CN114350585B - 一种高产d-泛酸的基因工程菌、构建方法其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高产D‑泛酸的基因工程菌株及其构建方法，以及其在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。本发明通过(1)利用起始密码子TTG替换coaA基因原始起始密码子GTG的同时，敲除了coaX基因，弱化了D‑泛酸降解途径，减少了CoA的合成；(2)使用弱启动子P_resD表达ilvE的同时，运用Cre/loxP基因编辑技术敲除了原有ilvK基因，在减少竞争支路代谢流的基础上进一步弱化了支链氨基酸合成途径代谢流；(3)运用Cre/loxP基因编辑技术敲除了poxB和lctE，为D‑泛酸合成提供了充分的代谢流。最后通过异源表达来源于谷氨酸棒杆菌的panB及panC，强化了D‑泛酸合成途径中关键酶的表达，最终使得D‑泛酸产量相较于出发菌株从几乎检测不到提高到了67.4 g/L。

Description

一种高产D-泛酸的基因工程菌、构建方法其应用

技术领域

本发明涉及一种高产D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用。

背景技术

D-泛酸又可称之为维生素B5，是一种重要的水溶性维生素，在生物体内起着重要的生理作用，是辅酶A和酰基载体蛋白（ACP）的重要合成前体。D-泛酸及其衍生物在食品、医药、饲料、化妆品等领域有广泛的应用。在食品领域，D-泛酸可作为一种食品营养强化剂可用于多种食品添加以补充营养成分；在医药方面，D-泛酸作为人体必需的维生素普遍存在于生物体内，其衍生物D-泛酸钙的单方制剂可用于治疗D-泛酸缺乏症，与其他组分构成的复方制剂可用于治疗神经炎、神经衰弱、术后肠绞痛和呼吸道等疾病，同时也可用于多种保健食品等；在饲料方面，饲料中添加一定剂量的D-泛酸能满足猪、鸡和鱼类等生长发育、脂肪代谢的需求，避免出现生长迟缓、适应性及抗病性下降、生殖系统障碍、毛发脱落的现象；在化妆品方面，D-泛酸及其衍生物D-泛醇与皮肤、毛发的营养状态息息相关，可用于防治毛发干枯和损伤，提高毛发营养使其光线亮泽。并且有增加保湿和抗老化的作用，促进皮肤对营养成分的吸收，广泛应用与保湿霜、护发液和乳液等化妆品。

目前生产D-泛酸的方法主要有三种：化学合成法，酶催化法和发酵合成法。化学合成法，先通过化学法制备得到前体物β-丙氨酸和D,L-泛解酸内酯，再合成D-泛酸。其中的β-丙氨酸主要通过丙烯腈法、丙烯酸法和琥珀酸亚胺法合成得到，而D,L-泛解酸内酯主要通过异丁醛-甲醛法、异丁醛-醛乙酸法和异丁醛-三氯甲烷法制备得到，但是法学法高耗能、对设备损耗大，同时产生对人体和环境的有害物质。得到上述中间体后，其中β-丙氨酸用氢氧化钙处理形成β-丙氨酸钙，β-丙氨酸钙再跟D,L-泛解酸内酯在甲醇溶液和高温下发生酰化反应得到D，L-泛酸钙，在通过物理拆分得到高纯度的D-泛酸钙。另一种拆分方法是先对D,L-泛解酸内酯拆分，D,L-泛解酸内酯的拆分方法又包含化学拆分法和酶法拆分，其中化学拆分主要采用奎宁、麻黄素、L-亮氨酸、L-1-对硝基甲苯-2-氨基-1,3-丙二醇等拆分试剂对D,L-泛解酸内酯拆分。酶法拆分主要使用L-泛解酸内酯水解酶、D-泛解酸内酯水解酶、酮泛解酸还原酶和醇脱氢酶等对D,L-泛解酸内酯进行拆分。得到的D-泛解酸内酯后，在将其跟β-丙氨酸钙在甲醇溶液和高温条件下进行酰化反应得到D-泛酸钙。酶法合成D-泛酸，利用微生物来源的泛酸合成酶，以D-泛解酸和β-丙氨酸为底物完成D-泛酸的合成，但是其前体物D-泛解酸和β-丙氨酸仍需要化学合成得到。

随着对微生物代谢过程的不断了解和代谢工程技术的日益发展，使用葡萄糖作为廉价的原料来生产D-泛酸在内的高附加值产品具有广阔的应用前景。但是，由于野生型菌株的自身原因，细胞内合成D-泛酸的途径受限，所以发酵法生产D-泛酸最重要的是得到适当的D-泛酸高产菌株。在代谢改造过程中，由于不同的代谢途径之间存在非线性的关系，以及辅因子的与中心代谢途径的竞争和协作关系，需要从多个维度改造目的代谢途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产D-泛酸的基因工程菌株及其构建方法，以及其在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。

本发明采用的技术方案是：

高产D-泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：

（1）以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为底盘菌，将其基因组中的coaA基因原始起始密码子GTG替换为起始密码子TTG，得到工程菌Bacillus subtilis （coaA ^*），记为DPA1；

（2）将工程菌DPA1基因组中的coaX基因敲除，得到工程菌Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaX），记为DPA2；

（3）将工程菌DPA2基因组中的ilvE基因的原始启动子替换为弱启动子P_resD，构建菌株Bacillus subtilis （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*），记为DPA3；

（4）将工程菌DPA3基因组中的ilvK基因敲除，构建菌株Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvK） ，记为DPA4；

（5）将工程菌DPA4基因组中的poxB基因敲除，构建菌株Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxB） ，记为DPA5；

（6）将工程菌DPA5基因组中的lctE基因敲除，构建菌株Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctE） ，记为DPA6；

