CN110713966A - 一种利用GlcN6P感应元器件促进N-乙酰氨基葡萄糖合成的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用GlcN6P感应元器件促进N‑乙酰氨基葡萄糖合成的方法，属于遗传工程技术领域。本发明以枯草芽孢杆菌BSGNY‑P_veg‑glmS‑P₄₃‑GNA1为出发菌株，在基因组上整合了受GlcN6P响应元器件调控的CRISPRi系统动态弱化N‑乙酰氨基葡萄糖合成竞争途径；同时利用GlcN6P响应启动子在质粒上调控GNA1的表达动态调控N‑乙酰氨基葡萄糖合成途径；并对乙偶姻合成途径的关键基因alsSD进行了敲除。该菌株在15L发酵罐上进行补料分批发酵时N‑乙酰氨基葡萄糖产量达到131.6g/L，而且没有副产物乙偶姻的积累，这为工业化发酵法生产GlcNAc奠定了基础。

Description

一种利用GlcN6P感应元器件促进N-乙酰氨基葡萄糖合成的 方法

技术领域

本发明涉及一种利用GlcN6P感应元器件促进N-乙酰氨基葡萄糖合成的方法，属于遗传工程技术领域。

背景技术

乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。在以葡萄糖为底物合成N-乙酰氨基葡萄糖时，糖酵解途径、磷酸戊糖途径以及肽聚糖合成途径会竞争性地利用进入胞内的葡萄糖从而限制N-乙酰氨基葡萄糖的高效合成。公开号为CN108148797A的专利申请中提供了一种重组枯草芽孢杆菌(BSGNX-dCas9-zpg)，利用木糖诱导的CRISPRi系统对这三条竞争途径进行了弱化，使得N-乙酰氨基葡萄糖的产量与产物转化率均达到较高水平，而且改造后解除了分解代谢物阻遏效应使其可以共利用葡萄糖和木糖。但是木糖的市场价格要比葡萄糖昂贵得多，在发酵生产中使用会造成生产成本的增加，而且诱导剂的添加也会增加发酵操作的复杂程度，因此还需进一步对重组枯草芽孢杆菌进行改造，使其在利用葡萄糖作为唯一碳源时可以自动对相关代谢网络进行调节，并高效地合成N-乙酰氨基葡萄糖。

因此，提供一种低成本、操作简单、无需添加诱导剂、高效的N-乙酰氨基葡萄糖合成方法，对于N-乙酰氨基葡萄糖的工业应用有重要价值。

发明内容

为了解决“发酵过程中加入诱导剂造成操作复杂，加入木糖引起生产成本增加”的问题，本发明只使用葡萄糖作为唯一碳源，利用重组枯草芽孢杆菌持续高效地合成N-乙酰氨基葡萄糖。

本发明的第一个目的是提供一种促进N-乙酰氨基葡萄糖合成的方法，是使用GlcN6P感应元器件控制N-乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1的表达来动态调控N-乙酰氨基葡萄糖合成途径；同时利用GlcN6P感应元器件调控表达的dCas9蛋白和三个分别作用于zwf，pfkA与glmM基因的sgRNA表达片段结合后形成的复合体对糖酵解途径、磷酸戊糖途径和肽聚糖合成途径进行动态弱化；所述GlcN6P感应元器件包含有枯草芽孢杆菌的转录因子GamR以及含GamR结合位点的启动子，所述启动子是P_gamA启动子或者将GamR结合位点添加到组成型启动子上构建的杂合启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述转录因子GamR的氨基酸序列含NCBI编号为WP_015382651.1的氨基酸序列的第1-235位。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子P_gamA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，，所述构建的杂合启动子包括P_vg1、P_vg2、P_vg3、P_vg4、P_vg5、P_vg6、P_vg7、P_rg、P_lg、P_vg、P_sg、P_sg1、P_sg2、P_sg3，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.19所示。

在本发明的一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1以载体pSTg-GNA1为表达载体，所述载体pSTg-GNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，是将启动子P_gamA与编码GNA1的基因连接到载体pSTOP1622上，替换了载体pSTOP1622上的阻遏蛋白xylR和启动子P_xylA后得到的。载体pSTOP1622的构建方法见文献：Biedendieck,R.,Yang,Y.,Deckwer,W.D.,Malten,M.,Jahn,D.,2007.Plasmid system for the intracellularproduction and purification of affinity-tagged proteins in Bacillusmegaterium.Biotechnol.Bioeng.96,525–537.。

在本发明的一种实施方式中，GNA1的表达具体是将游离载体pSTg-GNA1转化到枯草芽孢杆菌中，并使用四环素筛选转化子。

在本发明的一种实施方式中，所述dCas9蛋白的氨基酸序列如专利CN108148797A中的SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述dCas9蛋白，所述载体pLCg-dCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，是将载体pLCx-dCas9(构建方法记载于公开号为CN108148797A的专利申请中)中的阻遏蛋白XylR和木糖启动子替换为gamR和P_gamA后得到的。所述载体pLCx-dCas9的P_gamA上游含有氯霉素抗性基因，可用于抗性筛选；在氯霉素抗性基因-P_gamA-dCas9两端为枯草芽孢杆菌lacA基因的上游和下游同源臂。

在本发明的一种实施方式中，dCas9蛋白的表达具体是通过转化使用内切酶Eco91I线性化后的pLCg-dCas9载体整合到枯草芽孢杆菌BSGNY-P_veg-glmS-P₄₃-GNA1基因组上的lacA位点。

