CN111893146B

CN111893146B - 提高谷氨酸棒杆菌四氢嘧啶产量的培养基及发酵方法

Info

Publication number: CN111893146B
Application number: CN202010871916.XA
Authority: CN
Inventors: 董亮; 宁健飞; 蔡立明
Original assignee: Wuxi Jingyang Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuxi Jingyang Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-08-26
Filing date: 2020-08-26
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2040-08-26
Also published as: CN111893146A

Abstract

本发明公开了提高谷氨酸棒杆菌四氢嘧啶产量的培养基及发酵方法，属于生物工程领域。本发明提供了发酵培养基配方，发酵培养基富含谷氨酸棒杆菌CG‑ECT3生长所需的碳源、氮源、无机盐及复合微量元素，使菌种快速生长繁殖培养13小时，OD₆₀₀可达40以上，增加质粒拷贝数，缩短迟滞期和对数生长期时间。同时，本发明通过在发酵过程中控制发酵液残糖及前体物质—L‑天门冬氨酸补加，使重组谷氨酸棒杆菌CG‑ECT3的产酸能力得到提高，缩短发酵周期，发酵45h Ectoines产量可达48g/L以上。

Description

提高谷氨酸棒杆菌四氢嘧啶产量的培养基及发酵方法

技术领域

本发明涉及提高谷氨酸棒杆菌四氢嘧啶产量的培养基及发酵方法，属于生物工程领域。

背景技术

四氢嘧啶(Ectoines)是一种环状氨基酸衍生物，是一些微生物应答环境渗透压胁迫所合成的一种渗透压补偿溶质，不仅可为细胞生长提供能源物质，还能对逆境下的核酸、蛋白质及其细胞具有稳定性作用。在环境修复保护剂，酶、蛋白质和核酸等生物大分子的保护剂，细胞保护剂，化妆品添加剂及药物制剂等领域都具有广泛的应用价值和应用前景。

目前，Ectoines由微生物发酵主要有两种思路：

第一种，利用嗜盐微生物通过高盐诱导合成、低盐释放的“细胞挤奶法”来达到Ectoines的胞内积累和分泌。

第二种，利用代谢工程、基因工程技术构建重组菌株在低盐条件下控制发酵条件获得Ectoines。

第一种方法因其高盐浓度的培养基对设备要求高，工艺流程复杂，下游纯化难度大，生产成本昂贵等因素已有被第二种方法取代的趋势。CN110699310A公开了一株高产Ectoines的谷氨酸棒杆菌，避免了高盐培养基带来的一些弊端，同时规避了大肠杆菌带来的安全问题，为Ectoines的工业化生产提供重要实践意义。但是，一方面，由于该方案所用培养基涉及存在TSE风险的成份，例如：脑心浸出液，制约了其在化妆品及医药方面的应用；另一方面，谷氨酸棒杆菌作为一种成熟的氨基酸产品工业微生物生产菌株，其代谢过程中会产生缬氨酸、亮氨酸等氨基酸及中间代谢产物。因此，有必要通过安全廉价的培养基，开发一种发酵过程控制方法，减少杂酸、中间代谢产物产生来实现提高重组谷氨酸棒杆菌Ectoines产量的目标。

发明内容

[技术问题]

现有的用于培养谷氨酸棒杆菌工程菌生产四氢嘧啶的培养基存在TES风险，且谷氨酸棒杆菌发酵过程的中间代谢物、杂酸多，会影响谷氨酸棒杆菌Ectoines产量。

[技术方案]

本发明提供了用于谷氨酸棒杆菌发酵产四氢嘧啶的培养基：

一级种子培养基：以g/L计，蛋白胨4.0-5.0，酵母粉1.5-2.5，氯化钠5.0-6.0，磷酸氢二钠2.0-2.5，葡萄糖5.0-6.5，玉米浆0.1-0.2；用液氨调节pH 7.0±0.3。可选的，一级种子培养基：以g/L计，蛋白胨4.0，酵母粉2.0，氯化钠5.0，磷酸氢二钠2.5，葡萄糖5.0，玉米浆0.1。用液氨调节pH7.0±0.3。

二级种子培养基：以g/L计，葡萄糖15-20，(NH₄)₂SO₄ 8-10，KH₂PO₄ 0.8-1.0，K₂HPO₄0.8-1.0，MgSO₄ 0.25-0.5，生物素0.2×10^-3，玉米浆15-20或玉米粉6.5-7.5，KCl 1.9-2.3，复合微量元素0.5-1mL；用液氨调节pH7.0±0.3；复合微量元素的配方是：FeSO₄·7H₂O16.4g/L；MnSO₄·H₂O 100mg/L；CuSO₄ 200mg/L；ZnSO₄·7H₂O 1g/L。可选的，二级种子培养基(g/L):葡萄糖18，(NH₄)₂SO₄ 10，KH₂PO₄ 1.0，K₂HPO₄ 1.0，MgSO₄ 0.25，生物素0.2×10^-3，玉米浆/粉15/6.8，KCl 1.9，复合微量元素0.5mL；用液氨调节pH7.0±0.3；复合微量元素的配方是：FeSO₄·7H₂O 16.4g/L；MnSO₄·H₂O 100mg/L；CuSO₄ 200mg/L；ZnSO₄·7H₂O 1g/L。

