CN118109425A - 一种sucC突变体及其在L-缬氨酸发酵生产中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，提供了一种sucC突变体及其在L‑缬氨酸发酵生产中的应用。本发明通过对sucC基因进行点突变，降低酶表达活性，平衡供细胞生长的TCA循环与产物积累之间的代谢流问题，进而提高缬氨酸产量。并进一步通过实验筛选，得到了能够显著提高缬氨酸产量的重组菌株。通过发酵结果可以看出，该方法能够明显提高缬氨酸的产量，由原先的1.3 g/L提高为1.61 g/L，产量提高了23.8%，为进一步产业化提供了有力的菌株支持。

Description

一种sucC突变体及其在L-缬氨酸发酵生产中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种sucC突变体及其在L-缬氨酸发酵生产中的应用。

背景技术

缬氨酸(valine)是一种支链氨基酸(branchedchain amino acids,BCAA)，分子式C₅H₁₁NO₂，为白色结晶或粉末，溶于水，密度1.316g/cm³。缬氨酸分子是手性分子，根据偏振光的旋转方向分为D型和L型，天然的缬氨酸都为L-缬氨酸。L-缬氨酸是人体必需氨基酸之一，自身不能合成，必须通过膳食来源获得补充，其具有多种生理功能，被广泛应用于食品、医药、化妆品以及饲料等领域。

微生物细胞可以直接合成L-缬氨酸，通过大量培养微生物，利用其代谢反应进行合成。目前世界上L-缬氨酸的工业化生产大都采用此方法，使用的生产菌株有大肠杆菌(Escherichia coli)，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutacium)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，北京棒杆菌(Corynebacteriumpekineise)等亚种，粘质赛氏杆菌(Serratiamarcescens)，芽孢杆菌(Bacillus)等。其中，大肠杆菌因其具有遗传背景清晰、生长快速、基因编辑技术成熟等优点，常被作为底盘细胞以生产多种不同的天然产物。

虽然微生物细胞可以直接合成L-缬氨酸，但胞内大量反馈抑制等调控网络极大地限制了野生菌的生产能力。要想获得高效生产L-缬氨酸的发酵菌株，必须有效解除微生物细胞内部的自我调节机制。近年来，随着合成生物学和代谢工程的迅速发展，通过遗传改造获得能够高效生产L-缬氨酸，且易于培养的重组工程菌株应运而生并取得了很好的效果。谢希贤等整合枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶的编码基因alsS，解除了L-缬氨酸对合成通路的反馈抑制，同时整合大肠杆菌ppGpp3’-焦磷酸水解酶的突变基因spoTM，增强了丙酮酸供应，提高出发菌株VHY03的摇瓶发酵生产L-缬氨酸水平(ZL2020009206)。

在大肠杆菌生产L-缬氨酸的代谢通路中，如图1，丙酮酸是缬氨酸的前体物质，同时又连接着细胞生长所必需的TCA循环，直接敲除该循环中关键酶会使得TCA循环阻断，导致细胞生长受到严重影响，进而缬氨酸产量发生降低，因此平衡菌体生长和产物积累成为代谢改造的关键。有研究表明，TCA循环的强弱与琥珀酰辅酶A合成酶(sucCD)的转录水平有直接关系，故合理调控sucCD蛋白催化能力对缬氨酸工程菌至关重要。

发明内容

本发明目的是提供一种在代谢工程改造过程中，平衡菌体生长所需的氨基酸合成和产物生成的一种通用方法。本发明通过对sucC基因进行点突变，降低酶表达活性，达到碳流代谢平衡，进而实现提高缬氨酸产量的目的。并通过实验筛选，得到了能够显著提高缬氨酸产量的重组菌株。

本发明提供一种sucC突变体，其是相应于sucC的野生型的氨基酸的下述至少一个位点存在突变：L17、S36、G53、A125、L223或F286。

所述突变是根据sucC野生型序列进行分子对接，模拟出不同突变位点的序列，突变型蛋白会降低一定酶催化能力，同时又保留部分蛋白活性，使得菌株在能够正常生长的同时提高L-缬氨酸的积累。

