CN117701650A - 一种构建多聚磷酸激酶基因重组菌株及其发酵生产组氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建多聚磷酸激酶基因重组菌株及其发酵生产组氨酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过在大肠杆菌中表达多聚磷酸激酶，优化重组菌株的发酵条件，实现了L‑组氨酸产量的提高。将该菌以5％的接种量，接种于10‑L发酵罐中，从发酵温度、六偏磷酸钠浓度、镁离子浓度和残糖浓度的对发酵条件进行优化，得到最佳优化条件，L‑组氨酸的产量在48h达到最高36.9g/L。
Description
技术领域
本发明涉及一种构建多聚磷酸激酶基因重组菌株及其发酵生产组氨酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
L-组氨酸(L-Histidine)，分子式为C6H9N3O2，是一种含咪唑核的碱性氨基酸，由德国物理学家Kossel和Hedin于1986年首次分离制得。L-组氨酸是一类重要的功能性氨基酸，在参与组成蛋白质、平衡胞内pH等方面都发挥了重大功能，被广泛应用在了食品、医药、饲料等行业产品的制备中。
在整个大肠杆菌基因组中，L-组氨酸的合成途径都非常复杂。葡萄糖作为碳源通过磷酸转移酶系统(phosphotransferase system，PTS)进入胞内，经磷酸戊糖途径合成核糖-5-磷酸，再由核糖-5-磷酸与ATP在核糖磷酸焦磷酸激酶催化下生成L-组氨酸的重要前体物质5-磷酸核糖-1α-焦磷酸(Phosphoribosyl pyrophosphate，PRPP)，再以PRPP和ATP为底物，经过八种酶催化的十步酶促反应生成。因此，充足的ATP供应是合成L-组氨酸的必要条件。
多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,PPK)是一种催化多聚磷酸盐(polyphosphate,Poly P)可逆转化为ATP的酶。Poly P是ATP再生系统中非常有吸引力的磷酸供体，与其他磷酸供体相比，它成本最低，稳定性较高。
现有技术中，利用发酵技术生产L-组氨酸的发酵效率低，尚不清楚多聚磷酸盐激酶与组氨酸发酵的关联。
发明内容
[技术目的]
本发明的目的在于通过基因工程和发酵优化获得具有高效合成L-组氨酸的重组大肠杆菌的方法。
[技术方案]
本发明的技术方案：以基因工程手段构建一株产多聚磷酸激酶的大肠杆菌，对其进行发酵优化，通过菌体生长以及L-组氨酸浓度检测来确定最优发酵条件。本发明成功构建了一株表达多聚磷酸激酶合成L-组氨酸的重组大肠杆菌并优化了其发酵条件。来源于谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的多聚磷酸激酶CgPPK以多聚磷酸盐为底物，一步将AMP或ADP转化为ATP，可以为组氨酸的合成提供充足的ATP。
本发明提供了一种重组大肠杆菌，以pET28a为载体，在大肠杆菌中表达SEQ IDNO.2所示的多聚磷酸激酶CgPPK。
在一种实施方式中，编码所述多聚磷酸激酶CgPPK的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种生产组氨酸的方法，将所述的重组大肠杆菌接种至发酵培养基中进行发酵。
在一种实施方式中，所述发酵培养基的组成包括：葡萄糖、白色玉米浆粉、硫酸铵、KH2PO4、硫酸镁、六偏磷酸钠和卡那霉素。
在一种实施方式中，将重组大肠杆菌的摇瓶发酵条件优化，包括以下步骤：
a)考察发酵温度对细胞生物量和L-组氨酸产量的影响，将发酵温度分别设定25℃-40℃测试其对及L-组氨酸产量的影响。
b)在发酵温度的基础上，考察六偏磷酸钠浓度对L-组氨酸产量的影响，将六偏磷酸钠浓度分别设定为12.24g/L-61.17g/L。
