CN114250188A

CN114250188A - 合成n-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用

Info

Publication number: CN114250188A
Application number: CN202111268012.9A
Authority: CN
Inventors: 谭天伟; 刘慧�; 李泽民
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2021-10-29
Filing date: 2021-10-29
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2041-10-29
Also published as: CN114250188B

Abstract

本发明涉及一种合成N‑乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用。该基因工程菌为含有氨基葡萄糖合成酶基因glmS、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的重组谷氨酸棒状杆菌和6p‑乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB，且其经过了敲除GlcNAc逆转运途径、分解代谢途径和竞争代谢途径的相关基因的的底盘微生物改造。该基因工程菌安全无毒性，能够利用微生物发酵法高产GlcNAc，且批次稳定，生产成本较低，应用前景广阔。

Description

合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于基因重组技术领域，涉及一种合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖又称N-乙酰葡糖胺(N-acetyl-D-(+)-glucosamine， GlcNAc)，分子式C8H15NO6，分子量221.21，是葡萄糖的2位羟基被乙酰氨基取代后的产物，是一种具有生物活性的功能单糖，是生物体内多种多糖的组成单位，尤其是甲壳类动物的外骨骼含量最高。GlcNAc是合成双歧因子的重要前体，在生物体内具有许多重要生理功能；其具有软骨损伤修复、再生功能；也可改善免疫调节，刺激抗肿瘤免疫应答，具有抗肿瘤和消炎功能；同时，作为新型生化药品，它和氨基葡萄糖(GlcN)是糖胺聚糖结构单元的前体，包括人体内的透明质酸和硫酸软骨素，长期以来一直被用作治疗骨关节炎和保持软骨和关节健康的药物和营养品；其在药品和保健品领域有着广泛的应用。

GlcNAc的生产方法主要有化学法、酶催化法和微生物发酵法。化学法是通过酸水解甲壳素得到乙酰氨糖，但该方法污染大，且产品不适用于海鲜过敏症患者。与化学法相比，酶催化法和微生物发酵法属于环境友好型生产方法，但是酶催化几丁质降解合成乙酰氨糖，受制于底物虾蟹壳预处理困难、关键酶活性低、产物分离纯化困难，导致规模化生产难度较大。微生物发酵法生产GlcNAc是目前最具前景的方法，其在代谢工程技术和合成生物学技术的推动下，发展潜力越来越大，优势日益明显。

目前，利用微生物发酵法生产GlcNAc的主要菌株为大肠杆菌和酵母。早在 2005年，MingDe Deng等人利用大肠杆菌，通过代谢工程改造和发酵过程优化，可以产生110g/LGlcNAc，然而由于大肠杆菌在发酵过程中会分泌内毒素，生产的氨基葡萄糖并不能满足食品级需求。近几年来已报道的利用酵母发酵生产 GlcNAc，最高产量仅为3g/L，而且发酵周期长达135小时，生产强度较低。

因此，目前存在的问题是需要构建一株合成GlcNAc的无毒性安全菌株，其能够利用微生物发酵法高产GlcNAc，生产成本较低。

发明内容

本发明的目的之一是针对现有技术的存在的缺陷提供一种合成GlcNAc的基因工程菌，该菌株安全无毒性，能够利用微生物发酵法高产GlcNAc，生产成本较低。

本发明的目的之二是提供上述合成GlcNAc的基因工程菌在合成GlcNAc中的应用。

为此，本发明提供了一种合成GlcNAc的基因工程菌。

根据本发明第一方面的实施方式，所述合成GlcNAc的基因工程菌为含有氨基葡萄糖合成酶基因glmS、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB的重组谷氨酸棒状杆菌。

在本发明的一些实施例中，所述氨基葡萄糖合成酶基因glmS来源于枯草芽孢杆菌168，所述氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1来源于秀丽隐杆线虫，所述6p- 乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB来源于大肠杆菌K12。

在本发明的另一些实施例中，所述基因工程菌还包含在氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1前插入的融合标签，所述融合标签包括HA、CMYC、Flag和STREPII 中的一种或几种，优选为HA。

在本发明的一些优选的实施例中，来源于枯草芽孢杆菌168的氨基葡萄糖合成酶基因glmS，来源于秀丽隐杆线虫的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1，以及来源于大肠杆菌K12的6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB均进行了密码子优化。

根据本发明第二方面的实施方式，所述合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌为经过底盘微生物改造的合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌。

本发明中，所述底盘微生物改造包括GlcNAc逆转运途径、分解代谢途径的相关基因的敲除，以及竞争代谢途径相关基因的敲除或弱化。

在本发明的一些实施例中，所述GlcNAc逆转运途径的相关基因包括胞外 GlcNAc转运至胞内的GlcNAc特异性磷酸转移酶基因cgl2642。

在本发明的另一些实施例中，所述GlcNAc分解代谢途径的相关基因包括乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径的6p-GlcNAc脱乙酰酶基因nagA和6p-GlcN脱氨基酶基因nagB。

在本发明的又一些实施例中，所述竞争代谢途径相关基因包括副产物乳酸合成途径的基因ldh、甘露糖途径的相关基因、磷酸戊糖途径的相关基因和糖酵解途径相关基因。

本发明还提供了一种如本发明上述基因工程菌在合成N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。

根据本发明，所述应用包括将所述基因工程菌进行发酵培养制备N-乙酰氨基葡萄糖。

在本发明的一些实施例中，发酵的诱导条件为：葡萄糖添加浓度为60-100g/L，进一步优选为80-100g/L；和/或，玉米浆添加浓度为8-18g/L，进一步优选为 16-18g/L；和/或，IPTG诱导剂添加时间为发酵2-14小时，优选为2-5小时，进一步优选为2-3小时。

本发明对谷氨酸棒状杆菌从两个方面来进行改造，包括GlcNAc合成途径的构建及强化、GlcNAc合成菌株的底盘微生物改造(包括逆转运途径和分解代谢途径的阻断、副产物途径敲除)和GlcNAc合成途径关键酶的强化，最后构造一株高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌。本发明选用的宿主谷氨酸棒状杆菌是食品级微生物，对人和动物均无致病性，且在同等培养条件下具有更好的生长优势，可比其他菌株积累更高浓度的初级代谢产物GlcNAc。本发明中所构建的重组谷棒菌株是首次确定在GlcNAc合成途径关键基因Gna1前添加融合标签促进其表达，并对来源于枯草芽孢杆菌168的氨基葡萄糖合成酶基因glmS，来源于秀丽隐杆线虫的的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1，以及来源于通过过表达大肠杆菌来源的6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB均进行了密码子优化，并且首次在谷氨酸棒状杆菌中对甘露糖途径进行敲除，减少6p-GlcNAc的消耗，敲除磷酸戊糖竞争途径的基因zwf，弱化糖酵解途径基因fba的一株能够高效合成 GlcNAc的谷氨酸棒状杆菌，该重组菌株是目前在谷氨酸棒状杆菌中所能产生的最高GlcNAc浓度。最终本发明所构建的重组谷氨酸棒状杆菌的GlcNAc发酵浓度达到23.3g/L，转化率为0.3883g/g Glucose(葡萄糖)。

附图说明

下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：

图1示出敲除竞争途径磷酸戊糖途径关键基因zwf对GlcNAc合成的影响。

图2示出表达密码子优化后的氨基葡萄糖合成酶基因glmS、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1，6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB对GlcNAc合成的影响。

图3为GlcNAc合成途径的构建关键酶gna1前添加融合标签HA、CMYC、 FLag、STREPPII对GlcNAc合成的影响。

图4示出敲除6p-GlcNAc甘露糖差向异构酶基因nanE对GlcNAc合成的影响。

图5示出弱化糖酵解关键酶基因fba对GlcNAc合成的影响。

图6示出重组菌株的诱导条件IPTG诱导剂添加时间的优化结果。

图7示出重组菌株的葡萄糖添加浓度的优化结果。

图8示出重组菌株的玉米浆添加浓度的优化结果。

图9为重组谷氨酸棒状杆菌高效合成GlcNAc的途径示意图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

Ⅰ.术语

本发明所述用语“内源性基因”是指自身基因组内的基因。

本发明所述用语“外源性基因”是通过基因工程技术等途径引入靶细胞中的基因序列。

本发明所述用语“底盘微生物”亦称为“底盘微生物细胞”是指利用微生物细胞作为平台，置入功能化的生物系统，使该细胞能够具备人类需要的功能，用于生物合成。所以，底盘微生物细胞需要本身的功能精简，但是要具备最基本的自我复制和代谢能力，这样就能成为一个可以不断添加功能的空白平台。

本发明所述用语“基因工程菌”是指将目的基因导入宿主生物体(即宿主细胞或底盘微生物或细菌体)内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌，如谷氨酸棒状杆菌等。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，因此，本发明中也将基因工程菌称为为重组微生物。

本发明所述用语“重组”是指利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后再将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。

本发明所述用语“乙酰氨基葡萄糖-6磷酸特异性的磷酸酶”指大肠杆菌K12来源的糖磷酸酶，编码基因为yqaB，帮助使6P-GlcNAc更有效去磷酸化的酶。

本发明中所述“反义RNA弱化方法”为asRNA策略，是一种易操作的弱化方法，其不需要任何外源蛋白的辅助就可完成弱化基因的效果，将300bp的目标基因片段反向插入到启动子后，在转录阶段，这300bp的mRNA会与目标基因的 mRNA结合成双链，然后被降解，从而减少了目标基因的的mRNA水平，对目标基因完成了弱化。

本发明所述用语“弱化”指将300bp的目标基因片段反向插入到启动子后，在转录阶段，这300bp的mRNA会与目标基因的mRNA结合成双链，然后被降解，从而减少了目标基因的的mRNA水平，对目标基因完成弱化。

本发明中所述“△”代表敲除基因的意思。

Ⅱ.实施方案

现有的利用微生物发酵法生产GlcNAc的技术中，大肠杆菌在发酵过程中会分泌内毒素，生产的氨基葡萄糖并不能满足食品级需求；利用酵母发酵生产 GlcNAc，最高产量仅为3g/L，而且发酵周期长达135小时，生产强度较低。鉴于此，本发明人对于利用微生物发酵法生产GlcNAc进行了大量研究，具体研究过程如下：