具体地，其是相应于sucC的野生型的氨基酸的下述至少一个位点存在突变：L17S、S36P、G53A、A125D、L223P、F286S。

本发明提供所述的sucC突变体的编码核酸。

本发明也提供含有所述编码核酸的重组表达载体。

本发明进一步提供含有所述重组表达载体的重组菌，优选地，其是大肠杆菌。

本发明还提供如上所述的sucC突变体的编码核酸、所述编码核酸、所述重组表达载体或所述的重组菌在制备L-缬氨酸中的应用。

本发明尤其提供一种提高L-缬氨酸产量的生产菌株，其通过如下方法得到：

S1:为实现基因组中单点突变，根据CRISPR-cas9原理，编辑成功后的基因组中不能存在PAM位点对应的原N20序列，需对初始菌(具体如大肠杆菌Sva1024和野生型大肠杆菌ATCC8739)分别构建一株通用型底盘菌。具体为对sucC基因进行20bp特定位点突变，获得第一改造菌株；

S2:将如权利要求3所述编码核酸分别对第一改造菌株中sucC基因进行相应的点突变和20bp特定位点回复突变，获得第二改造的L-缬氨酸生产菌株。

本发明进一步提供一种制备L-缬氨酸的方法，其包括所述的重组菌的发酵培养以获得L-缬氨酸的步骤，任选地，还包括分离所述L-缬氨酸的步骤。

在一个具体实施方式，通过发酵结果可以看出，本发明改造得到的菌株能够明显提高缬氨酸的产量，例如初始菌Sva1024由原先的1.3g/L提高为1.61g/L，产量提高了23.8％，野生型菌株E.coliATCC8739由原先的0提高为0.11g/L，L-缬氨酸有明显积累，为进一步产业化提供了有力的菌株支持。

附图说明：

图1为大肠杆菌合成L-缬氨酸代谢通路；

图2为琥珀酰辅酶A生成结果图；

图3为代谢改造Sva1024菌株发酵结果；

图4为代谢改造野生型ATCC8739菌株发酵结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。

LB培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为去离子水。固体培养基需要加终浓度20g/L琼脂。

种子培养基：葡萄糖20g/L，玉米浆干粉10g/L，KH2PO48.8 g/L、(NH4)2SO42.5 g/L、MgSO4·7H2O 2g/L。

发酵培养基：发酵培养基和种子培养基成分相同，区别仅在于葡萄糖浓度为50g/L。

本发明初始缬氨酸转氨酶来自实验室保藏菌株Sva1024。

本发明所用的菌株和质粒如表1所示。

表1为本发明所用的菌株和质粒

实施例中所有引用的如表2所示。

表2为本发明所用的引物

引物名称	序列(5’-3’)
		suc-F	caaatgggtcgcggatccgaattcgagctcatgaacttacatgaatatca
suc-R	gtggtggtgctcgagtgcggccgcaagcttttatttcagaacagttttca
		pET28a-xian-F	aagcttgcggccgcactc
pET28a-xian-R	gagctcgaattcggatccgc
		pET28a-seq-F	ggtgatgtcggcgatataggc
pET28a-seq-R	cggatatagttcctcctttcagca
		sucC-N20-F	taatactagtgcggcttcttctgcttcgcggttttagagctagaaatagc
sucC-N20-R	gctctaaaaccgcgaagcagaagaagccgcactagtattatacctaggac
		sucC-F1	ccgagtcggtgctttttttgaattctctagaatgcacgctatcaaagatcgt
sucC-R1	ccggcaccgatttttgaagctgcctcctcggcctctcgcggagtagtacaggcataaccc
		sucC-F2	ggttatgcctgtactactccgcgagaggccgaggaggcagcttcaaaaatcggtgccggtcc
sucC-R2	agggtaatagatctaagcttctgcaggtcgacagtggcagcaacggcttca
		suc-seq-F1500	gagaggccgaggaggca
suc-seq-R	cgatacccactttacccggt
		S-N20-F	taatactagtgctgcctcctcggcctctcggttttagagctagaaatagc
S-N20-R	gctctaaaaccgagaggccgaggaggcagcactagtattatacctaggac
		S-seq-F1500	cgaagcagaagaagccgc