c)在发酵温度和六偏磷酸钠浓度的基础上，考察镁离子浓度对L-组氨酸产量的影响，将硫酸镁浓度分别设定为12.32-61.62g/L。
d)在发酵温度、六偏磷酸钠浓度以及镁离子浓度的基础上，考察残糖浓度对L-组氨酸产量的影响，当发酵体系中葡萄糖浓度低于10-30g/L时，补加葡萄糖，使得反应体系中的葡萄糖浓度维持在10g/L-30g/L。
本发明还提供了所述重组大肠杆菌在食品、保健品、药品、化妆品、或饲料领域制备含组氨酸的产品中的应用。
有益效果：
通过在大肠杆菌中表达多聚磷酸激酶，优化重组菌株的发酵条件，实现了L-组氨酸产量的提高。将该菌以5％的接种量，接种于10-L发酵罐中，使初始OD达到0.4。从发酵温度、六偏磷酸钠浓度、镁离子浓度和残糖浓度的对发酵条件进行优化，得到最佳优化条件，L-组氨酸的产量在48h达到最高36.62g/L。
附图说明
图1为CgPPK在大肠杆菌中表达的破细胞上清液SDS-PAGE图。
图2为大肠杆菌表达质粒pET-28a(+)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coliBL21购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，重组质粒pET28a-CgPPK由两端分别带限制性内切酶位点BamHI和XhoI核苷酸顺序的谷棒杆菌基因ppk2插入到质粒pET-28a(+)MCS区域相同的限制性内切酶位点BamHI和XhoI而制成。可以用引物F1和引物R1通过对谷棒杆菌基因组DNA的聚合酶链式反应(polymerasechain reaction,PCR)来制得两端分别带BamHI和XhoI核苷酸顺序的谷棒杆菌基因ppk2。
引物F1:5’-AGTGGATCCATGCGAAAGAAAAAAGACGGTC
引物R1:5’-AGTCTCGAGCTATTTCTTGGACTTCTTCTTGCC
所述引物可以从生物科研试剂公司(如上海生工生物工程股份有限公司或金斯瑞生物科技股份有限公司GenScript)订购，质粒pET-28a(+)可从生命科学试剂公司(如赛默飞Thermo Fisher，或上海博尔森生物科技有限公司BIOESN)订购。相关产品信息可在其产品资料中或其网站上获得。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl10.0g·L-1、卡那霉素50μg·mL-1(固体培养基中添加琼脂粉15g·L-1)。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
L-组氨酸浓度测定方法：
用高效液相色谱方法对组氨酸含量进行测定。
组氨酸标准品的配制：精密称取组氨酸标品10mg于100mL容量瓶中，用0.1mol·L-1盐酸溶液定容，得到质量浓度为100μg·mL-1的L-组氨酸母液，将其稀释为10μg·mL-1、20μg·mL-1、30μg·mL-1、40μg·mL-1、50μg·mL-1的标准品，置于4℃冰箱中备用。
衍生剂溶液和催化剂溶液的配制：移取异硫氰酸苯酯PITC250μL于10mL容量瓶中，乙腈定容，得到浓度为0.2mol·L-1的衍生剂溶液；移取三乙胺溶液1.4mL于10mL容量瓶中，乙腈定容，得到浓度为1mol·L-1的催化剂溶液。2份溶液均置于4℃冰箱中备用。
柱前衍生：取样品200μL于1mL离心管中，加入0.2mol·L-1衍生剂溶液和1mol·L-1催化剂溶液各100μL，涡旋混匀，室温放置20min，加入正己烷400μL，涡旋混匀1min后静置10min，取下层溶液进样分析。
色谱柱为安捷伦C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；柱温30℃；流动相A为0.05mol·L-1乙酸钠溶液(冰乙酸调pH至6.3)，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序：0～11.5min，91％A；11.5～12.5min，91％→70％A；12.5～20min，70％A；20～21min，70％→30％A；21～30min，30％A；30～31min，30％→91％A；31～35min，91％A；流速1mL·min-1；检测波长254nm；进样量20μL。