本发明选择食品安全级(GARS)且不易染菌，基因操作技术成熟的谷氨酸棒状杆菌来生产GlcNAc。GlcNAc的生成速率与菌体生长速率直接相关，是初级代谢产物，因此GlcNAc的发酵类型属于生长耦联型。而谷氨酸棒状杆菌可以很好地利用葡萄糖作为碳源，有着比其他菌株更好的生长优势；具有该特点的谷氨酸棒状杆菌更有利于GlcNAc的合成。

本发明利用谷氨酸棒状杆菌全基因组代谢网络模型和流平衡分析方法计算GlcNAc的理论产率。在没有产物GlcNAc合成所谓限制条件下，首先计算得到最大的生物质生成速率为0.42mmol/Dw h。再限制生物质合成速率，计算GlcNAc 的理论得率，最大理论得率随生物质合成速率的增大而降低。当没有生物质合成时，N-GlcNAc对葡萄糖的最大理论产率为67％(mol/mol)和82％(g/g)。由于菌株生长中一定会存在生物质合成，实际上GlcNAc可达到的最高产率约为最大理论得率的70％，即实际上谷棒菌株中GlcNAc可达到的最高产率为0.574g/g。

在发酵过程中，当葡萄糖用尽，GlcNAc也可作为替代碳和氮源，被甘露糖转运蛋白(由nanE编码)和乙酰氨糖特异性转运蛋白(由cgl2642编码)转运和磷酸化。因此需要敲除甘露糖转运蛋白和GlcNAc逆转运的相关基因，以减少胞外GlcNAc的消耗；接着进一步敲除胞内乙酰氨基葡萄糖的分解代谢基因nagA/B，减少胞内GlcNAc的损耗。

其次，重组谷氨酸棒状杆菌中GlcNAc的高效生物合成也需要合成和转运的协同改造，以增加产品浓度和转化率。在产GlcNAc的重组谷棒菌株内，GlcNAc 合成途径包含五个反应，每个反应所需的底物都有相应的竞争途径，为了提供产品的转化率，减少原料的浪费，就要着重对这些竞争途径进行阻断或者不同程度的弱化，减少碳代谢的损失，以达到增强合成途径碳代谢的目的。

在阻断或者弱化竞争途径之后，为了进一步增强中间合成途径，提高产品转化率，提高关键酶氨基葡萄糖合成酶(编码基因glmS)、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1、6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB的酶活成为另一需要解决的问题。为了进一步提高产品转化率，本发明对谷氨酸棒状杆菌从两个方面来进行改造，包括GlcNAc合成途径的构建及强化以及GlcNAc合成菌株的底盘微生物改造，最后构造一株高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌，该菌株安全无毒性，其能够利用微生物发酵法高产GlcNAc，且培养基成分简单，批次稳定，生产成本较低。

因此，本发明第一方面的实施方式所涉及的合成GlcNAc的基因工程菌，为含有氨基葡萄糖合成酶基因glmS、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB的重组谷氨酸棒状杆菌。

本发明中所述氨基葡萄糖合成酶基因glmS来源于枯草芽孢杆菌168，所述氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1来源于秀丽隐杆线虫，所述6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB来源于大肠杆菌K12。

在本发明的一些具体的实施例中，所述大肠杆菌(Escherichia coli)K12的保藏编号为ATCC 53678。

所述氨基葡萄糖合成酶基因glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和6p- 乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB用于在重组谷氨酸棒状杆菌中构建和强化 GlcNAc合成途径。

本发明中，所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的保藏编号为ATCC13032。该菌株为食品级菌株，安全、无毒性。

本领域技术人员应该了解的是，由于谷氨酸棒状杆菌自身含有氨基葡萄糖合成酶基因glmS。因此，本发明中所述合成GlcNAc的基因工程菌中所含的氨基葡萄糖合成酶基因glmS，由内源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS和来自于枯草芽孢杆菌168的外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS组成，且所述外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS在该基因工程菌中被表达。

本发明中，来自于所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的保藏编号为ATCC13032的氨基葡萄糖合成酶基因glmS的核苷酸序列如SEQ No.1 所示。

本发明中，将来源于枯草芽孢杆菌168的氨基葡萄糖合成酶基因glmS，来源于秀丽隐杆线虫的的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1，以及来源于大肠杆菌K12 的6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB均进行了密码子优化。

本发明中，密码子优化后的氨基葡萄糖合成酶基因glmS核苷酸序列如SEQ No.2所示。

本发明中，密码子优化后的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1核苷酸序列如 SEQNo.3所示。

本发明中，密码子优化后的6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB核苷酸序列如SEQ No.4所示。

本领域技术人员应该了解的是，本发明中上述来源为谷氨酸棒状杆菌的外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS，是指通过载体导入谷氨酸棒状杆菌靶细胞的是与该谷氨酸棒状杆菌靶细胞自身基因组内的基因序列同源性为100％的基因，例如，核苷酸序列如SEQNo.1所示的来自于所述谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的保藏编号为ATCC13032的氨基葡萄糖合成酶基因glmS。

根据本发明，所述基因工程菌还包含在氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1前插入的融合标签，所述融合标签包括HA、CMYC、Flag和STREPII中的一种或几种，优选为HA。

在本发明的一些实施例中，在所述氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1前插入融合标签HA、CMYC、FLag、STREPPI，优选HA来提高基因gna1的起始翻译速率。相应地，所述氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1为密码子优化后的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1，其核苷酸序列如SEQ No.3所示。

在本发明的一些具体的实施例中，在经过密码子优化的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1前插入融合标签HA；相应地，插入了融合标签HA的密码子优化后的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的核苷酸序列如SEQ No.5所示。

在本发明的一些具体的实施例中，在经过密码子优化的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1前插入融合标签CMYC；相应地，插入了融合标签CMYC的密码子优化后的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的核苷酸序列如SEQ No.6所示。

在本发明的一些具体的实施例中，在经过密码子优化的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1前插入融合标签FLag；相应地，插入了融合标签FLag的密码子优化后的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的核苷酸序列如SEQ No.7所示。

在本发明的一些具体的实施例中，在经过密码子优化的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1前插入融合标签STREPPII；相应地，插入了融合标签STREPPII的密码子优化后的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1的核苷酸序列如SEQ No.8所示。

在一些具体优选的例子中，本发明中所述合成GlcNAc的基因工程菌含有内源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS和外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS(密码子优化)，以及氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1(外源性基因，密码子优化，添加融合标签)和6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB(外源性基因，密码子优化)，用于在重组谷氨酸棒状杆菌中构建和强化GlcNAc合成途径。

进一步地，所述合成GlcNAc的基因工程菌为高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌，密码子优化后的外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS、密码子优化后的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1(外源性基因)以及密码子优化后6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB(外源性基因)在该基因工程菌中被表达。

在一些例子中，例如，可以在重组谷氨酸棒状杆菌中表达外源性氨基葡萄糖合成酶基因glmS(密码子优化)、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1(密码子优化)和6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB(密码子优化)，用于构建重组质粒的相关引物如表1所示，相应的序列如SEQ No.15-24。

表1构建重组质粒的相关引物(基因glmS、gna1和yqaB)

本发明第二方面的实施方式所涉及的合成GlcNAc的基因工程菌为经过底盘微生物改造的合成GlcNAc的基因工程菌。

根据本发明的一些实施例，所述底盘微生物改造包括GlcNAc逆转运途径相关基因的敲除。这可以理解为，本发明中的合成GlcNAc的基因工程菌为敲除了 GlcNAc逆转运途径的相关基的重组谷氨酸棒状杆菌。

本发明中，GlcNAc逆转运途径的相关基因包括胞外GlcNAc转运至胞内的 GlcNAc特异性磷酸转移酶基因cgl2642。

在本发明的一些具体的实施例中，所述基因cgl2642的核苷酸序列如SEQ No.39所示。

根据本发明的另一些实施例，所述底盘微生物改造包括分解代谢途径的相关基因的敲除。这可以理解为，本发明中的合成GlcNAc的基因工程菌为阻断了GlcNAc分解代谢途径的重组谷氨酸棒状杆菌。

本发明中，所述GlcNAc分解代谢途径的相关基因包括乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径的6p-GlcNAc脱乙酰酶基因nagA和6p-GlcN脱氨基酶基因nagB。

在本发明的一些具体的实施例中，所述基因nagA的核苷酸序列如SEQ No.40 所示。

在本发明的一些具体的实施例中，所述基因nagB的核苷酸序列如SEQ No.41 所示。

关于GlcNAc逆转运途径的相关基因包括胞外GlcNAc转运至胞内的GlcNAc 特异性磷酸转移酶基因cgl2642以及GlcNAc分解代谢途径的相关基因nagA和基因nagB的敲除操作参见中国专利CN 110669708A。

根据本发明的又一些实施例，所述底盘微生物改造还包括竞争代谢途径相关基因的敲除或弱化。这可以理解为，本发明中的合成GlcNAc的基因工程菌为敲除或弱化竞争代谢途径相关基因的重组谷氨酸棒状杆菌。

本发明中，所述竞争代谢途径相关基因包括副产物乳酸合成途径的基因ldh、甘露糖途径的相关基因、磷酸戊糖途径的相关基因和糖酵解途径基因。

在本发明的一些具体的实施例中，磷酸戊糖途径的相关基因包括基因zwf(竞争6p-glucose的消耗)，本发明中对此基因进行了敲除阻断。

在本发明的一些具体的例子中，所述磷酸戊糖途径的基因zwf的核苷酸序列如SEQ No.9所示。

在本发明的另一些具体的实施例中，所述甘露糖途径的相关基因包括将 6p-GlcNAc转化成6p-mannose的6p-GlcNAc甘露糖差向异构酶基因nanE(竞争 6p-GlcNAc的消耗)，本发明中对此基因进行了敲除阻断。本发明中的合成GlcNAc 的基因工程菌为阻断了磷酸戊糖这个途径的重组谷氨酸棒状杆菌。