发酵培养基：以g/L计，葡萄糖20-25，(NH₄)₂SO₄ 15-20，KH₂PO₄ 0.8-1.0，K₂HPO₄0.8-1.0，MgSO₄ 0.25-0.5，生物素0.2×10^-3，玉米浆12.5-15或玉米粉5.0-7.5，KCl 1.9-2.3，L-门冬氨酸2.5-3.5，复合微量元素1-2mL；用液氨调节pH 7.0±0.3。复合微量元素的配方是：FeSO₄·7H₂O 16.4g/L；MnSO₄·H₂O 100mg/L；CuSO₄ 200mg/L；ZnSO₄·7H₂O 1g/L)。用于补料的葡萄糖浓度：400-500g/L。一次性补料L-门冬氨酸1.5-2.5g/L。可选的，发酵培养基：(g/L):葡萄糖20，(NH₄)₂SO₄ 15，KH₂PO₄ 1.0，K₂HPO₄ 1.0，MgSO₄ 0.25，生物素0.2×10^-3，玉米浆/粉12.5/5.7，KCl 1.9，L-门冬氨酸3.0，复合微量元素1-2mL；用液氨调节pH7.0±0.3。复合微量元素的配方是：FeSO₄·7H₂O 16.4g/L；MnSO₄·H₂O 100mg/L；CuSO₄ 200mg/L；ZnSO₄·7H₂O 1g/L)。流加补料葡萄糖浓度：400-500g/L。可选的，每升发酵培养基还含有0.25L消泡剂，例如：泡敌。

本发明还提供了一种培养重组谷氨酸棒杆菌发酵生产四氢嘧啶的方法，以CN110699310A公开的重组谷氨酸棒杆菌CG-ECT3为生产菌株，在发酵过程中控制发酵液中的葡萄糖含量并补加前体物质—L-天门冬氨酸，来提高Ectoines产量。所述重组谷氨酸棒杆菌CG-ECT3是以谷氨酸棒杆菌为宿主表达了来自耐盐细菌的四氢嘧啶合成基因簇ectABC；并且，所述重组谷氨酸棒杆菌中lysC基因编码的天冬氨酸激酶的第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸，编码天冬氨酸激酶的基因lysC的启动子被替换为谷氨酸棒杆菌来源的强组成型启动子Pglya，磷酸戊糖途径基因簇的启动子被替换为谷氨酸棒杆菌来源的强组成型启动子Pglya。

所述培养重组谷氨酸棒杆菌发酵生产四氢嘧啶的方法，包括步骤：

(1)培养获得一级种；

(2)培养获得二级种；

(3)发酵产四氢嘧啶，在发酵过程中控制发酵液中的葡萄糖含量并补加前体物质—L-天门冬氨酸。

所述步骤(1)培养获得一级种，是将重组谷氨酸棒杆菌CG-ECT3菌种按0.5-0.6％的接种量接种于一级种子培养基中进行扩培，装液量：40-45％；温度：30.0±2℃；摇床频次：120-150rpm；培养时间：12-14h，获得一级种。

所述步骤(2)培养获得二级种，是将一级种按0.5-1％接种量接种于二级种子培养基中进行培养，装液量：40-45％；温度：30.0±2℃；摇床频次：120-150rpm；培养时间：12-14h，获得二级种。

所述步骤(3)发酵产四氢嘧啶，是将二级种按8-10％接种量接种于发酵培养基中进行培养，装液量：50-60％；控制温度：30.0±2℃；压力0.09±0.01MPa；用液氨维持pH7.0(在补加葡萄糖之后调节pH)；发酵时间45-60h；通风量40-60M³/h；整个发酵过程中通过调整转速使得溶氧水平保持在10％(将接种前的溶氧标定为100％)以上。

所述在发酵过程中控制发酵液中的葡萄糖含量，是当发酵液中残糖＜2g/L时，开始第一次补加葡萄糖，随着葡萄糖消耗，pH有反弹趋势时，进行第二次补加葡萄糖，每次补加糖控制残糖不超过5g/L，依照该原则，进行多次补加葡萄糖。当Ectoines的生产速率＜0.25g/L·h时，停止补加糖，继续培养至残糖小于2g/L，结束发酵。可选地，每4h测定一次发酵液中Ectoines的含量，当连续两次测得Ectoines增量小于1.0g/L时，停止补加糖。

所述补加前体物质—L-天门冬氨酸，是当发酵液中L-天门冬氨酸含量小于发酵培养基中L-天门冬氨酸起始浓度的50％时，一次性补料L-门冬氨酸至终浓度1.5-2.5g/L。可选地，一次性补加L-天门冬氨酸2g/L。

[有益效果]

本发明的发酵培养基富含谷氨酸棒杆菌CG-ECT3生长所需的碳源、氮源、无机盐及复合微量元素，使菌种快速生长繁殖13小时左右OD₆₀₀可达40以上，增加质粒拷贝数，缩短迟滞期和对数生长期时间。

本发明以重组谷氨酸棒杆菌CG-ECT3作为生产菌株，通过在发酵过程中控制发酵液残糖及前体物质—L-天门冬氨酸补加，使重组谷氨酸棒杆菌CG-ECT3的产酸能力得到提高，缩短发酵周期，发酵45h Ectoines产量可达48.5g/L以上，已满足工业化生产需要。

具体实施方式

涉及的培养基如下：

一级种子培养基：以g/L计，蛋白胨4.0，酵母粉2.0，氯化钠5.0，磷酸氢二钠2.5，葡萄糖5.0，玉米浆0.1。用液氨调节pH7.0±0.3。

二级种子培养基(g/L):葡萄糖18，(NH₄)₂SO₄ 10，KH₂PO₄ 1.0，K₂HPO₄ 1.0，MgSO₄0.25，生物素0.2×10^-3，玉米浆/粉15/6.8，KCl 1.9，复合微量元素0.5mL；用液氨调节pH7.0±0.3；复合微量元素的配方是：FeSO₄·7H₂O 16.4g/L；MnSO₄·H₂O 100mg/L；CuSO₄ 200mg/L；ZnSO₄·7H₂O 1g/L。

发酵培养基：(g/L):葡萄糖20，(NH₄)₂SO₄ 15，KH₂PO₄ 1.0，K₂HPO₄ 1.0，MgSO₄ 0.25，生物素0.2×10^-3，泡敌0.25L，玉米浆/粉12.5/5.7，KCl 1.9，L-门冬氨酸3.0，复合微量元素1-2mL；用液氨调节pH7.0±0.3。复合微量元素的配方是：FeSO₄·7H₂O 16.4g/L；MnSO₄·H₂O100mg/L；CuSO₄ 200mg/L；ZnSO₄·7H₂O 1g/L)。流加补料葡萄糖浓度：400-500g/L。一次性补料L-门冬氨酸至终浓度2g/L。

涉及的检测方法如下：

Ectoines的检测方法：

发酵液上清采用高效液相色谱法测定Ectoines含量。色谱柱：Agilent ZORBAXNH₂ column(4.6×250mm，5μm)；流动相：70％乙腈水溶液；流速：1ml/min；进样量：10μL；波长：210nm；柱温：30℃；运行时间：15分钟；采用外标法按峰面积定量。Sigma四氢甲基嘧啶羧酸标准品作为定性及定量标准。

L-天门冬氨酸含量检测：

发酵液上清采用薄层色谱法检测L-天门冬氨酸含量。展开剂为冰醋酸：水：正丁醇(1:1:3)、0.2％茚三酮的正丁醇-2mol/L醋酸溶液(95:5)混合溶液。待测样品：取发酵液上清1ml加浓氨溶液2ml溶解并做适当稀释。对照品：准确称取L-天冬氨酸标准品0.10g，加浓氨溶液(含NH₃ 28％，g/g)2ml溶解并稀释定容至10ml，量取1.0ml标准品溶液(10mg)﹢蒸馏水199ml→0.5％(50μg/ml)配制成对照溶液。

用微量进样器吸取上述待测溶液和对照溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，展开剂为冰醋酸：水：正丁醇(1:1:3)，显色剂为0.2％茚三酮的正丁醇-2mol/L醋酸溶液(95:5)混合溶液，在105℃加热约15分钟至斑点出现，立即检视。其颜色与对照溶液的主斑点比较。

涉及的菌株

下述实施例中采用的菌株是CN110699310A公开的CG-ECT3。CG-ECT3的构建方法如下：

(1)四氢嘧啶表达质粒的构建

根据施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri A1501)中的四氢嘧啶合成基因簇ectABC设计引物ect-PF和ect-PR，以施氏假单胞菌A1501基因组DNA为模板PCR扩增出5’端带有人工设计的RBS的ectABC基因(带有人工设计的RBS的ectABC基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，其中，1～26bp为人工设计的RBS)，获得约为2.3kb的基因片段并进行PCR产物纯化。

引物：

ect-PF：acagaattaattaagcttgtttaactttaagaaggagatataccatgcctaccctaaaaaggaattcaatcaac，SEQ ID NO.2，

ect-PR：agctcggtacccggggatcctcagacggtttcggcctccagagga，SEQ ID NO.3。

以谷氨酸棒杆菌商业化表达质粒pXMJ19(公司：Biovector Co.,LTD,北京；目录号：Biovector6476432)为模板，设计引物pXMJ19-PF1、pXMJ19-PR1扩增得到大小为6.4kb的pXMJ19片段并进行PCR产物纯化。

引物：pXMJ19-PF1：ggatccccgggtaccgagct，即SEQ ID NO.4；

pXMJ19-PR1：aagcttaattaattctgtttcctgtgtgaa，即SEQ ID NO.5。

用Gibson Assembly试剂盒(NEB公司)将带有人工设计的RBS的ectABC片段以及pXMJ19片段相连接，获得的质粒命名为pXMJ19-ectABC。

利用电穿孔仪(BIO-RAD)将重组质粒pXMJ19-ectABC通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)，在含有12.5mg/L氯霉素的BHI平板上筛选获得重组菌并命名为CG-ECT。

将谷氨酸棒杆菌野生菌株ATCC13032以及重组菌株CG-ECT分别在BHI平板上过夜培养。挑取单菌落接种到含有20ml种子培养基的100ml摇瓶中，30℃，200rpm培养12小时。以5％接种量将种子液接种到装有50ml发酵培养基的250ml摇瓶中，30℃，200rpm培养48小时。其中培养约4小时OD₆₀₀达到2时添加终浓度为0.5mM的IPTG。

摇瓶发酵结束后，利用HPLC测定发酵上清液中的四氢嘧啶的含量。结果表明，重组菌株CG-ECT菌可以利用CGXII培养基中的葡萄糖、尿素和硫酸铵为底物从头合成四氢嘧啶，摇瓶发酵培养24小时和48小时，发酵液上清中的四氢嘧啶的含量分别达到0.95g/L和1.21g/L。谷氨酸棒杆菌野生菌株ATCC13032的发酵液上清中未检测出四氢嘧啶。

(2)点突变解除天冬氨酸激酶LysC的反馈抑制

在四氢嘧啶的合成途径中，天冬氨酸激酶LysC催化天门冬氨酸到四氢嘧啶的第一步反应，该酶的催化活性直接影响四氢嘧啶的合成效率，而谷氨酸棒杆菌内源的天冬氨酸激酶与大肠杆菌一样都受到苏氨酸和赖氨酸的反馈抑制。因此本发明通过对谷氨酸棒杆菌lysC基因中引入点突变T311I以解除苏氨酸和赖氨酸对该酶的反馈抑制。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，用引物LysC-PF1和LysC-PR1进行PCR扩增，获得带有突变位点的大小为0.7Kb的上游同源臂片段LysC1。用引物LysC-PF2和LysC-PR2进行PCR扩增，获得带有突变位点的大小为0.7Kb的下游同源臂片段LysC2。将谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB(Gene,145(1994)69-73)用限制性内切酶BamHI线性化，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将片段LysC1和LysC2一步连接到pK18mobsacB上，获得同源重组打靶质粒pK18-LysC1。