实施例1:构建表达外源多聚磷酸激酶CgPPK的重组大肠杆菌菌株
具体步骤如下：
(1)大肠杆菌E.coliBL21感受态的制备
从-80℃冰箱取出保存好的大肠杆菌E.coliBL21解冻，用接种环挑取少量菌种划线接种到LB固体培养皿中，放置在37℃培养箱中过夜培养，次日从LB平板中挑取单菌落接种到10mL的LB液体培养基中，37℃，220rpm，摇床培养12-14h。按照1％的接种量接种到50mL液体培养基中，相同条件下摇床培养至OD600达到0.35-0.5左右，立即放置冰上冷却15-30min。后续操作按照Takara感受态制备试剂盒说明书进行，将制备好的感受态细胞分装成100μL，于-80℃条件储存。
(2)重组质粒热击转化法转化菌株大肠杆菌中
重组质粒pET28a-CgPPK的构建：
如上所述，利用BamHI和XhoI的核苷酸序列特征，将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的多聚磷酸激酶CgPPK基因连接至质粒pET28a，获得质粒pET28a-CgPPK。再将上述所得重组质粒pET28a-CgPPK用热击转化法转入至大肠杆菌E.coliBL21菌株，步骤如下：将10μL连接产物取出加入感受态细胞，轻轻混匀后，冰上放置30min左右。在42℃水浴中热激90s，立即在冰上放置2min。加入1mL的LB液体培养基，上下轻轻颠倒混匀，置于37℃，200rpm摇床中孵育2h。将孵育好的菌液3000rpm离心1min，去掉上清900μL，用剩余液体重悬菌体，均匀涂布在含有卡那霉素抗生素的LB琼脂平板上，37℃培养箱中过夜培养。
(3)重组菌株阳性转化子的筛选
挑取在具有卡那霉素抗生素压力平板上长出的菌落，于LB培养基中摇瓶发酵，将菌体用20mmol·L-1PBS(pH6.0)悬浮至OD600＝5，冰浴中25％功率超声破碎，工作5s间歇5s，工作时间10min。10000r·min-1离心5min获得细胞破碎上清液。将得到的发酵上清液进行SAS-PAGE分析验证，结果如图1所示，在35kDa处有明显条带，与CgPPK的理论大小36.03kDa相符，结果表明CgPPK在大肠杆菌中成功表达。
实施例2：重组菌株E.coliBL21(pET28a-CgPPK)发酵温度优化
具体步骤如下：
将重组菌株E.coliBL21(pET28a-CgPPK)接种于LB种子培养基，培养9-12h后，以5％接种量转接到含有5-L发酵培养基的10-L发酵罐中，使接种后的OD为0.4。
初始发酵条件为：初糖浓度40g/L，溶氧控制40％，通气量1vvm。发酵过程中对发酵体系中的葡萄糖含量进行实时监控，当残糖浓度低于10g/L时补加浓度为500g/L的葡萄糖水溶液，使发酵罐中的残糖浓度维持在10g/L。
发酵培养基的组成为：葡萄糖40g·L-1、白色玉米浆粉5g·L-1、硫酸铵10g·L-1、KH2PO41g·L-1、MgSO46g·L-1、六偏磷酸钠55.1g·L-1、卡那霉素50μg·mL-1。
分别在25℃、30℃、35℃与40℃条件下发酵，研究不同温度条件对重组菌株L-组氨酸合成水平的影响(结果如表1所示)。由表1可知重组菌株E.coliBL21(pET28a-CgPPK)的最适发酵温度为35℃，发酵48h，菌株OD值为50.1，L-组氨酸的产量为21.3g/L。
表1
| 温度(℃) | 25 | 30 | 35 | 40 |
| L-组氨酸浓度(g/L) | 10.6 | 17.0 | 21.3 | 13.7 |
实施例3：本发明重组菌株发酵的最适六偏磷酸钠浓度
具体步骤如下：
