CN113025550A - 高产维生素b2枯草芽孢杆菌工程菌株、其构建及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株、其构建方法和应用。具体是在枯草芽孢杆菌中引入rib操纵子非翻译区突变;引入核黄素激酶ribC(G596A);引入腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA(P242L)引入核酮糖‑5‑磷酸‑差向异构酶突变基因rpe(A504del);无痕敲除rpe;单独或组合无痕敲除嘌呤转运蛋白基因nupN、pbuX、pbuO、pbuG、nupG。所构建的核黄素生产菌株相比野生型产量有大幅提高,因而具有较大的推广应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及生产维生素B2的基因工程菌株菌株,其基因工程构建方法,以及其在制备维生素B2中的应用。
背景技术
维生素B2又名核黄素,是一种水溶性维生素,其分子式为C17H20O6N4,IUPAC中文名:7,8-二甲基-10-(1’-D-核糖醇基)-异咯嗪。核黄素在细胞中经过连续的两步反应生成黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD),它们可以作为黄素蛋白的辅酶或辅基参与细胞内呼吸电子传递与多种还原反应。许多微生物可以从头合成核黄素,而包括人在内的哺乳动物不能自身合成只能从食物中获取。核黄素缺乏会引起多种疾病,如发育迟缓、视力下降、口唇炎症等。因为其重要的生理作用,核黄素被广泛应用于保健品、食品以及畜牧业中。核黄素的生产方法主要为微生物发酵法,包括阿舒颊囊酵母(Eremothecium ashbyii)、棉囊阿舒氏酵母(Ashbya gossypii)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、产氨棒杆菌(Corynebactia aminogensis)在内的微生物都可以作为核黄素的生产菌株。而枯草芽孢杆菌由于其生长速度快、培养条件简单、核黄素产率高等优势而逐渐成为了微生物发酵生产核黄素的主要菌株。
核黄素的生物合成途径从葡萄糖出发,经过戊糖磷酸途径、嘌呤合成途径、核黄素合成途径最终生成核黄素。核黄素合成中所需的ATP则经由糖酵解途径和TCA循环提供,而核黄素合成的两个前体核酮糖-5-磷酸和鸟苷三磷酸分别由戊糖磷酸途径和嘌呤合成途径产生。最终核酮糖-5-磷酸和鸟苷三磷酸在核黄素操纵子编码的4个酶的催化下,经过7步反应生成核黄素。
核黄素操纵子的转录强度受到核糖开关的调节,通过突变核糖开关序列可以解除细胞对核黄素操纵子的表达调控。腺嘌呤琥珀酸合成酶(PurA)催化次黄嘌呤核苷酸转变为腺苷琥珀酸。通过突变purA基因可以削弱该反应对次黄嘌呤核苷酸的分流,增加鸟苷三磷酸的合成。核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase,Rpe)是核酮糖-5-磷酸与木糖-5-磷酸相互转变的关键酶,也在连接糖酵解途径与戊糖磷酸途径中起着重要作用。在数据库中,Rpe是一个双向的酶,且没有文献报道说明哪个方向是更强的。而之前的文献更倾向通过过表达该酶增加从糖酵解途径向戊糖磷酸途径的通量,并没有文献尝试过敲除或降低该酶活性来提高核黄素前体合成。然而我们推测该酶倾向催化从核酮糖-5-磷酸生成木糖-5-磷酸的反应,即核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶突变会减少核酮糖-5-磷酸生成木糖-5-磷酸,从而降低戊糖磷酸途径流向糖酵解途径的流量,使核黄素代谢通路流量增加。鸟苷三磷酸合成途径中的嘌呤中间体会对嘌呤合成途径产生抑制。通过敲除菌株的嘌呤转运蛋白,可以使细胞内嘌呤类物质的浓度降低,解除反馈抑制,增加鸟苷三磷酸的合成,进而提高核黄素的产量。
虽然像CN 105483071和CN 110591990等已涉及一种高产核黄素大肠杆菌工程菌株及构建,但是如何进一步提高维生素B2产量的菌株改造仍有进一步研究的必要。
发明内容
目前,尚未有突变或敲除核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶基因rpe,以及单独或组合敲除嘌呤转运蛋白基因nupN、pbuX、pbuO、pbuG、nupG用于构建产维生素B2基因工程菌株的报道。研究表明,如果从野生型直接突变rpe效果并不如人意,因此需要配合araR用ParaR-neo反选盒替换,并且在其基因组中引入rib操纵子非翻译区突变(以解除下游产物对核黄素操纵子的转录调控),或进一步在其基因组中引入前导区替换gsiB稳定子、引入G596A突变的ribC和引入P242L突变的 purA配合才能达到更好的效果。
本发明提供一种高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株,其特征在于,枯草芽孢杆菌中阿拉伯糖操纵子阻遏蛋白基因araR被ParaR-neo反选盒替换,并在其基因组中引入rib操纵子非翻译区突变、引入G596A突变的ribC和引入P242L突变的 purA。其中,rib操纵子非翻译区转录后会形成被称为“核糖开关”的二级结构(Kil Y V , Mironovi V N ,Gorishin I Y, et al. Riboflavin operon of Bacillus subtilis: unusualsymmetric arrangement of the regulatory region[J]. Mol Gen Genet, 1992, 233(3):483-486.)。该核糖开关在结合核黄素下游产物FMN后会使rib操纵子的转录提前终止,而当对非翻译区进行突变以破坏“核糖开关”,以削弱了其结合FMN的能力,因而解除其对rib操纵子的转录调控。