在本发明的一些具体的例子中，所述基因nanE的核苷酸序列如SEQ No.10 所示。

根据本发明的又一些具体的实施例中，所述糖酵解途径的相关基因包括基因fba，本发明中采用反义RNA弱化方法对基因fba进行了三种不同程度的弱化，分别命名为asfba1、asfba2、asfba3。本发明中的合成GlcNAc的基因工程菌为阻断了磷酸戊糖途径、甘露糖途径、乳酸合成途径和弱化了糖酵解途径的重组谷氨酸棒状杆菌。

在本发明的一些具体的实施例中，所述基因fba的核苷酸序列如SEQ No.11 所示。

在本发明的一些具体的实施例中，所述基因asfba1的核苷酸序列如SEQ No.12所示。

在本发明的一些具体的实施例中，所述基因asfba2的核苷酸序列如SEQ No.13所示。

在本发明的一些具体的实施例中，所述基因asfba3的核苷酸序列如SEQ No.14所示。用于构建重组质粒的相关引物如表2所示，相应的序列如SEQ No. 15-38。

表2构建敲除质粒的相关引物(基因zwf和nanE、fba)

本发明中所述合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌采用以下方法制备：

(1)构建高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌，并敲除阻断竞争代谢途径磷酸戊糖途径：

步骤A，在谷氨酸棒状杆菌中敲除竞争代谢途径磷酸戊糖途径，阻断6p-glucos 的分解代谢；

所述磷酸戊糖途径的主要基因是zwf；

步骤B，向步骤A获得的合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌中导入氨基葡萄糖合成酶基因glmS、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB，并在该重组谷氨酸棒状杆菌中表达氨基葡萄糖合成酶glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB；

所述氨基葡萄糖合成酶glmS来源于来源于枯草芽孢杆菌168；

所述氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1来源于秀丽隐杆线虫菌；

所述6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB来源于大肠杆菌K12；

上述步骤B的筛选敲除的结果表面：进行磷酸戊糖途径主要基因zwf的敲除后的高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌的GlcNAc产率较高，获得最佳高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌。

(2)对高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌中的GlcNAc合成途径进行强化表达：

步骤C，对氨基葡萄糖合成酶基因glmS、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1 和6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB均进行密码子优化。

所述氨基葡萄糖合成酶glmS来源于来源于枯草芽孢杆菌168；

所述氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1来源于秀丽隐杆线虫菌；

所述6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB来源于大肠杆菌K12；

步骤D，分别向步骤A获得的合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌中导入密码子优化前后的来源于来源于枯草芽孢杆菌168的氨基葡萄糖合成酶基因glmS、来源于秀丽隐杆线虫菌的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和来源于大肠杆菌 K12的6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB；并在该重组谷氨酸棒状杆菌中表达氨基葡萄糖合成酶glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB；

对比含有密码子优化前后的氨基葡萄糖合成酶基因glmS、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌的GlcNAc产率，获得最佳高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌。

上述步骤D的筛选优化的结果表明：外源导入密码子优化后的枯草芽孢杆菌 168来源的氨基葡萄糖合成酶基因glmS、秀丽隐杆线虫来源的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和来源于大肠杆菌K12的6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB 的基因工程菌合成GlcNAc的效果最好。

步骤E，向步骤D中密码子优化后的来源于秀丽隐杆线虫菌的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1前分别添加融合标签HA、CMYC、FLag、STREPPII。

步骤F，分别向步骤A获得的合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌中导入加入融合标签HA、CMYC、FLag、STREPPII的来源于秀丽隐杆线虫菌的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1、来源于枯草芽孢杆菌168的氨基葡萄糖合成酶基因glmS 和来源于大肠杆菌K12的6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB。并在该重组谷氨酸棒状杆菌中表达氨基葡萄糖合成酶glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1 和6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB；

上述步骤F的筛选优化的结果表明：(1)外源导入密码子优化的枯草芽孢杆菌168来源的氨基葡萄糖合成酶基因glmS、且在基因前添加融合标签HA秀丽隐杆线虫来源的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和来源于大肠杆菌K12的6p- 乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB的基因工程菌合成GlcNAc的效果最好。

(3)构建高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌，并敲除阻断竞争代谢途径甘露糖途径：

步骤G，在谷氨酸棒状杆菌中敲除竞争途径甘露糖途径，阻断6p-GlcNAc的的分解代谢；

所述甘露糖途径的主要基因是nanE；

步骤H，向步骤G获得的合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌中导入氨基葡萄糖合成酶基因glmS、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB，并在该重组谷氨酸棒状杆菌中表达氨基葡萄糖合成酶glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB；

所述氨基葡萄糖合成酶glmS来源于来源于枯草芽孢杆菌168(密码子优化)；

所述氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1来源于秀丽隐杆线虫菌(密码子优化且添加融合标签HA)；

所述6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB来源于大肠杆菌K12(密码子优化)；

上述步骤H的筛选敲除的结果表面：进行甘露糖糖途径主要基因zwf的敲除后的高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌的GlcNAc产率较高，获得最佳高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌。

(4)构建高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌，弱化糖酵解途径：

步骤M，在谷氨酸棒状杆菌中反义RNA方法三种不同程度弱化竞争途径糖酵解途径，阻断6p-fructose的分解的代谢；

所述糖酵解途径的主要基因是fba；弱化程度分别为asfba1、asfba2、asfba3。

步骤N，分别向步骤M获得的合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌中导入氨基葡萄糖合成酶基因glmS、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB，并在该重组谷氨酸棒状杆菌中表达氨基葡萄糖合成酶 glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因 yqaB；

上述步骤N的筛选敲除的结果表面：进行糖酵解途径主要基因fba的弱化后asfba1的高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌的GlcNAc产率较高，获得最佳高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌。

上述合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌的制备方法中，敲除磷酸戊糖途径主要基因zwf和甘露糖途径主要基因nanE，阻断6p-glucose和6p-GlcNAc的分解代谢途径，并弱化并筛选出最佳弱化程度的糖酵解关键基因fba；并对三个关键酶进行密码子优化且在氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1前添加融合标签且进行筛选出最优融合标签HA。通过上述两个方面的改造和优化制备得到的高效合成 GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌是产GlcNAc最佳的重组谷氨酸棒状杆菌。

所述三个关键酶基因分别为来源于来源于枯草芽孢杆菌168的氨基葡萄糖合成酶glmS、来源于秀丽隐杆线虫的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和来源于大肠杆菌K12的6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB。

通过上述方法构建的基因工程菌为含有来源于枯草芽孢杆菌168的密码子优化后的氨基葡萄糖合成酶基因glmS、来源于秀丽隐杆线虫的密码子优化后且添加融合标签HA的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和来源于大肠杆菌K12的密码子优化后6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB的重组谷氨酸棒状杆菌和且其经过了敲除磷酸戊糖途径、甘露糖途径和弱化糖酵解途径的底盘微生物改造；该重组谷氨酸棒状杆菌高效合成GlcNAc的途径如图9所示。

研究结果表明，该基因工程菌安全无毒性，能够利用微生物发酵法高产 GlcNAc，且培养基成分简单(例如，可以使用本领域常规培养基)，批次稳定，生产成本较低。

本发明中谷氨酸棒状杆菌培养专用培养基包括：

1.LBHIS培养基(g/L)：蛋白胨5，添加酵母粉2.5，NaCl 5，脑心浸提液(BHI) 18.5，山梨醇91，116℃灭菌20min。对应的固体培养基添加1.8％-2％琼脂。该培养基主要用于谷棒在试管培养，固体平板培养。

2.LBG培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，葡萄糖20，116℃灭菌20min。该培养基主要作为谷棒发酵时用的种子培养基。

3.EPO培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，甘氨酸30，Tween80 10，pH7.0。用于谷棒感受态的制备。

4.LB-suc10％(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，蔗糖(suc)100，琼脂15，pH7.0。用于谷棒基因敲除实验同源重组筛选。

5.发酵培养基(g/L)：葡萄糖65，尿素5，玉米浸粉8，生物素4×10^-4，VB1 生物素4×10^-4，K₂HPO₄ 1，KH₂PO₄ 1，29.4mg二水合氯化钙，1.2325g七水硫酸镁，微量元素0.2％。(微量元素配制：称取1g FeSO₄·7H₂O，1gMnSO₄·H₂O， 0.1ZnSO₄·7H₂O，0.2gCuSO₄，0.002gNiCl₂·6H₂O，加水定容成100mL，加入100μL 浓盐酸(防止二价铁氧化)，过膜灭菌，在发酵培养体系中加千分之二。

本发明所涉及的上述重组谷氨酸棒状杆菌在制备GlcNAc中的应用，可以理解为利用上述重组谷氨酸棒状杆菌制备GlcNAc的方法。

根据本发明，所述应用包括将所述基因工程菌进行发酵培养，制备GlcNAc。

在本发明的一些实施例中，发酵诱导条件为：发葡萄糖添加浓度为60-100g/l，进一步优选为80-100g/l；和/或，玉米浆添加浓度为8-18g/l，进一步优选为16-18g/l；和/或，IPTG诱导剂添加时间为发酵2-14小时，优选为2-5小时，进一步优选为 2-3小时。

本发明中的检测方法及仪器：

(1)采用PTC-200型PCR仪(MJ RESEARCH.INC.美国)进行PCR扩增和检测。

(2)采用MicropulserTM型电转仪(BIO-Rad，美国)进行电转化操作。

(3)采用UltiMate3000高效液相色谱仪(HPLC，赛默飞)检测发酵液中的乳酸浓度、GlcNAc浓度。使用BIO-Rad 87H柱子，以0.5mM硫酸为流动相，柱温65℃，流速0.6ml/min，进样体积20μL，检测器为紫外和示差检测器。

(4)使用870型酶标仪(Thermo)通过测定样品的在600nm波长下的吸光值来测量发酵过程中的生物量。

(5)使用SBA-40E葡萄糖测定仪(济南延和生物科技有限公司)检测发酵液中的葡萄糖浓度。

Ⅲ.实施例

在构建强化高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌，并敲除或弱化相关竞争途径后，通过以下实施例对高效合成GlcNAc的重组谷氨酸棒状杆菌中的 GlcNAc合成途径进行筛选优化。

