JP6903256B2

JP6903256B2 - コリネバクテリウムグルタミクムを用いた３’−フコシルラクトースの生産方法

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Publication number: JP6903256B2
Application number: JP2019556815A
Authority: JP
Inventors: ソ，ジン−ホ; ジョン，サン−ミン; イ，ド−ヘン; ジョン，ヒョン−ド
Original assignee: Advanced Protein Technologies Corp; Seoul National University R&DB Foundation
Current assignee: Advanced Protein Technologies Corp; SNU R&DB Foundation
Priority date: 2017-04-21
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2021-07-14
Anticipated expiration: 2038-04-20
Also published as: EP3613858A1; CN110662842B; KR102050522B1; US20200080095A1; JP6903256B6; EP3613858A4; JP2020517251A; CN110662842A; KR20180118544A; EP3613858B1; US11512318B2; EP3613858C0

Description

本発明は、野生型コリネバクテリウムグルタミクム菌株を用いて３’−フコシルラクトース生産変異微生物を製造する方法及びグルコース、ラクトースからフコシルラクトースを製造する方法に関し、詳細には、コリネバクテリウムにホスホマンノムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ，ＭａｎＢ）、マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＭａｎＣ）、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，Ｇｍｄ）、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＷｃａＧ）、α−１，３−フコース転移酵素（α−１，３−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及びｌａｃＺが除去された変異ｌａｃオペロンを導入した組換えコリネバクテリウムグルタミクムを用いて３’−フコシルラクトースを生産する方法に関する。

ヒトの母乳は、２００余種以上の個別の構造を持つオリゴ糖（ＨｕｍａｎＭｉｌｋＯｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＨＭＯ）を有しており、これが他の哺乳類に比べて非常に高い濃度（５〜１５ｇ／Ｌ）で存在する。このようなＨＭＯは、前生物的（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）効果、病原菌腸内付着抑制効果そして免疫調節システム調節効果など、乳児に必須な機能性を有する。
一方、ＨＭＯのうち３’−フコシルラクトースは様々な生物学的活性に関与する主要ＨＭＯとして報告されている。３’−フコシルラクトースの生産方法には、母乳から直接抽出する方法、及び化学的又は酵素的方法で合成する方法がある。しかし、直接抽出する方法は、母乳供給の限界及び低い生産性という短所があり、化学的合成法は、高価の基質、低い異性体選択性（ｓｔｅｒｅｏ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）及び生産収率、毒性有機溶媒の使用などの問題がある。また、酵素的合成法は、フコースの供与体（ｄｏｎｏｒ）として用いられるＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅが非常に高価であり、フコース転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の精製費用が多くかかるという短所がある。
このように、直接抽出、化学的又は酵素的生産法は、フコシルラクトースの大量生産に適用し難い実情である。しかし、微生物を用いた生物工学的生産方法は、単純な工程によって安価の基質からフコシルラクトースを大量に生産できる点から、健康機能性食品及び医薬品素材への開発可能性を持つ３’−フコシルラクトースの生産のための方法として脚光を浴びている。
一方、微生物を用いた３’−フコシルラクトース生産に関する従来の技術は、殆どが組換え大腸菌を用いた生産技術だった。実験用に用いられる大腸菌は実は病原菌でないのに、消費者にとっては有害な菌という認識が強く、細胞膜成分がエンドトキシンとして作用することがあるため、分離精製の費用が多くかかるという短所があり、食品及び医薬品の素材である３’−フコシルラクトースを生産する宿主細胞として大腸菌を用いることは困難である実情である。
大韓民国登録特許第１０−１５４４１８４号（登録日：２０１５．０８．２１）には、２’−フコシルラクトースを生産するための変異微生物及びこれを用いた２’−フコシルラクトースの製造方法に関するものであり、特に、ｌａｃＺが変形又は除去されたオペロンの導入、及びＦｕｃＴ２又はその変異体をコードする遺伝子、Ｇ６ＰＤＨ（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びＧＳＫ（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ−ｉｎｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ）をコードする遺伝子からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子が導入又は増幅されている変異微生物及びこれを用いて２’−フコシルラクトースを製造する方法が記載されている。
大韓民国登録特許第１０−１６４８３５２号（登録日：２０１６．０８．０９．）には、フコース代謝酵素であるフコースイソメラーゼ（ｆｕｃｏｓｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＦｕｃＩ）、フクロースキナーゼ（ｆｕｃｕｌｏｓｅｋｉｎａｓｅ，ＦｕｃＫ）及びフクロース１−ホスフェートアルドラーゼ（ｆｕｃｕｌｏｓｅ１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅａｌｄｏｌａｓｅ，ＦｕｃＡ）をコードする遺伝子のいずれか一つ以上が破砕されており、‘野生型ｌａｃオペロン’の代わりに、‘野生型ベータガラクトシダーゼよりも活性が低くなったベータガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子、野生型ｌａｃＹ遺伝子及び野生型ｌａｃＡ遺伝子で構成されたｌａｃオペロン’又は‘野生型ｌａｃＺ遺伝子が完全に除去され、野生型ｌａｃＹ遺伝子及び野生型ｌａｃＡ遺伝子だけで構成されたｌａｃオペロン’を保有しているフコシルラクトース生産用組換え大腸菌及びこれを用いたフコシルラクトースの生産方法に関するものであり、高生産性で２−又は３−フコシルラクトースを生産できる方法が記載されている。

