木葡萄糖醋杆菌来源序列的启动子功能鉴定及在促进细菌纤维素合成中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LISA WASSERSTROM等: "Exploring d‑xylose oxidation in Saccharomyces cerevisiae through the Weimberg pathway", 《AMB EXPRESS》, vol. 8, no. 33, 5 March 2018 (2018-03-05) * |
| 武雅楠: "丙酮酸对木葡糖酸醋杆菌细菌纤维素合成的影响", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》, no. 04, 15 April 2019 (2019-04-15) * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Levin et al. | Challenges for biohydrogen production via direct lignocellulose fermentation | |
| Li et al. | Efficient production of 2, 3-butanediol from corn stover hydrolysate by using a thermophilic Bacillus licheniformis strain | |
| An et al. | Characterization on hydrogen production performance of a newly isolated Clostridium beijerinckii YA001 using xylose | |
| JP5324430B2 (ja) | サーモアナエロバクター・マスラニｂｇ１株 | |
| Chookaew et al. | Fermentative production of hydrogen and soluble metabolites from crude glycerol of biodiesel plant by the newly isolated thermotolerant Klebsiella pneumoniae TR17 | |
| Saripan et al. | Biohydrogen production by Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum KKU-ED1: Culture conditions optimization using mixed xylose/arabinose as substrate | |
| JP5907865B2 (ja) | 改善されたアラビノース資化能を有するザイモモナス（ｚｙｍｏｍｏｎａｓ） | |
| WO1990002193A1 (en) | Ethanol production by genetically engineered escherichia coli strains | |
| Xu et al. | Cell growth and hydrogen production on the mixture of xylose and glucose using a novel strain of Clostridium sp. HR-1 isolated from cow dung compost | |
| JP2013545491A (ja) | バイオマス加水分解物培地中でのキシロース資化性ザイモモナス・モビリスによるエタノール産生の向上 | |
| Tian et al. | Recent advances in lactic acid production by lactic acid bacteria | |
| Sveinsdóttir et al. | Ethanol production from monosugars and lignocellulosic biomass by thermophilic bacteria isolated from Icelandic hot springs | |
| US20110230682A1 (en) | Microorganisms with inactivated lactate dehydrogenase gene (ldh) for chemical production | |
| Wu et al. | Microbial application of thermophilic Thermoanaerobacterium species in lignocellulosic biorefinery | |
| Teramoto et al. | Effects of potential inhibitors present in dilute acid-pretreated corn stover on fermentative hydrogen production by Escherichia coli | |
| CN112280700B (zh) | 一株耐乙酸和甲酸的发酵菌株及其构建方法 | |
| Dai et al. | Bioconversion of inulin to 2, 3-butanediol by a newly isolated Klebsiella pneumoniae producing inulinase | |
| CN114540395B (zh) | 希瓦氏菌中木糖利用代谢的构建方法 | |
| CA2920617A1 (en) | Clostridium acetobutylicum capable of fermenting lignocellulosic hydrolysate to produce butanol | |
| CN102936576B (zh) | 一种木糖醇基因工程菌及其混合转化生产木糖醇的方法 | |
| CN116240232A (zh) | 木葡糖酸醋杆菌中Weimberg木糖代谢途径的构建方法 | |
| US20170260549A1 (en) | Modified bacteria for the production of bioalcohol | |
| CN114410562A (zh) | 一种克雷伯氏菌工程菌及其在生产乙醇中的应用 | |
| CN101633690B (zh) | 一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| Su et al. | Development and application of a novel screening method and experimental use of the mutant bacterial strain Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 for production of butanol via fermentation of fresh cassava |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |