CN107849577B - 利用谷氨酸棒状杆菌的2’-岩藻糖基乳糖的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产岩藻糖基乳糖用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)以及利用其的岩藻糖基乳糖的制造方法，特征在于，生产岩藻糖基乳糖用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)转化为表达出α‑1,2‑岩藻糖基转移酶(α‑1,2‑fucosyltransferase)、GDP‑甘露糖‑4,6‑脱水酶(GDP‑D‑mannose‑4,6‑dehydratase，Gmd)、GDP‑L岩藻糖合成酶(GDP‑L‑fucose‑synthase，WcaG)以及乳糖透过酶(lactosepermease，LacY)，保留磷酸甘露糖变位酶(Phosphomannomutase)以及GTP‑甘露糖‑1‑磷酸鸟嘌呤基转移酶(GTP‑mannose‑1‑phosphateguanylyltransferase)。根据本发明的重组谷氨酸棒状杆菌以及利用其的岩藻糖基乳糖生产方法，使用作为GRAS的谷氨酸棒状杆菌菌株，从而比现有的大肠杆菌安全，消除了生产浓度较低从而无法应用于产业的现有技术的限制，可以以非常高浓度生产2’‑岩藻糖基乳糖。

Description

利用谷氨酸棒状杆菌的2’-岩藻糖基乳糖的生产方法
技术领域
本发明涉及一种重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)以及利用该重组谷氨酸棒状杆菌的岩藻糖基乳糖的生产方法，该重组谷氨酸棒状杆菌转化为表达出α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-fucosyltransferase)、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(GDP-D-mannose-4,6-dehydratase，Gmd)、GDP-L岩藻糖合成酶(GDP-4-keto-6-deoxymannose-3,5-epimerase-4-reductase，WcaG)以及乳糖透过酶(lactosepermease，LacY)，且转化为超表达出磷酸甘露糖变位酶(Phosphomannomutase，ManB)以及甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(GTP-mannose-1-phosphateguanylyltransferase，ManC)。
背景技术
与其它哺乳类的乳汁相比，人的母乳中存在相当高浓度(5～15g/L)的200多种以上的具有独特结构的低聚糖(human milk oligosaccharides，HMO)。
HMO提供益生元(prebiotic)效果、预防感染致病菌、调节免疫系统以及对大脑发育等婴幼儿的发育以及健康带来正面影响的多种生物活性，所以婴幼儿期的母乳喂养非常重要。
据报道，母乳中包含约200多种的低聚糖，其中，尤其是2’-岩藻糖基乳糖和3'-岩藻糖基乳糖是参与上述的多种生物活性的主要HMO。由此，最近，岩藻糖基乳糖在可用作婴幼儿用奶粉、老人用健康功能食品原材料以及医药品原材料方面备受瞩目。但是，女性的约20％由于合成岩藻糖低聚糖的岩藻糖转移酶突变，无法在体内正常合成。从而，实际上需要岩藻糖基乳糖的产业化生产。
但是，目前还难以大量工业生产岩藻糖基乳糖，所以目前作为一种代替，将作为类似物的低聚半乳糖(galactooligosaccharide)或者低聚果糖(fructooligosaccharide)添加于断乳期食品中，期待类似的效果。
另一方面，岩藻糖基乳糖的生产方法有直接从母乳提取的方法和以化学或者酶方法合成的方法。
直接提取的方法存在母乳供求问题和生产性较低的问题，化学合成方法存在基质价格高、异构体选择性(stereo-selectivity)和产率低、有毒有机溶剂的使用等问题。并且，酶合成方法存在用作岩藻糖的供体(donor)的GDP-L-fucose的价格非常高，岩藻糖转移酶(fucosyltransferase)提炼成本高的问题。
由于上述问题，直接提取、化学或者酶生产方法均难以应用于岩藻糖基乳糖的大量生产，目前还几乎没有用于大量生产的技术。但是，还可以期待开发后用作利用2’-岩藻糖基乳糖的健康功能食品以及医药品的原材料，所以目前还需要更多地研究利用微生物的2’-岩藻糖基乳糖的产业化生产。
并且，利用微生物生产2’-岩藻糖基乳糖的现有技术的大部分是利用重组大肠杆菌生产的技术。但是，用于实验的大部分大肠杆菌实际上并不是致病菌，但是，消费者大多认为是有害真菌。
