CN112538453A - 一种产核黄素的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵领域，公开了一种产核黄素的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。本发明所述的枯草芽孢杆菌其为枯草芽孢杆菌菌株中purR、ribC或pyrE中至少一个基因位点发生突变。purR、ribC或pyrE至少一个基因位点突变获得的枯草芽孢杆菌菌株在本发明公开的发酵条件下积累核黄素显著增加。本发明所述的枯草芽孢杆菌为核黄素高产菌株，生产的核黄素显著增加，为核黄素的工业化生产奠定基础。

Description

一种产核黄素的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种产核黄素的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。
目前生产上应用的产核黄素菌种有酵母、芽孢杆菌、棒杆菌和大肠杆菌等，多为野生菌种或诱变菌种，发酵性能较差。传统生产菌种主要是由多轮物理化学诱变及结构类似物筛选获得。但由于随机诱变引入的突变点具有不确定性，使得这些菌株往往具有比较复杂的遗传背景。对于相关突变点作用的解析会耗费大量的时间和精力，也使得后续的代谢工程改造面临较大的挑战。同时，诱变获得的菌种普遍存在难转化或改造效率低等缺点。
本发明将诱变菌株进行测序，结合理性分析，将获得的有益突变点挖掘出来，水平移植到背景清晰的枯草芽孢杆菌168菌株上，同时辅以其他理性代谢工程改造，获得高产核黄素的菌种。
背景技术
核黄素(Riboflavin)，又称维生素B2，分子式为C17H20O6N4，分子量：376.36，其化学结构式如图1所示。核黄素是人体必需的13种维生素之一，是B族维生素的成员之一，微溶于水，可溶于氯化钠溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液，微溶于乙醇、环己醇、乙酸乙酯、苄醇和酚，不溶于乙醚、氯仿、丙酮和苯。在中性或酸性溶液中稳定，耐热、耐氧化，但在碱溶液中不稳定，加热可被破坏，光照及紫外照射引起不可逆的分解。278～282℃时分解，饱和水溶液的pH约为6.0，水溶液呈黄色并显绿色荧光。
核黄素是黄素酶类的辅酶组成部分，在生物体内主要以黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在，以辅酶或辅基的形式参与各种酶系统反应。作为黄素蛋白的辅酶参与呼吸电子传递链及氧化还原反应，在呼吸和生物氧化中起着重要作用，直接参与碳水化合物、蛋白质、脂肪的生物氧化作用，在生物体内具有多种生理功能，是生命活动不可缺少的维生素，是维持机体正常代谢和生理功能所必须的营养素。核黄素具有促进发育和细胞再生，促使皮肤、指甲、毛发的正常生长，帮助消除口腔内、唇、舌炎症，增进视力，减轻眼疲劳等功效。微生物可以自身合成核黄素，但人和动物必须从食物中获取。正常成年人血清核黄素的浓度为69～98μmol/L，人体每天需要0.3～1.8mg核黄素。核黄素成为一种重要的饲料添加剂、食品添加剂、药品和食品染料，市场每年需求约8000～10000吨。
目前核黄素的生产方法主要有2种：半微生物发酵合成法和微生物发酵法。半微生物发酵合成法是先通过微生物发酵生产D-核糖，再以D-核糖为原料，与3,4-二甲代苯胺反应形成核醇二甲代苯胺，转化成偶氮染料后与巴比妥酸反应生产核黄素。该方法的优点是产品纯度较高，达到96％，主要缺点是得率较低，约60％，且需要用到大量的有机溶剂，环境污染大。微生物发酵法仅需一步发酵，具有生产成本低，环境污染小，生产周期短，产品纯度高等优点。该方法是目前核黄素工业化生产的主要方法，生产的核黄素占到市场份额的90％以上。
核黄素生产菌种是微生物发酵法的核心。早期的核黄素生产菌种从丙酮丁酸梭菌，到阿舒氏假囊酵母、棉囊阿舒酵母、解朊假丝酵母等，存在发酵周期长、原料复杂、菌体粘度大、工艺复杂等问题。枯草芽孢杆菌和产氨棒状杆菌等核黄素工程菌相继构建成功，成为核黄素工业生产的主要菌种。尤其是枯草芽孢杆菌具有发酵周期短、单位高、原料易得、工艺简单、生产效率高等优势。且枯草芽孢杆菌作为重要的模式菌，其生理、生化及分子遗传学方面的研究都比较清楚，具有基因工程改造技术成熟的优势，未来仍有较大的提升空间。
近年来，虽然通过代谢工程改造获得了许多高产核黄素的枯草芽孢杆菌基因工程菌，但由于我们对微生物生理及复杂代谢网络调控机制了解的局限性，运用基因工程技术对菌株继续进行改造，很难再获得核黄素产量进一步大幅度提升的菌株；而传统的诱变育种，工作量大、缺乏高效、快速的筛选方法，使得枯草芽孢杆菌在提高核黄素生产能力上受到很大程度的限制。
发明内容
本发明提供了一种产核黄素的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。本发明所述枯草芽孢杆菌为基因工程重构菌，其携带多个有助于产核黄素的突变基因。本发明所述的产核黄素的枯草芽孢杆菌其获得过程为，首先将枯草芽孢杆菌168经多轮紫外诱变获得诱变菌，通过全基因组测序分析，该菌株有多个重要突变，推测与核黄素合成或分解相关。其中的3个突变基因为：突变的嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR，其148位丙氨酸突变为天冬氨酸；突变的双功能黄素激酶FAD合成酶RibC，其144位天冬氨酸突变为精氨酸；突变的乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE，其104位赖氨酸突变为谷氨酸。其次，将上述3个突变基因分别通过反向遗传学手段重新引入到野生出发菌株枯草168菌株中，并进行核黄素生产测试。结果表明，三个点突变对核黄素生产均有正向作用，并且具有叠加的效果。
第一方面，本发明提供了一种产核黄素的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌株中下述至少一个位点发生了点突变：1)purRA148D：嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR，其148位丙氨酸突变为天冬氨酸；2)ribCD144R：双功能黄素激酶FAD合成酶RibC，其144位天冬氨酸突变为精氨酸；3)pyrEK104E：乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE，其104位赖氨酸突变为谷氨酸。
在此基础上，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR的突变基因purRA148D，该突变基因如SEQ NO.2所示，其编码的蛋白如SEQ NO.8所示；本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌双功能黄素激酶FAD合成酶RibC的突变基因ribCD144R，该突变基因如SEQ NO.4所示，其编码的蛋白如SEQ NO.10所示；本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE的突变基因pyrEK104E，该突变基因如SEQ NO.6所示，其编码的蛋白如SEQ NO.12所示。
第二方面，本发明提供了一株产核黄素的工程菌，其特征在于，所述工程菌为枯草芽孢杆菌，该菌株已于2020年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.21202。该菌株具有核黄素生产能力，摇瓶水平核黄素产量可达1.65g/L。
第三方面，本发明提供了一种产核黄素工程菌的构建方法，其包括如下步骤：(1)在出发菌株的染色体上整合了purR、ribC或pyrE的基因，其中至少一个基因存在突变；(2)获得较出发菌株相比核黄素产量提高的菌株。
优选的，本发明提供了一种产核黄素工程菌的构建方法，其包括如下步骤：(1)在出发菌株的染色体上整合突变的嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR，其148位丙氨酸突变为天冬氨酸；以及突变的双功能黄素激酶FAD合成酶RibC，其144位天冬氨酸突变为精氨酸；以及突变的乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE，其104位赖氨酸突变为谷氨酸；(2)获得较出发菌株相比核黄素产量提高的菌株。
其中，所述步骤(1)中的出发菌株为枯草芽孢杆菌，优选为Bacillus subtilis168；所述步骤(1)中的质粒为芽孢杆菌常用表达质粒，优选为pKSV7或pKSU。
优选地，所述步骤(2)中核黄素产量提高的菌株为突变株CGMCC NO.21202。
第四方面，本发明提供了一种生产核黄素的方法，其包括如下步骤：(1)将甘油管保藏的权利要求1所述工程菌在LB平板进行无菌划线，36℃过夜培养；(2)挑一环培养物接种至30mL种子培养基中，110rpm，36℃培养7～8h；(3)按10％接种量转接至30ml发酵培养基中，摇床转速120rpm，36℃培养60h。
其中，种子培养基配方(g/L)为：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20分钟；发酵培养基配方(g/L)为：葡萄糖60，酵母粉3.5，磷酸二氢钾3，硫酸铵25，硫酸锰0.01，硫酸镁5，味精10，玉米浆干粉15，碳酸钙25，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。