实施例1、检测sucCD不同突变体酶学参数

(1)以sucC野生型序列(野生型sucC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，NCBI基因编号：NZ_CP043852.1:364930-366096)为对象，采用分子对接方法，模拟出6种不同突变位点的序列，分别是：sucCDL17S、sucCDS36P、sucCDG53A、sucCDA125、sucCDL223P、sucCDF286S。这些突变型蛋白会降低一定酶催化能力，同时又能保留部分蛋白活性，将模拟出的基因序列送至通用生物进行基因合成，并构建到质粒pET28a，分别得到质粒pET28a-sucCD1、pET28a-sucCD2、pET28a-sucCD3、pET28a-sucCD4、pET28a-sucCD5及pET28a-sucCD6，其中各个质粒序号对应上述的sucCD突变位点。

(2)扩增sucCD片段

sucCD片段获得：以suc-F/suc-R为引物，以Sval024为模板，进行PCR扩增(2036bp为阳性)。PCR反应体系：KOD酶25μL，suc-F/suc-R各1μL，模板DNA 1μL，ddH2O22μL。PCR反应程序：95℃5min；98℃10s，58℃5s，68℃20s，35个循环；72℃10min。经电泳验证后，将阳性扩增子用DNA产物纯化试剂盒纯化，获得片段sucCD。

(3)pET28a质粒线性化

以pET28a-xian-F/pET28a-xian-R为引物，以pET28a质粒为模版，进行PCR扩增(5362bp为阳性)。PCR反应体系：KOD酶25μL，pET28a-xian-F/pET28a-xian-R各1μL，pET28a质粒1μL，ddH2O 22μL。PCR反应程序：95℃5min；98℃10s，58℃5s，68℃30s，35个循环；72℃10min。使用DpnⅠ酶消化原pET28a质粒模板，并使用DNA产物纯化试剂盒纯化PCR产物，获得线性化pET28a片段。

(4)目的基因克隆与鉴定

使用诺唯赞重组试剂盒对sucCD片段和线性化pET28a片段进行无缝连接，取10μL连接产物转化进DH5α感受态细胞中，涂布于卡那霉素平板中，37℃倒置培养过夜。以pET28a-seq-F/pET28a-seq-R为引物，单菌落为模版，进行菌落PCR扩增(2500bp为阳性)。PCR反应体系：验证酶2×Rapid Taq Master Mix 10μL，pET28a-seq-F/pET28a-seq-R各1μL，ddH2O 8μL。PCR反应程序：95℃5min；95℃15s，58℃15s，72℃45s，35个循环；72℃10min。经电泳验证后，得到重组质粒pET28a-sucCD。将上述重组质粒和基因合成质粒pET28a-sucCD1、pET28a-sucCD2、pET28a-sucCD3、pET28a-sucCD4、pET28a-sucCD5及pET28a-sucCD6分别转化至BL21表达菌株中，涂布于卡那霉素抗性的平板中，37℃倒置过夜培养，得到重组克隆。

(5)重组质粒表达

将(4)中得到的重组克隆接种于5mL含有卡那霉素的LB培养基中，37℃200rpm培养过夜。然后按1％接种量接种于100mL LB培养基中，添加终浓度50mg/L卡那抗生素，37℃培养至菌体OD600达到0.6-1.0，添加终浓度0.4mM IPTG，18℃诱导16-20h。

(6)重组蛋白纯化

将(5)中诱导后的菌液进行离心(离心温度：4℃，转速：10000rpm，时间5min)，收集菌体，然后将收集到的菌体沉淀以40:3比例重悬于Lysis Buffer中，并补加苯甲基磺酰氟溶液(PMSF)至终浓度1mM(添加100mM的PMSF异丙醇母液)。随后，使用超声破碎仪，冰上破碎细胞。将细胞破碎液4℃，10000rpm离心30min，得到破胞液上清及沉淀。

镍柱(Cytiva，5mL)装载于AKTA蛋白纯化仪上，使用Lysis Buffer，以2mL/min的流速平衡镍柱。镍柱平衡完毕后(10个柱体积左右)，使用AKTA系统，以1mL/min的流速使破胞液上清穿过镍柱，His-sucCD、His-sucCD1、His-sucCD2、His-sucCD3、His-sucCD4、His-sucCD5和His-sucCD6会被镍柱捕获。上清全部进入AKTA系统后，使用Washing Buffer，冲洗镍柱直至AKTA的紫外吸收记录数值大致稳定。随后，使用Elution Buffer，洗脱镍柱中的目标蛋白，得到7种纯化蛋白——His-sucCD、His-sucCD1、His-sucCD2、His-sucCD3、His-sucCD4、His-sucCD5和His-sucCD6。

表3蛋白纯化试剂所需配方

试剂名称	LysisBuffer	WashingBuffer	ElutionBuffer
				Tris-HCl	25mM	25mM	25mM
NaCl	500mM	500mM	150mM
				咪唑	10mM	25mM	300mM
pH	8.0	8.0	8.0

(7)SDS-PAGE验证

分别取离心后的上清、沉淀(10％Lysis Buffer重悬)和纯化后产物40μL，加5×蛋白电泳缓冲液10μL，混匀，沸水浴5min，取10μL样品进行12％SDS-PAGE，分别在41.4kDa和29.8kDa附近有蛋白条带。

(8)酶活检测

琥珀酰辅酶A的硫酯键在230nm处有吸收峰，根据这一原理对重组蛋白的活性进行测定。首先配制4种蛋白反应底物母液，10g/L琥珀酸、0.1g/L辅酶A、0.1g/LATP-tris(pH7.2)和10g/L氯化镁溶液。10mL反应液中包括5mg的重组蛋白、50μL琥珀酸钠、50μL辅酶A、50μLATP-tris(pH 7.2)、50μL的氯化镁，剩下使用Lysis Buffer补齐10mL。混匀后25℃反应，分别取2、5、10、15和30分钟反应液，置于紫外分光光度计进行检测，测定波长为230nm，以Lysis Buffer替代酶液作为空白对照，琥珀酰辅酶A随时间生成结果结果如图2所示。

从琥珀酰辅酶A生成情况来看，6种突变酶催化能力均有所降低，但不会完全抑制，与本发明所要求结果一致，酶活降低会促使更多碳流流向L-缬氨酸生成方向，保留部分催化能力以保证菌株的正常生长。

实施例2、重组菌株获得

(1)构建重组菌株SS0及AS0

为了后续在基因组中进行点突变，首先构建一株通用型底盘菌株SS0和AS0，即在底盘菌Sva1024基因组和ATCC 8739基因组中引入突变型N20-1,整合方式采用CRISPR-cas9基因编辑方式，具体操作方式如下：

第一步，构建pTarget-sucC-N20质粒

利用CHOPCHOP在线网站设计sucCN20，序列见序列2，以pTarget(Li Q,Sun B,ChenJ,Zhang Y,Jiang Y,Yang S.A modified pCas/pTargetF system for CRISPR-Cas9-assisted genome editing in Escherichia coli.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai).2021Apr 15；53(5):620-627.doi:10.1093/abbs/gmab036.PMID:33764372.)载体作为模板，以sucC-N20-F/sucC-N20-R为引物，进行PCR扩增。PCR反应条件如下：95℃3min；95℃15s，58℃15s，72℃1.5min，重复35个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物用DpnI于37℃处理1h后，转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h，随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒，获得pTarget-sucC-N20载体。

第二步，构建重叠片段UsucC-sucCN20-1-DsucC

以Sva1024基因组为模板，分别使用引物sucC-F1/引物sucC-R1和引物sucC-F2/引物sucC-R2，通过PCR扩增，PCR反应条件如下：95℃3min；95℃15s，58℃15s，72℃1min，重复35个循环；72℃继续延伸10min。将PCR产物进行胶回收，得到片段UsucC(555bp为阳性)和片段sucCN20-1-DsucC(1254bp为阳性)。

使用引物sucC-F1和引物sucC-R2对上述片段UsucC和sucCN20-1-DsucC进行融合PCR，PCR反应条件如下：95℃3min；95℃15s，58℃15s，72℃1.5min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。PCR产物进行胶回收，获得重叠片段UsucC-sucCN20-1-DsucC(1809bp为阳性)。

第三步，构建pTarget-sucC载体

将上述pTarget-sucC-N20载体和重叠片段UsucC-sucCN20-1-DsucC进行一步克隆，反应程序：37℃30min。将克隆产物转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒，获得pTarget-sucC载体。

第四步，获得重组菌株SS0和AS0

将上述pTarget-sucC载体电转化至含有pEccas载体(Li Q,Sun B,Chen J,ZhangY,Jiang Y,Yang S.A modified pCas/pTargetF system for CRISPR-Cas9-assistedgenome editing in Escherichia coli.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai).2021Apr15；53(5):620-627.doi:10.1093/abbs/gmab036.PMID:33764372.)的Sva1024和ATCC 8739菌株中，操作步骤如下：

电转：将转化有pEccas载体的Sva1024和ATCC 8739菌株在含有50mg/L的卡那霉素和10mM的L-阿拉伯糖的LB培养基中，在37℃下培养，直到OD600达到0.6，菌液经过离心得到菌体。菌体使用10％的甘油洗涤两次以便使用。电穿孔在2.5KV下进行。

质粒消除：将电转化后的菌液涂布至含有50mg/L卡那霉素和50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物suc-seq-F1500和引物suc-seq-R进行PCR扩增(1500bp为阳性)。将验证正确的菌株接种在含有50mg/L卡那霉素和10mM的鼠李糖的LB培养基中，37℃下培养过夜，去除pTarget-sucC载体。然后将去除pTarget-sucC载体的菌株接种在含有10g/L蔗糖的LB培养基中以去除pEccas载体，即可得到重组菌株SS0和AS0。

(2)构建重组菌株SS1、SS2、SS3、SS4、SS5、SS6、AS1、AS2、AS3、AS4、AS5、AS6

第一步，构建pTarget-S-N20-1载体

以pTarget载体作为模板，使用引物S-N20-F和引物S-N20-R，进行PCR扩增，将PCR产物用Dpn I于37℃处理1h后，转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒，获得pTarget-S-N20-1载体。

第二步，构建pTarget-S载体

分别以质粒pET28a-sucCD1、质粒pET28a-sucCD2、质粒pET28a-sucCD3、质粒pET28a-sucCD4、质粒pET28a-sucCD5、质粒pET28a-sucCD6为模板，使用引物sucC-F1和引物sucC-R2，通过PCR扩增，将产物进行胶回收，得到S1、S2、S3、S4、S5、S6片段(1809bp为阳性)。PCR反应条件如下：95℃3min；95℃15s，58℃15s，72℃2min，重复35个循环；72℃继续延伸10min。

分别将pTarget-S-N20-1载体和片段S1、S2、S3、S4、S5、S6进行一步克隆，反应程序：37℃30min。将克隆产物转化至E.coli DH5α受体菌中，涂布于含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。随机挑取单菌落转接至含终浓度50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养12h，收集菌体并提取质粒获得pTarget-S1、pTarget-S2、pTarget-S3、pTarget-S4、pTarget-S5、pTarget-S6载体。

第三步，获得重组菌株SS1、SS2、SS3、SS4、SS5、SS6、AS1、AS2、AS3、AS4、AS5、AS6

分别将pTarget-S1、pTarget-S2、pTarget-S3、pTarget-S4、pTarget-S5、pTarget-S6载体电转化至含有pEccas载体的SS0和AS0菌株中，电转化步骤同(1)中所述。

将电转化后的菌液涂布至含有50mg/L卡那霉素和50mg/L盐酸壮观霉素抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物S-seq-F1500和引物suc-seq-R进行PCR扩增(1500bp为阳性)，随后进行质粒消除，步骤同(1)中所述，即可得重组菌株SS1、SS2、SS3、SS4、SS5、SS6、AS1、AS2、AS3、AS4、AS5、AS6。