并且，大肠杆菌的细胞膜成分有可能起到内毒素作用，所以在生产2’-岩藻糖基乳糖时，分离纯化费用较高。从而，目前还难以作为生产食品以及医药品的原材料、即岩藻糖基乳糖的宿主细胞使用大肠杆菌。
发明内容
技术课题
本发明的目的在于开发并提供作为生产食品以及医药品的原材料、即岩藻糖基乳糖的宿主细胞，使用比大肠杆菌更加安全的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，且能够高浓度、高产率、生产率地生产2’-岩藻糖基乳糖的方法。
解决课题的手段
本发明提供重组谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，其特征在于，转化为表达出α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-fucosyltransferase)，并且转化为表达出GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(GDP-D-mannose-4,6-dehydratase)，转化为表达出GDP-L岩藻糖合成酶(GDP-L-fucosesynthase)，转化为表达出乳糖透过酶(lactose permease)，保留磷酸甘露糖变位酶(Phosphomannomutase)以及GTP-甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(GTP-mannose-1-phosphateguanylyltransferase)。
本发明人之前通过韩国专利公报第10-1544184号(2015.08.21)获得过利用大肠杆菌的2’-岩藻糖基乳糖生产方法的专利。但是，被指出将2’-岩藻糖基乳糖用作功能性食品的添加剂时，由于大肠杆菌所具有的各种安全性问题，使用大肠杆菌来生产时存在一些问题。从而，在本发明中，使用在食品安全上不存在问题的代替菌株来生产2’-岩藻糖基乳糖。
在本发明中，作为生产2’-岩藻糖基乳糖的宿主细胞，选择了谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，与以前使用的大肠杆菌不同，该菌株是被认定为GRAS(generally recognized as safe)的菌株，并且不产生内毒素，是广泛应用于作为食品添加剂的氨基酸以及核酸的产业化生产的菌株。从而，可以说谷氨酸棒状杆菌是适合生产食品以及医药品的原材料的菌株，具有可以打消消费者对于安全性方面的担忧的优点。
但是，大肠杆菌和氨酸棒状杆菌的菌株本身的遗传特性不同，所以需要使用与应用于大肠杆菌的战略不同的战略。在生产2’-岩藻糖基乳糖时，大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌基本都需要引入外来的α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-fucosyltransferase)，但是，谷氨酸棒状杆菌需要另外引入GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(GDP-D-mannose-4,6-dehydratase，Gmd)、GDP-L岩藻糖合成酶(GDP-L-fucosesynthase，该酶还被称为‘GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reductase’。并且，简称为‘WcaG’，将对该酶进行加密的基因特别称为‘WcaG’)、乳糖透过酶(lactosepermease，LacY)。即、大肠杆菌具有对GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(GDP-D-mannose-4,6-dehydratase，Gmd)、GDP-L岩藻糖合成酶(GDP-L-fucosesynthase，WcaG)、乳糖透过酶(lactosepermease，LacY)进行加密的基因，但是谷氨酸棒状杆菌菌株不具有加密上述酶的基因，所以需要从外部引入并表达出来。
这时，优选地，作为加密上述α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-fucosyltransferase)的基因使用由幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)衍生的基因，作为加密GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(GDP-D-mannose-4,6-dehydratase，Gmd)、GDP-L岩藻糖合成酶(GDP-L-fucose-synthase，WcaG)以及乳糖透过酶(lactosepermease，LacY)的基因使用由大肠杆菌衍生的基因。
另一方面，优选地，本发明的重组谷氨酸棒状杆菌转化为表达出磷酸甘露糖变位酶(Phosphomannomutase)，并且转化为超表达出GTP-甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(GTP-mannose-1-phosphateguanylyltransf erase)。谷氨酸棒状杆菌本身可以保留加密磷酸甘露糖变位酶(Phosphomannomutas e，ManB)、GTP-甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(GTP-mannose-1-phosphateguanyly ltransferase，ManC)的基因，并且能表达出来，所以没有必要特意引入加密该酶的基因，但是，大量生产时需要超表达该基因。从而，在本发明中，优选地，主要将谷氨酸棒状杆菌转化为能够超表达该两个酶。
另一方面，上述酶的作用可通过图1理解，所以省略其详细说明。需要说明的是，乳糖透过酶(lactosepermease，LacY)是参与将位于菌株外部的乳糖输送至菌株内部的酶。在下面的本发明实施例中，引入从大肠杆菌的Lac操纵子去除lacZ的lacYA基因后进行了实验，但是，在本发明中引入Lac操纵子的目的在于引入乳糖，所以能够引入lacY基因即可，无需还能够引入lacA基因。
另一方面，本发明中使用的术语‘表达’是指对于本发明的谷氨酸棒状杆菌菌株本身无法表达的酶，为了人为地表达，向菌株内引入外源基因实现表达，术语‘超表达’是指本发明的谷氨酸棒状杆菌菌株本身具有加密对应酶的基因，可以自行表达，但是，为了大量生产而增加其表达量，人为增加对应酶的表达量，从而超表达。
另一方面，本发明人通过上述的转化战略，发现从谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)可以大量生产母乳低聚糖、即2’-岩藻糖基乳糖。
另一方面，在本发明中，优选地，加密上述α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-fucosyltransferase)的基因的一例是fucT2基因，更加优选地，具有将野生型的fucT2基因(例如，序列号4)的一部分碱基变种的序列号6中记载的核酸序列的fucT2基因。而且还发现在引入具有序列号6记载的核酸序列的fucT2基因时，与野生型fucT2基因相比，增加2’-岩藻糖基乳糖的生产量。
另一方面，本发明提供2’-岩藻糖基乳糖的生产方法，其特征在于，在添加有乳糖的培养基上培养本发明的重组谷氨酸棒状杆菌。在应用本发明的重组谷氨酸棒状杆菌菌株时，可以高浓度、高产率、高生产率生产2’-岩藻糖基乳糖。
另一方面，在上述本发明的2’-岩藻糖基乳糖的生产方法中，优选地，上述培养基还包含葡萄糖。通过在培养基添加葡萄糖，菌株的繁育更加活跃，从而能够以更加高生产率生产2’-岩藻糖基乳糖。
另一方面，优选地，上述本发明的2’-岩藻糖基乳糖的生产方法是追加供给葡萄糖或者乳糖的补料分批培养。这是因为通过补料分批培养持续供给葡萄糖或者乳糖时，进一步加大细胞的成长，高纯度、高产率、高生产率生产岩藻糖基乳糖。关于补料分批培养的具体细节技术可以采用本领域公知，所以省略对该技术的记载。
附图说明
图1是为了在谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)菌株生物合成GDP-L-fucose以及岩藻糖基乳糖而引入的代谢途径示意图。
图2是评价去除了lacZ的lac操纵子(lacYA)的引入对于在谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)中的2’-岩藻糖基乳糖的生产带来的影响的图表。图2a是只是超表达ManB、ManC、Gmd以及WcaG的谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)菌株(对照组)的培养结果，图2b是超表达ManB、ManC、Gmd以及WcaG，追加引入FucT2的菌株(对比例1)的培养结果，图2c是引入去除了ManB、ManC、Gmd、WcaG、FucT2以及lacZ基因的lac操纵子(lacYA)的菌株(实施例1)的培养结果。图表中的符号表示如下：●：干燥细胞重量，■：葡萄糖，▲：乳糖，：乳酸，◆：2’-岩藻糖基乳糖。