本発明では、食品及び医薬品の素材であるフコシルラクトースを生産する宿主細胞として、大腸菌に比べて安全なコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を用いるが、高濃度、高収率、高生産性で３’−フコシルラクトースを生産する方法を提供することを目的とする。

本発明は、α−１，３−フコース転移酵素（α−１，３−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅｐｅｒｍｅａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）及びＧＴＰ−マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を保有していることを特徴とする組換えコリネバクテリウムグルタミクムを提供する。
本発明の組換えコリネバクテリウムグルタミクムにおいて、前記α−１，３−フコース転移酵素は、ａｚｏＴ遺伝子によって暗号化されたものを使用することができる。前記ａｚｏＴ遺伝子は、好ましくは配列番号５の核酸配列で構成されたものとすることができる。
本発明の組換えコリネバクテリウムグルタミクムにおいて、前記組換えコリネバクテリウムグルタミクムは、好ましくは、ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）が過発現されるように形質転換され、ＧＴＰ−マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が過発現されるように形質転換されたものがよい。
本発明は、ラクトースが添加された培地に、α−１，３−フコース転移酵素（α−１，３−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅｐｅｒｍｅａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）及びＧＴＰ−マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を保有している組換えコリネバクテリウムグルタミクムを培養することを特徴とする３’−フコシルラクトースの生産方法を提供する。
本発明の３’−フコシルラクトース生産方法において、前記培地は、好ましくは、グルコースをさらに含むことがよい。前記フコシルラクトースの生産方法は、より好ましくは、グルコース又はラクトースを追加供給する回分式培養又は流加式培養とすることができる。

本発明によれば、ＧＲＡＳ菌株であるコリネバクテリウムグルタミクム菌株を用いて３’−フコシルラクトースを生産でき、従来の大腸菌に比べて安全に３’−フコシルラクトースを生産することができる。また、本発明のコリネバクテリウムグルタミクム菌株を用いる場合、高濃度、高収率、高生産性で３’−フコシルラクトースを生産することができる。

コリネバクテリウムグルタミクム菌株においてＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ及び３’−フコシルラクトースを生合成するために導入した代謝経路を図式化したものである。コリネバクテリウムグルタミクムｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＡ（ｐＥＧＷ＋ａｚｏＴ）で生産された３’−フコシルラクトースをＨＰＬＣによって測定した結果である。組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＡを用いたフラスコ回分式培養結果を示すグラフである。光学密度（ＯＤ６００）が約０．８に到達すると、ＩＰＴＧとラクトースを最終濃度がそれぞれ１．０ｍＭ、１０ｇ／Ｌ（矢印）となるように添加した。グラフ中の記号は次の通りである：●：乾燥細胞重量、▲：グルコース、■：ラクトース、▼：ラクテート、◆：３’−フコシルラクトース。組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴを用いた流加式培養結果を示すグラフである。初期に投入した４０ｇ／Ｌグルコースが全て消耗した後、グルコースを連続式（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｆｅｅｄｉｎｇ）方法で供給し始め、ＩＰＴＧとラクトースを同時に添加した（矢印）。グラフ中の記号は次の通りである：●：乾燥細胞重量、▲：グルコース、■：ラクトース、▼：ラクテート、◆：３’−フコシルラクトース。