在本发明的一种实施方式中，所述作用于zwf的sgRNA表达片段的核苷酸序列如专利CN108148797A中的SEQ ID NO.2所示；所述作用于pfkA的sgRNA表达片段的核苷酸序列如专利CN108148797A中的SEQ ID NO.3所示；所述作用于glmM的sgRNA表达片段的核苷酸序列如专利CN108148797A中的SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述sgRNA的表达片段通过转化线性化后的整合载体psga-zpg(构建方法记载于公开号为CN108148797A的专利申请中)整合到重组枯草芽孢杆菌基因组上，所述载体psga-zpg的核苷酸序列如专利CN108148797A中的SEQ ID NO.7所示。

在本发明的一种实施方式中，所述三个分别作用于zwf，pfkA与glmM基因的sgRNA表达片段和dCas9结合后可通过CRISPRi机制对糖酵解途径、磷酸戊糖途径和肽聚糖合成途径进行动态弱化，具体是转录形成的sgRNA可以同dCas9蛋白形成复合体，然后引导其识别并结合到与该sgRNA特异性互补的基因组DNA上，从而阻止了RNA聚合酶通过该基因，抑制了基因的转录过程，实现了对特定基因的表达弱化。因为dCas9蛋白是使用GlcN6P感应元器件进行动态表达的，因此弱化的过程也是动态的。关于CRISPRi的具体原理可参见文献：Gilbert LA,Larson MH,Morsut L,Liu Z,Brar GA,Torres SE,Stern-Ginossar N,Brandman O,Whitehead EH,Doudna JA,Lim WA,Weissman JS,Qi LS.2013.CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.Cell154:442.。

在本发明的一种实施方式中，所述sgRNA的表达片段通过转化内切酶Eco91I线性化后的psga-zpg载体整合到重组枯草芽孢杆菌BSGNY-P_veg-glmS-P₄₃-GNA1基因组上amyE位点。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括在枯草芽孢杆菌敲除了副产物乙偶姻合成关键基因alsSD。

在本发明的一种实施方式中，所述的乙偶姻合成途径关键基因alsSD的敲除是通过转化alsSD敲除框实现的，敲除框的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，是通过融合PCR将alsSD基因的上下游同源臂与壮观霉素抗性基因融合之后得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述副产物乙偶姻合成关键基因的敲除具体是：首先以枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增alsSD的上游和下游同源臂各1000bp；然后以p7S6质粒为模板，扩增壮观霉素抗性基因片段；之后通过融合PCR将alsSD上下游同源臂与壮观霉素抗性基因通过融合PCR进行融合，得到敲除框；直接将敲除框转化枯草芽孢杆菌后，使用壮观霉素抗性平板进行筛选。p7S6质粒以及详细基因敲除方法可参见文献：Yan X,Yu HJ,Hong Q,Li SP.2008.Cre/lox system and PCR-based genome engineering in Bacillussubtilis.Appl.Environ.Microbiol.74:5556–5562。

本发明的第二个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌使用GlcN6P感应元器件控制N-乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1的表达来动态调控N-乙酰氨基葡萄糖合成途径；同时利用GlcN6P感应元器件调控表达的dCas9蛋白和三个分别作用于zwf，pfkA与glmM基因的sgRNA表达片段结合后形成的复合体对糖酵解途径、磷酸戊糖途径和肽聚糖合成途径进行动态弱化；所述GlcN6P感应元器件包含有枯草芽孢杆菌的转录因子GamR以及含GamR结合位点的启动子，所述转录因子GamR的氨基酸序列含NCBI编号为WP_015382651.1的氨基酸序列的第1-235位，所述启动子是P_gamA启动子或者将GamR结合位点添加到组成型启动子上构建的杂合启动子。

本发明的第三个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，所述方法是以枯草芽孢杆菌BSGNY-P_veg-glmS-P₄₃-GNA1为出发菌株；所述出发菌株以枯草芽孢杆菌168(BS168)为基础，基因型作如下改造得到的：ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔptaΔglcKΔpckAΔpyk::lox72，并以启动子P_veg调控表达来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB与枯草芽孢杆菌168自身的glmS、在质粒上以启动子P₄₃调控GNA1的重组表达。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌BSGNY-P_veg-glmS-P₄₃-GNA1，构建方法记载于公开号为CN107699533A的专利申请中。

本发明的第四个目的是提供一种生产乙酰氨基葡萄糖的方法，是将上述重组枯草芽孢杆菌进行种子培养，再转入发酵培养基中发酵培养。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将上述重组枯草芽孢杆菌置于35-39℃、200-220rpm下培养10-15h的种子以1-10％的接种量转入摇瓶发酵培养基，35-39℃、200-220pm条件下培养50-70h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将35-39℃、200-220rpm下培养10-15h的种子以1-10％的接种量转入上罐发酵培养基，于装液量为30-50％的发酵罐中，35-39℃、pH6.5-7.5条件下培养，通气量为1-2vvm，转速控制在500-900rpm之间维持溶氧在30％以上，持续流加750g/L以控制葡萄糖浓度在1-30g/L之间。

本发明还提供上述重组枯草芽孢杆菌或上述促进N-乙酰氨基葡萄糖合成的方法在食品、制药、营养保健品或者化妆品领域中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供了GlcN6P感应元器件的构建方法，得到了可以被胞内GlcN6P激活的一系列合成启动子。并利用该感应元器件实现了一种利用葡萄糖高效合成N-乙酰氨基葡萄糖的方法，即通过GlcN6P感应元器件调控N-乙酰氨基葡萄糖合成途径及其主要竞争途径(糖酵解途径、磷酸戊糖途径和肽聚糖合成途径)，促进了N-乙酰氨基葡萄糖的持续高效合成；并进一步通过敲除副产物乙偶姻的合成途径，避免了副产物的积累，进一步提高了N-乙酰氨基葡萄糖的产量。

(2)本发明构建的重组枯草芽孢杆菌可持续高效地利用葡萄糖合成乙酰氨基葡萄糖，其在摇瓶上产量可达到28.0g/L，15L发酵罐上进行补料分批发酵时是产量可达到131.6g/L，是目前发酵生产的最高水平，为其工业化奠定了基础。