图3是示出利用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)pVBCL+pEGWT的分批培养结果的图表。图3a是烧杯分批培养结果，图3b是发酵机分批培养结果。当光密度(OD600)达到约0.8时，添加IPTG和乳糖使最终浓度分别达到1.0mM、10g/L(箭头)。图表中的符号表示如下：●：干燥细胞重量，■：葡萄糖，▲：乳糖，：乳酸，◆：2’-岩藻糖基乳糖。
图4是通过LC-MS/MS分析确认重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的分批培养液的2’-岩藻糖基乳糖生产性的结果。图4a是利用MALDI-TOPMS在阳离子模式下通过分子量示出岩藻糖基乳糖的生产的图表，图4b是利用串联质谱法(Tandemmassspectrometry)(MS/MS)确认岩藻糖基乳糖的结构组成的图表。
图5是示出利用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)pVBCL+pEGWT的补料分批培养结果的图表。在消耗完开始投入的40g/L葡萄糖之后，开始以连续(continuous feeding)方法供给葡萄糖，同时添加了IPTG和乳糖(大箭头)。图表中的符号表示如下：●：干燥细胞重量，■：葡萄糖，▲：乳糖，：乳酸，◆：2’-岩藻糖基乳糖。
图6是为了加大幽门螺杆菌(H.pylori)衍生的fucT2基因的翻译(translation)效率，将fucT2基因codon优化为符合谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的结果示意图。
图7是示出codon优化为谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的fucT2基因(COfucT2)的引入给2’-岩藻糖基乳糖的生产带来的影响的图表。图7a是利用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)pVBCL+pEGWT(CO)的烧杯分批培养结果，光密度(OD600)达到约0.8时，添加IPTG和乳糖使最终浓度分别达到1.0mM、10g/L(箭头)。图7b是示出利用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)pVBCL+pEGWT(CO)的发酵机补料分批培养结果的图表，在消耗完开始投入的40g/L葡萄糖之后，开始以连续(continuousfeeding)方法供给葡萄糖，同时添加了IPTG和乳糖(大箭头)。图表中的符号表示如下：●：干燥细胞重量，■：葡萄糖，▲：乳糖，：乳酸，◆：2’-岩藻糖基乳糖。
具体实施方式
下面，通过实施例更加详细说明本发明的内容。需要说明的是，本发明的保护范围并不限定于下面的实施例，还包括与其等同的技术思想的变形。
[实施例1：重组菌株以及质粒的制备]
为了制备质粒以及生产2’-岩藻糖基乳糖(fucosyllactose，2'-FL)，分别利用了大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10和谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)ATCC13032。
为了组建pVBCL质粒，从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的genomicDNA通过利用两个DNAprimer(F_PstI-manB和R_BamHI-SpeI-XbaI-manB)的PCR反应，放大manB基因后，处理限制酶PstI和BamHI，将其插入到处理了相同的限制酶的pVWEx2质粒中。对于组建的上述质粒，再次从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的genomicDNA通过利用两个DNAprimer(F_XbaI-manC和R_SpeI-manC)的PCR反应放大了manC基因，处理限制酶XbaI和SpeI之后进行插入，从而组建了pVmBC。之后，从先行研究(韩国注册专利第10-1544184号)中组建的pGlacYA质粒通过利用两个DNAprimer(F_inf_AsiSI_lacYA和R_inf_AsiSI_lacYA)的PCR反应放大lacYA基因簇后，处理限制酶AsiSI，并将其插入处理了相同的限制酶的pVmBC质粒中，从而组建了pVBCL质粒。
并且，为了组建pEGWT质粒，从大肠杆菌K-12MG1655的genomicDNA通过利用两个DNAprimer(F_KpnI-gmd和R_SacI-wcaG)的PCR反应放大gmd-wcaG基因簇后，处理限制酶KpnI和SacI，插入处理了相同的限制酶的pEKEx2质粒中，从而组建了pEGW。