引物：

LysC-PF1：aattcgagctcggtacccggtctaacgctctcgtcgccatggcta，即SEQ ID NO.6；

LysC-PR1：agggcaggtgaaaatgatgtcggtgg，即SEQ ID NO.7；

LysC-PF2：ccaccgacatcattttcacctgccct，即SEQ ID NO.8；

LysC-PR2：gcctgcaggtcgactctagacggaagggttcacctcagagacgat，即SEQ ID NO.9。

利用电穿孔仪(BIO-RAD)将重组质粒pK18-LysC1通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)，转化子在含25mg/L卡那霉素的BHI平板上进行第一次筛选获得单交换重组菌，在BHI液体培养基里过夜培养后稀释涂布于含有20％蔗糖的BHI平板上进行二次筛选获得同源重组双交换菌株。双交换重组菌用引物LysC-PF1和LysC-PR2进行PCR扩增，测序鉴定突变位点。测序正确的菌株命名为CG-LysC1，该菌基因组DNA上编码的天冬氨酸激酶第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸，该突变解除了苏氨酸和赖氨酸对LysC的反馈抑制。

将重组质粒pXMJ19-ectABC通过电转化转入突变菌株CG-LysC1中，获得重组菌并命名为CG-ECT1。利用CGXII培养基发酵培养24小时，发酵液上清中的四氢嘧啶的含量达到1.62g/L，比CG-ECT提高了75％。

(3)启动子置换增强天冬氨酸激酶LysC的表达

利用谷氨酸棒杆菌强组成型启动子Pglya替换LysC基因原始的启动子Plysc，以增强天冬氨酸激酶的表达，进一步促进四氢嘧啶的合成。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，用两组引物LysC-PF3、LysC-PR3和LysC-PF4、LysC-PR4分别扩增出同源重组上游和下游的同源臂，大小均约为500bp并进行PCR产物纯化。用引物GlyA-PF1和GlyA-PR1扩增出带有glyA基因启动子序列和人工设计RBS的片段，大小约为200bp并进行PCR产物纯化。利用Gibson Assembly试剂盒将上述PCR获得的三个片段连接到BamHI线性化处理的谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB上，获得同源重组打靶质粒pK18-LysC2。带有glyA基因启动子序列和人工设计的RBS的编码天冬氨酸激酶第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，其中，1～176bp是glyA基因启动子序列，177～208bp是人工设计的RBS。

引物：

LysC-PF3：aattcgagctcggtacccggggtagcccagaagatttcagttcgg，即SEQ IDNO.11；

LysC-PR3：gaggagtgttttctttctgcacagg，即SEQ ID NO.12；

LysC-PF4：gtcgagaaggaggtaaaataatggccctggtcgtacagaaatatg，即SEQ IDNO.13；

LysC-PR4：gcctgcaggtcgactctagagcgttcaaagcagctgccaa，即SEQ ID NO.14；

GlyA-PF1：gcagaaagaaaacactcctcagctactccactagtgtgatcgggg，即SEQ IDNO.15；

GlyA-PR1：tattttacctccttctcgacgtgtttaatgatgcgtaagacctcactcgcggga，即SEQID NO.16。

利用电穿孔仪将重组质粒pK18-LysC2电转化转入到谷氨酸棒杆菌lysC基因点突变菌株CG-LysC1中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)，转化子在含25mg/L卡那霉素的BHI平板上进行第一次筛选获得单交换重组菌，在BHI液体培养基里过夜培养后稀释涂布于含有20％蔗糖的BHI平板上进行二次筛选获得同源重组双交换菌株。用引物GlyA-PF1和LysC-PR4对双交换重组子PCR鉴定，并对扩增片段测序鉴定。将测序正确的菌株命名为CG-LysC2。

将重组质粒pXMJ19-ectABC电转化转入CG-LysC2中，获得重组菌并命名为CG-ECT2。重组菌CG-ECT2在CGXII培养基中发酵培养24小时，由于替换了LysC的启动子和RBS序列，四氢嘧啶的合成量达到1.85g/L，比CG-ECT1提高了14％。

(4)启动子置换增强磷酸戊糖途径增加还原力NADPH的供给

在四氢嘧啶的合成途径中L-天冬氨酸-β-半醛脱氢酶Asd催化天冬氨酸到四氢嘧啶的第二步反应，即将L-天冬氨酸磷酸盐转化为L-天冬氨酸-β-半醛，该步反应由NADPH提供还原力。所以通过将原始的启动子Ptkt置换为强启动子Pglya能够增强磷酸戊糖途径编码基因簇tkt-operon的表达促进NADPH的合成从而进一步提高重组菌四氢嘧啶的合成水平。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，用两组引物PPP-PF1、PPP-PR1和PPP-PF2、PPP-PR2分别扩增出同源重组上游和下游的同源臂，大小约为500bp并进行PCR产物纯化。用引物GlyA-PF2和GlyA-PR2扩增出带有glyA基因启动子序列和人工设计RBS的片段，大小约为200bp并进行PCR产物纯化。利用Gibson Assembly试剂盒将上述PCR获得的三个片段连接到BamHI线性化处理的谷氨酸棒杆菌自杀性质粒pK18mobsacB上，获得同源重组打靶质粒pK18-PPP。