附图说明

图1为GlcN6P对相关基因调控的作用原理。1A为枯草芽孢杆菌中葡萄糖(Glc)、氨基葡萄糖(GlcN)和N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)分解代谢相关基因，1B为GlcN6P对GlcN和GlcNAc分解相关基因的调控作用，1C为GlcN6P对启动子PgamA的调控机制。

图2为构建的GlcN6P响应元器件。2A为含有GamR结合位点的启动子的部分序列，2B为这些启动子在GamR结合前后的强度变化。

图3为GlcN6P响应元器件的调控作用验证。3A为激活作用验证，3B为抑制作用验证，3C为同时进行激活和抑制的作用验证。

图4为GlcN6P响应元器件的调控下的细胞生长与产物合成情况；4A是利用GlcN6P响应元器件进行调控的实现过程，4B为使用GlcN6P响应元器件调控后24h的细胞干重，4C为36h的细胞干重，4D为GlcNAc的合成情况，4E为副产物乙偶姻的合成情况。

图5为BNDR022的15L罐上的补料分批发酵结果。

图6为BNDR122的15L罐上的补料分批发酵结果。

具体实施方式

种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

摇瓶发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨6，酵母粉12，尿素6，K₂HPO₄·3H₂O 12.5，KH₂PO₄2.5，CaCO₃ 5，微量元素10ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO₄·5H₂O 1.0，CoCl₂·6H₂O0.4，NaMoO₄·2H₂O 0.2，ZnSO₄·7H₂O 0.2，AlCl₃·6H₂O 0.1，CuCl₂·H₂O 0.1，H₃BO₄ 0.05，含5M HCl。

发酵罐发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨20，酵母粉20，尿素10，K₂HPO₄·3H₂O 12.5，KH₂PO₄ 2.5，CaCO₃ 5，微量元素10ml/L；微量元素溶液按g/L计含有：MnSO₄·5H₂O 1.0，CoCl₂·6H₂O 0.4，NaMoO₄·2H₂O 0.2，ZnSO₄·7H₂O 0.2，AlCl₃·6H₂O 0.1，CuCl₂·H₂O 0.1，H₃BO₄ 0.05，含5M HCl。

乙酰氨基葡萄糖的测定方法：高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1260，RID检测器，HPX-87H柱(Bio-Rad Hercules,CA)，流动相：5mM H₂SO₄，流速0.6mL/min，柱温35℃，进样体积为10μL。

实施例1：GlcN6P感应元器件的构建

本发明的工作机制：在枯草芽孢杆菌中，6-磷酸氨基葡萄糖(GlcN6P)是重要的代谢调节物。在以葡萄糖为碳源时，其胞内浓度受到由glmS核糖开关介导的反馈调节。而在以氨基葡萄糖(GlcN)或N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)为碳源时，GlcN6P又会分别激活与这两种碳源分解代谢相关操纵子的表达，这一过程是通过转录因子GamR或NagR实现的(图1)。其中GamR的调控原理如图1C所示，GamR其可以识别和结合到启动子P_gamA上的特异性位点(gamO)从而阻止RNA聚合酶的结合和转录的起始。当胞内的GlcN6P浓度高于其响应阈值时，gamO会与GamR结合并改变其结构从而使其丧失对启动子P_gamA的结合能力，转录便可以正常进行(Gaugué,I.,Oberto,J.,Plumbridge,J.,2014.Regulation of amino sugar utilizationin Bacillus subtilis by the GntR family regulators,NagR andGamR.Mol.Microbiol.92,100–115.https://doi.org/10.1111/mmi.12544)。因此，可以用这一调控系统进行改造，并利用其实现对于N-乙酰氨基葡萄糖以及其主要竞争途径的自动调控，从而促进葡萄糖持续高效地流向N-乙酰氨基葡萄糖合成。

本发明构建的GlcN6P感应元器件由转录因子GamR和含有GamR结合位点的启动子组成，含有GamR结合位点的启动子的部分序列如图2A所示。感应元器件受胞内GlcN6P调控的作用机制如图1C所示，当GlcN6P浓度较低时，GamR与包含有其结合位点的启动子发生结合，限制了下游基因的转录；而随着GlcN6P浓度的升高，GamR与启动子的结合也越来越弱，因此下游基因的转录则逐渐增强。

为了构建得到不同强度的响应元件，设计了一系列包含有GamR结合位点的杂合启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.19所示)，合成后连接到了含有绿色荧光蛋白的载体上。同时将野生型的枯草芽孢杆菌168(BS168)中的gamR基因进行了敲除，得到重组菌株BS01(BS168△gamR)，并将包含有上述杂合启动子的质粒分别转化到了BS168以及BS01中，验证GamR结合前后启动子的表达情况。

图2B为在GamR表达或者缺失时不同杂合启动子的强度变化情况，这些启动子中P_vg6、P_gamA和P_sg2在GamR结合前后表达强度分别有2.4、5.7和11.9倍的变化。为了进一步验证了这三个启动子对于GlcN6P的响应情况，在BS01中又敲除了GlcN6P流入糖酵解途径的相关基因nagB和gamA得到重组菌株BS03(BS168△gamR△nagB△gamA)，这样可以通过添加不同浓度的GlcN来控制其胞内GlcN6P的浓度。利用图3A与3B所示的调控结构，分别验证了由GlcN6P响应元器件介导的基因的激活与抑制效应。验证激活作用时，将GamR与含有GamR结合位点的启动子都放置于同一载体上，并利用GFP验证了GlcN添加量对启动子强度的影响，P_vg6、P_gamA和P_sg2都是随着GlcN的添加量的增加而增强，且当添加量在1g/L时达到最大，超过此浓度时也不再增强，而且这三个启动子的强度大约为1:3:4；在验证抑制作用时，将pLCx-dCas9中阻遏蛋白XylR和木糖启动子分别替换成了gamR和P_vg6、gamR和P_gamA、gamR和P_sg2，得到载体pLCv-dCas9、pLCg-dCas9和pLCs-dCa9。将三个载体分别使用Eco91I进行线性化后转化BS03，再分别转化Eco31I线性化的GFP特异性sgRNA表达载体psga-GFP(核苷酸序列见SEQID NO.20)和组成型表达的GFP的质粒，得到菌株BS13，BS23和BS33。通过添加GlcN测定荧光蛋白的表达情况，抑制强度同样是随着GlcN添加量的增加而增强，而且三个启动子的弱化作用也是P_vg6<P_gamA<P_sg2。如图3C所示，最后使用绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(mCherry)验证了利用GlcN6P响应元器件同时进行激活和抑制的效果。