并且，从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)ATCC700392的genomicDNA通过利用两个DNAprimer(F_inf_SacI_RBS_fucT2和R_inf_SacI_fucT2)的PCR反应放大fucT2基因之后，处理限制酶SacI，插入处理了相同的限制酶的pEGW质粒中，从而组建了pEGWT。
并且，从pBHA(COfucT2)质粒通过利用所设计的两个DNAprimer(F_SacI_RBS_COfucT2和R_SacI_COfucT2)的PCR反应放大codon优化的fucT2基因(COfucT2)之后，对于放大的COfucT2基因处理限制酶SacI后将其插入到处理了相同的限制酶的pEGW质粒中，从而组建了pEGWT(CO)(图1)。图1是为了在谷氨酸棒状杆菌菌株生物合成GDP-L-fucose以及岩藻糖基乳糖引入的代谢途径。
下面的表1至表4示出了本实施例中使用的基因序列、菌株、质粒以及寡核苷酸。
[表1]
基因以及基因序列
基因名称 序列号
manB 序列号1
manC 序列号2
gmd-wcaG 序列号3
fucT2 序列号4
lacYA 序列号5
COfucT2 序列号6
[表2]
菌株
Figure BDA0001467585870000071
[表3]
质粒
Figure BDA0001467585870000081
[表4]
引物
Figure BDA0001467585870000082
*斜体表示的序列表示RBS(ribosomebindingsite)以及spacer。
*加粗表示的序列表示指定限制酶的识别部位。
[实施例2：重组谷氨酸棒状杆菌的培养条件以及方法]
种子细菌的培养使用了装有包含适当的抗生素(kanamycin25μg/mL，tetracycline5μg/mL)的5mL的BHI(Brain Heart Infusion)培养基的实验管，温度为30℃，搅拌速度维持在250rpm，培养了12小时。
在装有100mL或者1L的最低培养基((NH4)2SO4 20g/L，urea 5g/L，KH2PO41g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4 0.25g/L，MOPS4 2g/L，CaC12 10mg/L，Biotin 0.2mg/L，Protocatechuicacid 30mg/L，FeSO47H20 10mg/L，MnSO4H2O 10mg/L，ZnSO47H2O 1mg/L，CuSO4 0.2mg/L，NiCl26H2O 0.02mg/L，pH7.0)的500mL容积的生物反应器(bioreactor，Kobiotech，Incheon，Korea)中，30℃下执行了分批培养。搅拌速度是烧杯为250rpm，生物反应器为1000rpm，维持2vvm进行了培养。分批培养时，在光密度(OD600)达到0.8的时刻，添加IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)、乳糖使最终浓度分别达到1.0mM、10g/L。
用于培养高浓度细胞的补料分批培养是在包括包含40g/L的葡萄糖以及适当的抗生素(kanamycin25μg/mL，tetracycline5μg/mL)的1.0L的最低培养基的2.5L容积的生物反应器(bioreactor，Kobiotech，Incheon，Korea)中实施。
在最初添加的葡萄糖完全枯竭后，以5.7g/L/h的速度，连续(continuousfeeding)方法供给了包含800g/L的葡萄糖的进料溶液(feeding solution)。同时，介导tac启动子介导基因表达，为了生产2’-岩藻糖基乳糖，添加IPTG、乳糖使最终浓度达到1.0mM、10g/L。
发酵过程中，如果培养基的pH低于设定点(set-point)，则自动供给28％NH4OH，高于设定点时，添加2N HCl，以使pH维持在一定范围内(pH6.98～7.02)。使用pH电极(MettlerToledo，USA)实时测量了培养基的pH。为了防止缺氧，搅拌速度以及通气速度分别维持了1000rpm以及2vvm。
[实施例3：细胞以及代谢物的浓度的决定]
对光密度(optical density，OD)乘以事先测量的变换常数0.3来决定了干燥细胞重量。将样品适当稀释后光密度调节至0.1～0.5之间的范围后，使用分光光度计(spectrophotometer，Ultrospec2000，AmershamPharmaciaBiotech，USA)，在600nm吸光度下测量了光密度(OD)。