优选地,进一步在所述菌株基因组中引入rpe表达量降低或表达的蛋白活性降低的突变或者敲除rpe。
更优选地,进一步在所述菌株基因组中引入rpe表达活性降低的突变是引入A504del突变的 rpe。
还优选地,进一步在所述菌株基因中敲除嘌呤转运蛋白基因nupN、pbuX、pbuO、pbuG和/或nupG,或降低嘌呤转运蛋白基因nupN、pbuX、pbuO、pbuG和/或nupG的表达或降低其表达蛋白的活性。最优选地,进一步所述菌株基因中敲除嘌呤转运蛋白基因pbuG和nupG,或降低嘌呤转运蛋白基因pbuG和nupG的表达或降低其表达蛋白的活性;敲除嘌呤转运蛋白基因nupN和pbuX,或降低嘌呤转运蛋白基因nupN和pbuX的表达或降低其表达蛋白的活性;敲除嘌呤转运蛋白基因pbuG、nupG、nupN和pbuX,或降低嘌呤转运蛋白基因nupN、pbuX、pbuG和nupG的表达或降低其表达蛋白的活性;或者敲除嘌呤转运蛋白基因nupN、pbuX、pbuO、pbuG和nupG,或降低嘌呤转运蛋白基因nupN、pbuX、pbuO、pbuG和nupG的表达或降低其表达蛋白的活性。
在一个具体实施方式中,枯草芽孢杆菌原始出发菌株可以适合的枯草芽孢杆菌,优选地的是Bacillus subtilis 168。
优选地,所述的高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株,其特征在于,涉及引入的外源基因是采取无痕引入方式。
本发明还提供所述的高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株的制备方法,其特征在于通过遗传操作方法来实现。
本发明还提供所述的高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株在生产维生素B2中的应用。
具体地,通过发酵培养所述高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株,从培养液中提取产维生素B2。
其中,各工程菌株的具体构建方法如下:
高产核黄素枯草芽孢杆菌工程菌株的构建方法,其特征是包括如下步骤:(1)构建BS168Y菌株:使用ParaR-neo反选盒替换菌株B. subtilis 168中阿拉伯糖操纵子阻遏蛋白基因araR;(2)构建BS168YXM菌株:在(1)中所获得的菌株BS168Y基因组引入rib操纵子非翻译区突变,更具体的是是转录起始位点后第39位G突变为A;(3)构建BS168D1菌株:在(2)中所获得的菌株BS168YXM基因组无痕引入ribC(G596A),得到的菌株命名为BS168D1;(4)构建BS168D2菌株:在(3)中所获得的菌株BS168D1基因组无痕引入purA(P242L),得到的菌株命名为BS168D2;(5)构建BS168D3菌株:在(4)中所获得的菌株BS168D2基因组无痕引入rpe(L168D),得到的菌株命名为BS168D3:(6)构建BS168pGNXO菌株:敲除步骤(5)所获得的菌株BS168D3基因组的嘌呤转运蛋白基因nupN、pbuX、pbuO、pbuG、nupG,得到的菌株命名为BS168pGNXO。
或者上述(4)中所获得的菌株BS168D2基因组敲除rpe,得到的菌株命名为BS168DR。
或者上述(5)中所获得的菌株BS168D3基因组敲除nupN,得到的菌株命名为BS168N。
或者上述(5)中所获得的菌株BS168D3基因组敲除pbuX,得到的菌株命名为BS168X。
或者上述(5)中所获得的菌株BS168D3基因组敲除pbuO,得到的菌株命名为BS168O。
或者上述(5)中所获得的菌株BS168D3基因组敲除pbuG,得到的菌株命名为BS168p。
或者上述(5)中所获得的菌株BS168D3基因组敲除nupG,得到的菌株命名为BS168G。
或者上述(5)中所获得的菌株BS168D3基因组敲除pbuG、nupG,得到的菌株命名为BS168pG。
或者上述(5)中所获得的菌株BS168D3基因组敲除nupN、pbuX,得到的菌株命名为BS168NX。
或者上述(5)中所获得的菌株BS168D3基因组敲除pbuG、nupG、nupN、pbuX得到的菌株命名为BS168pGNX。
现有技术文献的主要是通过提高前体物质合成基因、末端产物合成基因的表达量,解除合成途径中基因的表达调控、相关酶的反馈抑制,以及利用组学分析和逆向代谢工程的方法构建核黄素高产菌株。而本发明创新性地对枯草芽孢杆菌中的核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶和嘌呤转运蛋白进行了突变或敲除,其中的核黄素高产菌株构建的关键改造位点:核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶和嘌呤转运蛋白还没有被报道。同时,与引入rib操纵子非翻译区突变(如ribD+(G+39A)),或进一步在其基因组中引入前导区替换gsiB稳定子、引入G596A突变的ribC和引入P242L突变的 purA配合才能达到显著的效果。