实施例2：利用GlcN6P响应元器件调控GlcNAc合成

为了利用构建的GlcN6P响应元器件调控GlcNAc合成，将公开号为CN107699533A的专利申请中构建的重组枯草芽孢杆菌BSGNY-P_veg-glmS-P₄₃-GNA1的gamR基因进行敲除，得到重组菌株BNDR000。将载体pLCg-dCas9(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)和paga-zpg(核苷酸序列如专利CN108148797A中的SEQ ID NO.7所示)使用内切酶Eco91I线性化后转化BNDR000得到BNDR020，再将受P_gamA调控的GNA1表达载体pSTg-GNA1(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)转化到BNDR020中后得到重组菌株BNDR022，最后敲除副产物乙偶姻合成的关键基因alsSD得到重组菌株BNDR122。

实施例3：重组枯草芽孢杆菌BNDR122发酵生产乙酰氨基葡萄糖

采用实施例2构建得到的重组芽孢杆菌BNDR022进行摇瓶发酵，以枯草芽孢杆菌BSGNY-P_veg-glmS-P₄₃-GNA1作为对照，在相同条件下培养和发酵。将37℃、220rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，37℃、220rpm条件下培养60h。最终发酵上清液中的GlcNAc含量达到28.0g/L，较出发菌株(BSGNY-P_veg-glmS-P₄₃-GNA1)提高了53.0％；同时本发明提供的重组枯草芽孢杆菌发酵N-乙酰氨基葡萄糖对葡萄糖的得率也由0.244g/g葡萄糖提高到了0.373g/g葡萄糖，但是菌株BNDR还是有10g/L的副产物乙偶姻生成。为了消除乙偶姻的生成，对乙偶姻合成关键基因alsSD进行了敲除，得到重组菌株BNDR122，对该菌株进行了15L发酵罐水平的验证。将37℃、220rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入上罐发酵培养基，于15L发酵罐、37℃、pH 7.0条件下培养，通气量为1.5vvm，转速控制在500-900rpm之间维持溶氧在30％以上。初始装液量为7.5L，并持续流加750g/L以控制葡萄糖浓度在1-30g/L之间。最终发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到131.6g/L，为目前发酵生产的最高水平，这为其工业化奠定了基础。

对照例1：使用不同的GlcN6P感应元器件调控GlcNAc合成

本发明的方法中，使用GlcN6P感应元器件对GlcNAc合成的关键基因GNA1进行了强化，并对其主要竞争途径的关键基因zwf、pfkA和glmM进行了弱化(图4A)，从而促进了重组枯草芽孢杆菌利用葡萄糖持续高效合成GlcNAc。本发明共得到了三个强度不同的GlcN6P响应启动子P_vg6、P_gamA和P_sg2，在重组菌株BNDR122中强化与弱化都是使用的三个启动子中强度中等的启动子P_gamA进行调控。为了比较不同强度启动子的影响，利用载体pLCs-dCas9(将载体pLCg-dCas9中的P_gamA启动子替换为P_sg2)和pLCv-dCas9(将载体pLCg-dCas9中的P_gamA启动子替换为P_vg6)对P_sg2和P_vg6表达的dCas9进行了整合；并转化了利用P_sg2和P_vg6调控表达GNA1的载体pSTs-GNA1(将载体pSTg-GNA1中的P_gamA启动子替换为P_sg2)和pSTv-GNA1(将载体pSTg-GNA1中的P_gamA启动子替换为P_vg6)。比较使用不同强度的启动子组合进行强化和弱化的结果如图4B-4E所示，只有强化与弱化都使用中等强度启动子P_gamA时，GlcNAc的产量最高，为28.0g/L。

对照例2：乙偶姻合成途径敲除影响

BNDR122与BNDR022相比，没有副产物乙偶姻的积累。为了比较敲除乙偶姻合成关键基因alsSD的影响，对BNDR022和BNDR122在15L发酵罐上进行了补料分批发酵，发酵结果分被如图5和6所示。BNDR022生成的副产物乙偶姻最终可以达到22.9g/L，而GlcNAc产量可以达到96.3g/L；与之相比BNDR122的GlcNAc产量可以达到131.6g/L，而且没有副产物乙偶姻的生成，这不仅为其进一步的发酵生产奠定了基础，同时也更加有利于后续的分离与纯化过程。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种利用GlcN6P感应元器件促进N-乙酰氨基葡萄糖合成的方法