引物：

PPP-PF1：aattcgagctcggtacccggggtggacgccaacctttaaaaagct，即SEQ ID NO.17；

PPP-PR1：aggtgatctaccccgaaagtagtct，即SEQ ID NO.18；

PPP-PF2：tcactaaggaggattttactatgaccaccttgacgctgtcacctg，即SEQ ID NO.19；

PPP-PR2：gcctgcaggtcgactctagaggtcgaatggggattcgccc，即SEQ ID NO.20；

GlyA-PF2：actttcggggtagatcacctagctactccactagtgtgatcgggg，即SEQ IDNO.21；

GlyA-PR2：agtaaaatcctccttagtgagtagatttaaagcgtaagacctcactcgcggga，即SEQID NO.22。

利用电穿孔仪将重组质pK18-PPP电转化转入到谷氨酸棒杆菌LysC突变菌株CG-LysC2中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)，转化子在含25mg/L卡那霉素的BHI平板上进行第一次筛选获得单交换重组菌，在BHI液体培养基里过夜培养后稀释涂布于含有20％蔗糖的BHI平板上进行二次筛选获得同源重组双交换菌株。用引物GlyA-PF2和PPP-PR2对双交换重组子PCR鉴定，并对扩增片段测序鉴定。将测序正确的菌株命名为CG-LysC3。

将重组质粒pXMJ19-ectABC电转化转入CG-LysC3中，获得重组菌并命名为CG-ECT3。重组菌在CGXII培养基中发酵培养24小时，四氢嘧啶的合成量达到2.46g/L，比CG-ECT2提高了33％。

通过一些列的改造最终获得的四氢嘧啶高产菌株CG-ECT3对比对照菌株CG-ECT的合成能力有大幅提高，发酵24小时四氢嘧啶产量提高了1.6倍，发酵48小时产量达到2.98g/L。

实施例1

将谷氨酸棒杆菌CG-ECT3按照CN110699310A公开的培养及发酵条件、接种量、补糖方式培养，种子培养基、发酵培养基采用本发明前述培养基。

培养基为：

种子培养基(g/L)：蛋白胨4.0；酵母粉2.0；氯化钠5.0；磷酸氢二钠2.5；葡萄糖5.0；玉米浆0.1。用液氨调节pH7.0±0.3。

发酵培养基：(g/L):葡萄糖20；(NH4)₂SO₄ 15；KH₂PO₄ 1；K₂HPO₄ 1；MgSO₄ 0.25；生物素0.2×10^-3；泡敌0.25L；玉米浆12.5；KCl 1.9；L-门冬氨酸3；复合微量元素1mL(复合微量元素：FeSO₄·7H₂O 16.4g；MnSO₄·H₂O 100mg；CuSO₄ 200mg；ZnSO₄·7H₂O 1g；单位：/L)。

种子培养：将谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌CG-ECT3在BHI平板上过夜培养。挑取单菌落接种到含有20ml种子培养基的100ml摇瓶中，30℃，200rpm培养12小时。

发酵培养：以10％(体积比)的接种量将种子液接种到装有1L发酵罐培养基的2.5L发酵罐中，控制温度为30℃，通气量为1vvm，通过流加3M磷酸和3M氨水维持pH值稳定在6.8-7.2。OD₆₀₀到10时，加入终浓度为0.5mM的IPTG；发酵16小时后开始流加补料培养基维持葡萄糖浓度在2-5g/L范围。整个发酵过程中调整转速使得溶氧水平保持在10％(将接种前的溶氧标定为100％)以上。补料培养基：每升含葡萄糖400g、(NH₄)₂SO₄ 50g。

结果发现，改变培养基后，发酵13小时OD₆₀₀可达45，发酵60小时Ectoines产量为43g/L，优于CN110699310A公开的产量(41.7g/L)，且发酵13小时即可达到OD₆₀₀＝45，有利于菌体快速生长繁殖。

实施例2：

一级种子培养基(g/L)：蛋白胨4.0，酵母粉2.0，氯化钠5.0，磷酸氢二钠2.5，葡萄糖5.0，玉米浆0.1。用液氨调节pH 7.0±0.3。

二级种子培养基(g/L):葡萄糖18；(NH₄)₂SO₄ 10；KH₂PO₄ 1；K₂HPO₄ 1；MgSO₄ 0.25；生物素0.2×10^-3；玉米浆15；KCl 1.9；复合微量元素0.5mL(FeSO₄·7H₂O 16.4g；MnSO₄·H₂O100mg；CuSO₄ 200mg；ZnSO₄·7H₂O 1g；单位：/L)；用液氨调节pH7.0±0.3。

发酵培养基：(g/L):葡萄糖20；(NH₄)₂SO₄ 18；KH₂PO₄ 1；K₂HPO₄ 1；MgSO₄ 0.25；生物素0.2×10^-3；泡敌0.25L；玉米浆12.5；KCl 1.9；L-门冬氨酸3；复合微量元素1mL(复合微量元素：FeSO₄·7H₂O 16.4g；MnSO₄·H₂O 100mg；CuSO₄ 200mg；ZnSO₄·7H₂O 1g；单位：/L)。流加补料葡萄糖浓度400g/L，用液氨调节pH7.0±0.3。

将甘油管中重组谷氨酸棒杆菌CG-ECT3菌种按0.5％的接种量接种于一级种子培养基中进行扩培，装液量：40％；温度：30.0℃；摇床频次：120rpm；培养时间：12h，获得一级种。