由于嘌呤从头合成途径受到严格的反馈抑制作用,胞内的嘌呤核苷酸浓度过高就会抑制其从头合成的通量,而在核黄素的发酵生产中,嘌呤类物质如果外排受限,会不可避免在细胞中积累。并且发酵培养基成分通常比较复杂,如酵母粉、酵母抽提物中就会含有一些嘌呤类物质,影响嘌呤的从头合成,进而影响核黄素的合成。枯草芽孢杆菌能够吸收预先形成的嘌呤碱基,并将其用于核苷酸合成(补救)和用作氮源(分解代谢)。通过与PRPP反应,将嘌呤碱基直接转化为嘌呤核苷单磷酸。磷酸核糖基化可以被特定的嘌呤磷酸核糖基转移酶催化。环境中存在的嘌呤碱可被特定的膜蛋白运输系统吸收。因此,可以通过改造嘌呤转运蛋白来调节嘌呤碱对嘌呤途径的抑制。本发明以B. subtilis 168为基础,引入rib操纵子非翻译区突变(如ribD+(G+39A));引入核黄素激酶ribC(G596A);引入腺苷琥珀酸合成酶突变基因purA(P242L)引入核酮糖-5-磷酸-差向异构酶突变基因rpe(A504del);无痕敲除rpe;单独或组合无痕敲除嘌呤转运蛋白基因nupN、pbuX、pbuO、pbuG、nupG。所构建的核黄素生产菌株相比野生型产量有大幅提高,因而具有较大的推广应用价值。rpe改造菌株的产量相较对照菌株BS168D2提高了362-375%,嘌呤转运蛋白改造菌株的产量相较对照菌株BS168D3提高了8.4-35.2%。
因此,本发明的工程菌株为后期持续性改造高产维生素B2枯草芽孢杆菌的非氧化戊糖磷酸途径基因和嘌呤转运蛋白提供了依据。
附图说明
图1 不同枯草芽孢杆菌菌株发酵41h后的维生素B2产量。
图2 不同枯草芽孢杆菌菌株发酵41h后的生物量。
具体实施方式
本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案,这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制,任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变,均落在本发明的保护范围之内。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法,如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可通过正规商业渠道获得。
培养基配方:
LB 培养基(g/L):氯化钠 10,胰蛋白胨10,酵母提取物5,固体培养基加琼脂粉18。
发酵培养基(g/L):玉米浆干粉10、蔗糖30、硫酸镁2、硫酸铵7、磷酸氢二钾3、磷酸二氢钾1,用NaOH调节pH至7.2~7.4。
维生素B2的检测方法:发酵液混匀,用0.01mol/L NaOH将其稀释到适当的倍数后,混匀,避光碱溶20 min,12000 rpm离心2 min,取上清液以0.01 mol/L NaOH做空白在444nm下测定吸光度(显示值控制在0.2-0.8之间),按以下公式计算核黄素的含量:FB(mg/L)=(稀释倍数*吸光度)/0.0321。
实施例1:构建BS168Y菌株
用ParaR-neo反选盒替换菌株Bacillus subtilis 168(Kunst, F等,Thecomplete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis.Nature (1997) 390:249-256.)中阿拉伯糖操纵子阻遏蛋白基因araR(Gene ID: 938635)的菌株BS168Y的构建(Shi T等,Establishment of a markerless mutation deliverysystem in Bacillus subtilis stimulated by a double-strand break in thechromosome. PloS one 2013, 8:1-10.)。
(1)利用PCR反应,以B. subtilis 168基因组为模板,使用primer star高保真DNA聚合酶利用上下游引物UParaR-F,和UParaR-R扩增araR的上游同源臂UPara。以B. subtilis 168基因组为模板,使用primerstar高保真DNA聚合酶利用上下游引物para-F和para-R扩增araR的启动子paraR。以质粒pUB110 为模板,使用primerstar高保真DNA聚合酶利用上下游引物neo-F和neo-R,扩增新霉素抗性基因neo。以B. subtilis 168基因组为模板,使用primerstar高保真DNA聚合酶利用上下游引物DNaraR-F,DNaraR-R扩增araR的下游同源臂DNara。将UPara,paraR,neo,DNara作为模板,利用融合PCR反应,使用上下游引物UParaR-F和DNaraR-R获取携带araR上下游同源臂的用于整合反选盒paraR-neo的片段。
(2)将上述paraR-neo片段Spizizen转化导入到野生型枯草芽孢杆菌B. subtilis168中,用含有20 µg/mL的新霉素LB固体培养基中筛选重组成功的阳性克隆,以菌液作为模板使用引物UParaR-F和DNaraR-R进行PCR验证,得到paraR-neo替换阿拉伯糖操纵子阻遏蛋白基因araR的阳性菌株,BS168Y。
实施例2:构建BS168YXM菌株