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5755

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

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<210> 2

<211> 171

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<400> 2

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1 5 10 15

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20 25 30

Leu Ala Lys Asp Asp Phe Ser Lys Gly Tyr Val Asp Leu Leu Ser Gln

35 40 45

Leu Thr Ser Val Gly Asn Leu Asp Gln Glu Ala Phe Glu Lys Arg Phe

50 55 60

Glu Ala Met Arg Thr Ser Val Pro Asn Tyr His Ile Val Val Ile Glu

65 70 75 80

Asp Ser Asn Ser Gln Lys Val Val Ala Ser Ala Ser Leu Val Val Glu

85 90 95

Met Lys Phe Ile His Gly Ala Gly Ser Arg Gly Arg Val Glu Asp Val

100 105 110

Val Val Asp Thr Glu Met Arg Arg Gln Lys Leu Gly Ala Val Leu Leu

115 120 125

Lys Thr Leu Val Ser Leu Gly Lys Ser Leu Gly Val Tyr Lys Ile Ser

130 135 140

Leu Glu Cys Val Pro Glu Leu Leu Pro Phe Tyr Ser Gln Phe Gly Phe

145 150 155 160

Gln Asp Asp Cys Asn Phe Met Thr Gln Arg Phe

165 170

<210> 3

<211> 9954

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

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gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctct actagagtca 9180

cactggctca ccttcgggtg ggcctttctg cgtttatacc tagggatata ttccgcttcc 9240

tcgctcactg cagcgtcatc acgaaagaac aagacttttc accatataaa ctgctgatcg 9300

tcccgatgct gtatttaatc agcgaggaca ccgtttcccg tttaaaagcg tttacggctg 9360

acggcggcac cttagtcatg acgtatatca gcggggttgt gaatgagcat gacttaacat 9420

acacaggcgg atggcatccg gatcttcaag ctatatttgg agttgagcct cttgaaacgg 9480

acaccctgta tccgaaggat cgaaacgctg tcagctaccg cagccaaata tatgaaatga 9540

aggattatgc aaccgtgatt gatgtaaaga cagcttcagt ggaagcggtg tatcaagaag 9600

atttttatgc gcgcacgcca gcggtcacaa gccatgagta tcagcagggc aaggcgtatt 9660

ttatcggcgc gcgtttggag gatcaatttc agcgtgattt ctatgagggt ctgatcacag 9720

acctgtctct ctctccagtt tttccggttc ggcacggaaa aggcgtctcc gtacaagcga 9780

ggcaggatca ggacaatgat tatatttttg tcatgaattt cacggaagaa aaacagctgg 9840

tcacgtttga tcagagtgtg aaggacataa tgacaggaga catattgtca ggcgacctga 9900

cgatggaaaa gtatgaagtg agaattgtcg taaacacaca ttagggggta cccc 9954

<210> 4

<211> 3244

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ctttataagc ggattatgat tgtctttgcg gtaagcgata acccattctg cattaagctg 60