将一级种按1％接种量接种于二级种子培养基中进行培养，装液量：40％；温度：30.0℃；摇床频次：120rpm；培养时间：12h，获得二级种。

将二级种按10％接种量接种于发酵培养基中(10L发酵罐)进行培养，装液量：60％；控制温度：30.0℃；压力0.09MPa；用液氨维持pH7.0(在补加葡萄糖之后调节pH)；时间45h；通分量60M³/h；整个发酵过程中通过调整转速使得溶氧水平保持在10％(将接种前的溶氧标定为100％)以上。

在发酵过程中，当OD₆₀₀到10时，加入终浓度为0.5mM的IPTG；在发酵过程中控制发酵液中的葡萄糖含量，当发酵液中残糖＜2g/L时，开始第一次补加葡萄糖，随着葡萄糖消耗、产酸增多，pH有反弹趋势时，进行第二次补加葡萄糖，每次补加糖控制残糖不超过具体指定范围(如下表1所示)，依照该原则，进行多次补加葡萄糖。当发酵液中L-天门冬氨酸含量小于发酵培养基中L-天门冬氨酸起始浓度的50％时，开始一次性补料L-门冬氨酸至终浓度2g/L。当连续两个产酸周期，Ectoines产酸速率＜1.0g/L时，停止补加糖，继续培养至残糖小于2g/L，结束发酵。将发酵液进行Ectoines产量检测，Ectoines产量见下表1，补糖时控制残糖≤5g/L最佳，Ectoines产量可达48.8g/L。

表1每次补加糖时控制的残糖浓度对Ectoines产量的影响

实施例3：

培养基同上述实施例2。

在发酵过程中，当OD₆₀₀到10时，加入终浓度为0.5mM的IPTG；在发酵过程中控制发酵液中的葡萄糖含量，当发酵液中残糖＜2g/L时，开始第一次补加葡萄糖，随着葡萄糖消耗、产酸增多，pH有反弹趋势时，进行第二次补加葡萄糖，每次补加糖控制残糖≤5g/L，依照该原则，进行多次补加葡萄糖。当发酵液中L-天门冬氨酸含量小于发酵培养基中L-天门冬氨酸起始浓度的一定范围(如下表2所示)，开始一次性补料L-门冬氨酸至终浓度2g/L。当连续两个产酸周期，Ectoines产酸速率＜1.0g/L时，停止补加糖，继续培养至残糖小于2g/L，结束发酵。将发酵液进行Ectoines产量检测，Ectoines产量见下表2。当发酵液中L-天门冬氨酸含量小于发酵培养基中L-天门冬氨酸起始浓度的50％时，添加前体物质有利于提高Ectoines产量。

表2补前体的时机对Ectoines产量的影响

实施例4：

培养基同上述实施例2。

在发酵过程中，当OD₆₀₀到10时，加入终浓度为0.5mM的IPTG；在发酵过程中控制发酵液中的葡萄糖含量，当发酵液中残糖＜2g/L时，开始第一次补加葡萄糖，随着葡萄糖消耗、产酸增多，pH有反弹趋势时，进行第二次补加葡萄糖，每次补加糖控制残糖≤5g/L，依照该原则，进行多次补加葡萄糖。当发酵液中L-天门冬氨酸含量小于发酵培养基中L-天门冬氨酸起始浓度的50％，开始一次性补料L-门冬氨酸至如下表3所示终浓度。当连续两个产酸周期，Ectoines产酸速率＜1.0g/L时，停止补加糖，继续培养至残糖小于2g/L，结束发酵。将发酵液进行Ectoines产量检测，Ectoines产量见下表3，一次性补料L-门冬氨酸至终浓度2g/L最佳。

表3补加的前体的终浓度对Ectoines产量的影响

SEQUENCE LISTING

<110> 无锡晶扬生物科技有限公司

<120> 提高谷氨酸棒杆菌四氢嘧啶产量的培养基及发酵方法

<130> BAA200893A

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2294

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtttaacttt aagaaggaga tataccatgc ctaccctaaa aaggaattca atcaacaacc 60