本発明は、α−１，３−フコース転移酵素（α−１，３−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅｐｅｒｍｅａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）及びＧＴＰ−マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を保有していることを特徴とする組換えコリネバクテリウムグルタミクムを提供する。
本発明者らは以前、大韓民国特許出願番号第１０−２０１６−００１２８０３号（２０１６．０２．０２）によって、大腸菌を用いた３’−フコシルラクトース生産方法を出願した。しかし、３’−フコシルラクトースを機能性食品添加物として使用するに当たって、これを、大腸菌を用いて生産することは、大腸菌が持つ様々な安全上の懸念から問題があるという指摘がある。したがって、本発明では食品安全上、問題のない代替菌株を用いて３’−フコシルラクトースを生産することを意図する。

本発明では、３’−フコシルラクトースを生産する宿主細胞としてコリネバクテリウムグルタミクムを選定したが、この菌株は、従来に使用した大腸菌とは違い、ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄａｓｓａｆｅ）と認定された菌株である。また、エンドトキシンを生産することがなく、食品添加物であるアミノ酸及び核酸の産業的生産に広く用いられている菌株である。したがって、コリネバクテリウムグルタミクムは食品及び医薬品素材の生産に適した菌株であるといえ、安全性の側面において消費者の不安を払拭できるという長所がある。
一方、大腸菌とコリネバクテリウムグルタミクムは、菌株自体の遺伝的特性が異なるため、大腸菌に適用した戦略とは異なる戦略を用いなければならない。
３’−フコシルラクトースを生産するためには大腸菌、コリネバクテリウムグルタミクムのいずれであれ、基本的に外来のα−１，３−フコース転移酵素（α−１，３−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を導入しなければならないが、コリネバクテリウムグルタミクムはその他にもＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，Ｇｍｄ）、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅ、この酵素は「ＧＤＰ−４−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ−４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ」とも呼ばれる。また、略して「ＷｃａＧ」とも呼ばれるが、この酵素を暗号化する遺伝子を特に「ＷｃａＧ」と呼ぶ。）、ラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）をさらに導入しなければならない。すなわち、大腸菌はＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，Ｇｍｄ）、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＷｃａＧ）、ラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）を暗号化する遺伝子を有しているが、コリネバクテリウムグルタミクム菌株は上記酵素を暗号化する遺伝子を有しておらず、それを外部から導入して発現させなければならない。
好ましくは、前記α−１，３−フコース転移酵素（α−１，３−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を暗号化する遺伝子は、アゾスピリルムブラシレンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）から由来した遺伝子（ａｚｏＴ）を使用することが好ましい。また、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，Ｇｍｄ）、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ−ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＷｃａＧ）及びラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）を暗号化する遺伝子は、大腸菌から由来したものを使用することが好ましい。

本発明の組換えコリネバクテリウムグルタミクムは、好ましくは、ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）が過発現されるように形質転換され、ＧＴＰ−マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が過発現されるように形質転換されたものが好ましい。コリネバクテリウムグルタミクムは、ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ，ＭａｎＢ）、ＧＴＰ−マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＭａｎＣ）を暗号化する遺伝子を自分で保有していて発現させることができるため、敢えてこれらの酵素を暗号化する遺伝子を導入する必要はないが、大量生産のためにはこれらの酵素を過発現させる必要がある。したがって、本発明では、好ましくは、これら２つの酵素を過発現させ得るようにコリネバクテリウムグルタミクムを形質転換する必要がある。
上記酵素の作用は、図１から理解できるので、その説明は省略するものとする。ただし、ラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）は、菌株の外部に存在するラクトースを菌株内に輸送するのに関与する酵素であることに特に留意されたい。下記の本発明の実施例では大腸菌のＬａｃオペロンからｌａｃＺが除去されたｌａｃＹＡ遺伝子を導入して実験しているが、本発明においてＬａｃオペロン導入の理由はラクトースの取り込みに関連しているので、ｌａｃＡ遺伝子までは要らず、ｌａｃＹ遺伝子の導入だけで十分である。

本発明における「発現」とは、本発明のコリネバクテリウムグルタミクム菌株が自ら発現させることのできない酵素を、人為的に発現させるために外部由来の遺伝子を菌株内に導入して発現させることを意味する。「過発現」とは、本発明のコリネバクテリウムグルタミクム菌株が該当の酵素を暗号化する遺伝子を有しており、自ら発現させることができるが、大量生産の目的でその発現量を増大させるために人為的に該当の酵素の発現量を増大して発現させることを意味する。