实施例1：重组质粒的构建

该实施例中所用到的引物如前文中表1所示。

首先提取得到枯草芽孢杆菌168、大肠杆菌的基因组，以枯草芽孢杆菌、秀丽隐杆线虫、大肠杆菌的基因组为模板扩增glmS、yqaB基因，随后由公司合成基因Cegna1，且将这3个基因由公司进行密码子优化，通过吉普森连接与质粒 pec-xk99E进行连接，测序得到正确的质粒pec-xk99E-BeglmS-Cegna1-yqaB。

再以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的基因组为模板扩增分别来自这些菌的glmS、 yqaB基因，随后由公司合成基因Cegna1，且将这3个基因由公司进行密码子优化，且分别在基因gna1前添加融合标签HA、CMYC、FLag、STREPPII,再通过吉普森方式与质粒pec-xk99E进行连接，测序得到正确的质粒 pec-xk99E-BeglmS-HACegna1-yqaB、pec-xk99E-BeglmS-CMYCCegna1-yqaB、 pec-xk99E-BeglmS-FLagCegna1-yqaB、pec-xk99E-BeglmS-STREPPIICegna1-yqaB。

实施例2：敲除质粒的构建

该实施例中所用到的引物如前文中表2所示。

以谷氨酸棒状杆菌的基因组为模板，分别扩增敲除基因zwf、nanE的上下游同源臂1000bp左右，所得同源臂分别为zwf-L、zwf-R、nanE-L、nanE-R。再按照设计好的酶切位点将这些同源臂与质粒PK-JL进行酶切连接，测序得到正确的敲除质粒PK-JL-zwf-L-R、PK-JL-nanE-L-R。随后按照谷棒基因传统敲除方法进行各基因的敲除。

实施例3：谷棒基因敲除传统方法

对于谷氨酸棒状杆菌的基因敲除，一般采用非复制型的自杀质粒引导的定向同源重组技术，利用此种方法敲除掉基因组上的基因后，不会留下任何标记，相较大肠杆菌的Red敲除系统更加简单方便。目前，研究和应用比较广的为 pK18mobsacB质粒和pK19mobsacB质粒进行谷氨酸棒状杆菌基因组上的特定基因的敲除。这种敲除方法的敲除原理主要是基于两次同源重组。第一次同源重组是由于质粒pK18mobsacB和质粒或者pK19mobsacB上不含有谷氨酸棒状杆菌的复制子。因此，该质粒在谷氨酸棒状杆菌中不能复制，只有通过同源重组的方式将整个质粒整合至谷氨酸棒状杆菌的基因组上，才能随基因组的复制而复制，随后通过质粒上的卡那抗性基因进行第一次重组的筛选。第二次同源重组，是基于第一轮重组后而发生的，最终使得待敲除的基因从基因组上消失。第二次重组的筛选标记为质粒上的sacB基因。

在谷氨酸棒状杆菌的敲除质粒上分别含有以下几个特别重要的元件：用于筛选的标记基因sacB(来自于谷草芽孢杆菌，谷氨酸棒状杆菌中不存在)，卡那霉素抗性基因。但不含有谷氨酸棒状杆菌复制子，因此谷氨酸棒状杆菌的第一次同源重组基于整个质粒整合入谷氨酸棒状杆菌的基因组中。下面是具体敲除方法：

①首先是相应基因敲除质粒的构建，通过PCR扩增待敲除基因的上下游同源臂(每条臂均约为1000bp，不可相差太多)，依次连接至敲除质粒pK-JL上测序正确后待用；

②将上述①中质粒按照上述谷棒电转方法转入谷氨酸棒状杆菌感受态中，并离心全部涂布于含有50mg/L卡那霉素的LBHIS平板上；

③挑取平板上长出的单菌落进行sacB基因的验证，只有既能在卡那抗性平板上生长的菌又能扩增出sacB基因的菌落才是发生了第一次同源重组的菌种；

④挑取符合上述③中的菌接种于30％蔗糖培养基中培养24h(必要时可重复转接2-3代)，待菌液变混浊后划线于含有20％的蔗糖固体培养基上；

⑤挑取④中的平板上的单菌落，进行sacB基因的菌落PCR；

⑥选取⑤中并没有扩增出sacB基因的单菌落，使用验证引物进行二次菌落 PCR；因为依据谷氨酸棒状杆菌敲除原理，发生第二次同源重组后，整个敲除质粒会从基因组脱落，从而达到敲除的目的，因此发生二次重组的菌落将不再含有 sacB基因；

⑦通过验证引物验证已成功敲除的菌体接种于LBHIS液体培养基中进行培养，并划线于LBHIS平板上进行纯化和再次验证，确定无误后可保菌待用；

最后成功得到两株底盘菌株，分别是△nagA/B△ldh△cgl2642△zwf、 △nagA/B△ldh△cgl2642△zwf△nanE的两株底盘菌株。

实施例4：谷棒基因反义RNA弱化传统方法

对于谷氨酸棒状杆菌的基因的反义RNA弱化，asRNA策略是一种易操作的弱化方法，其不需要任何外源蛋白的辅助就可完成弱化基因的效果，将300bp 的目标基因片段反向插入到启动子后，在转录阶段，这300bp的mRNA会与目标基因的mRNA结合成双链，然后被降解，从而减少了目标基因的的mRNA水平，对目标基因完成了弱化。

①在基因上前端，中间，末端各取一组300bp的片段进行弱化效果的筛选实验。

②设计引物扩增基因的300bp片段，通过酶切方式反向插入质粒，电泳回收纯化后进行连接反应，条件为16℃，3h，化学转化于Trans 10中。

③筛选后测序保存，获得重组质粒。

④重组质粒导入宿主菌株。

最后成功得到三株底盘菌株，分别是：

△nagA/B△ldh△cgl2642△zwf△nanEasfba1；

△nagA/B△ldh△cgl2642△zwf△nanEasfba2；

△nagA/B△ldh△cgl2642△zwf△nanEasfba3。

实施例4：重组菌株的构建

(1)感受态细胞的制备

将-80℃保存的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032 的甘油菌接种到4mL的LBHIS试管中，过夜培养之后，以一定的接种量接入20 mL EPO培养基中，使初始OD600为0.3左右。在30℃摇床培养约2h，当OD600 达0.9左右取出用于制备感受态细胞。

将培养好的菌落装入1.5mL离心管，冰浴使菌体冷却到0℃，之后4℃、4500 rpm冷冻离心10min收集菌体，用100μL预冷的10％的甘油重悬菌体(三管菌体混一管)，然后4℃、4500rpm冷冻离心10min收集菌体。重复洗涤三次，洗涤完成后用100μL 10％的无菌甘油重悬菌体，用于电转化。

(2)谷氨酸棒状杆菌感受态细胞的电转化

在制备的谷氨酸棒状杆菌感受态细胞中加入4μL构建成功的重组质粒，轻柔的混匀，冰浴5-10min，之后将混合液移入预冷的0.2cm电击杯中，电击条件为： 1.8kv，电击5ms，50μF，100Ω。电击完毕后立即加入800μL在46℃预热的 LBHIS培养基，轻柔的混匀后吸出放入1.5mL离心管中，46℃水浴6min，然后置于30℃复苏3h。复苏完成之后吸取一定量的菌液涂布于对应抗性平板上， 30℃培养24-36h，对长出的单菌落进行菌落PCR验证、划线纯化等操作，然后挑取合适的阳性克隆，将其接种到4mL的LBHIS培养基的试管中，过夜培养之后，进行甘油菌的保存，将保存的甘油菌放置在-80℃冰箱中存放。

实施例5：重组菌株的摇瓶发酵验证

吸取-80℃冰箱中存放的重组菌株的甘油菌100μL接种于4mL的LBHIS试管培养基中，30℃、200rpm摇床培养12-14h。之后将种子液按照2％的接种量接种到20mL LBG种子培养基中，同样在30℃、200rpm摇床培养12-14h。待种子培养完成之后，按照5％的接种量将种子液接种到配好的50mL无菌发酵培养基中，在OD600＝2.5左右时，加入终浓度为0.8mMIPTG，对目的基因进行诱导表达，在30℃、200rpm摇床条件下培养48h左右。

实施例6：发酵条件优化

按照实施例5重组菌株发酵验证的实验方法，通过改变诱导条件，进行菌株的培养和产量测定，以筛选最适的发酵诱导条件。酵诱导条件为：发葡萄糖添加浓度设定为60g/l、70g/l、80g/l、90g/l、100g/l；玉米浆添加浓度设定为8、12、 16、18g/l，IPTG诱导剂添加时间设定为发酵2.5、3、4、5小时。该部分实验选择目前来说产量较高的菌株△nagA/B△ldh△cgl2642△zwf-pec-BsS-B-CeA作为研究对象。

实施例7：代谢物及产物检测方法

(1)生物量测定

取发酵液用去离子水进行适当稀释之后，用酶标仪测定其在600nm波长下的吸光值，选用96孔板进行吸光值的测定，装液量是200μL。

(2)葡萄糖浓度

用SBA测糖仪检测发酵液中的葡萄糖浓度。

(3)乳酸浓度、GlcNAc浓度测定

用HPLC检测发酵液中的乳酸、GlcNAc浓度。使用BIO-Rad 87H柱子，以 0.5mM硫酸为流动相，柱温65℃，流速0.6ml/min，进样体积20μL，检测器为紫外和示差检测器。

根据上述的发酵方法和检测方法对各重组菌株进行发酵验证及产物测定，结果如图1-4所示。

图1为GlcNAc合成竞争图就途径磷酸戊糖途径敲除后对GlcNAc合成的影响；结果显示：

菌株△nagA/B△ldh△cgl2642-pec-BsS-CeA-B的GlcNAc产量可达到 14.39g/L；

菌株△nagA/B△ldh△cgl2642△zwf-pec-BsS-CeA-B的GlcNAc产量则可达到19g/L；

图2示出密码子优化后的氨基葡萄糖合成酶glmS和氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB对GlcNAc合成的影响，结果显示：

在发酵48小时时；

菌株△nagA/B△ldh△cgl2642△zwf-pec-BsS-CeA-B的GlcNAc浓度达到 19.1g/L；

菌株△nagA/B△ldh△cgl2642△zwf-pec-BsS-CeA-B(密码子优化)的GlcNAc 浓度达到20.2g/L；

图3示出添加不同融合标签的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1对重组谷棒菌株GlcNAc合成的影响。结果显示：