ccaaaggcat tgttttgagt ttccccaccg taatgctccg tcgcccaacc gacggcgacg 120

gttacaacct tcatcagctg gtggcgcgct gccagcccct cgataccaat tcggtctact 180

gcaacctgct gcagtgttcc gatttcgctg acaccgccat cgccgcagag aacgcccaag 240

gcgagctggt cggtttcatc tcgggttacc gccccccttc gcggccggac acgctgttcg 300

tctggcaggt cgccgtcgac agttcgatgc gcggtcaggg gctggccctg cgcatgctgc 360

tggcactgac cgcccgggtc gctcgcgagt acggcgtgcg ttacatggaa accaccatct 420

cgccggacaa cggggcgtca caggcgctgt tcaagcgggc cttcgaccgc ctcgatgcca 480

actgcacgac gcgcacgctg tttgcccgcg acacgcattt cgccggtcag cacgaggacg 540

aggtgctcta ccgcgccggc ccgttcaccg tttcccatct agaagaagag ctcaaggagc 600

acgcatgaaa acttttgaac tgaatgaatc cagggttcgc agctactgcc gttccttccc 660

cgtggtcttc aagcaggccc agggcgccga actggtcact caggacggca agcgctacat 720

cgacttcctc gctggtgccg gcacgctcaa ctacgggcac aaccacccgg tgctcaagca 780

ggcgctgctc gagtacatcg agagcgacgg catcacccac ggcctggaca tgtacaccga 840

agccaaggag cgtttcctcg aaaccttcaa ccggctgatc ctcgagccgc gcggcatggg 900

cgactaccgc atgcagttca ccggcccgac cggcaccaac gcggtcgagg cggcgatgaa 960

gctggcgcgc aaggtcaccg ggcgcaacaa catcatcagt ttcaccaacg gcttccacgg 1020

ctgcagcatt ggcgcgctgg ccgccaccgg caaccagcat caccgcggcg gctccggcat 1080

cggcctcacc gatgtcagcc gcatgccgta cgccaactat ttcggcgaca agaccaacac 1140

catcggcatg atggacaagc tgctctccga cccgtccagc gggatcgaca agcccgccgc 1200

ggtgatcgtc gaggtggtcc agggcgaagg cggtctgaac acagcatcgg ccgagtggat 1260

gcgcaagctc gagaagctct gccgcaagca cgagatgctg ctgatcgtcg atgacatcca 1320

ggccggctgc ggccgcaccg ggactttctt cagcttcgaa gagatgggca tccagccgga 1380

tatcgtcacg ctgtccaagt cgctgtccgg ctacggcctg ccgttcgcca tggtgttgct 1440

gcgccaagag ctggaccagt ggaagcccgg cgaacacaac ggcaccttcc gcggcaacaa 1500

ccatgcattc gtcacggcgg ccgcggcggt cgagcacttc tggcagaacg acgcgttcgc 1560

caacagcgtg aaggccaagg gcaagcgcat cgccgacggc atgcagcgca tcatccgtcg 1620

ccacggcccg gattcgctgt tcctcaaggg ccgcgggatg atgatcggca tcagctgccc 1680

cgatggcgag attgccgccg cagtgtgccg ccacgccttc gaaaacggcc tggtgatcga 1740

gaccagcggc gcccacagcg aagtggtcaa gtgcctctgc ccgctgatca tcagcgatga 1800

gcagatcgac caggcacttt ccatcctcga caaggccttt gccgccgtga tgagcgagca 1860

gaccgagaac caagcttcct gaggtatccg caatgatcgt cagaaccctc gccgagtgcg 1920

aaaagaccga ccgcaaggtc cacagccaga ccggcacctg ggacagcacg cgcatgctgc 1980

tcaaggacga caaggtggga ttctccttcc acatcaccac catctacgcc ggcagcgaga 2040

cgcacatcca ctaccagaac cacttcgagt cggtgtactg catcagcggc aatggcgaga 2100

tcgaaaccat cgccgacggc aagatctaca agatcgagcc gggcacgctg tacgtgctgg 2160

agaagcatga cgagcacctg ctgcgcggtg gcagcgaaga catgaagctg gcctgcgtct 2220

tcaacccgcc gctcaacggg cgcgaagtgc atgacgaaag cggcgtctat cctctggagg 2280

ccgaaaccgt ctga 2294

<210> 2

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acagaattaa ttaagcttgt ttaactttaa gaaggagata taccatgcct accctaaaaa 60

ggaattcaat caac 74

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agctcggtac ccggggatcc tcagacggtt tcggcctcca gagga 45

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggatccccgg gtaccgagct 20

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aagcttaatt aattctgttt cctgtgtgaa 30

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aattcgagct cggtacccgg tctaacgctc tcgtcgccat ggcta 45

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agggcaggtg aaaatgatgt cggtgg 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccaccgacat cattttcacc tgccct 26

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcctgcaggt cgactctaga cggaagggtt cacctcagag acgat 45

<210> 10

<211> 1474

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agctactcca ctagtgtgat cggggttatt ttttcacttc aatgggtggc taaaagacgt 60

gggcacgtga gtaaactcat gcgcgcgaaa cgatgggagt gaacccatac ttttatatat 120

gggtatcggc ggtctatgct tgtgggcgta cctgtcccgc gagtgaggtc ttacgcatca 180

ttaaacacgt cgagaaggag gtaaaataat ggccctggtc gtacagaaat atggcggttc 240

ctcgcttgag agtgcggaac gcattagaaa cgtcgctgaa cggatcgttg ccaccaagaa 300

ggctggaaat gatgtcgtgg ttgtctgctc cgcaatggga gacaccacgg atgaacttct 360

agaacttgca gcggcagtga atcccgttcc gccagctcgt gaaatggata tgctcctgac 420

tgctggtgag cgtatttcta acgctctcgt cgccatggct attgagtccc ttggcgcaga 480

agcccaatct ttcacgggct ctcaggctgg tgtgctcacc accgagcgcc acggaaacgc 540

acgcattgtt gatgtcactc caggtcgtgt gcgtgaagca ctcgatgagg gcaagatctg 600

cattgttgct ggtttccagg gtgttaataa agaaacccgc gatgtcacca cgttgggtcg 660

tggtggttct gacaccactg cagttgcgtt ggcagctgct ttgaacgctg atgtgtgtga 720

gatttactcg gacgttgacg gtgtgtatac cgctgacccg cgcatcgttc ctaatgcaca 780

gaagctggaa aagctcagct tcgaagaaat gctggaactt gctgctgttg gctccaagat 840

tttggtgctg cgcagtgttg aatacgctcg tgcattcaat gtgccacttc gcgtacgctc 900

gtcttatagt aatgatcccg gcactttgat tgccggctct atggaggata ttcctgtgga 960

agaagcagtc cttaccggtg tcgcaaccga caagtccgaa gccaaagtaa ccgttctggg 1020

tatttccgat aagccaggcg aggctgcgaa ggttttccgt gcgttggctg atgcagaaat 1080

caacattgac atggttctgc agaacgtctc ttctgtagaa gacggcacca ccgacatcat 1140

tttcacctgc cctcgttccg acggccgccg cgcgatggag atcttgaaga agcttcaggt 1200

tcagggcaac tggaccaatg tgctttacga cgaccaggtc ggcaaagtct ccctcgtggg 1260

tgctggcatg aagtctcacc caggtgttac cgcagagttc atggaagctc tgcgcgatgt 1320

caacgtgaac atcgaattga tttccacctc tgagattcgt atttccgtgc tgatccgtga 1380

agatgatctg gatgctgctg cacgtgcatt gcatgagcag ttccagctgg gcggcgaaga 1440

cgaagccgtc gtttatgcag gcaccggacg ctaa 1474

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aattcgagct cggtacccgg ggtagcccag aagatttcag ttcgg 45