将重组菌株E.coliBL21(pET28a-CgPPK)接种于LB种子培养基，培养9-12h后，以5％接种量转接到含有5-L发酵培养基的10-L发酵罐中，使接种后的OD为0.4。
初始发酵条件为：初糖浓度40g/L，溶氧控制40％，发酵温度为35℃，通气量1vvm。发酵过程中对发酵体系中的葡萄糖含量进行实时监控，当残糖浓度低于10g/L时补加浓度为500g/L的葡萄糖水溶液，使发酵罐中的残糖浓度维持在10g/L。
发酵培养基的组成为：葡萄糖40g·L-1、白色玉米浆粉5g·L-1、硫酸铵10g·L-1、KH2PO41g·L-1、MgSO46g·L-1、卡那霉素50μg·mL-1、六偏磷酸钠。调节六偏磷酸钠浓度分别在12.24、24.47、36.71、48.94、61.17g/L，研究不同六偏磷酸钠浓度对重组菌株L-组氨酸合成水平的影响(结果如表2所示)。由表2可知重组菌株E.coli BL21(pET28a-CgPPK)的最适六偏磷酸钠浓度为24.47g/L，发酵48h，菌株OD值为48.7，L-组氨酸的产量为27.8g/L。
表2
实施例4：本发明重组菌株发酵的最适硫酸镁浓度
具体步骤如下：
将重组菌株E.coli BL21(pET28a-CgPPK)接种于LB种子培养基，培养9-12h后，以5％接种量转接到含有5-L发酵培养基的10-L发酵罐中，使接种后的OD为0.4。初始发酵条件为：初糖浓度40g/L，溶氧控制40％，发酵温度为35℃通气量1vvm。发酵过程中对发酵体系中的葡萄糖含量进行实时监控，当残糖浓度低于10g/L时补加浓度为500g/L的葡萄糖水溶液，使发酵罐中的残糖浓度维持在10g/L。
发酵培养基的组成为：葡萄糖40g·L-1、白色玉米浆粉5g·L-1、硫酸铵10g·L-1、KH2PO41g·L-1、六偏磷酸钠24.47g·L-1、卡那霉素50μg·mL-1、MgSO4。调节硫酸镁浓度分别在12.32、24.64、36.97、49.29、61.62g/L，研究不同硫酸镁浓度对重组菌株L-组氨酸合成水平的影响(结果如表3所示)。由表3可知重组菌株E.coli BL21(pET28a-CgPPK)的最适硫酸镁浓度为24.64g/L，发酵48h，菌株OD值为49.2，L-组氨酸的产量为31.0g/L。
表3
实施例5：本发明重组菌株发酵的最适残糖浓度
具体步骤如下：
将重组菌株E.coli BL21(pET28a-CgPPK)接种于LB种子培养基，培养9-12h后，以5％接种量转接到含有5-L发酵培养基的10-L发酵罐中，使接种后的OD为0.4。
初始发酵条件为：初糖浓度50g/L，溶氧控制40％，发酵温度为35℃，通气量1vvm。发酵培养基的组成为：葡萄糖40g·L-1、白色玉米浆粉5g·L-1、硫酸铵10g·L-1、KH2PO41g·L-1、MgSO4·7H2O24.64g·L-1、六偏磷酸钠24.47g·L-1、卡那霉素50μg·mL-1。
发酵过程中对发酵体系中的葡萄糖含量进行实时监控，残糖浓度分别设定为10、20、30g/L，当残糖浓度低于设定值时，补加浓度为500g/L的葡萄糖水溶液，使发酵罐中的残糖浓度维持在设定值。研究不同残糖浓度对重组菌株L-组氨酸合成水平的影响(结果如表4所示)。由表4可知重组菌株E.coli BL21(pET28a-CgPPK)的最适残糖浓度为30g/L，发酵48h，菌株OD值为55.6，L-组氨酸的产量为36.6g/L。
表4
| 残糖浓度(g/L) | 10 | 20 | 30 |
| L-组氨酸浓度(g/L) | 31.2 | 33.3 | 36.6 |
对比例1：大肠杆菌E.coli BL21(pET-28a)发酵生产L-组氨酸
具体步骤如下：
将菌株E.coli BL21(pET-28a)[即不含有其它基因的空质粒的菌]接种于LB种子培养基，培养9-12h后，以5％接种量转接到含有5-L发酵培养基的10-L发酵罐中，使接种后的OD为0.4。