第五方面，本发明提供了权利要求1所述的工程菌在生产核黄素中的应用。
第六方面，本发明提供了权利要求1所述的工程菌在饲料、医药、食品中的应用。
本发明不仅获得了可高产核黄素的诱变菌株，在此基础上，本发明还首次发现了三个与核黄素合成或分解相关基因的有益突变，上述有益突变由诱变获得，无文献报道，为独有突变，而且最重要且最具创新性的是，本发明通过反向代谢工程表明将上述突变整合入枯草芽孢杆菌，可使枯草芽孢杆菌获得产核黄素的能力，同时，这三个基因的突变均对枯草芽孢杆菌产核黄素有正效果，并且突变可组合使用，具有叠加效应。本发明将上述三个有益突变叠加到枯草芽孢杆菌168上获得了高产核黄素的菌种，该菌种目前保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21202。
附图说明
图1：核黄素的化学结构式。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。本发明所用到的原始菌株枯草芽孢杆菌168(B.subtilis 168)来源为BGSC(Bacillus Genetic Stock Center，http://www.bgsc.org/)。本发明所用到的核黄素标准品从Sigma公司购买，所用DNA聚合酶、DNA纯化试剂盒、限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从Thermo公司购买，所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买。
实施例中使用的引物信息见表1。
表1引物序列
Figure BDA0002837354070000041
Figure BDA0002837354070000051
实施例1.诱变筛选获得核黄素高产菌株
以枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)作为原始菌株，B.subtilis 168菌株先用紫外15W、30cm、20min进行常规诱变处理，再用亚硝基胍进行诱变，条件为0.4mg/mL、36℃、20min。然后，涂布在含有0.2g/L 8-氮鸟嘌呤的基本培养基上(g/L：葡萄糖20、硫酸铵2、硫酸镁0.4、氯化钙0.02、硫酸亚铁0.02、磷酸氢二钠1.5、硫酸锌0.01、硫酸锰0.01、磷酸二氢钾1.5、琼脂18，pH7.0～7.2)，36℃培养24h。之后，挑选长势最好的菌株进行下一轮诱变，并提高基本培养基中8-氮鸟嘌呤的浓度。经过多轮诱变筛选后，获得了B.subtilisMHZ-1908-1菌株，该菌能在含有1.0g/L的8-氮鸟嘌呤培养基上生长。B.subtilis MHZ-1908-1菌株摇瓶发酵60小时产核黄素水平为1.2g/L，对葡萄糖的得率为4.00％(g/g)。
将B.subtilis MHZ-1908-1进行全基因组测序分析，序列信息与其出发菌株枯草芽孢杆菌168进行比对，其突变率大于千分之零点二。通过比较基因组学分析，B.subtilisMHZ-1908-1在相关代谢路径上具有三个重要突变，推测可能与核黄素高产相关。具体突变信息为：突变的嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR，其148位丙氨酸突变为天冬氨酸；突变的双功能黄素激酶FAD合成酶RibC，其144位天冬氨酸突变为精氨酸；突变的乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE，其104位赖氨酸突变为谷氨酸。嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR与嘌呤合成相关，而三磷酸鸟嘌呤核苷是核黄素的重要前体。RibC是双功能酶，可催化核黄素合成黄素腺嘌呤单核苷酸(FMN)，并进一步合成黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，二者是核黄素的下游产物，也是重要的辅酶。乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE是嘧啶合成关键基因，与嘌呤合成是竞争关系。理性分析，该三个位点的突变可能是促进核黄素高产的主要因素。
实施例2：基因无痕编辑方法构建B.subtilis168,Δupp菌株