在发酵48小时时，菌株△nagA/B△ldh△cgl2642△zwf-pec-BsS-HACeA-B(密码子优化)的GlcNAc浓度达到21.22g/L；

菌株△nagA/B△ldh△cgl2642△zwf-pec-BsS-CMYCCeA-B(密码子优化)的GlcNAc浓度达到20.7g/L。

图4为GlcNAc合成竞争途径甘露糖途径敲除后对GlcNAc合成的影响；结果显示：

菌株△nagA/B△ldh△cgl2642△zwf-pec-BsS-HACeA-B(密码子优化)的 GlcNAc产量达到19g/L；

菌株nagA/B△ldh△cgl2642△zwf△nanE-pec-BsS-HACeA-B(密码子优化) 的GlcNAc产量可达到22.4g/L；

图5为GlcNAc合成竞争途径糖酵解途径弱化后对GlcNAc合成的影响；结果显示：

菌株nagA/B△ldh△cgl2642△zwf△nanE-pec-BsS-HACeA-Basfba1(密码子优化)的GlcNAc产量可达到23.3g/L；

菌株nagA/B△ldh△cgl2642△zwf△nanE-pec-BsS-HACeA-Basfba2(密码子优化)的GlcNAc产量只有7.43g/L；

菌株nagA/B△ldh△cgl2642△zwf△nanE-pec-BsS-HACeA-Basfba3(密码子优化)的GlcNAc产量可达到21.4g/L；

图示出6、7、8谷棒菌株△nagA/B△ldh△cgl2642△zwf-pec-BsS-B-CeA发酵培养条件的优化结果，其中，图6示出不同IPTG诱导剂添加时间的优化结果，图7示出不同葡萄糖添加浓度的优化结果，图8显示出不同玉米浆添加浓度的优化结果。

结果显示，诱导剂添加时间在2.5h时，即OD≈2.5时，GlcNAc浓度较高。葡萄糖添加浓度为80g/l时，更利于GlcNAc的合成。玉米浆浓度为18g/l，更利于GlcNAc的合成。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌及其应用