初始发酵条件为：初糖浓度50g/L，溶氧控制40％，发酵温度为35℃，通气量1vvm。发酵培养基的组成为：葡萄糖40g·L-1、白色玉米浆粉5g·L-1、硫酸铵10g·L-1、KH2PO41g·L-1、MgSO4·7H2O24.64g·L-1、六偏磷酸钠24.47g·L-1、卡那霉素50μg·mL-1。
发酵过程中对发酵体系中的葡萄糖含量进行实时监控，残糖浓度为30g/L，当残糖浓度低于30g/L时，补加浓度为500g/L的葡萄糖溶液，使发酵罐中的残糖浓度维持在30g/L。
发酵48h后检测菌株OD值和组氨酸产量，此时菌株OD值为62.3，组氨酸产量为15.1g/L。
对比例2：发酵培养基中磷酸盐的种类影响组氨酸产量
将重组菌株E.coliBL21(pET28a-CgPPK)接种于LB种子培养基，培养9-12h后，以5％接种量转接到含有5-L发酵培养基的10-L发酵罐中，使接种后的OD为0.4。
发酵培养基的组成为：葡萄糖40g·L-1、白色玉米浆粉5g·L-1、硫酸铵10g·L-1、KH2PO41g·L-1、MgSO4·7H2O24.64g·L-1、卡那霉素50μg·mL-1、磷酸盐40mmol·L-1。改变磷酸盐的种类分别为三聚磷酸钠、四聚磷酸钠和六偏磷酸钠，考察不同磷酸盐对组氨酸产量的影响。
初始发酵条件为：初糖浓度40g/L，溶氧控制40％，发酵温度为35℃，通气量1vvm。发酵过程中对发酵体系中的葡萄糖含量进行实时监控，当残糖浓度低于30g/L时补加浓度为500g/L的葡萄糖溶液，使发酵罐中的残糖浓度维持在30g/L。
发酵48h后检测菌株OD值和组氨酸产量，以三聚磷酸钠、四聚磷酸钠和六偏磷酸钠作为磷酸盐时，菌株OD值分别为54.5、55.8和55.3，组氨酸产量分别为29.2、30.2和36.6g/L。对比例3：不同激酶对组氨酸产量的影响
改变引入的激酶种类，分别用大肠杆菌(Escherichiacolistr.K-12)来源的丙酮酸激酶pykA(如SEQ ID NO.3所示)和大肠杆菌(Escherichiacolistr.K-12)来源的乙酸激酶ackA(如SEQ ID NO.4所示)对比CgPPK，考察不同激酶在基因工程菌发酵中对组氨酸产量的影响。用类似于上述构建重组质粒pET28a-CgPPK的方法(基因两端分别连接BamHI和XhoI酶切位点的序列)构建pET28a-pykA和pET28a-ackA，然后将这些质粒分别转入E.coliBL21细胞获得重组菌株E.coliBL21(pET28a-pykA)和E.coliBL21(pET28a-ackA)。将这两个重组菌株和E.coliBL21(pET28a-CgPPK),分别接种于LB种子培养基，培养9-12h后，以5％接种量转接到含有5-L发酵培养基的10-L发酵罐中，使接种后的OD为0.4。
初始发酵条件为：初糖浓度50g/L，溶氧控制40％，发酵温度为35℃，通气量1vvm。发酵培养基的组成为：葡萄糖40g·L-1、白色玉米浆粉5g·L-1、硫酸铵10g·L-1、KH2PO41g·L-1、MgSO4·7H2O24.64g·L-1、卡那霉素50μg·mL-1，分别以0.04mol/L磷酸烯醇式丙酮酸、乙酰磷酸和六偏磷酸钠为磷酸供体。
发酵过程中对发酵体系中的葡萄糖含量进行实时监控，残糖浓度为30g/L，当残糖浓度低于30g/L时，补加浓度为500g/L的葡萄糖溶液，使发酵罐中的残糖浓度维持在30g/L。
发酵48h后检测菌株OD值和组氨酸产量，菌株E.coliBL21(pET28a-pykA)、E.coliBL21(pET28a-ackA)和E.coliBL21(pET28a-CgPPK),的OD值分别为55.4、54.9和56.2，组氨酸的产量分别为25.2、21.2和36.9g/L。
对比例4：不同来源的多聚磷酸激酶对组氨酸产量的影响