以枯草芽孢杆菌B.subtilis168为出发菌株，本发明所用基因无痕编辑方法是基于温敏质粒介导的两步整合，通过氯霉素正筛及5-氟尿嘧啶(5-FU)反筛(AppliedMicrobiology and Biotechnology,2014,98(21):8963-8973.Zhang W,Gao W,Feng J,etal)。该筛选方法需首选缺失目标菌株基因组上的upp基因，该基因编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶，当upp与5-FU同时存在时，对细胞具有致死作用。
具体构建过程如下：用引物upp-1f/1r、upp-2f/2r，以B.subtilis 168基因组为模板，使用pfu DNA聚合酶扩增分别得到888bp和938bp的上下游同源臂，用引物upp-1f/2r扩增得到上下游融合片段，将片段与pKSV7(工具载体)质粒经SalI/PstI双酶切、连接、转化等操作，得到质粒pKSV7-Δupp。通过Spizizen方法转化至B.subtilis 168中，用含2.5μg/mL氯霉素的LB平板在30℃下筛选，获得转化子。将获得的转化子接种到5ml LB液体培养基中，42℃、200rpm培养12h并传代一次，稀释涂布于含有5μg/mL的氯霉素LB平板，获得一次重组子。将一次重组子接种到5ml LB液体培养基中，42℃、200rpm培养12h并传代一次，稀释涂布于含有0.8μM 5-FU(5-氟尿嘧啶，upp作用底物)的LB平板进行筛选，获得二次重组子，即B.subtilis 168,Δupp菌株，该菌株命名为B.subtilis MHZ-1909-1。
实施例3：工程菌株B.subtilis 168,Δupp,purRA148D的构建
用引物purR-1f、purR-1r和purR-2f、purR-2r，以B.subtilis 168基因组为模板，使用pfu高保真DNA聚合酶扩增，分别得到purRA148D上、下游同源臂；用引物purR-1f、purR-2r融合扩增上、下游片段，得到purRA148D融合片段(含A148D突变，完整purR野生型及突变型核苷酸序列如SEQ ID No.1、2所示；具体编码的野生型及突变型蛋白序列如SEQ ID No.7、8所示。将融合片段与pKSU质粒(工具载体)分别进行SalI、PstI双酶切，然后进行连接，并转化至Trans1 T1大肠杆菌感受态细胞。最终，得到重组质粒pKSU-purRA148D。
后续转化及筛选方法同实施例2，最终得到在B.subtilis168,Δupp菌株中引入purR点突变的菌株B.subtilis 168,Δupp,purRA148D，该菌株命名为B.subtilis MHZ-1909-3。
实施例4：工程菌株B.subtilis 168,Δupp,ribCD144R的构建
用引物ribC-1f、ribC-1r和ribC-2f、ribC-2r，以B.subtilis 168基因组为模板，使用pfu高保真DNA聚合酶扩增，分别得到ribCD144R上、下游同源臂；用引物ribC-1f、ribC-2r融合扩增上、下游片段，得到ribCD144R融合片段(含D144R突变，完整ribC野生型及突变型核苷酸序列如SEQ ID No.3、4所示；具体编码的野生型及突变型蛋白序列如SEQ ID No.9、10所示。将融合片段与pKSU质粒(工具载体)分别进行SalI、PstI双酶切，然后进行连接，并转化至Trans1 T1大肠杆菌感受态细胞。最终，得到重组质粒pKSU-ribCD144R。
后续转化及筛选方法同实施例2，最终得到在B.subtilis168,Δupp菌株中引入ribC点突变的菌株B.subtilis 168,Δupp,ribCD144R，该菌株命名为B.subtilis MHZ-1909-4。
实施例5：工程菌株B.subtilis 168,Δupp,purRA148D,ribCD144R的构建
以携带purR点突变的B.subtilis MHZ-1910-3为出发菌株，叠加ribC突变改造。具体操作方法同前述实施例2-4，最终得到在B.subtilis168,Δupp菌株中引入purR、ribC双点突变的菌株B.subtilis 168,Δupp,purRA148D,ribCD144R，该菌株命名为B.subtilis MHZ-1909-5。
实施例6：工程菌株B.subtilis 168,Δupp,purRA148D,ribCD144R,pyrEK104E的构建