本発明者らは、上に説明した形質転換戦略を用いて、コリネバクテリウムグルタミクムから母乳オリゴ糖である３’−フコシルラクトースを大量生産できることを確認した。
本発明において、前記α−１，３−フコース転移酵素（α−１，３−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードする遺伝子は、ａｚｏＴ遺伝子によって暗号化されたものを使用することが好ましく、前記ａｚｏＴ遺伝子は、好ましくは、配列番号５の核酸配列で構成されたものとすることができる。α−１，３−フコシルラクトースを生産するためには、ＧＤＰ−Ｌ−フコース（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ）とラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）とを基質にしてα−１，３−フコシルラクトース生産反応を行うα−１，３−フコース転移酵素（α−１，３−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が必要である（図１参照）。この酵素は様々な微生物に存在するが、本発明ではアゾスピリルムブラシレンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）から由来した遺伝子（ａｚｏＴ）を使用した。他の由来のα−１，３−フコース転移酵素を使用した場合には３’−フコシルラクトースの生産量がわずかであったが、ａｚｏＴ遺伝子を使用した場合、他の由来のものを使用する場合に比べて３’−フコシルラクトースの生産量が著しく高く現れた。

本発明は、ラクトースが添加された培地に、本発明の組換えコリネバクテリウムグルタミクムを培養することを特徴とする３’−フコシルラクトースの生産方法を提供する。本発明の組換えコリネバクテリウムグルタミクム菌株を用いる場合、高濃度、高収率、高生産性で３’−フコシルラクトースを生産することができる。
上記の本発明の３’−フコシルラクトースの生産方法において、前記培地は、グルコースをさらに含むことが好ましい。グルコースが培地に追加されると、菌株の生育が活発になり、より高い生産性で３’−フコシルラクトースを生産することができる。
上記の本発明の３’−フコシルラクトースの生産方法は、回分式又はラクトースを追加供給する流加式培養によって行うことができる。回分式又は流加式培養に関する細部・枝葉の技術は当業界の公知技術を用いればよく、それについての記載は省略する。

本発明の菌株コリネバクテリウムグルタミクムは、３’−ＦＬ生産の基質であるラクトースを菌体内に取り込むためにラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅｐｅｒｍｅａｓｅ）を導入した。すなわち、コリネバクテリウムグルタミクムを用いて３’−ＦＬを生産するためにはラクトースを菌体内に取り込み得るラクトースペルメアーゼに形質転換させなければならないが、本発明の菌株はこの酵素で形質転換されたものである。
ラクトースペルメアーゼは通常、ブドウ糖の存在下で「ｇｌｕｃｏｓｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ（ブドウ糖阻害）」を受けてその活性が阻害する。このため、ブドウ糖の存在下でラクトースの取り込みが起きなくなり、結果として３−ＦＬを生産できなくなる。
しかし、３’−ＦＬの生産のためのホスト菌株として本発明で使用したコリネバクテリウムグルタミクムでは「ブドウ糖阻害」作用が起こらず、ブドウ糖の存在下でもラクトースの取り込みによる３’−ＦＬの生産ができ、これによって３’−ＦＬの生産性を増大することができた。

本発明のコリネバクテリウムグルタミクムを用いた３’−ＦＬの生産方法は、３’−ＦＬを「ｎｏｎｇｒｏｗｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｆｏｒｍａｔｉｏｎ」の生産パターンで生産することが、本発明の下記の実験から確認された。
代謝産物の生産がホスト菌株の生育に関係なく生産される「ｎｏｎｇｒｏｗｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｆｏｒｍａｔｉｏｎ」は、代謝産物の生産のためのホスト菌株が共に生長されることが要求されないため、ホスト菌株を大量で培養した後、基質を投入して短時間で代謝産物を大量に生産できるという長所がある。また、培養に使用されたホスト菌株を繰り返し使用することもできるため、生産性を増大できるという長所もある。したがって、本発明でコリネバクテリウムグルタミクムを用いて構築した３’−ＦＬ生産方法は、３’−ＦＬの生産を増大することができる方法である。
以下、本発明の内容を下記の実施例を用いてより詳細に説明する。ただし、本発明の権利範囲が下記の実施例に限定されるものではなく、それと等価の技術的思想の変形をも含む。