耐辐射球菌(Deinococcusradiodurans)来源的多聚磷酸激酶基因DrPPK(如SEQID NO.5所示)和类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)来源的多聚磷酸激酶基因RsPPK(如SEQ ID NO.6所示)，按与前述构建pET28a-CgPPK质粒的相同方法来构建重组质粒pET28a-DrPPK和pET28a-RsPPK(DrPPK可继续使用BamHI和XhoI位点来切换核苷酸片段，RsPPK基因用SalI和HindIII位点序列)。然后将重组质粒分别转入大肠杆菌E.coliBL21从而获得表达外源多聚磷酸激酶的工程菌。设计和开展实验来检查不同来源的多聚磷酸激酶对发酵生产组氨酸产量的影响。将重组菌株E.coliBL21(pET28a-DrPPK)，E.coliBL21(pET28a-RsPPK)和E.coliBL21(pET28a-CgPPK)分别接种于LB种子培养基，培养9-12h后，以5％接种量转接到含有5-L发酵培养基的10-L发酵罐中，使接种后的初始OD600为0.4。
初始发酵条件为：初糖浓度50g/L，溶氧控制40％，发酵温度为35℃，通气量1vvm。发酵培养基的组成为：葡萄糖40g·L-1、白色玉米浆粉5g·L-1、硫酸铵10g·L-1、KH2PO41g·L-1、MgSO4·7H2O24.64g·L-1、六偏磷酸钠24.47g·L-1、卡那霉素50μg·mL-1。
发酵过程中对发酵体系中的葡萄糖含量进行实时监控，残糖浓度为30g/L，当残糖浓度低于30g/L时，补加浓度为500g/L的葡萄糖溶液，使发酵罐中的残糖浓度维持在30g/L。
发酵48h后检测菌液OD600值和组氨酸产量，DrPPK、RsPPK和CgPPK作为多聚磷酸激酶催化，菌液OD600值分别为56.2、57.1和56.8，组氨酸的产量分别为31.5、30.8和36.7g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用于限定本发明，任何熟悉重组DNA技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰：比如表达外源多聚磷酸激酶基因可以用pET28a以外的其它质粒；目标基因多聚磷酸激酶基因可以在游离的质粒上也可整合到宿主染色体上；可以用不同启动子调节基因表达水平。多聚磷酸激酶基因的序列可以有变异或差异，一般经验，与SEQ ID NO.1相似度在85％以上的具有多聚磷酸激酶活力的其它序列预期也能提高组氨酸发酵生产；其它非大肠杆菌组氨酸发酵菌株表达多聚磷酸激酶活力后预期也能提高组氨酸发酵生产。
Claims (7)
1.一种生产组氨酸的方法，其特征在于，将过表达多聚磷酸激酶基因的重组大肠杆菌接种至发酵培养基中进行发酵；所述多聚磷酸激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成包括：葡萄糖、白色玉米浆粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、六偏磷酸钠和卡那霉素。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中六偏磷酸钠的含量为12.24-61.17g/L。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中硫酸镁的含量为12.32-61.62g/L。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵过程中还进行补料，当发酵体系中葡萄糖浓度低于10-30g/L时，补加葡萄糖，使得反应体系中的葡萄糖浓度维持在10g/L-30g/L。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵的温度为30-40℃。
7.权利要求1～6任一所述方法在食品、保健品、药品、化妆品、或饲料领域制备含组氨酸的产品中的应用。
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