(1)利用PCR反应,以B. subtilis 168基因组为模板,使用primerstar高保真DNA聚合酶利用上下游引物UPribR-F和UPribR-R,扩增ribD上游非翻译区突变同源臂片段UPrib,其中在引物UPribR-R的非互补序列中,引入对上游非翻译区的修饰。以B. subtilis168基因组为模板,使用primerstar高保真DNA聚合酶利用上下游引物DNribR-F和DNribR-R,扩增包含ribD基因的下游同源臂片段DNrib。合成两条序列反向互补的长引物P1和P2,其中含有rib操纵子非翻译区突变(Shi T等,Deregulation of purine pathway inBacillus subtilis and its use in riboflavin biosynthesis. Microb Cell Fact2014, 13:1-16.)。将UPrib、DNrib和P1、P2为模板,利用融合PCR反应,使用上下游引物UPribR-F和DNribR-R获取用于同源重组的rib-gsiB片段。
(2)将上述rib-gsiB片段Spizizen转化导入到带有新霉素反选盒的BS168Y菌株中,用含有100 µg/mL的玫瑰黄素LB固体培养基中筛选重组成功的阳性克隆,提取染色体作为模板使用引物UPribR-F和DNribR-R进行PCR验证,得到gsiB替换mRNA前导区的阳性菌株。将上述引物扩增得到PCR产物进行测序验证,确定rib操纵子非翻译区突变被正确引入到BS168YXM中。
实施例3:筛选标记cat-araR片段的克隆
利用PCR反应,以Staphylococcus aureus NCTC8325(Iordanescu S, SurdeanuM. Two restriction and modification systems in Staphylococcus aureusNCTC8325. J Gen Microbiol. 1976 Oct;96(2):277-81. doi: 10.1099/00221287-96-2-277. PMID: 136497.)基因组为模板,使用primerstar高保真DNA聚合酶利用上下游引物cat-F和cat-R扩增氯霉素抗性基因cat(GenBank登录号为GI 10956142)。以B. subtilis168为模板,使用primerstar高保真DNA聚合酶利用上下游引物ara-F和ara-R扩增阿拉伯糖操纵子阻遏蛋白基因araR。将cat和araR作为模板,利用融合PCR反应,使用上下游引物cat-F和ara-R获取筛选标记cat-araR片段。
实施例4:构建BS168D1菌株
向菌株BS168YXM中无痕引入ribC(G596A)(Wang G等,Integrated whole-genomeand transcriptome sequence analysis reveals the genetic characteristics of ariboflavin-overproducing Bacillus subtilis. Metab Eng 2018, 48:138-149.)的操作流程。
利用PCR反应以B. subtilis 168基因组为模板,使用primerstar高保真DNA聚合酶利用上下游引物UPribC-F,UPribC-R扩增包含部分ribC及上游同源臂的片段UPribC。以cat-araR片段为模板,使用primerstar高保真DNA聚合酶利用上下游引物CR-F,CRrib-R扩增CRrib。以B. subtilis 168基因组为模板,使用primerstar高保真DNA聚合酶利用上下游引物MIDribC-F,MIDribC-R扩增包含部分ribC基因的片段MIDribC,使用primerstar高保真DNA聚合酶利用上下游引物DNribC-F(包含需要引入的点突变),DNribC-R扩增包含部分ribC基因及下游同源臂的片段DNribC。将UPribC, CRrib, MIDribC, DNribC作为模板,利用融合PCR反应,使用上下游引物UPribC-F,DNribC-R获得用于同源重组的ribCm-CR片段。
将上述ribCm-CR片段使用spizizen转化导入到底盘菌BS168YXM,用含有8 µg/mL的氯霉素LB固体培养基筛选重组成功的阳性克隆,以菌液作为模板,利用引物UPribC-F,DNribC-R进行PCR验证,得到ribCm-CR替换ribC基因的阳性菌株。将上述PCR产物进行测序验证,确定ribCm点突变被正确引入到BS168YXM中。
将上述阳性克隆接种在5 mL LB液体培养基中,37 ℃,200 rpm培养8 h。将上述菌液取出120 µL,涂布于含有40 µg/mL的新霉素LB固体培养基中筛选cm-araR因重组丢失的转化子。以菌液作为模板,利用引物UPribC-F,DNribC-R进行PCR验证,得到丢失CR的ribCm阳性菌株。将上述PCR产物进行测序验证,确定ribCm点突变被正确引入到BS168YXM中。该菌株命名为BS168D1。
实施例5:构建BS168D2菌株
向菌株BS168D1引入purA(P242L)(Wang G等,Integrated whole-genome andtranscriptome sequence analysis reveals the genetic characteristics of ariboflavin-overproducing Bacillus subtilis. Metab Eng 2018, 48:138-149.)