［実施例１：組換え菌株及びプラスミドの作製］
プラスミド作製のためにクローニングには大腸菌（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＴＯＰ１０）を用い、３’−フコシルラクトース（３’−ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ，３’−ＦＬ）の生産のためにコリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２を用いた。先行研究で開発されたｍａｎＢとｍａｎＣそしてｌａｃＹＡ遺伝子クラスターを発現するｐＶＢＣＬ発現用プラスミドを用いた。また、ｇｍｄとｗｃａＧ遺伝子を発現するｐＥＧＷ発現用プラスミドにα−１，３−フコース転移酵素（α−１，３−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ａｚｏＴ））を発現させるためにベクターを構築した。このとき、α−１，３−フコース転移酵素（ａｚｏＴ）の由来はアゾスピリルムブラシレンセ（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）ＡＴＣＣ２９１４５であり、ｐＥＧＷベクターにＳａｃ１の制限酵素を用いてα−１，３−フコース転移酵素（ａｚｏＴ）を挿入した。
上記で利用したｍａｎＢ、ｍａｎＣ、ｇｍｄ、ＷｃａＧ、ｌａｃＹＡ及びα−１，３−フコース転移酵素（ａｚｏＴ）の遺伝子配列、菌株、プラスミド及びオリゴヌクレオチドを下記の表１〜３に記載した。

［実施例２：組換えコリネバクテリウムグルタミクムを用いた３’−フコシルラクトースの生産］
（１）培養条件及び方法
種菌培養には、適切な抗生剤（カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン５μｇ／ｍＬ）が含まれた５ｍＬのＢＨＩ（ＢｒａｉｎＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ）培地が入っている実験管を利用し、温度は３０℃、撹拌速度は２５０ｒｐｍを維持しつつ１２時間培養した。
回分式培養は、１００ｍＬ（（ＮＨ₄）₂ＳＯ４２０ｇ／Ｌ、尿素５ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄ １ｇ／Ｌ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄ ０．２５ｇ／Ｌ、ＭＯＰＳ₄ ２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ₂ １０ｍｇ／Ｌ、Ｂｉｏｔｉｎ０．２ｍｇ／Ｌ、プロトカテク酸３０ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂０１０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ１０ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ₄ ０．２ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ０．０２ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）が入っている２５０ｍｌフラスコで、３０℃にて行った。撹拌速度は２５０ｒｐｍを維持しつつ培養した。回分式培養時には、光学密度（ＯＤ６００）が０．８に到達した時点でＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、ラクトースを最終濃度がそれぞれ１．０ｍＭ、１０ｇ／Ｌとなるように添加した。
高濃度細胞培養のための流加式培養は、４０ｇ／Ｌのグルコース及び適切な抗生剤（カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、テトラサイクリン５μｇ／ｍＬ）を含む１．０Ｌの最小培地を含む２．５Ｌ入り生物反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ，Ｋｏｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃｈｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）で行った。
初期に添加したグルコースが完全に枯渇した後、８００ｇ／Ｌのグルコースを含むフィーディング溶液を５．７ｇ／Ｌ／ｈの速度にて、連続式（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｆｅｅｄｉｎｇ）で供給した。これと同時に、ｔａｃプロモーター−媒介遺伝子発現を誘導して３’−フコシルラクトースを生産するために、ＩＰＴＧ、ラクトースを、最終濃度が１．０ｍＭ、１０ｇ／Ｌとなるように添加した。
発酵中に培地のｐＨが設定ポイント（ｓｅｔ−ｐｏｉｎｔ）よりも低くなると、自動で２８％のＮＨ₄ＯＨが供給され、高くなると２ＮＨＣｌが添加され、ｐＨが一定範囲内（ｐＨ６．９８〜７．０２）に維持されるようにした。培地のｐＨは、ｐＨ電極（ＭｅｔｔｌｅｒＴｏｌｅｄｏ，ＵＳＡ）を用いて実時間で測定された。撹拌速度及び通気速度は、酸素欠乏を防止するためにそれぞれ１０００ｒｐｍ及び２ｖｖｍに維持した。