<130> RB2103741-FF

<160> 41

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1872

<212> DNA

<213> （来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因glmS）

<400> 1

atgtgtggaa ttgttggata tattggccaa gcgggcgact cccgtgatta ctttgctcta 60

gatgtagttg ttgaaggact acgtcgcctg gaataccgcg gatatgactc cgcaggtatt 120

gctattcacg ccaatggtga gattagctac cgaaagaagg ccggaaaggt tgctgcacta 180

gatgcagaaa tcgctaaagc acctcttcca gattctattt tgggaattgg acacacccgt 240

tgggcaactc atggtggccc aaccgatgtc aacgctcacc cccacgttgt ttccaatggc 300

aagcttgccg tagtacacaa cggcatcatc gaaaactttg cggaactgcg ctctgagctt 360

tccgctaagg gctacaactt tgtatccgat accgataccg aagttgctgc ttctttgctt 420

gctgaaattt acaatactca ggcaaacggt gacctcaccc ttgctatgca gctgaccggt 480

cagcgccttg agggtgcttt caccctgcta gctattcatg ctgatcacga tgaccgcatc 540

gttgcagctc gtcgtaactc tcctttggtt atcggcgtcg gcgagggcga gaacttcctc 600

ggatctgacg tttctggctt tattgattac acccgcaagg ctgtagagct ggctaatgac 660

caggttgtta ccatcaccgc tgatgattac gccatcacca actttgatgg atcagaagca 720

gttggcaagc ctttcgacgt ggagtgggac gctgcagctg ctgaaaaggg tggcttcggt 780

tccttcatgg agaaggaaat ccacgatcag ccagcagctg ttcgcgatac cctgatgggc 840

cgtcttgatg aagatggcaa gctcgttctt gatgagctgc gcatcgatga agctattctg 900

cgtagtgtcg acaagatcgt cattgttgct tgtggtactg cagcttatgc aggccaggtt 960

gctcgttacg ccattgagca ctggtgccgc atcccaaccg aggtggagct ggctcacgag 1020

ttccgttacc gcgacccaat cctcaacgag aagacccttg ttgtggcatt gtcccagtcc 1080

ggcgagacca tggataccct catggctgtt cgccacgcac gtgagcaggg tgccaaggtt 1140

gttgctattt gtaacactgt tggatccact cttccacgtg aagcagatgc gtccctgtac 1200

acctacgctg gccctgagat cgctgtggcg tccaccaagg cgttcttggc tcagatcact 1260

gcttcttact tgcttggcct gtacttggct cagctgcgcg gcaacaagtt cgctgatgag 1320

gtttcttcca ttctggacag cctgcgtgag atgcctgaga agattcagca ggtcatcgat 1380

gcagaagagc agatcaagaa gcttggccaa gatatggcag atgctaagtc tgtgctgttc 1440

ctgggccgcc acgttggttt cccagttgcg cttgagggtg cgttgaagct caaggagatc 1500

gcatacctgc acgctgaagg tttcgctgca ggcgagctca agcacggccc aattgctttg 1560

gttgaggaag gccagccgat cttcgttatc gtgccttcac ctcgtggtcg cgattccctg 1620

cactccaagg ttgtctccaa cattcaggag atccgtgcac gtggcgctgt caccatcgtg 1680

attgcagagg aaggcgatga ggctgtcaac gattacgcca acttcatcat ccgcattcct 1740

caggccccaa ccctgatgca gcctctgctg tccaccgtgc ctctgcagat ctttgcgtgc 1800

gctgtggcaa ccgcaaaggg ctacaacgtg gatcagcctc gtaacctggc aaagtctgtc 1860

accgtcgaat aa 1872

<210> 2

<211> 1803

<212> DNA

<213> （来自枯草芽孢杆菌168的密码子优化后的基因glms）

<400> 2

atgtgcggca tcgtgggcta catcggccag ctggatgcaa aggaaatctt gctgaagggc 60

ctcgaaaagc tggaataccg cggctacgat tctgcaggca tcgcagtggc taacgaacag 120

ggcatccacg tgttcaagga aaagggccgc atcgcagatc tgcgtgaagt tgtggatgcc 180

aacgttgaag caaaggcagg catcggccac acccgctggg caacccacgg cgaaccatcc 240

tacctgaacg cacacccaca ccagtccgca ctgggtcgct tcaccctggt gcacaacggc 300

gtgatcgaaa actacgtgca gttgaagcag gaatacctgc aggacgtgga actgaagtcc 360

gataccgaca ccgaggtggt ggtgcaggtg atcgaacagt tcgtgaacgg cggcctggag 420

accgaagaag cattccgtaa gaccctcacc ctgctgaagg gctcctacgc gatcgcactg 480

ttcgataacg ataaccgcga gaccatcttc gtggcaaaga acaagtcccc acttctggtg 540

ggcctcggtg acaccttcaa cgtggtggca tccgatgcca tggcaatgct gcaggtgacc 600

aacgaatacg tggaactgat ggataaggaa atggtgattg tgaccgatga ccaggttgtc 660

atcaagaacc tcgatggcga tgtcatcacc cgtgcatcct acatcgcaga actggatgca 720

tccgatatcg aaaagggcac ctacccacac tacatgctga aggaaaccga tgaacagcca 780

gtggtgatgc gcaagatcat ccaaacctac caggatgaaa acggtaagct gtccgtgccg 840

ggcgatatcg cagcagctgt ggcagaagct gatcgcatct acatcatcgg ctgcggcacc 900

tcctatcacg caggcctggt gggtaagcag tacattgaaa tgtgggcaaa cgtgccagtg 960

gaagtgcacg tggcttccga attctcctac aacatgccac tgctctccaa aaagccactg 1020

ttcatcttcc tgtcccagtc cggtgaaacc gcagattccc gcgcggtgct ggtgcaggtg 1080

aaggccctcg gccacaaggc actgaccatc accaacgtgc ctggttcaac cctgtcccgc 1140

gaagcagatt acaccctgct gctgcacgca ggccctgaaa tcgcagtggc atccaccaag 1200

gcatacaccg cacagatcgc agttctcgca gtgctggctt ccgtggcagc tgataagaac 1260

ggcatcaaca tcggcttcga tctggtgaag gaactgggca tcgccgctaa cgcgatggaa 1320

gcactgtgcg atcagaagga cgaaatggaa atgatcgcac gcgaatacct caccgtgtcc 1380

cgcaacgcat tcttcatcgg ccgcggcctg gattacttcg tgtgcgttga aggcgccctg 1440

aagctgaagg aaatctccta catccaggcc gaaggcttcg ccggcggcga actgaagcac 1500

ggcaccatcg cactgatcga acagggcacc cccgtgttcg ccctggcaac ccaggagcac 1560

gtgaacctgt ccatccgcgg caacgtgaag gaagtggcag cccgcggcgc caacacctgc 1620

atcatctccc tgaagggctt ggatgatgcc gatgatcgct tcgtgctgcc agaagtgaac 1680

ccagcactgg caccactggt gtccgtggtc ccactccagt tgatcgctta ctacgccgca 1740

ctgcaccgcg gctgcgatgt ggataagcca cgcaacctgg caaagtccgt gaccgtggaa 1800

taa 1803

<210> 3

<211> 498

<212> DNA

<213> （来自秀丽隐杆线虫的密码子优化后的基因gna1）

<400> 3

atgtcccaca tcttcgatgc atccgtgctg gcaccacaca tcccatccaa cttgccagat 60

aacttcaaag ttcgcccatt ggcaaaggat gatttctcca agggctacgt ggatctgctg 120

tcccaactca cctccgtggg taacttggat caggaagcat ttgaaaaacg cttcgaagca 180

atgcgtacct ccgtgccaaa ctaccacatt gtggttattg aagattctaa ttcccagaaa 240

gtggttgcat ccgcatccct ggttgttgaa atgaagttca tccacggtgc aggttcccgt 300

ggtcgcgttg aagatgtggt tgtggatacc gaaatgcgcc gccaaaaact gggcgcagtt 360

ttgcttaaga ccctggtttc cttgggcaag tccctgggcg tgtacaagat ttccctggaa 420

tgcgtgccag aactgctgcc attttactcc caattcggct tccaggatga ttgcaacttt 480

atgacccagc gcttctaa 498

<210> 4

<211> 567

<212> DNA

<213> （来自大肠杆菌K12ATCC53678的密码子优化后的基因yqaB）

<400> 4

atgtacgaac gctacgcagg cctgatcttc gatatggatg gcaccatcct ggataccgaa 60

ccaacccacc gcaaggcatg gcgcgaagtg ctgggccact acggcctgca gtacgatatc 120

caggcaatga tcgcactgaa cggctcccca acctggcgca tcgcacaggc aatcatcgaa 180

ctgaaccagg cagatctgga tccacacgca ctggcacgcg aaaagaccga agcagtgcgc 240

tccatgctgc tggattccgt ggaaccactg ccactggtgg atgtggtgaa gtcctggcac 300

ggccgccgcc caatggcagt gggcaccggc tccgaatccg caatcgcaga agcactgctg 360

gcacacctgg gcctgcgcca ctacttcgat gcagtggtgg cagcagatca cgtgaagcac 420

cacaagccag caccagatac cttcctgctg tgcgcacagc gcatgggcgt gcagccaacc 480

cagtgcgtgg tgttcgaaga tgcagatttc ggcatccagg cagcacgcgc agcaggcatg 540

gatgcagtgg atgtgcgcct gctgtaa 567

<210> 5

<211> 525

<212> DNA

<213> （添加融合标签HA的基因gna1）

<400> 5

tatccgtatg atgttccgga ttatgcaatg tcccacatct tcgatgcatc cgtgctggca 60

ccacacatcc catccaactt gccagataac ttcaaagttc gcccattggc aaaggatgat 120

ttctccaagg gctacgtgga tctgctgtcc caactcacct ccgtgggtaa cttggatcag 180

gaagcatttg aaaaacgctt cgaagcaatg cgtacctccg tgccaaacta ccacattgtg 240

gttattgaag attctaattc ccagaaagtg gttgcatccg catccctggt tgttgaaatg 300

aagttcatcc acggtgcagg ttcccgtggt cgcgttgaag atgtggttgt ggataccgaa 360

atgcgccgcc aaaaactggg cgcagttttg cttaagaccc tggtttcctt gggcaagtcc 420

ctgggcgtgt acaagatttc cctggaatgc gtgccagaac tgctgccatt ttactcccaa 480

ttcggcttcc aggatgattg caactttatg acccagcgct tctaa 525

<210> 6

<211> 528

<212> DNA

<213> （添加融合标签CMYC的基因gna1）

<400> 6

gaacaaaaac ttattagcga agaagatctt atgtcccaca tcttcgatgc atccgtgctg 60

gcaccacaca tcccatccaa cttgccagat aacttcaaag ttcgcccatt ggcaaaggat 120

gatttctcca agggctacgt ggatctgctg tcccaactca cctccgtggg taacttggat 180

caggaagcat ttgaaaaacg cttcgaagca atgcgtacct ccgtgccaaa ctaccacatt 240

gtggttattg aagattctaa ttcccagaaa gtggttgcat ccgcatccct ggttgttgaa 300

atgaagttca tccacggtgc aggttcccgt ggtcgcgttg aagatgtggt tgtggatacc 360

gaaatgcgcc gccaaaaact gggcgcagtt ttgcttaaga ccctggtttc cttgggcaag 420

tccctgggcg tgtacaagat ttccctggaa tgcgtgccag aactgctgcc attttactcc 480

caattcggct tccaggatga ttgcaacttt atgacccagc gcttctaa 528

<210> 7

<211> 522

<212> DNA

<213> （添加融合标签FLag的基因gna1）

<400> 7

gactacaaag acgatgacga caagatgtct cacatttttg atgcgtctgt gttagctcca 60

cacattcctt cgaatcttcc tgacaatttt aaagttcgtc ccttggcaaa agacgatttc 120

tcgaaaggat atgttgatct tctgagtcag ttgacttcgg tcggaaatct tgatcaggaa 180

gcatttgaaa agcgatttga ggcgatgagg acctcggtcc ccaattatca tatagtcgtc 240

atcgaagatt ccaattctca aaaagttgtt gcatctgcca gtttggttgt cgaaatgaag 300

ttcattcacg gggcaggaag tcgcggaagg gttgaagatg ttgtcgtgga tactgaaatg 360

cgtcgtcaaa aattaggagc cgttcttttg aagactcttg tttctcttgg aaagtctctc 420

ggagtttaca aaatttctct cgagtgtgtt cctgaacttc tcccattcta ctcacaattc 480

gggttccagg acgattgcaa ttttatgact cagcgcttct aa 522

<210> 8

<211> 524

<212> DNA

<213> （添加融合标签STREPII的基因gna1）

<400> 8

atgggagcca cccgcagttc gaaaaaatgt ctcacatttt tgatgcgtct gtgttagctc 60

cacacattcc ttcgaatctt cctgacaatt ttaaagttcg tcccttggca aaagacgatt 120

tctcgaaagg atatgttgat cttctgagtc agttgacttc ggtcggaaat cttgatcagg 180