tatttggtcc atttttcgat aagtaacatc caaattaaat aattttttgg ccgaggaagg 120

aacaaatgtc ataccaattc cggcactgac taaaccaatc accatttgat attctgtggc 180

ttcctggaca atgttgggtc tgaagcccgc ttgttcacag aactgaataa aatccatgta 240

tagagtaggc catgcttctt tagcaacagt aataattggt tcatctctta aatcctcaat 300

cgtaattgat tccttagaag tcaatgggtg ttgcttaggc aaagctaaaa cacaagggct 360

gctttgggcg gtttcgatat gtaaagctgt atgctgtaag ggaggatgaa gtataccaat 420

atcaatgttg ccctttagta gctcctcctg ctgcctagac gaggatattt cacgcagttc 480

tattttcaca gatgggaatt ttttacgata ttcccggaca atcggcggca gaaattcata 540

tgtagctgat ccgacaaaac cgattacgag aaggccttgc tcgccgcggg ccgtccgctg 600

tgccagttca attccttgtc cgatttgcat caatgccatg cggcaatgat ttaaaaagat 660

ttctcctgct gcggtaagct cgacaaatcg ttttgtcctt ttcagaagcg taactccgac 720

ttcttcctcc agctgtttga tctgctggct gagaggaggc tgcgtcatgt tcagccgccg 780

ggcagccttt ccgaaatgaa gctcttcggc tactgcgata aagtattgaa gatggcgaag 840

ctccattcaa tatgcattcc tttccatagg ttaataattc gtattacata ttaatcataa 900

ggcgaatcga tattggaggt caatttccaa agagtgtata gtgaaactta tcacaagata 960

tttaaaattt tacgtttaaa atgcataata aggagtgagg gtgttacgaa ttcgagctcg 1020

gtacccgggg atcctctaga gattgtaccg ttcgtatagc atacattata cgaagttatc 1080

gattttcgtt cgtgaataca tgttataata actataacta ataacgtaac gtgactggca 1140

agagatattt ttaaaacaat gaataggttt acacttactt tagttttatg gaaatgaaag 1200

atcatatcat atataatcta gaataaaatt aactaaaata attattatct agataaaaaa 1260

tttagaagcc aatgaaatct ataaataaac taaattaagt ttatttaatt aacaactatg 1320

gatataaaat aggtactaat caaaatagtg aggaggatat atttgaatac atacgaacaa 1380

attaataaag tgaaaaaaat acttcggaaa catttaaaaa ataaccttat tggtacttac 1440

atgtttggat caggagttga gagtggacta aaaccaaata gtgatcttga ctttttagtc 1500

gtcgtatctg aaccattgac agatcaaagt aaagaaatac ttatacaaaa aattagacct 1560

atttcaaaaa aaataggaga taaaagcaac ttacgatata ttgaattaac aattattatt 1620

cagcaagaaa tggtaccgtg gaatcatcct cccaaacaag aatttattta tggagaatgg 1680

ttacaagagc tttatgaaca aggatacatt cctcagaagg aattaaattc agatttaacc 1740

ataatgcttt accaagcaaa acgaaaaaat aaaagaatat acggaaatta tgacttagag 1800

gaattactac ctgatattcc attttctgat gtgagaagag ccattatgga ttcgtcagag 1860

gaattaatag ataattatca ggatgatgaa accaactcta tattaacttt atgccgtatg 1920

attttaacta tggacacggg taaaatcata ccaaaagata ttgcgggaaa tgcagtggct 1980

gaatcttctc cattagaaca tagggagaga attttgttag cagttcgtag ttatcttgga 2040

gagaatattg aatggactaa tgaaaatgta aatttaacta taaactattt aaataacaga 2100

ttaaaaaaat tataaataac ttcgtatagc atacattata cgaacggtag aatcgtcgac 2160

ctgcaggcat gcaagcttgg cactggccgt caagaaaaaa agaaagcccc ttttagcagg 2220

gctttctttt tatttggctc ttttcctgat tttagataaa ataacatcaa aacagtaaag 2280

gtgtggtctg atgaaaatat tggttttggc agtgcatcct catatggaga cctcagttgt 2340

taataaggcg tgggctgagg aattgagtaa acatgacaat atcacagtac gggatcttta 2400

taaggaatac ccggatgaag cgatagatgt tgcgaaggaa cagcagctgt gcgaggaata 2460

cgatcggatt gtctttcaat tcccgctata ttggtacagc tctccgccgc tcttgaaaaa 2520

atggcaggat cttgtgctga cttatggctg ggcttttggt tcagaaggaa atgccttgca 2580

tggcaaggag ctgatgctgg ctgtatcaac agggagcgaa gcggaaaaat atcaagcggg 2640

cggagcaaat cattactcga tcagtgagct attgaaacca tttcaggcca cgagtaatct 2700

gatcggcatg aagtatctgc ctccatatgt gttctatggc gtgaattatg cagctgcaga 2760

ggatatttct cacagtgcaa aacggttagc cgaatacatc cagcagcctt ttgtttaaaa 2820

tacagccctg tccaacatac ggcagggctg tatttgttta aaaatccggc agctcagaca 2880

ggttattttc cttgatgccg tccggttcac ttcgcaaaat gtcacgcccg tatttatgga 2940

agacatcaac atgagcgagt tttcctgatt ttgcttctga cagcgcagta gggtagtcga 3000

gctctcttcc tgtattggtt ttcactgcga taatattgtc ttcctcattt cttctaaccg 3060

caataatttc ttcttttcca gatggaacat tttcttgatc ggcagttgtt tgccgggctt 3120

tatacgattc atatgctgct tcaaattgat ccatatttac acctccgctt tttagcgtga 3180

acaaaaatgt cgatgatcat gtaaggtttc gacacagcat acgacaatat ttcctgagaa 3240

atat 3244

<210> 5

<211> 113

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cttttataac aaattttcag aaattaatat tgacagtttg ataagggcgg tgctaaattc 60

gtaatgacaa gtatcataaa ttggtcataa caaatatggt gcttgtctat ctc 113

<210> 6

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ttttgtcaaa ataattttat tgacaacgtc ttattaacgt tgatataatt taaattttat 60

ttgacaaaaa tgggctcgtg ttgtacaata aatgtcgtaa attggtcata acaa 114

<210> 7

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ttttgtcaaa ataattttat tgacaacgtc ttattaacgt tgatataatt taaattttat 60

ttgacataaa ttggtcataa caatacaata aatgtcg 97

<210> 8

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ttttgtcaaa ataattttat tgacaacgtc ttattaacgt tgataaattg gtcataacaa 60

ttgacaaaaa tgggctcgtg ttgtacaata aatgtcg 97

<210> 9

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ttttgtcaaa ataattttat tgacaacgtc ttattaacgt tgatataatt taaattttat 60

ttgacataaa ttggtcataa caatacaata aatgtcgtaa attggtcata acaa 114

<210> 10

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

ttttgtcaaa ataattttat tgacaacgtc ttattaacgt tgataaattg gtcataacaa 60

ttgacaaaaa tgggctcgtg ttgtacaata aatgtcgtaa attggtcata acaa 114

<210> 11

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ttttgtcaaa ataattttat tgacaacgtc ttattaacgt tgataaattg gtcataacaa 60

ttgacataaa ttggtcataa caatacaata aatgtcg 97

<210> 12

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ttttgtcaaa ataattttat tgacaacgtc ttattaacgt tgataaattg gtcataacaa 60