利用PCR反应以B. subtilis 168基因组为模板,使用primerstar高保真DNA聚合酶利用上下游引物UPpurA-F,UPpurA-R(包含P242L)扩增包含purA上游同源臂及部分purA基因的片段UPpurA。以cat-araR片段为模板,以 CR-F, CRpA-R为引物扩增CRpurA,利用DNpurA-F,DNpurA-R扩增包含部分purA(包含另一个点突变)基因及其下游同源臂的片段DNpurA。将UPpurA, CRpurA, DNpurA为模板,利用融合PCR反应,使用上下游引物UPpurA-F,DNpurA-R获得用于同源重组的purAm-CR片段。
将上述purAm-CR片段使用spizizen转化导入到BS168D1中,用含有8 µg/mL的氯霉素LB固体培养基筛选重组成功的阳性克隆,以菌液作为模板,利用引物UPpurA-F,DNpurA-R进行PCR验证,得到purAm-CR替换purA的阳性克隆菌株。将上述PCR产物进行测序验证,确定purA m点突变被正确引入到BS168D1中。
将上述阳性克隆接种在5 mL LB液体培养基中,37 ℃,200 rpm培养8 h。将上述菌液取出120 µL,涂布于含有40 µg/mL的新霉素LB固体培养基中筛选cm-araR因重组丢失的转化子。以菌液作为模板,利用引物UPpurA-F,DNpurA-R进行PCR验证,得到丢失cat-araR的purA m阳性菌株。将上述PCR产物进行测序验证,确定purA m点突变被正确引入到BS168D1中。该菌株命名为BS168D2。
实施例6:构建含核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶rpe表达活性降低的突变体的BS168D3菌株
以B. subtilis 168染色体为模板,用引物UPrpem-F、UPrpem-R(含DR)扩增带接头的且带有点突变(L168D)的UPrpem(含DR)片段,以cat-araR片段为模板,用引物CR-F、CRrpem-R扩增CRrpem片段(含DR);以B. subtilis 168染色体为模板,用引物DNrpe-F、DNrpe-R扩增下游同源臂片段DNrpe,其中所述突变的rpe的核苷酸序列如(Elodie B-P,Sigrid CJ, De K, Veronique W, Ceeline G, Waulter P, Adarto C, Patrick P,Nancy HR: Genome Sequence of EU-Unauthorized Genetically Modified Bacillussubtilis Strain 2014-3557 Overproducing Riboflavin, Isolated from a VitaminB2 80% Feed Additive. Genome Announc 2015, 3: e00214-15.)所报道。
以UPrpem片段、CRrpem片段和DNrpe片段为模板,用引物UPrpem-F、DNrpe-R进行融合PCR,得到组装片段UCR-rpem,经核酸电泳检测正确,胶回收后得到纯化的rpem-CR片段。
将rpem-CR片段Spizizen转化BS168D2,涂布于含有8 µg/mL氯霉素的LB固体平板上,培养24 h后进行菌落PCR验证,核酸电泳正确的送金唯智测序,测序正确后,获得rpe基因带有点突变的中间菌株BS168D3-CR。
挑取中间菌株BS168D3-CR的单菌落于含有5 mL LB的试管中,37 ℃振荡培养8 h后,取120 µL菌液涂布于含有40 µg/mL新霉素的LB固体平板上,培养24 h后进行菌落PCR验证,核酸电泳正确的送金唯智测序,测序正确后,获得了染色体内部通过DR发生同源重组而去掉筛选标记cat-araR且rpe基因带有点突变的菌株BS168D3。
实施例7:构建核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶Rpe (Gene ID: 936393) 缺失的菌株BS168DR
以B. subtilis 168染色体为模板,用引物UPRpe-Ko1、UPRpe-Ko2(含DR)扩增带接头的UPrpe-ko(含DR)片段;以cat-araR片段为模板,用引物CR-F、CRRpe-ko2扩增CRrpe-ko片段(含DR);以菌株B. subtilis 168染色体为模板,用引物DNRpe-ko1、DNRpe-ko2扩增下游同源臂片段DNrpe-ko。
以UPrpe-ko片段、CRrpe-ko片段和DNrpe-ko片段为模板,用引物UPRpe-Ko1、DNRpe-Ko2进行融合PCR,得到组装片段rpe-ko-CR,经核酸电泳检测正确,胶回收后得到纯化的rpe-ko-CR片段。
将rpe-ko-CR片段Spizizen转化BS168D2,涂布于含有8 µg/mL氯霉素的LB固体平板上,培养24 h后进行菌落PCR验证,核酸电泳条带大小正确,约4 kb,即获得rpe缺失的中间菌株BS168∆rpe-CR。
挑取中间菌株BS168∆rpe-CR的单菌落于含有5 mL LB的试管中,37 ℃振荡培养8h后,取120 µL菌液涂布于含有40 µg/mL新霉素的LB固体平板上,培养24 h后进行菌落PCR验证,核酸电泳正确的,约2kb,获得了染色体内部通过DR发生同源重组而去掉筛选标记cat-araR且rpe缺失的菌株BS168DR。
实施例8:构建嘌呤转运蛋白NupN缺失的菌株BS168N
以B. subtilis 168染色体为模板,用引物UPnupN-F、UPnupN-R(含DR)扩增带接头的UPnupN(含DR)片段;以cat-araR片段为模板,用引物CR-F、CRnN-R扩增CRnN片段(含DR);以菌株B. subtilis 168染色体为模板,用引物DNnupN-F、DNnupN-R扩增下游同源臂片段DNnupN。其中,NupN基因的GenBank登录号为ID: 938870。
以UPnupN片段、CRnN片段和DNnupN片段为模板,用引物UPnupN-F、DNnupN-R进行融合PCR,得到组装片段nN-CR,经核酸电泳检测正确,胶回收后得到纯化的nN-CR片段。
将nN-CR片段Spizizen转化BS168D3,涂布于含有8 µg/mL氯霉素的LB固体平板上,培养24 h后进行菌落PCR验证,核酸电泳条带大小正确,约4 kb,即获得嘌呤转运蛋白nupN缺失的中间菌株BS168∆nupN-CR。
挑取中间菌株BS168∆nupN-CR的单菌落于含有5 mL LB的试管中,37℃振荡培养8h后,取120 µL菌液涂布于含有40 µg/mL新霉素的LB固体平板上,培养24 h后进行菌落PCR验证,核酸电泳正确的,约2 kb,获得了染色体内部通过DR发生同源重组而去掉筛选标记cat-araR且嘌呤转运蛋白NupN缺失的菌株BS168N。