利用安装有“CarbohydrateAnalysiscolumn(RezexROA-organicacid，Phenomenex，USA)”以及“RI(refractiveindex)”检测仪是HPLC(high performance liquidchromatography)(Agilent 1100LC，USA)测量了2’-岩藻糖基乳糖、乳糖、乳酸、葡萄糖以及醋酸的浓度。采用60℃下加热的层析柱，分析了稀释10倍的20μl的培养基。以0.6mL/min流速，以流动相使用了5mM的H2SO4溶液。
[实验例1：对于去除lacZ基因的lac操纵子(lacYA)的引入给谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)中的2’-岩藻糖基乳糖生产带来的影响的评价]
在本实验例中，为了在谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)中生物合成2’-岩藻糖基乳糖，引入了乳糖输送体，并且观察由此带来的影响。
为此，尝试了将先行研究(韩国注册专利第10-1544184号)中组建的去除了E.coliK-12衍生的lacZ基因的lac操纵子(lacYA)引入谷氨酸棒状杆菌，生产2’-岩藻糖基乳糖。
在先行研究中，为了组件没有β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的活性，只有乳糖输送体的活性的大肠杆菌，去除了大肠杆菌的染色体(chromosome)上的lac操纵子，将去除加密β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的lacZ基因的lac操纵子(lacYA)再次引入大肠杆菌的染色体内，从而生产了2’-岩藻糖基乳糖(韩国注册专利第10-1544184号)。
使用仅超表达GDP-L-fucose生物合成酶ManB、ManC、Gmd、WcaG的重组谷氨酸棒状杆菌菌株(对照组)、超表达GDP-L-fucose生物合成酶ManB、ManC、Gmd、WcaG且追加引入FucT2的菌株(对比例1)以及引入去除了GDP-L-fucose生物合成酶ManB、ManC、Gmd、WcaG、FucT2以及lacZ基因的lac操纵子(lacYA)的菌株(实施例1)进行了实验。在烧杯中，通过分批培养，对比对照组、对比例1以及实施例1，从而评价了lacYA操纵子以及岩藻糖基转移酶的引入对于2’-岩藻糖基乳糖的生产的影响。
实验结果，在仅超表达GDP-L-fucose生物合成酶ManB、ManC、Gmd、WcaG的谷氨酸棒状杆菌菌株(对照组)以及超表达GDP-L-fucose生物合成酶ManB、ManC、Gmd、WcaG且追加引入FucT2的菌株(对比例1)中根本没有生产2’-岩藻糖基乳糖。
但是，确认为在引入去除了GDP-L-fucose生物合成酶ManB、ManC、Gmd、WcaG、FucT2以及lacZ基因的lac操纵子(lacYA)的菌株(实施例1)中生产2’-岩藻糖基乳糖(表5以及图2)。图2是评价去除了lacZ的lac操纵子(lacYA)的引入对于谷氨酸棒状杆菌中的2’-岩藻糖基乳糖生产带来的影响的图表。图2a是对照组的培养结果，图2b是对比例1的培养结果，图2c是实验例1的培养结果。
根据上述结果可以得知，随着引入乳糖输送体，乳糖被引入菌株内，用于2’-岩藻糖基乳糖的生产，因此在生产2’-岩藻糖基乳糖时必须要引入去除了lacZ基因的lac操纵子(lacYA)。
[表5]
去除了lacZ的lac操纵子(lacYA)的引入对于谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)中的2’-岩藻糖基乳糖生产带来的影响评价
Figure BDA0001467585870000111
[实验例2：通过分批培养生产2’-岩藻糖基乳糖]
为了确认在实验例1中组建的重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的2’-岩藻糖基乳糖生产性能以及发酵特性，分别在烧杯和发酵机分批培养了引入去除了ManB、ManC、Gmd、WcaG、FucT2以及lacZ的lac操纵子(lacYA)的重组谷氨酸棒状杆菌。在光密度(OD600)达到0.8的时刻，添加IPTG、乳糖使最终浓度分别达到1.0mM、10g/L。
烧杯分批培养的结果，生产出246mg/L的2’-岩藻糖基乳糖，这时的2’-岩藻糖基乳糖相对于乳糖的产率为0.22mole2’-岩藻糖基乳糖/mole乳糖，生产率为4.97mg/L/h(图3以及表6)。