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gaggagtgtt ttctttctgc acagg 25

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtcgagaagg aggtaaaata atggccctgg tcgtacagaa atatg 45

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcctgcaggt cgactctaga gcgttcaaag cagctgccaa 40

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gcagaaagaa aacactcctc agctactcca ctagtgtgat cgggg 45

<210> 16

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tattttacct ccttctcgac gtgtttaatg atgcgtaaga cctcactcgc ggga 54

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aattcgagct cggtacccgg ggtggacgcc aacctttaaa aagct 45

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aggtgatcta ccccgaaagt agtct 25

<210> 19

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tcactaagga ggattttact atgaccacct tgacgctgtc acctg 45

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gcctgcaggt cgactctaga ggtcgaatgg ggattcgccc 40

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

actttcgggg tagatcacct agctactcca ctagtgtgat cgggg 45

<210> 22

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

agtaaaatcc tccttagtga gtagatttaa agcgtaagac ctcactcgcg gga 53

Claims

1.一种培养重组谷氨酸棒杆菌发酵生产四氢嘧啶的方法，所述重组谷氨酸棒杆菌是以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为宿主表达了来自耐盐细菌的四氢嘧啶合成基因簇ectABC，并且，所述重组谷氨酸棒杆菌中lysC基因编码的天冬氨酸激酶的第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸，编码天冬氨酸激酶的基因lysC的启动子被替换为谷氨酸棒杆菌来源的强组成型启动子Pglya，磷酸戊糖途径基因簇的启动子被替换为谷氨酸棒杆菌来源的强组成型启动子Pglya；所述四氢嘧啶合成基因簇ectABC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的27～2294bp所示，表达耐盐细菌的四氢嘧啶合成基因簇ectABC时，以质粒pXMJ19为表达质粒；编码第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸的天冬氨酸激酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10的209～1474bp所示；所述启动子Pglya的核苷酸序列如SEQ ID NO.10中的1～176bp所示；

其特征在于，

包括步骤：

(1)培养获得一级种；

将重组谷氨酸棒杆菌CG-ECT3菌种按0.5-0.6％的接种量接种于一级种子培养基中进行扩培，装液量：40-45％；温度：30.0±2℃；摇床频次：120-150rpm；培养时间：12-14h，获得一级种；一级种子培养基：以g/L计，蛋白胨4.0-5.0，酵母粉1.5-2.5，氯化钠5.0-6.0，磷酸氢二钠2.0-2.5，葡萄糖5.0-6.5，玉米浆0.1-0.2；用液氨调节pH 7.0±0.3

(2)培养获得二级种；

(3)发酵产四氢嘧啶，在发酵过程中控制发酵液中的葡萄糖含量并补加前体物质—L-天门冬氨酸；

在发酵过程，当发酵液中残糖＜2g/L时，开始第一次补加葡萄糖，随着葡萄糖消耗、pH有反弹趋势时，进行第二次补加葡萄糖，随着葡萄糖消耗、pH有反弹趋势时，进行第三次补加葡萄糖，每次补加糖控制残糖不超过5g/L，如此反复多次补加葡萄糖，当Ectoines的生产速率＜0.25g/L·h时，停止补加糖，继续培养至残糖小于2g/L，结束发酵；

发酵培养基以g/L计，含：葡萄糖20-25，(NH₄)₂SO₄ 15-20，KH₂PO₄ 0.8-1.0，K₂HPO₄0.8-1.0，MgSO₄ 0.25-0.5，生物素0.2×10^-3，玉米浆12.5-15或玉米粉5.0-7.5，KCl 1.9-2.3，L-门冬氨酸2.5-3.5，复合微量元素1-2mL；用液氨调节pH 7.0±0.3；所述复合微量元素的配方是：FeSO₄·7H₂O 16.4g/L；MnSO₄·H₂O 100mg/L；CuSO₄ 200mg/L；ZnSO₄·7H₂O 1g/L；

当发酵液中L-天门冬氨酸含量小于发酵培养基中L-天门冬氨酸起始浓度的50％时，一次性补加L-天门冬氨酸2g/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)培养获得二级种，是将一级种按0.5-1％接种量接种于二级种子培养基中进行培养，装液量：40-45％；温度：30.0±2℃；摇床频次：120-150rpm；培养时间：12-14h，获得二级种；

二级种子培养基：以g/L计，葡萄糖15-20，(NH₄)₂SO₄ 8-10，KH₂PO₄ 0.8-1.0，K₂HPO₄0.8-1.0，MgSO₄ 0.25-0.5，生物素0.2×10^-3，玉米浆15-20或玉米粉6.5-7.5，KCl 1.9-2.3，复合微量元素0.5-1mL；用液氨调节pH7.0±0.3；复合微量元素的配方是：FeSO₄·7H₂O 16.4g/L；MnSO₄·H₂O 100mg/L；CuSO₄ 200mg/L；ZnSO₄·7H₂O 1g/L。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)发酵产四氢嘧啶，是将二级种按8-10％接种量接种于发酵培养基中进行培养，装液量：50-60％；控制温度：30.0±2℃；压力0.09±0.01MPa；用液氨维持pH7.0；发酵时间45-60h；通风量40-60M³/h；整个发酵过程中通过调整转速使得溶氧水平保持在10％。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，补加葡萄糖时，采用400-500g/L的葡萄糖溶液。