用引物pyrE-1f、pyrE-1r和pyrE-2f、pyrE-2r，以B.subtilis 168基因组为模板，使用pfu高保真DNA聚合酶扩增，分别得到pyrEK104E上、下游同源臂；用引物pyrE-1f、pyrE-2r融合扩增上、下游片段，得到pyrEK104E融合片段(含K104E突变，完整pyrE野生型及突变型核苷酸序列如SEQ ID No.5、6所示；具体编码的野生型及突变型蛋白序列如SEQ ID No.11、12所示。将融合片段与pKSU质粒(工具载体)分别进行SalI、PstI双酶切，然后进行连接，并转化至Trans1 T1大肠杆菌感受态细胞。最终，得到重组质粒pKSU-pyrEK104E。
后续转化及筛选方法同实施例2。以携带purR、ribC双点突变的B.subtilis MHZ-1909-5为出发菌株，叠加pyrE突变改造，最终得到在B.subtilis168,Δupp菌株中引入purR、ribC、pyrE三点突变叠加的菌株B.subtilis 168,Δupp,purRA148D,ribCD144R,pyrEK104E，该菌株命名为B.subtilis MHZ-1910-1。
实施例7：工程菌株核黄素生产性能测试
1.培养基：
(1)种子培养基配方(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。
(2)发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖50，酵母粉3.5，磷酸二氢钾3，硫酸铵25，硫酸锰0.01，硫酸镁5，味精10，玉米浆干粉15，碳酸钙25，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。
2.培养方法：
(1)将甘油管保藏的菌株LB平板进行无菌划线，36℃过夜培养；
(2)挑一环培养物接种至30mL种子培养基中，110rpm，36℃培养7～8h；
(3)按10％接种量转接至30ml发酵培养基中，摇床转速120rpm，36℃培养40h；
发酵测试结果见表2。从测试结果可以看出，出发菌株B.subtilis168本身不积累核黄素，诱变菌(编号MHZ-1908-1)具有较高核黄素积累量和产物得率。4种工程菌株均积累核黄素，说明三个基因的突变均有正效果，并且突变可组合使用，具有叠加的正效果。该结果与前期理性分析相符。
PurR为嘌呤操纵子转录调节因子，其148位发生氨基酸取代，其丙氨酸被天冬氨酸取代。该氨基酸替换可能导致该转录调节因子对嘌呤操纵子的作用减弱或消失，有利于强化嘌呤合成，进而利于其下游产物核黄素的积累。
RibC为双功能黄素激酶FAD合成酶，可催化核黄素转变为FMN及FAD。有文献报道失活ribC可利于核黄素的积累，但会导致缺失FMN和FAD，对细胞的氧化还原反应不利。点突变弱化可以平衡两种需求。本发明获得的突变经验证具有正的效果，且为独有突变。该突变与purR突变的组合改造具有叠加的效果，也说明该位点对于核黄素合成的必要性和重要性。
PyrE是芽孢杆菌嘧啶合成途径重要基因，编码乳清酸磷酸核糖基转移酶。该酶的第104位氨基酸赖氨酸被谷氨酸取代。从蛋白构象上解析，104位为其底物结合位点，该位点发生氨基酸取代，且由碱性氨基酸取代为酸性氨基酸，会造成底物结合效率降低，进而降低了酶促反应效率。而嘧啶合成途径通量的减少，节省了更多底物和能量，有利于促进嘌呤途径的产物得率。
综上所述，发明人通过传统诱变方式获得了一株核黄素高产菌，并鉴定得到三个基因的有益突变。将相关突变通过反向遗传学手段移植到模式菌株后，模式菌株也获得了产核黄素表型。并且，相关工程菌株的生长和耗糖能力有所改善，避免了诱变带来的生长差、底物利用差、遗传不稳定等缺陷。
表2核黄素发酵测试
Figure BDA0002837354070000081
Figure BDA0002837354070000091
本发明的菌株构建，其步骤的前后顺序不限定，本领域的技术人员按本发明公开的内容达到本发明的目的均属于本发明的保护范围。本发明中的菌株编号是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。上述方法构建的包含有枯草芽孢杆菌的嘌呤操纵子转录调节因子突变体PurRA148D、黄素激酶突变体RibCD144R、乳清酸磷酸核糖基转移酶突变体PyrEK104E的工程菌的用途，包括但不局限于核黄素生产。
本发明公开了一种核黄素高产菌株构建方法与应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，或进行适当改进。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
SEQUENCE LISTING
<110> 申请人
<120> 一种产核黄素的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
<130> 一种产核黄素的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 858