实施例3、12种突变菌株、原始菌Sva1024和野生型菌ATCC 8739发酵检测

对底盘菌Sva1024、野生型菌ATCC 8739及上述实施例2中构建的菌株(SS1、SS2、SS3、SS4、SS5、SS6、AS1、AS2、AS3、AS4、AS5、AS6)在发酵罐中进行发酵实验测试，以比较sucC基因不同突变位点之间对生产L-缬氨酸的能力影响。发酵实验按如下方案进行：

(1)种子培养：将LB平板上新鲜的克隆接种到含有4mL种子培养基的试管中，37℃，250rpm振荡培养过夜。然后，按照2％(V/V)的接种量将培养物转接到含有30mL种子培养基的250mL三角瓶中，在37℃，250rpm振荡培养12小时得到种子培养液用于发酵培养基接种。

(2)发酵培养：500mL厌氧罐中发酵培养基体积为250mL，将种子培养液按照终浓度OD550＝0.1的接种量接种于发酵培养基，37℃，150rpm，发酵4天，得到发酵液。中和剂为5M氨水，使发酵罐的pH控制在7.0，培养过程中不通任何气体。

从发酵罐中取1mL发酵液，12000rpm离心1min取上清，通过过滤膜(孔径0.22μm)后，使用HPLC分析发酵液中L-缬氨酸的含量，最终比较每种菌株获得L-缬氨酸的量，结果如图3所示。

使用安捷伦高效液相色谱仪检测：色谱柱为月旭Ultimate HILIC Amphion II，流动相：有机相纯乙腈；水相0.05M磷酸二氢钾pH 3.0(配制方法称取0.05M对应浓度质量的磷酸二氢钾溶解于超纯水，用磷酸调节pH至3.0，抽滤后，按照乙腈：0.05M磷酸二氢钾＝75:25的比例加入对应体积的乙腈，混匀后超声去除气泡)，设置参数为检测波长206nm，进样量10μL，流速1mL/min，检测时间20min。

从图3和图4中可以看出，6种不同位点的突变均会使L-缬氨酸产量上升，初始菌Sva1024发酵4天后，缬氨酸产量达到1.3g/L，点突变后产量提升最高为SS3菌株，达到1.61g/L，提高23.8％。对于野生菌基因改造有同样提升效果，L-缬氨酸积累从0提高到0.11g/L。发酵结果表明该方法对TCA循环存在竞争关系的代谢产物来说，有广泛的适用性和有效性，为后续相关代谢改造奠定了一定的基础。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种sucC突变体，其特征在于，其是相应于sucC的野生型的氨基酸的下述至少一个位点存在突变：L17、S36、G53、A125、L223或F286。

2.如权利要求1所述的sucC突变体，其特征在于，其是相应于sucC的野生型的氨基酸的下述至少一个位点存在突变：L17S、S36P、G53A、A125D、L223P、F286S。

3.如权利要求1或2所述的sucC突变体的编码核酸。

4.含有如权利要求3所述编码核酸的重组表达载体。

5.含有如权利要求4所述重组表达载体的重组菌，优选地，其是大肠杆菌。

6.如权利要求1或2所述的sucC突变体的编码核酸、如权利要求3所述编码核酸、如权利要求4所述重组表达载体或如权利要求5所述的重组菌在制备L-缬氨酸中的应用。

7.一种L-缬氨酸生产菌株，其特征在于，通过如下方法得到：

S1:对初始大肠杆菌分别构建一株通用型底盘菌，具体为对sucC基因进行20bp特定位点突变，获得第一改造菌株；

S2:将如权利要求3所述编码核酸分别对第一改造菌株中sucC基因进行相应的点突变和20bp特定位点回复突变，获得第二改造的L-缬氨酸生产菌株。

8.如权利要求7所述的L-缬氨酸生产菌株，其特征在于，所述初始大肠杆菌是野生大肠杆菌，或能够产L-缬氨酸的大肠杆菌，具体如大肠杆菌Sva1024和野生型大肠杆菌ATCC8739。

9.一种制备L-缬氨酸的方法，其特征在于，其包括如权利要求7所述的重组菌的发酵培养以获得L-缬氨酸的步骤，任选地，还包括分离所述L-缬氨酸的步骤。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养是厌氧发酵培养。