另一方面，在发酵机分批培养中，生产出274mg/L的2’-岩藻糖基乳糖，2’-岩藻糖基乳糖相对于乳糖的产率为0.34mole/mole，生产率为5.6mg/L/h，与烧杯培养相比，2’-岩藻糖基乳糖的最终浓度提高约11％，产率提高55％，生产率提高12％。这是因为与烧杯培养相比，发酵机中的温度、pH以及供氧等条件更加调节到位。
表6记载了上述分批培养的结果，图3是示出利用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)pVBCL+pEGWT的分批培养结果的图表，图3a是烧杯分批培养结果，图3b是发酵机分批培养结果。
[表6]
利用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)pVBCL+pEGWT的分批培养结果
Figure BDA0001467585870000121
a乳糖和2’-岩藻糖基乳糖的浓度是仅测量培养基上的数值。
[实验例3：通过LC-MS/MS分析确认2’-岩藻糖基乳糖的生产]
为了确认在上述实验例2的分批培养中生产的2’-岩藻糖基乳糖，利用LC-MS/MS进行了定性分析。
利用MALDI-TOPMS，以阳离子模式测量分子量的结果，发现存在2-岩藻糖基乳糖上结合一个钠分子的分子量511.164m/z的峰值。
并且，为了确认该峰值的结构组成，利用串联质谱法(Tandem massspectrometry)(MS/MS)分析的结果，发现由构成2’-岩藻糖基乳糖的葡萄糖、半乳糖以及岩藻糖构成(图4)。图4是通过LC-MS/MS分析确认重组谷氨酸棒状杆菌的培养液的2’-岩藻糖基乳糖的生产性的结果。图4a是利用MALDI-TOPMS，阳离子模式下通过分子量分析确认包含在培养液中的物质的岩藻糖基乳糖的生产的图，图4b是利用串联质谱法(Tandem massspectrometry)(MS/MS)从结构上确认511.134m/z的峰值是2’-岩藻糖基乳糖。
实验结果发现，在上述的分批培养中生产出了2’-岩藻糖基乳糖。
[实验例4：通过补料分批培养生产2’-岩藻糖基乳糖]
为了通过高浓度的细胞培养生产出高浓度2’-岩藻糖基乳糖，利用引入pVBCL、pEGWT质粒的重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)，在2.5L水平的发酵机中进行了补料分批培养。
从消耗完开始添加的40g/L的葡萄糖的时刻起，为了维持细胞生长，利用连续(continuous feeding)方法，以5.7g/L/h的速度供给进料溶液(feeding solution)。同时，为了引导2’-岩藻糖基乳糖的生产，添加了IPTG和乳糖。
实验结果，在发酵期间根本没有生产醋酸，通过葡萄糖的代谢，细胞最终达到干燥细胞重量57.3g/L。并且，最高2’-岩藻糖基乳糖的浓度为5.8g/L，相对于乳糖的产率为0.55mole2’-岩藻糖基乳糖/mole乳糖，生产率为0.06g/L/h(图5以及表7)。
表7示出了用于生产2’-岩藻糖基乳糖的补料分批培养的结果，图5是示出利用重组谷氨酸棒状杆菌pVBCL+pEGWT的补料分批培养结果的图表。
[表7]
利用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)pVBCL+pEGWT的补料分批培养结果
Figure BDA0001467585870000131
a2-FL生产率是从IPTG感应后起计算的数值。
b乳糖和2’-岩藻糖基乳糖的浓度是仅测量培养基上的数值。
[实验例5：密码子优化(codon optimization)的fucT2基因(COfucT2)的引入对于重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的2’-岩藻糖基乳糖生产带来的影响的评价]
(1)密码子优化(codonoptimization)的fucT2基因(COfucT2)制备
为了在重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)中加大幽门螺杆菌(H.pylori)衍生的α-1,2-岩藻糖基转移酶fucT2基因的翻译(translation)效率，按照谷氨酸棒状杆菌的密码子使用频率(codon usage)，对fucT2基因进行了密码子优化。
实验结果发现，与现有的fucT2基因相比，约17.1％的序列发生突变(mutation)(图6)。图6是将fucT2基因密码子优化为符合谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的结果示意图。
(2)密码子优化(codono ptimization)的fucT2基因(COfucT2)的引入对于2’-岩藻糖基乳糖的生产带来的影响的评价