<212> DNA
<213> B. subtilis 168
<400> 1
atgaagtttc gtcgcagcgg cagattggtg gacttaacaa attatttgtt aacccatccg 60
cacgagttaa taccgctaac ctttttctct gagcggtatg aatctgcaaa atcatcgatc 120
agtgaagatt taacaattat taaacaaacc tttgaacagc aggggattgg tactttgctt 180
actgttcccg gagatgccgg aggcgttaaa tatattccga aaatgaagca ggctgaagct 240
gaagagtttg tgcagacact tggacagtcg ctggcaaatc ctgagcgtat ccttccgggc 300
ggttatgtat atttaacgga tatcttagga aagccatctg tactctccaa ggtagggaag 360
ctgtttgctt ccgtgtttgc agagcgcgaa attgatgttg tcatgaccgt tgccacgaaa 420
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gagtttaacg caaatgtggc gggaatcggc gtcttagttg aagccgaagg agtagatgaa 720
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<212> DNA
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gcgaagcaaa tagccgaaga aaaaggtctg acattagctg tgatgacctt tcatccccat 180
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Leu Thr His Pro His Glu Leu Ile Pro Leu Thr Phe Phe Ser Glu Arg
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Tyr Glu Ser Ala Lys Ser Ser Ile Ser Glu Asp Leu Thr Ile Ile Lys
35 40 45
Gln Thr Phe Glu Gln Gln Gly Ile Gly Thr Leu Leu Thr Val Pro Gly
50 55 60
Asp Ala Gly Gly Val Lys Tyr Ile Pro Lys Met Lys Gln Ala Glu Ala
65 70 75 80
Glu Glu Phe Val Gln Thr Leu Gly Gln Ser Leu Ala Asn Pro Glu Arg
85 90 95
Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Val Tyr Leu Thr Asp Ile Leu Gly Lys Pro
100 105 110
Ser Val Leu Ser Lys Val Gly Lys Leu Phe Ala Ser Val Phe Ala Glu
115 120 125
Arg Glu Ile Asp Val Val Met Thr Val Ala Thr Lys Gly Ile Pro Leu
130 135 140
Ala Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Asn Val Pro Val Val Ile Val Arg
145 150 155 160
Lys Asp Asn Lys Val Thr Glu Gly Ser Thr Val Ser Ile Asn Tyr Val
165 170 175
Ser Gly Ser Ser Asn Arg Ile Gln Thr Met Ser Leu Ala Lys Arg Ser
180 185 190
Met Lys Thr Gly Ser Asn Val Leu Ile Ile Asp Asp Phe Met Lys Ala
195 200 205
Gly Gly Thr Ile Asn Gly Met Ile Asn Leu Leu Asp Glu Phe Asn Ala
210 215 220
Asn Val Ala Gly Ile Gly Val Leu Val Glu Ala Glu Gly Val Asp Glu