ttgacataaa ttggtcataa caatacaata aatgtcgtaa attggtcata acaa 114

<210> 13

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

cgagctttct taccttgacg gcagaaataa gctcgaagat tacgacatct taacattgat 60

gaaatactaa ggataaccgc ataacgaaaa agcactccat gtcagggtgc ttttttccta 120

ttgttttgca tttattttat ataatatttg gctatttgaa cttctgctct ttacatcttt 180

cgtttttttc ttgtaaattc gtaatgacaa gtatcataaa ttggtcataa caaatatggt 240

gcttgtctat ctc 253

<210> 14

<211> 258

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

tcaatatgtt ttcaaaagcc ggaaaagcgc tttcggacac cgtaaccaat actgcccagt 60

caatgtatga atggatacgg gatatgaatc aataagtacg tgaaagagaa aagcaaccca 120

gatatgatag ggaacttttc tctttcttgt tttacattga atctttacaa tcctattgat 180

ataatctaag ctagtgtata aattcgtaat gacaagtatc ataaattggt cataacaaat 240

atggtgcttg tctatctc 258

<210> 15

<211> 183

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

aatgtttagt ggaaatgatt gcggcatccc gcaaaaaata ttgctgtaaa taaactggaa 60

tctttcggca tcccgcatga aacttttcac ccatttttcg ttgacaaaaa catttttttc 120

atttaaattc gtaatgacaa gtatcataaa ttggtcataa caaatatggt gcttgtctat 180

ctc 183

<210> 16

<211> 183

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

aatgtttagt ggaaatgatt gcggcatccc gcaaaaaata ttgctgtaaa taaactggaa 60

tctttcggca tcccgcatga aacttttcac ccatttttcg ttgacaaaaa catttttttc 120

atttaaattc gtaatgacaa gtatcataaa ttggtcataa caaatatggt gcttgtctat 180

ctc 183

<210> 17

<211> 183

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

aatgtttagt ggaaatgatt gcggcatccc gcaaaaaata ttgctgtaaa taaactggaa 60

tctttcggca tcccgcatga aacttttcac ccatttttcg ttgacataaa ttggtcataa 120

caataaattc gtaatgacaa gtatcataaa ttggtcataa caaatatggt gcttgtctat 180

ctc 183

<210> 18

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

aatgtttagt ggaaatgatt gcggcatccc gcaaaaaata ttgctgtaaa taaactggaa 60

tctttcggca tcccgcatga aacttttcac ccatttttcg taaattggtc ataacaattg 120

acaaaaacat ttttttcatt taaattcgta atgacaagta tcataaattg gtcataacaa 180

atatggtgct tgtctatctc 200

<210> 19

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

aatgtttagt ggaaatgatt gcggcatccc gcaaaaaata ttgctgtaaa taaactggaa 60

tctttcggca tcccgcatga aacttttcac ccatttttcg taaattggtc ataacaattg 120

acataaattg gtcataacaa taaattcgta atgacaagta tcataaattg gtcataacaa 180

atatggtgct tgtctatctc 200

<210> 20

<211> 4238

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

tcgagttcat gtgcagctcc atcagcaaaa ggggatgata agtttatcac caccgactat 60

ttgcaacagt gccgttgatc gtgctatgat cgactgatgt catcagcggt ggagtgcaat 120

gtcatgaggg aagcggtgat cgccgaagta tcgactcaac tatcagaggt agttggcgtc 180

atcgagcgcc atctcgaacc gacgttgctg gccgtacatt tgtacggctc cgcagtggat 240

ggcggcctga agccacacag tgatattgat ttgctggtta cggtgaccgt aaggcttgat 300

gaaacaacgc ggcgagcttt gatcaacgac cttttggaaa cttcggcttc ccctggagag 360

agcgagattc tccgcgctgt agaagtcacc attgttgtgc acgacgacat cattccgtgg 420

cgttatccag ctaagcgcga actgcaattt ggagaatggc agcgcaatga cattcttgca 480

ggtatcttcg agccagccac gatcgacatt gatctggcta tcttgctgac aaaagcaaga 540

gaacatagcg ttgccttggt aggtccagcg gcggaggaac tctttgatcc ggttcctgaa 600

caggatctat ttgaggcgct aaatgaaacc ttaacgctat ggaactcgcc gcccgactgg 660

gctggcgatg agcgaaatgt agtgcttacg ttgtcccgca tttggtacag cgcagtaacc 720

ggcaaaatcg cgccgaagga tgtcgctgcc gactgggcaa tggagcgcct gccggcccag 780

tatcagcccg tcatacttga agctagacag gcttatcttg gacaagaaga agatcgcttg 840

gcctcgcgcg cagatcagtt ggaagaattt gtccactacg tgaaaggcga gatcaccaag 900

gtagtcggca aataagatgc cgctcgccag tcgattggct gagctcatga agttcctatt 960

ccgaagttcc gcgaacgcgt aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1020

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1080

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1140

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1200

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1260

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1320

agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1380

accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1440

gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 1500

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 1560

cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 1620

cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 1680

cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 1740

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 1800

taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 1860

gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatgctg 1920

gatccgcgat gtttgcaaaa cgattcaaaa cctctttact gccgttattc gctggatttt 1980

tattgctgtt tcatttggtt ctggcaggac cggcggctgc gagtgctgaa acggcgaaca 2040

aatcgaatga gcttacagca ccgtcgatca aaagcggaac cattcttcat gcatggaatt 2100

ggtcgttcaa tacgttaaaa cacaatatga aggatattca tgatgcagga tatacagcca 2160

ttcagacatc tccgattaac caagtaaagg aagggaatca aggagataaa agcatgtcga 2220

actggtactg gctgtatcag ccgacatcgt atcaaattgg caaccgttac ttaggtactg 2280

aacaagaatt taaagaaatg tgtgcagccg ctgaagaata tggcataaag gtcattgttg 2340

acgcggtcat caatcatacc accagtgatt atgccgcgat ttccaatgag gttaagagta 2400

ttccaaactg gacacatgga aacacacaaa ttaaaaactg gtctgatcga tgggatgtca 2460

cgcagaacat gccatggcat gagattctac cgttcgtata gcatacatta tacgaagtta 2520

tcttgatatg gctttttata tgtgttactc tacatacaga aaggaggaac taaatatggc 2580

caagttgacc agtgccgttc cggtgctcac cgcgcgcgac gtcgccggag cggtcgagtt 2640

ctggaccgac cggctcgggt tctcccggga cttcgtggag gacgacttcg ccggtgtggt 2700

ccgggacgac gtgaccctgt tcatcagcgc ggtccaggac caggtggtgc cggacaacac 2760

cctggcctgg gtgtgggtgc gcggcctgga cgagctgtac gccgagtggt cggaggtcgt 2820

gtccacgaac ttccgggacg cctccgggcc ggccatgacc gagatcggcg agcagccgtg 2880

ggggcgggag ttcgccctgc gcgacccggc cggcaactgc gtgcacttcg tggccgagga 2940

gcaggactga ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggtaaatcgt cgacctgcag 3000

gcttattaac gttgatataa tttaaatttt atttgacaaa aatgggctcg tgttgtacaa 3060

taaatgtaca agtgttggcc aaggaacgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 3120