（２）細胞及び代謝産物の濃度の決定
乾燥細胞重量は、光学密度（ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ，ＯＤ）にあらかじめ測定した変換定数０．３をかけて決定した。光学密度（ＯＤ）は、サンプルを適切に希釈して光学密度を０．１〜０．５の範囲に合わせた後に、分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ２０００，ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）を用いて吸光度６００ｎｍで測定した。
３’−フコシルラクトース、ラクトース、ラクテート、グルコース及び酢酸の濃度は、ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＡｎａｌｙｓｉｓｃｏｌｕｍｎ（ＲｅｚｅｘＲＯＡ−ｏｒｇａｎｉｃａｃｉｄ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，ＵＳＡ）及びＲＩ（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅｉｎｄｅｘ）検出器が装着されたＨＰＬＣ（ｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＬＣ，ＵＳＡ）を用いて測定した。６０℃で加熱したカラムを適用して１０倍希釈した２０マイクロリットルの培養培地を分析した。０．６ｍＬ／ｍｉｎの流速で５ｍＭのＨ₂ＳＯ₄溶液を移動相として用いた。

（３）回分式培養を用いた３’−フコシルラクトースの生産
３’−フコシルラクトース生産性能及び発酵特徴を調べるために、ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧ、ａｚｏＴ及びｌａｃＺが除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）を導入した組換えコリネバクテリウムグルタミクムをそれぞれフラスコで回分式培養した。光学密度（ＯＤ６００）が０．８に到達した時点でＩＰＴＧ、ラクトースを最終濃度がそれぞれ１．０ｍＭ、１０ｇ／Ｌとなるように添加した。
フラスコ回分式培養の結果、３９０ｍｇ／Ｌの３’−フコシルラクトースが生産され、この時のラクトースに対する２’−フコシルラクトースの収率は０．３２（ｍｏｌｅ２’−フコシルラクトース／ｍｏｌｅラクトース）、生産性は５．４９ｍｇ／Ｌ／ｈだった（図３及び表４）。図２は、コリネバクテリウムグルタミクムｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＡ（ｐＥＧＷ＋ａｚｏＴ）から生産された３’−フコシルラクトースをＨＰＬＣで測定した結果である。上記の回分式培養の結果は下記の表４に記載し、図３は、組換えコリネバクテリウムグルタミクムｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＡを用いたフラスコ回分式培養結果を示すグラフである。

組換えコリネバクテリウムグルタミクムｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＡを用いたフラスコ回分式培養の結果

（４）流加式培養を用いた３’−フコシルラクトースの生産
高濃度の細胞培養によって高濃度３’−フコシルラクトースを生産するために、ｐＶＢＣＬ、ｐＥＧＷＡプラスミドを導入した組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を用いて２．５Ｌ水準の発酵器で流加式培養を行った。
初期に添加した４０ｇ／Ｌのグルコースを全て消耗した時点から細胞生長を維持するためにフィーディング溶液を、連続式（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｆｅｅｄｉｎｇ）方法を用いて５．７ｇ／Ｌ／ｈの速度で供給した。これと同時に３’−フコシルラクトースの生産を誘導するためにＩＰＴＧとラクトースを添加した。
実験の結果、発酵が進行される間に酢酸は全く生成されなく、グルコースの代謝によって細胞は最終的に乾燥細胞重量４８．９ｇ／Ｌに到達した。また、最大の３’−フコシルラクトース濃度は３．６ｇ／Ｌ、ラクトースに対する生産収率は０．１７（ｍｏｌｅ３’−フコシルラクトース／ｍｏｌｅラクトース）であり、生産性は、０．０３ｇ／Ｌ／ｈが得られた（図４及び表５）。
３’−フコシルラクトースの生産のための流加式培養の結果は下記の表５に記載し、図４は、組換えコリネバクテリウムグルタミクムｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＡを用いた流加式培養結果を示すグラフである。

組換えコリネバクテリウムグルタミクムｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＡを用いたフラスコ流加式培養の結果

Claims

基質としてラクトースとグルコースとが添加されている培地に、
α−１，３−フコース転移酵素（α−１，３−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が発現されるように形質転換され、
ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）が発現されるように形質転換され、
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅｓｙｎｔｈａｓｅ）が発現されるように形質転換され、
ラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅｐｅｒｍｅａｓｅ）が発現されるように形質転換され、
ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）及びＧＴＰ−マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を保有している組換えコリネバクテリウムグルタミクムを添加して、３’−フコシルラクトースを生産することを特徴とする３’−フコシルラクトースの生産方法。
前記フコシルラクトースの生産方法は、グルコース又はラクトースを追加供給する回分式培養又は流加式培養である請求項１に記載の３’−フコシルラクトースの生産方法。
前記組換えコリネバクテリウムグルタミクムは、
ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）が過発現されるように形質転換され、
ＧＴＰ−マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が過発現されるように形質転換されている請求項１又は２に記載の３’−フコシルラクトースの生産方法。