为了确认利用密码子优化的fucT2基因(COfucT2)组建的重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的2’-岩藻糖基乳糖生产性能以及发酵特性，在烧杯中进行分批培养，并且在发酵机中进行了补料分批培养。
在分批培养中，在光密度(OD600)达到0.8的时刻，添加IPTG以及乳糖，使最终浓度分别达到1.0mM、10g/L，在补料分批培养中，从消耗完开始添加的40g/L的葡萄糖的时刻起为了维持细胞生长，利用连续(continuous feeding)方法，以5.7g/L/h的速度供给了进料溶液(feedingsolution)。同时，为了引导2’-岩藻糖基乳糖的生产，添加了IPTG和乳糖。
分批培养的结果，生产出370mg/L的2’-岩藻糖基乳糖，这时的2’-岩藻糖基乳糖相对于乳糖的产率为0.28mole2’-岩藻糖基乳糖/mole乳糖，生产率为7.18mg/L/h(图7a以及表8)。这与实验例2的结果相比，2’-岩藻糖基乳糖的最终浓度提高了约50％，产率提高了27％，生产率提高了44％。
另一方面，在补料分批培养结果，生产出8.1g/L的2’-岩藻糖基乳糖，2’-岩藻糖基乳糖相对于乳糖的产率为0.42mole/mole，生产率为0.07g/L/h(图7b以及表8)，这与引入野生型fucT2时的结果(实验例4)相比，2’-岩藻糖基乳糖的最终浓度提高了约39％，生产率提高了17％。
表8示出了上述培养的结果，图7a是利用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)pVBCL+pEGWT(CO)的烧杯分批培养结果图表，图7b是利用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)pVBCL+pEGWT(CO)的发酵机补料分批培养结果图表。
[表8]
利用重组谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)pVBCL+pEGWT(CO)的分批以及补料分批培养结果
Figure BDA0001467585870000141
a2-FL生产率是IPTG感应后起计算的数值。
b乳糖和2’-岩藻糖基乳糖的浓度是仅测量培养基上的数值。
Figure IDA0001547495380000011
Figure IDA0001547495380000021
Figure IDA0001547495380000031
Figure IDA0001547495380000041
Figure IDA0001547495380000051
Figure IDA0001547495380000061
Figure IDA0001547495380000071
Figure IDA0001547495380000081
Figure IDA0001547495380000091
Figure IDA0001547495380000101
Figure IDA0001547495380000111
Figure IDA0001547495380000121
Figure IDA0001547495380000131
Figure IDA0001547495380000141
Figure IDA0001547495380000151
Figure IDA0001547495380000161
Figure IDA0001547495380000171

Claims (3)

1.一种2’-岩藻糖基乳糖的生产方法，其特征在于，其包括
在添加有乳糖和葡萄糖的培养基中培养重组谷氨酸棒状杆菌，所述重组谷氨酸棒状杆菌转化为表达出α-1,2-岩藻糖基转移酶，转化为表达出GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶，转化为表达出GDP-L岩藻糖合成酶，和转化为表达出乳糖透过酶，以及从所述培养基中分离2’-岩藻糖基乳糖，
其中所述重组谷氨酸棒状杆菌具有磷酸甘露糖变位酶以及GTP-甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
上述岩藻糖基乳糖的生产是通过包括追加供给葡萄糖或者乳糖的补料分批培养而进行的。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述重组谷氨酸棒状杆菌转化为超表达出磷酸甘露糖变位酶，和转化为超表达出GTP-甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶。
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