实施例9:构建嘌呤转运蛋白PbuX缺失的菌株BS168X
以B. subtilis 168染色体为模板,用引物UPpbuX-F、UPpbuX-R(含DR)扩增带接头的UPpbuX(含DR)片段;以cat-araR片段为模板,用引物CR-F、CRpX-R扩增CRpX片段(含DR);以菌株B. subtilis 168染色体为模板,用引物DNpbuX-F、DNpbuX-R扩增下游同源臂片段DNpbuX。其中,PbuX的基因GenBank登录号ID: 939068。
以UPpbuX片段、CRpX片段和DNpbuX片段为模板,用引物UPpbuX-F、DNpbuX-R进行融合PCR,得到组装片段pX-CR,经核酸电泳检测正确,胶回收后得到纯化的pX-CR片段。
将pX-CR片段Spizizen转化BS168D3,涂布于含有8 µg/mL氯霉素的LB固体平板上,培养24 h后进行菌落PCR验证,核酸电泳条带大小正确,约4 kb,即获得嘌呤转运蛋白PbuX缺失的中间菌株BS168∆pbuX-CR。
挑取中间菌株BS168∆pbuX-CR的单菌落于含有5 mL LB的试管中,37℃振荡培养8h后,取120 µL菌液涂布于含有40 µg/mL新霉素的LB固体平板上,培养24 h后进行菌落PCR验证,核酸电泳正确的,约2 kb,获得了染色体内部通过DR发生同源重组而去掉筛选标记cat-araR且嘌呤转运蛋白PbuX缺失的菌株BS168X。
实施例10:构建嘌呤转运蛋白PbuO缺失的菌株BS168O
以B. subtilis 168染色体为模板,用引物UPpbuO-F、UPpbuO-R(含DR)扩增带接头的UPpbuO(含DR)片段;以cat-araR片段为模板,用引物CR-F、CRpO-R扩增CRpO片段(含DR);以菌株B. subtilis 168染色体为模板,用引物DNpbuO-F、DNpbuO-R扩增下游同源臂片段DNpbuO。其中,PbuO基因的GenBank登录号为ID: 938070。
以UPpbuO片段、CRpO片段和DNpbuO片段为模板,用引物UPpbuO-F、DNpbuO-R进行融合PCR,得到组装片段pO-CR,经核酸电泳检测正确,胶回收后得到纯化的pO-CR片段。
将pO-CR片段Spizizen转化BS168D3,涂布于含有8 µg/mL氯霉素的LB固体平板上,培养24 h后进行菌落PCR验证,核酸电泳条带大小正确,约4 kb,即获得嘌呤转运蛋白pbuO缺失的中间菌株BS168∆pbuO-CR。
挑取中间菌株BS168∆pbuO-CR的单菌落于含有5 mL LB的试管中,37 ℃振荡培养8 h后,取120 µL菌液涂布于含有40 µg/mL新霉素的LB固体平板上,培养24 h后进行菌落PCR验证,核酸电泳正确的,约2 kb,获得了染色体内部通过DR发生同源重组而去掉筛选标记cat-araR且嘌呤转运蛋白PbuO缺失的菌株BS168O。
实施例11:构建嘌呤转运蛋白PbuG缺失的菌株BS168p
以B. subtilis 168染色体为模板,用引物UPpbuG-F、UPpbuG-R(含DR)扩增带接头的UPpbuG(含DR)片段;以cat-araR片段为模板,用引物CR-F、CRpG-R扩增CRpG片段(含DR);以菌株B. subtilis 168染色体为模板,用引物DNpbuG-F、DNpbuG-R扩增下游同源臂片段DNpbuG。其中,PbuG的基因GenBank登录号ID: 936043。
以UPpbuG片段、CRpG片段和DNpbuG片段为模板,用引物UPpbuG-F、DNpbuG-R进行融合PCR,得到组装片段pG-CR,经核酸电泳检测正确,胶回收后得到纯化的pG-CR片段。
将pG-CR片段Spizizen转化BS168D3,涂布于含有8 µg/mL氯霉素的LB固体平板上,培养24 h后进行菌落PCR验证,核酸电泳条带大小正确,约4 kb,即获得嘌呤转运蛋白pbuG缺失的中间菌株BS168∆pbuG-CR。
挑取中间菌株BS168∆pbuG-CR的单菌落于含有5 mL LB的试管中,37 ℃振荡培养8 h后,取120 µL菌液涂布于含有40 µg/mL新霉素的LB固体平板上,培养24 h后进行菌落PCR验证,核酸电泳正确的,约2 kb,获得了染色体内部通过DR发生同源重组而去掉筛选标记cat-araR且嘌呤转运蛋白pbuG缺失的菌株BS168p。
实施例12:构建嘌呤转运蛋白NupG缺失的菌株BS168G
以B. subtilis 168染色体为模板,用引物UPnupG-F、UPnupG-R(含DR)扩增带接头的UPnupG(含DR)片段;以cat-araR片段为模板,用引物CR-F、CRnG-R扩增CRnG片段(含DR);以菌株B. subtilis 168染色体为模板,用引物DNnupG-F、DNnupG-R扩增下游同源臂片段DNnupG。其中,NnupG基因的GenBank登录号ID: 937472。
以UPnupG片段、CRnG片段和DNnupG片段为模板,用引物UPnupG-F、DNnupG-R进行融合PCR,得到组装片段nG-CR,经核酸电泳检测正确,胶回收后得到纯化的nG-CR片段。
将nG-CR片段Spizizen转化BS168 D3,涂布于含有8µg/mL氯霉素的LB固体平板上,培养24h后进行菌落PCR验证,核酸电泳条带大小正确,约4kb,即获得嘌呤转运蛋白nupG缺失的中间菌株BS168∆nupG-CR。
挑取中间菌株BS168∆nupG-CR的单菌落于含有5 mL LB的试管中,37 ℃振荡培养8 h后,取120 µL菌液涂布于含有40 µg/mL新霉素的LB固体平板上,培养24 h后进行菌落PCR验证,核酸电泳正确的,约2 kb,获得了染色体内部通过DR发生同源重组而去掉筛选标记cat-araR且嘌呤转运蛋白NupG缺失的菌株BS168G。
实施例13:构建嘌呤转运蛋白NupN、PbuX缺失的菌株BS168NX
按照实施例8中的构建方法敲除BS168D3菌株中的嘌呤转运蛋白NupN、PbuX,所获得的菌株命名为BS168NX。
实施例14:构建嘌呤转运蛋白PbuG、NupG缺失的菌株BS168pG
按照实施例8中的构建方法敲除BS168D3菌株中的嘌呤转运蛋白PbuG、NupG,所获得的菌株命名为BS168pG。
实施例15:构建嘌呤转运蛋白NupN、PbuX、PbuG、NupG缺失的菌株BS168pGNX
按照实施例8中的构建方法敲除BS168D3菌株中的嘌呤转运蛋白NupN、PbuX、PbuG、NupG,所获得的菌株命名为BS168pGNX。
实施例16:构建嘌呤转运蛋白NupN、PbuX、PbuO、PbuG、NupG缺失的菌株BS168pGNXO
按照实施例8中的构建方法敲除BS168D3菌株中的嘌呤转运蛋白NupN、PbuX、PbuO、PbuG、NupG,所获得的菌株命名为BS168pGNXO。
本部分所用引物如下:
本部分所用到的菌株及质粒如下:
实施例17:评价不同菌株的维生素B2生产能力
1、菌株培养条件:
将通过基因工程构建的上述各种维生素B2生产菌株在无菌条件下用接种针划线含有25 mg/L新霉素的LB固体平板,在37℃培养箱中倒置培养24 h,以获得新鲜活化的单菌落。用接种针挑取单菌落划线含有25 mg/L红霉素的LB固体斜面,在37℃培养箱中培养48h。刮取斜面上1/3的菌苔接种含有70 mL发酵培养基的500 mL挡板三角瓶中(每株菌3个平行),37 ℃、200 rpm振荡培养41 h后取发酵液测定OD600和维生素B2产量。测定方法参照Shi T等(Deregulation of purine pathway in Bacillus subtilis and its use inriboflavin biosynthesis. Microb Cell Fact 2014, 13:1-16.)中描述的方法。
2、不同菌株OD600和维生素B2产量的比较
不同菌株培养41 h后的维生素B2产量和OD600结果如图1和图2所示。其中,BS168D2的维生素B2产量达到53.30±0.043 mg/L,与之相比含有核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶突变基因rpe m的工程菌株BS168D3的维生素B2产量提高了4.62倍;敲除rpe的工程菌株BS168DR的维生素B2产量提高了4.75倍。与工程菌株BS168D3相比,单独敲除nupN、pbuX、pbuO、pbuG、nupG的工程菌株BS168N、BS168X、BS168O、BS168p、BS168G的维生素B2产量分别提高了10.7%、10.1%、12.1%、15.8%、8.4%。与工程菌株BS168D3相比,双敲除pbuG、nupG和nupN、pbuX的工程菌株BS168pG和BS168NX的维生素B2产量分别提高了22.5%和16.4%。与工程菌株BS168D3相比,组合敲除nupN、pbuX、pbuG、nupG的工程菌株BS168pGNX的维生素B2产量提高了26.8%。与工程菌株BS168D3相比,组合敲除nupN、pbuX、pbuO、pbuG、nupG的工程菌株BS168pGNXO的维生素B2产量提高了35.2%。(参见下表3和图1)。
实验结果表明,本发明中将核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶编码基因rpe变为突变基因rpem以及敲除该基因的遗传操作能提高菌株生产维生素B2的能力,并且突变该基因对菌株生长造成的影响很小。单独和组合敲除嘌呤转运蛋白基因nupN、pbuX、pbuO、pbuG、nupG也可以提高菌株生产维生素B2的能力。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株、其构建及应用
<160> 66
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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cgtgagtggt ggtctttctt gtg 23
<210> 27
<211> 23
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<213> 人工序列()
<400> 27
gatcacttca aagctaaagc aca 23
<210> 28
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
gtttgttgaa ctaatgggtg ctttagttga agagatcgtg acaccgccgg caaccagggt 60
tagatgacgt aacaaacggg tatgttcctt ggtcgatatc g 101
<210> 29
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列()
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ccgatcgtga caccgccggc aaccagggtt agatgacgta acttattcat tcagttttcg 60
tgcg 64
<210> 30
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列()
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<210> 31
<211> 25
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<210> 32
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<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
ctcagcggtt cagccttct 19
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<212> DNA
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ggagcggttt ctttgttgac gccgccgtct acttcaatta acagatcttt tttccttttt 60
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<211> 81
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ggagcggttt ctttgttgat tagttgaaga cgccgccgtc tacttcaatt aacagatctt 60
tattcattca gttttcgtgc g 81
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<213> 人工序列()
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tgaactaatg ggtgctttag ttgaagatta tcattatgct aatacctcgg ctttc 55
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<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 39
gcttatttac ttcctctgat ttcagaaatt gttatcatta tgctaatacc tcggctttct 60
gtctttaatc tttattcatt cagttttcgt gcg 93