aagcatttga aaagcgattt gaggcgatga ggacctcggt ccccaattat catatagtcg 240

tcatcgaaga ttccaattct caaaaagttg ttgcatctgc cagtttggtt gtcgaaatga 300

agttcattca cggggcagga agtcgcggaa gggttgaaga tgttgtcgtg gatactgaaa 360

tgcgtcgtca aaaattagga gccgttcttt tgaagactct tgtttctctt ggaaagtctc 420

tcggagttta caaaatttct ctcgagtgtg ttcctgaact tctcccattc tactcacaat 480

tcgggttcca ggacgattgc aattttatga ctcagcgctt ctaa 524

<210> 9

<211> 1860

<212> DNA

<213> （基因zwf）

<400> 9

ttagaccttc agttctgggt ggtagtcctt catgcgaaga accttgtttg ttctattcgc 60

cagggtggag atggcgagca tcagtgccca gatgaagagc agtacccaga ttgcttgtat 120

gaagcgtggg tcgttggatg gggtttcgtt gaagatcatt tggcgcacga ggttgactgc 180

gtaggtgatc gggtcgtagg tgtggaacca gtggaagaat gctggctggg tttctggtgg 240

gtataggcca ccggaggaga ctagctggaa ggacatcatc acgatggaca gcacacggcc 300

tgcggagggt cctgccacgt tgttgaacat atgggtaatg gagatgaata cccatgagat 360

ggcgaccatc gccatccaca gtccagctgg gtgagctgga ttgaggtcga gcaggaagta 420

cagtactgcc cacatgatgg ttgcttggcc aaggcctaag actgttgatg gaaggtagct 480

tgccagggtg cctcggaagc ctcccatgcg ggagtcgagt gcgcggcgac tgattgggtg 540

caggatcatc caggcaacgg ttgctcccat gaacaggccg acagccatga agaatggtgc 600

gagaccaata ccgaagagcg gtgtggtgtc tcctgcttgt tctgtttcaa ctggggttgc 660

gatggtggtg tctgcgccgt cagcgaaggt tggtacttgg cttgcgccgt cggtgagttt 720

gagggcgagt tcgctggagc cttcatcaag ctggacggtg ccgtcgcgca gtgcttgtgc 780

gccaacaact agctgttcgg aacctgcggc caattggctg gtgccatcag cgagggtgcg 840

tgcaccgatg ctgagttggc tggatccgtc tttcagggtt tgcaggccgg ctgctagttg 900

ctgggatgcg ctcacagcgg agtccacgcc ggagcggtag gtgctggagg gatcagatag 960

ttcagaggca atggtggctg cgccgtcgcg cagggtgatc aactgagagt tgatgtctgg 1020

aacataggcg gtcagtggtg ctacttggtc gacaagttgg cccacgccat ctgaaacctg 1080

ggttgcgcct tggcctagtt gggcggtgcc cgcagacagg ctggatagac cgtcggcgag 1140

cgtttggctg cctgtagccg cggagccgag gccggtgtcg agctggctgg cgccgtcggc 1200

aagcgattgc gcaccctcat tggcacttgc gatgccgtcg cgcagggtga ccgcgccgtc 1260

ggcaagctga actgcaccgt cgttggcgga accgacgcca tcgctgagcg tagtggcacc 1320

ttcggcggct tggttcatgc cgtcgcccaa ggtggagaaa ccgacgagca tgttatccac 1380

aatgcggacg ccgaattccg tgtccatggt ctccacaaca gtgttgacca cctggttgcc 1440

cagcatggag gcaatgaagc cgttgctgtt gttgaatacc gcgttgacgg ttgctggcgc 1500

gggtgaatcg ctggtcacgc tggcaataga atcgctgaag ttcttcggaa tttcaatgcc 1560

gaagtagtag gtgccgtcgt tgattccctc gcgggcttcc tcggcgctga cttcaatgaa 1620

tttgatgtcg tcttgctcca ggaggttctc caccacctgg gcgccggcat cgagttcacc 1680

ttcgtcctga ttgaccacgg ccacgggaag cttggacaag ccaccgatgg ggtcatagta 1740

ggcagaaaca aagacgccgc cgaaaagcaa cggcagcaac atgaccacaa caaaccccaa 1800

tggtgggagt tttccgcggc caaatcgttt cagttctgag ccaaagtgta aaaatgccat 1860

<210> 10

<211> 1140

<212> DNA

<213> （基因nanE）

<400> 10

gtgcgttggc tcttggtatt gttgtccatt ttggtcatca tcattggcat caacctcatc 60

ttggacggtg tctacggatt tggtactttt tcaaccaccc agatgtacca agttgcgaaa 120

gatccactca ttggtgtgct gatcggtatc ttggctacgg ccttggtgca atcatcaacc 180

accaccacaa cgttgacggt gactgcagtt ggtacgggca ttgtgtcggt gcctgtggcg 240

attccgatca ttcttggcgc aaatatcggt acgacgatca ccgcgatgct cgttgcgttt 300

tcttatgtgg gtgaacgcag ggagtttaag cgagctttta cggttgccgc catgcatgtg 360

tggtttaacg tgctcgtcat tcttgttcta tttgttgtgg aattgctctt tcatccattc 420

cgcacaatta gtggtgcgat cgcaacggag atcacactga caactggtgg ctctttgcct 480

accagtggtg tgatgaccaa gatttttgat cccccaaccc aacttctggg tatgaatggt 540

cttatcggtt cgatcggcaa tcctagtatt tcggcgattg tatgtcttgt ggtgggcacc 600

attcttattc tgatttcggt gcgtgccatg agttctcaga tccgaaccat tacggcagcg 660

accgtaacct caattatgga caaggtgatc aatccagaga acagccccaa ggcgacgatt 720

ctttccaatt tctggagctt cattcttgga gttttgttca cgctcatggt cactgcctcg 780

tcagtgaccg tggcttccat gcagccagtg gctgcctctg gtgtcgttaa gcaaaagcca 840

ttgctgggcg tcattttggg tgccaacgtg ggcaccacgg tgaccgcaat gtttgctact 900

ttcgcgattg tcagcgatca gggtgagttc gctattcagg ctgcgttgat ccacctcatt 960

gtgaacttca ccggcgcatt actagtgctg tgtattccgc agcttgccaa tgtgattatt 1020

cacttggccg agaaaactgc gaacctcact gcccgcagtt actccatcac cctggccaca 1080

attgtaacgg cctatgtctt ggttccttca gctgtgttga tgatttactt cttcatttaa 1140

<210> 11

<211> 1086

<212> DNA

<213> （基因fba）

<400> 11

atgcgaggat ttttcagcaa cccctggatt cgttgggctt tgtccctggc gtttctaggg 60

gtgatcctat ttttcctgag ggatcagctg gatttcctca aaatgggcat ccaacaaatc 120

cgccacgtca gccccgtagg cgttgccctc accatggtgg cgttggtgtt gtcattcgtt 180

gcgatggcca gagtcatgca gatcatgttg aaagccggag gtagtcctgc gactctcaaa 240

gccaccacgg ctttaacttt tgcggctaac tcctggtccg cgacccttcc tggcggcccg 300

gcgttttccg cgattctcac ctataaagtg cagcgcagct ggggtgccag cgccgtgctg 360

tgttcgtggt ttttcctgct ctccagtgcc ctatcgaccg tctggttggt tgctctcggt 420

gtcatcgccg tgttttatat gggcgcatcg ctgaacttat ggtcactgat cgccacattc 480

atcgccatgg tcgggctgtc tggcgccgtt tattgggcag ccaacaaccc cgactccttg 540

gctcggtggg tgcgaaaatt gacgaaaaac agggagtggg gcttcgtcga aaagcttctt 600

ggaagcattg agcagctgcg ctcggtctcg ctcaccgggc cgcaattcgc ggccagcacc 660

gcgtggtctt taggcaatag gcttttcgac gccatctccc tctggatttg catctgggcg 720

gtcaccggca ctgccccgat gtttgaacca gaacccaaca acaccaccat cgcaggcgta 780

ctgttggcgt acaccaccgc aaaaatcgca ggctcaatcc aagccacccc aggcggaatc 840

ggccccatcg aagccgccta catcgcagcc ctcgtagcca ccggtatgac cgcagtggaa 900

gccgccggag ctgtcataat ctaccgttta tgctcattta tcatcatggc gattgtcgga 960

tgggtcatct attttatcta tttcaccccc cagggactca aggccaatga atccctggat 1020

gtggaacagg atacgattaa ctcagactct aaccgacagt ccgcaattga aaggccagat 1080

acgtga 1086

<210> 12

<211> 453

<212> DNA

<213> （asfba1）

<400> 12

agaaggccat cctgacggat ggcctttttg cgtttgttga caattaatca tccggctcgt 60

ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc atgccattcg 120

acttcgtctt ccacggtggc tcaggctccg agaaggaaaa gatcgaagag gcgctgacct 180

acggcgtcat caagatgaac gttgatactg acacccagta cgcattcacc cgcccaatcg 240

tctcccacat gtttgagaac tacaacggcg ttctcaagat cgacggcgag gtcggaaaca 300

agaaggctta cgacccacgc tcttacatga agaaggctga gcagagcatg tctgagcgca 360

ttatcgagtc ttgccaggac ctcaagtctg ttggaaagac cacctctaag taaatcaaat 420

taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttt 453

<210> 13

<211> 453

<212> DNA

<213> （asfba2）

<400> 13

agaaggccat cctgacggat ggcctttttg cgtttgttga caattaatca tccggctcgt 60

ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc atgagcttga 120

cgttgcctgg cttgtaaacg ccgtggacgt taccgaaggt agctgctagc aggtagcggc 180

ccttctcacc ggtgccgatt gcatcgatgg tcttctcaaa gtcttctggg gaggtgtaga 240

ggtttgcgcc agccttagcc tcaacgccgt cttcttcgcc accgacaaca ccgatctcaa 300

cttccaagat gatgttcgct gccttggcct tagccagcag ctcctgtgcg atttcgaggt 360

tctcgtcgat tgggacagcg gaaccatccc acatgtggga ctggaacagt ggaatcaaat 420

taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttt 453

<210> 14

<211> 453

<212> DNA

<213> （asfba3）

<400> 14

agaaggccat cctgacggat ggcctttttg cgtttgttga caattaatca tccggctcgt 60

ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc atgttactta 120

gaggtggtct ttccaacaga cttgaggtcc tggcaagact cgataatgcg ctcagacatg 180

ctctgctcag ccttcttcat gtaagagcgt gggtcgtaag ccttcttgtt tccgacctcg 240

ccgtcgatct tgagaacgcc gttgtagttc tcaaacatgt gggagacgat tgggcgggtg 300

aatgcgtact gggtgtcagt atcaacgttc atcttgatga cgccgtaggt cagcgcctct 360

tcgatctttt ccttctcgga gcctgagcca ccgtggaaga cgaagtcgaa tggatcaaat 420

taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttt 453

<210> 15

<211> 58

<212> DNA

<213> （引物GBS-glms-F(YH)）

<400> 15

attcgagctc ggtacccggg gatccaagga ggatatacat atgtgcggca tcgtgggc 58

<210> 16

<211> 49

<212> DNA

<213> （引物GBS-glms-R(YH)）

<400> 16

tgtgggacat atgtatatcc tccttttatt ccacggtcac ggactttgc 49

<210> 17

<211> 46

<212> DNA

<213> （引物GBS-gna1-F(YH)）

<400> 17

gaataaaagg aggatataca tatgtcccac atcttcgatg catccg 46

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> （引物GBS-gna1-R(YH)）

<400> 18

acatatgtat atcctccttt tagaagcgct gggtcataaa gttgcaa 47

<210> 19

<211> 45

<212> DNA

<213> （引物GBS-yqaB-F(YH)）

<400> 19

gcgcttctaa aaggaggata tacatatgta cgaacgctac gcagg 45

<210> 20

<211> 44

<212> DNA

<213> （引物GBS-yqaB-R）

<400> 20

tgcatgcctg caggtcgact ctagattaca gcaggcgcac atcc 44

<210> 21

<211> 76

<212> DNA

<213> （引物GBS-HAgna1-F（YH））

<400> 21

gaataaaagg aggatataca tatgtatccg tatgatgttc cggattatgc aatgtcccac 60

atcttcgatg catccg 76

<210> 22

<211> 80

<212> DNA

<213> （引物GBS-CMYCgna1-F(YH)）

<400> 22

ggaataaaag gaggatatac atatggaaca aaaacttatt agcgaagaag atcttatgtc 60

ccacatcttc gatgcatccg 80

<210> 23

<211> 90

<212> DNA

<213> （引物GBS-FLAGgna1-F）

<400> 23