225 230 235 240
Arg Leu Val Asp Glu Tyr Met Ser Leu Leu Thr Leu Ser Thr Ile Asn
245 250 255
Met Lys Glu Lys Ser Ile Glu Ile Gln Asn Gly Asn Phe Leu Arg Phe
260 265 270
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65 70 75 80
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165 170 175
Leu Thr Asp Tyr Asp Thr Leu Thr Glu Val Ala Leu Glu Asn Gly Asn
180 185 190
Ile His Ser Asp Asp Leu Lys Lys Leu Gln Thr Trp Lys Arg Asn Pro
195 200 205
Glu Ser Lys Asp Trp Phe Lys Lys
210 215

Claims (12)

1.一种产核黄素的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌菌株中存在下述至少一个位点发生了点突变：
1)purRA148D：嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR，其148位丙氨酸突变为天冬氨酸；
2)ribCD144R：双功能黄素激酶FAD合成酶RibC，其144位天冬氨酸突变为精氨酸；
3)pyrEK104E：乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE，其104位赖氨酸突变为谷氨酸。
2.如权利要求1所述的产核黄素的枯草芽孢杆菌，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNO.21202。
3.一种枯草芽孢杆菌嘌呤操纵子转录调节蛋白PurR的突变基因，其特征在于，该突变基因如SEQ NO.2所示；编码的蛋白如SEQ NO.8所示。
4.一种枯草芽孢杆菌双功能黄素激酶FAD合成酶RibC的突变基因，其特征在于，该突变基因如SEQ NO.4所示；编码的蛋白如SEQ NO.10所示。
5.一种枯草芽孢杆菌乳清酸磷酸核糖基转移酶PyrE的突变基因，其特征在于，该突变基因如SEQ NO.6所示；编码的蛋白如SEQ NO.12所示。
6.一种产核黄素工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)在出发菌株的染色体上整合了purR、ribC或pyrE的基因，其中至少一个基因存在突变；
(2)获得较出发菌株相比核黄素产量提高的菌株。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述基因突变优选为：1)PurR的148位丙氨酸突变为天冬氨酸；2)RibC的144位天冬氨酸突变为精氨酸；3)PyrE的104位赖氨酸突变为谷氨酸；所述步骤(1)中的出发菌株为枯草芽孢杆菌，优选为Bacillus subtilis 168；所述步骤(1)中的质粒为芽孢杆菌常用表达质粒，优选为pKSV7或pKSU。
8.一种制备核黄素的方法，包括如下步骤：
(1)将甘油管保藏的权利要求1所述工程菌在LB平板进行无菌划线，36℃过夜培养；
(2)挑一环培养物接种至30mL种子培养基中，110rpm，36℃培养7～8h；
(3)按10％接种量转接至30ml发酵培养基中，摇床转速120rpm，36℃培养40h。
9.如权利要求8所述方法，其特征在于，种子培养基配方(g/L)为：葡萄糖20，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.01，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20分钟；发酵培养基配方(g/L)为：葡萄糖50，酵母粉3.5，磷酸二氢钾3，硫酸铵25，硫酸锰0.01，硫酸镁5，味精10，玉米浆干粉15，碳酸钙25，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20分钟。
10.权利要求1-2所述的工程菌在生产核黄素中的应用。
11.权利要求1-2所述的工程菌在饲料、医药、食品中的应用。
12.权利要求3-5所述的突变基因或蛋白在生产核黄素中的应用。
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