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caatttctga aatcagagga ag 22
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aaatgccgac tccgtcttga tcaagcccct acgtcagtaa ccatcgccac actgaatttg 60
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<213> 人工序列()
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ggcttgatca agacggagtc g 21
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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aatatttaag acgactgcag taaagctgca atcagaggaa cgacaatggc gccggcatac 60
atggcaagat tattcattca gttttcgtgc g 91
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<213> 人工序列()
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gcagctttac tgcagtcgtc tta 23
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atcgatcact ttttttccgc ctg 23
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<212> DNA
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tgaactaatg ggtgctttag ttgaagacca ttgtgaaaaa ggtcgtcagc 50
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gatgacgagc ggatgaatct ctctccattc cattgtgaaa aaggtcgtca gccctgctat 60
gatttcttgt tattcattca gttttcgtgc g 91
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aatggagaga gattcatccg ctc 23
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ttattcattc agttttcgtg cg 82
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<213> 人工序列()
<400> 66
ggtgtttgcc cagtggtgc 19
Claims (11)
1.高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株,其特征在于,枯草芽孢杆菌中阿拉伯糖操纵子阻遏蛋白基因araR被ParaR-neo反选盒替换,并在其基因组中引入rib操纵子非翻译区突变以解除下游产物对核黄素操纵子的转录调控、引入G596A突变的ribC和引入P242L突变的 purA,以使二者的表达量降低或表达的蛋白活性降低。
2.如权利要求1所述的高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株,其特征在于,rib操纵子非翻译区突变具体是rib操纵子的转录起始位点后第39位的G突变为A。
3.如权利要求1所述的高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株,其特征在于,进一步在所述菌株基因组中引入rpe表达量降低或表达的蛋白活性降低的突变或者敲除rpe。
4.如权利要求1所述的高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株,其特征在于,进一步在所述菌株基因组中引入rpe表达活性降低的突变是引入A504del突变的 rpe。
5.如权利要求3所述的高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株,其特征在于,进一步在所述菌株基因中敲除嘌呤转运蛋白基因nupN、pbuX、pbuO、pbuG和/或nupG,或降低嘌呤转运蛋白基因nupN、pbuX、pbuO、pbuG和/或nupG的表达或降低其表达蛋白的活性。
6.如权利要求3所述的高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株,其特征在于,进一步在所述菌株基因中敲除嘌呤转运蛋白基因pbuG和nupG,或降低嘌呤转运蛋白基因pbuG和nupG的表达或降低其表达蛋白的活性;敲除嘌呤转运蛋白基因nupN和pbuX,或降低嘌呤转运蛋白基因nupN和pbuX的表达或降低其表达蛋白的活性;敲除嘌呤转运蛋白基因pbuG、nupG、nupN和pbuX,或降低嘌呤转运蛋白基因nupN、pbuX、pbuG和nupG的表达或降低其表达蛋白的活性;或者敲除嘌呤转运蛋白基因nupN、pbuX、pbuO、pbuG和nupG,或降低嘌呤转运蛋白基因nupN、pbuX、pbuO、pbuG和nupG的表达或降低其表达蛋白的活性。
7.如权利要求1至5任一项所述的高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株,其特征在于,原始出发菌株是Bacillus subtilis 168。
8.如权利要求1至7任一项所述的高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株,其特征在于,涉及引入的外源基因是采取无痕引入方式。
9.如权利要求1至8任一项所述的高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株的制备方法,其特征在于通过遗传操作方法来实现。
10.如权利要求1至8任一项所述的高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株在生产维生素B2中的应用。
11.如权利要求10所述的应用,其特征在于,通过发酵培养所述高产维生素B2枯草芽孢杆菌工程菌株,从培养液中提取产维生素B2。
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