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt gaattccgtc 3180

gacatggatg agcgatgatg atatccgttt aggctgggcg gtgatagctt ctcgttcagg 3240

cagtacgcct cttttctttt ccagacctga gggaggcgga aatggtgtga ggttcccggg 3300

gaaaagccaa ataggcgatc gcgggagtgc tttatttgaa gatcaggcta tcactgcggt 3360

caatagattt cacaatgtga tggctggaca gcctgaggaa ctctcgaacc cgaatggaaa 3420

caaccagata tttatgaatc agcgcggctc acatggcgtt gtgctggcaa atgcaggttc 3480

atcctctgtc tctatcaata cggcaacaaa attgcctgat ggcaggtatg acaataaagc 3540

tggagcgggt tcatttcaag tgaacgatgg taaactgaca ggcacgatca atgccaggtc 3600

tgtagctgtg ctttatcctg atgatattgc aaaagcgcct catgttttcc ttgagaatta 3660

caaaacaggt gtaacacatt ctttcaatga tcaactgacg attaccttgc gtgcagatgc 3720

gaatacaaca aaagccgttt atcaaatcaa taatggacca gagacggcgt ttaaggatgg 3780

agatcaattc acaatcggaa aaggagatcc atttggcaaa acatacacca tcatgttaaa 3840

aggaacgaac agtgatggtg taacgaggac cgagaaatac agttttgtta aaagagatcc 3900

agcgtcggcc aaaaccatcg gctatcaaaa tccgaatcat tggagccagg taaatgctta 3960

tatctataaa catgatggga gccgagtaat tgaattgacc ggatcttggc ctggaaaacc 4020

aatgactaaa aatgcagacg gaatttacac gctgacgctg cctgcggaca cggatacaac 4080

caacgcaaaa gtgattttta ataatggcag cgcccaagtg cccggtcaga atcagcctgg 4140

ctttgattac gtgctaaatg gtttatataa tgactcgggc ttaagcggtt ctcttcccca 4200

ttgacccaag cttagatcta ttaccctgtt atccctac 4238

Claims (10)

1.一种促进N-乙酰氨基葡萄糖合成的方法，其特征在于，使用GlcN6P感应元器件控制N-乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1的表达来动态调控N-乙酰氨基葡萄糖合成途径；同时利用GlcN6P感应元器件调控表达的dCas9蛋白和三个分别作用于zwf，pfkA与glmM基因的sgRNA表达片段结合后形成的复合体对糖酵解途径、磷酸戊糖途径和肽聚糖合成途径进行动态弱化；所述GlcN6P感应元器件包含有转录因子GamR以及含GamR结合位点的启动子，所述转录因子GamR含NCBI编号为WP_015382651.1的氨基酸序列的第1-235位，所述启动子是P_gamA启动子或者将GamR结合位点添加到组成型启动子上构建的杂合启动子。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述启动子P_gamA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述N-乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述N-乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1以载体pSTg-GNA1为表达载体，所述载体pSTg-GNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述dCas9蛋白的氨基酸序列如专利CN108148797A中的SEQ ID NO.1所示；所述dCas9蛋白以载体pLCg-dCas9为表达载体进行整合表达，所述载体pLCg-dCas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述作用于zwf的sgRNA表达片段的核苷酸序列如专利CN108148797A中的SEQ ID NO.2所示；所述作用于pfkA的sgRNA表达片段的核苷酸序列如专利CN108148797A中的SEQ ID NO.3所示；所述作用于glmM的sgRNA表达片段的核苷酸序列如专利CN108148797A中的SEQ ID NO.4所示；所述sgRNA的表达片段通过转化载体psga-zpg整合到重组枯草芽孢杆菌基因组上，所述载体psga-zpg的核苷酸序列如专利CN108148797A中的SEQ ID NO.7所示。

6.如权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括同时敲除了副产物乙偶姻合成关键基因alsSD。

7.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌使用GlcN6P感应元器件控制N-乙酰氨基葡萄糖乙酰化酶GNA1的表达来动态调控N-乙酰氨基葡萄糖合成途径；同时利用GlcN6P感应元器件调控表达的dCas9蛋白和三个分别作用于zwf，pfkA与glmM基因的sgRNA表达片段结合后形成的复合体对糖酵解途径、磷酸戊糖途径和肽聚糖合成途径进行动态弱化；所述GlcN6P感应元器件包含有转录因子GamR以及含GamR结合位点的启动子，所述转录因子GamR含NCBI编号为WP_015382651.1的氨基酸序列的第1-235位，所述启动子是P_gamA启动子或者将GamR结合位点添加到组成型启动子上构建的杂合启动子。

8.如权利要求7所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，是以枯草芽孢杆菌BSGNY-P_veg-glmS-P₄₃-GNA1为出发菌株；所述出发菌株以枯草芽孢杆菌168为基础，基因型作如下改造得到的：ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔptaΔglcKΔpckAΔpyk::lox72，并以启动子P_veg调控表达来自大肠杆菌的磷酸酶yqaB与枯草芽孢杆菌168自身的glmS、在质粒上以启动子P₄₃调控GNA1的重组表达。

9.一种生产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求7或8所述的重组枯草芽孢杆菌置于35-39℃、200-220rpm下培养10-15h的种子以1-10％的接种量转入摇瓶发酵培养基，35-39℃、200-220pm条件下培养50-70h；或，所述方法是将权利要求7或8所述的重组枯草芽孢杆菌置于35-39℃、200-220rpm下培养10-15h的种子以1-10％的接种量转入上罐发酵培养基，于装液量为30-50％的发酵罐中，35-39℃、pH 6.5-7.5条件下培养，通气量为1-2vvm，转速控制在500-900rpm之间维持溶氧在30％以上，持续流加750g/L以控制葡萄糖浓度在1-30g/L之间。

10.权利要求7-8任一所述的重组枯草芽孢杆菌或权利要求1-6任一所述的促进N-乙酰氨基葡萄糖合成的方法在食品、制药、营养保健品或者化妆品领域中的应用。

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