gaagagtgtt actgtggagt aaaaggagga tatacatatg gactacaaag acgatgacga 60

caagatgtct cacatttttg atgcgtctgt 90

<210> 24

<211> 90

<212> DNA

<213> （引物GBS-Strepiigna1-F）

<400> 24

gaagagtgtt actgtggagt aaaaggagga tatacatatg gactacaaag acgatgacga 60

caagatgtct cacatttttg atgcgtctgt 90

<210> 25

<211> 43

<212> DNA

<213> （引物GBS-zwf-L-F）

<400> 25

attcgagctc ggtacccggg gatcccagag ctcaaggccg ctg 43

<210> 26

<211> 46

<212> DNA

<213> （引物GBS-ZWF-L-R）

<400> 26

atgattaatt gtcaagatgg tagtgtcacg atcctttctt taatga 46

<210> 27

<211> 41

<212> DNA

<213> （引物GBS-Zwf-R-F）

<400> 27

atggcctttt tttaggggca aaaaatgatc tttgaacttc c 41

<210> 28

<211> 58

<212> DNA

<213> （引物GBS-ZWF-R-R）

<400> 28

taaaacgacg gccagtgcca agcttcatca accatagtgt tgtatttctc cttagacg 58

<210> 29

<211> 47

<212> DNA

<213> （引物GBS-nanE-L-F）

<400> 29

attcgagctc ggtacccggg gatccttctg gcaggcttaa aagctgc 47

<210> 30

<211> 41

<212> DNA

<213> （引物GBS-nanE-L-R）

<400> 30

ggactaagtg tatttaagga aactcctgtg ttgagaacag c 41

<210> 31

<211> 39

<212> DNA

<213> （引物GBS-nanE-R-F）

<400> 31

acaggagttt ccttaaatac acttagtcca gcgctgcac 39

<210> 32

<211> 42

<212> DNA

<213> （引物GBS-nanE-R-R）

<400> 32

taaaacgacg gccagtgcca agcttaccct gatctgcgac gc 42

<210> 33

<211> 49

<212> DNA

<213> （引物asfba1-F ）

<400> 33

gccatccgtc aggatggcct tctttaatgc ctatcgcaac tcccgaggt 49

<210> 34

<211> 76

<212> DNA

<213> （引物asfba1-R）

<400> 34

aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagaccat gttccttctg 60

gcagtggtca gtgtgc 76

<210> 35

<211> 52

<212> DNA

<213> （引物asfba2-F）

<400> 35

gccatccgtc aggatggcct tctttaactg ttccagtccc acatgtggga tg 52

<210> 36

<211> 72

<212> DNA

<213> （引物asfba2-R）

<400> 36

aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagaccat gcgcagcttg 60

acgttgcctg gc 72

<210> 37

<211> 52

<212> DNA

<213> （引物asfba3-F）

<400> 37

gccatccgtc aggatggcct tctttaccat tcgacttcgt cttccacggt gg 52

<210> 38

<211> 86

<212> DNA

<213> （引物asfba3-R）

<400> 38

aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagaccat gttacttaga 60

ggtggtcttt ccaacagact tgaggt 86

<210> 39

<211> 1986

<212> DNA

<213> （基因cgl2642）

<400> 39

atggaccata aggacctcgc gcaacgcatc ctgcgcgaca ttggcggcga agacaacatt 60

gtcgccgccg cacactgtgc aacgcgttta cgcctcgtgc tcaaagacac caaggatgtg 120

gatcgccaaa gtctggatga tgatccagat ctgaaaggca cgtttgaaac gggtggtatg 180

ttccagatca tcgtcgggcc aggcgatgtg gatcatgttt tcaaagaact cgatgacgca 240

acctccaaag acatcgctgt gtccacagag cagctcaaag atgttgtggc taacaacgcc 300

aactggttca gccgtgctgt gaaggtattg gcggacattt tcgtcccgct gattccaatc 360

ttggttggtg gcggtctgct catggctatc aacaatgtgt tggttgcgca ggatctgttc 420

ggtccgcaat cactggtgga gatgttccct cagatcagcg gtgttgctga gatgatcaac 480

ctcatggcat ctgcgccgtt cgcgttcttg ccagtgttgg ttggtttcac cgcaaccaag 540

cgtttcggcg gcaatgagtt cctgggcgcc ggtattggta tggcgatggt gttcccgagc 600

ttggtgaacg gctacgacgt ggccgccacc atggctgcgg gcgaaatgcc aatgtggtcc 660

ctgtttggtt tagatgttgc ccaagccggt taccagggca ccgtgcttcc tgtgctggtg 720

gtttcttgga ttctggcaac gatcgagaag ttcctgcaca agcgactcaa gggcactgca 780

gacttcctga tcactccagt gctgacgttg ctgctcaccg gattccttac attcatcgcc 840

attggcccag caatgcgctg ggtgggcgat gtgctggcac acggtctaca gggactttat 900

gatttcggtg gtccagtcgg cggtctgctc ttcggtctgg tctactcacc aatcgtcatc 960

actggtctgc accagtcctt cccgccaatt gagctggagc tgtttaacca gggtggatcc 1020

ttcatcttcg caacggcatc tatggctaat atcgcccagg gtgcggcatg tttggcagtg 1080

ttcttcctgg cgaagagtga aaagctcaag ggccttgcag gtgcttcagg tgtctccgct 1140

gttcttggta ttacggagcc tgcgatcttc ggtgtgaacc ttcgcctgcg ctggccgttc 1200

ttcatcggta tcggtaccgc agctatcggt ggcgctttga ttgcactctt taatatcaag 1260

gcagttgcgt tgggcgctgc aggtttcttg ggtgttgttt ctattgatgc tccagatatg 1320

gtcatgttct tggtgtgtgc agttgttacc ttcttcatcg cattcggcgc agcgattgct 1380

tatggccttt acttggttcg ccgcaacggc agcattgatc cagatgcaac cgctgctcca 1440

gtgcctgcag gaacgaccaa agccgaagca gaagcacccg cagaattttc aaacgattcc 1500

accatcatcc aggcaccttt gaccggtgaa gctattgcac tgagcagcgt cagcgatgcc 1560

atgtttgcca gcggaaagct tggctcgggc gttgccatcg tcccaaccaa ggggcagtta 1620

gtttctccgg tgagtggaaa gattgtggtg gcattcccat ctggccatgc tttcgcagtt 1680

cgcaccaagg ctgaggatgg ttccaatgtg gatatcttga tgcacattgg tttcgacaca 1740

gtaaacctca acggcacgca ctttaacccg ctgaagaagc agggcgatga agtcaaagca 1800

ggggagctgc tgtgtgaatt cgatattgat gccattaagg ctgcaggtta tgaggtaacc 1860

acgccgattg ttgtttcgaa ttacaagaaa accggacctg taaacactta cggtttgggc 1920

gaaattgaag cgggagccaa cctgctcaac gtcgcaaaga aagaagcggt gccagcaaca 1980

ccataa 1986

<210> 40

<211> 1155

<212> DNA

<213> （基因nagA）

<400> 40

gtgcattatc aagaaaatgc aggtcaagca gttaaaaaaa ttgaaggaag aattgttacc 60

ccccacgggg tgattgatgg ctttctccaa ctcgaaaacg gcatcatcac ggaactctct 120

ggagaaccag cacctaaaaa cgcaggattc caccccgaac tccccacgat tgttcccagt 180

tttattgatc ttcataatca cggtggaaac ggtggcgcgt ttcctacggg aacgcaggac 240

caggcgagga atgccgcgca gtatcaccgc gaacatggca cgaccgtgat gttggcaagc 300

atggtttcgg cgccggctga cgcactggca gcgcaggtgg aaaaccttat tcccttgtgt 360

gaagagggcc tgctgtgcgg cattcacctc gagggtcctt tcatcaacgc atgccgttgt 420

ggtgctcaaa acccggattt tatttttccc ggcaacccaa cagatcttgc ccaggtgatc 480

catgcgggaa aaggttggat caaatcgatc acagtagcgc cggaaactga caatcttact 540

gagcttctcg atctctgcgc agcgcaccac atcattgctt ccttcgggca cactgatgca 600

gattttgata ccactaccag cgcaattgcc ttggctaaag agaaaaatgt gacggtcacg 660

gctacgcatt tgttcaatgc gatgcctccg ctgcatcata gggatcccgg cagcgtgggc 720

gctttgcttg ctgcggcacg tgccggggac gcatatgttg agttgatcgc cgacggcgtg 780

catttggccg atggaacggt cgatctagct cgttccaaca acgccttttt catcacggac 840

gccatggaag ccgccggaat gccagacggt gagtacattt tgggcgtttt gaacgtcacc 900

gtcaccgatg gcgtcgcccg tctgcgcgat ggcggcgcca tcgccggggg taccagcaca 960

ctagcgagtc agttcgtgca ccacgtgcgc aggggtatga cgcttatcga cgcgaccctc 1020

cacacctcaa ccgtcgccgc caaaattctc ggacttagcg atcacgaaat cgttaaatcc 1080

aaccctgtaa attttgtggt ctttgactca aacggccagt tacaacaggt ccatttagac 1140

catcaagtaa tttaa 1155

<210> 41

<211> 762

<212> DNA

<213> （基因nagB）

<400> 41

atggacatca tcatctgcaa agacgagcaa gaagtcggca aagcagcggc agccctgatc 60

gcacccttcg caactaaggg cggaaccttg gggcttgcaa ctggatcgtc acctttgagc 120

acctaccaag agctcattcg catgtatgaa gctggggaag tgtcattcaa gaactgcaag 180

gcattcttgt tggatgaata cgtgggatta acgcgcgacg atgaaaacag ctacttcaaa 240

accattcgta aagagttcac tgaccacatc gacatcgttg atgaagaggt ctacagccca 300

gatggtgcaa accctgatcc atacgaagca gctgcagagt atgaggcaaa gatcgctgca 360

gaatccgttg atgttcaaat ccttggcatc ggcggaaacg gccacatcgc tttcaatgag 420

ccatcatctt ctctgtcagg actgacaaag gtccaggcgc tgcaccctaa aactgtggag 480

gacaacgctc gattcttcaa caccatcgaa gaggtcccaa cccacgccct cacccagggt 540

ttgggcactt tgtcccgcgc gcaaaacatc gtgttggtgg caactggtga aggaaaagcc 600

gacgccatcc gcggaactgt ggaaggccca ctgaccgcca tgtgcccagg ttccatcctg 660

cagatgcaca acaatgccac catcatcgtt gatgaagcag cagcatccaa gctggaaaac 720

gctgatcact accgtctcat ggagcaatta aagctgcgct ag 762

Claims

1.一种合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌，其为含有氨基葡萄糖合成酶基因glmS、氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1和6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB的重组谷氨酸棒状杆菌。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述氨基葡萄糖合成酶基因glmS来源于枯草芽孢杆菌168，所述氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1来源于秀丽隐杆线虫，所述6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB来源于大肠杆菌K12。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还包含在氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1前插入的融合标签，所述融合标签包括HA、CMYC、Flag和STREPII中的一种或几种，优选为HA。

4.根据权利要求2或3所述的基因工程菌，其特征在于，来源于枯草芽孢杆菌168的氨基葡萄糖合成酶基因glmS，来源于秀丽隐杆线虫的氨基葡萄糖转乙酰基酶基因gna1，以及来源于大肠杆菌K12的6p-乙酰氨糖特异性的磷酸酶基因yqaB均进行了密码子优化。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌为经过底盘微生物改造的合成N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程菌。

6.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述底盘微生物改造包括GlcNAc逆转运途径、分解代谢途径的相关基因的敲除，以及竞争代谢途径相关基因的敲除或弱化。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述GlcNAc逆转运途径的相关基因包括胞外GlcNAc转运至胞内的GlcNAc特异性磷酸转移酶基因cgl2642；和/或，所述GlcNAc分解代谢途径的相关基因包括乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径的6p-GlcNAc脱乙酰酶基因nagA和6p-GlcN脱氨基酶基因nagB；和/或，所述竞争代谢途径相关基因包括副产物乳酸合成途径的基因ldh、甘露糖途径的相关基因、磷酸戊糖途径的相关基因和糖酵解途径相关基因。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的基因工程菌在合成N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述基因工程菌进行发酵培养，制备N-乙酰氨基葡萄糖；优选地，发酵诱导条件为：葡萄糖添加浓度为60-100g/L，进一步优选为80-100g/L；和/或，玉米浆添加浓度为8-18g/L，进一步优选为16-18g/L；和/或，IPTG诱导剂添加时间为发酵2-14小时，优选为2-5小时，进一步优选为2-3小时。