（7）将工程菌DPA6基因组中的panB基因的原始启动子替换为强启动子P_srfA，构建菌株Bacillus subtilis （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctEpanB ^*），记为DPA7；

（8）在工程菌DPA7基因组中过表达panB及panC基因，构建菌株Bacillus subtili（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctEpanB ^*-panBC），记为DPA8，即为所述的高产D-泛酸的基因工程菌。

在大肠杆菌中D-泛酸的合成是非线性的途径，包含了泛解酸的合成途径和β-丙氨酸的合成途径，分别合成泛解酸和β-丙氨酸，最后在泛酸合成酶的作用下合成D-泛酸。在泛解酸合成途径中，首先是葡萄糖的摄取，经过糖酵解途径得到丙酮酸，从而进入泛解酸的合成途径，首先丙酮酸在乙酰乳酸合成酶催化作用下合成乙酰乳酸，接着在酮泛解酸还原酶的催化作用下合成2,3-二羟基异戊酸，然后在二羟酸脱水酶催化作用下合成α-酮异戊酸，在3-甲基-2-氧桥丁酸羟甲基转移酶催化作用下合成酮泛解酸，最后在酮泛解酸还原酶的作用下合成泛解酸。而在β-丙氨酸合成途径中，首先是葡萄糖的摄取，进过糖酵解途径得到磷酸烯醇式丙酮酸，从而进入到β-丙氨酸的合成途径，磷酸烯醇式丙酮酸在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用下合成草酰乙酸，然后在天冬氨酸合成酶的作用下合成天冬氨酸，最后在天冬氨酸脱羧酶的催化下合成β-丙氨酸。同时泛解酸合成还与辅因子NADPH和ATP有关，同时还需要丝氨酸提高一碳单位供体。在本发明专利中主要改造泛解酸的合成途径，并在发酵液中外源添加β-丙氨酸，从而达到微生物代谢合成D-泛酸的目的。

本发明通过（1）利用起始密码子TTG替换原始coaA基因原始起始密码子GTG，弱化了D-泛酸降解途径，减少了CoA的合成，有利于D-泛酸的积累；（2）在上述构建菌株的基础上进一步弱化了D-泛酸的降解途径；（3）弱化异亮氨酸和缬氨酸等支链氨基酸合成途径，减少了竞争支路代谢流；（4）进一步弱化支链氨基酸合成途径代谢流；（5）敲除乙酸合成途径，为D-泛酸合成提供充分的代谢流；（6）敲除乳酸合成途径，为D-泛酸合成提供充分的代谢流；（7）强化D-泛酸合成途径关键基因表达，最终得到D-泛酸高产的枯草芽孢杆菌基因工程菌株。

本发明还涉及到构建所述基因工程菌的方法，所述方法包括：

（1）以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为底盘菌，应用Cre/loxP基因编辑方法，将其基因组中的coaA基因原始起始密码子GTG替换为起始密码子TTG，弱化D-泛酸的降解，得到工程菌Bacillus subtilis （coaA ^*），记为DPA1；

（2）应用Cre/loxP基因编辑方法，将工程菌DPA1基因组中的coaX基因敲除，进一步弱化D-泛酸的降解，得到工程菌Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaX），记为DPA2；

（3）应用Cre/loxP基因编辑方法，将工程菌DPA2基因组中的ilvE基因的原始启动子替换为弱启动子P_resD，弱化了支链氨基酸代谢流，构建菌株Bacillus subtilis （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*），记为DPA3；

（4）应用Cre/loxP基因编辑方法，将工程菌DPA3基因组中的ilvK基因敲除，进一步弱化了支链氨基酸代谢流，构建菌株Bacillus subtilis （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvK） ，记为DPA4；

（5）应用Cre/loxP基因编辑方法，将工程菌DPA4基因组中的poxB基因敲除，敲除乙酸的合成途径，增加了D-泛酸合成代谢流，构建菌株Bacillus subtilis （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxB） ，记为DPA5；

（6）应用Cre/loxP基因编辑方法，将工程菌DPA5基因组中的lctE基因敲除，敲除乳酸合成途径，增加了D-泛酸合成代谢流，构建菌株Bacillus subtilis （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctE） ，记为DPA6；

（7）应用Cre/loxP基因编辑方法，将工程菌DPA6基因组中的panB基因的原始启动子替换为强启动子P_srfA，构建菌株Bacillus subtilis （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctEpanB ^*），记为DPA7；

（8）将来源于谷氨酸棒杆菌的panB及panC基因构建到pMA5质粒上得到pMA5-panB- panC，在工程菌DPA7基因组中过表达panB及panC基因，构建菌株Bacillus subtili （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctEpanB ^*-panBC），记为DPA8，即为所述的高产D-泛酸的基因工程菌。

优选的 ，所述底盘菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 6633。

优选的，所述启动子P_resD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述启动子P_srfA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。

具体的，所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种于发酵培养基中，于25~32℃、180~300 rpm条件下进行发酵培养48~60h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到所述D-泛酸。

优选的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖 10~30 g/L、硫酸铵10~20 g/L、KH₂PO₄0.1~1.5 g/L、硫酸镁0.1~2.0 g/L、酵母粉1~5 g/L、β-丙氨酸1~5 g/L、碳酸钙10~20 g/L、0.5~2mL微量元素溶液，溶剂为水，pH自然；微量元素溶液组成为：10 g/L CaCl₂，10 g/LFeSO₄•7H₂O，1 g/L ZnSO₄•7H₂O， 0.2 g/L CuSO₄，0.02 g/L NiCl₂•7H₂O，溶剂为去离子水。

更为优选的，所示发酵培养基组成如下：葡萄糖 20 g/L、硫酸铵16 g/L、KH₂PO₄0.8 g/L、硫酸镁0.5 g/L、酵母粉3 g/L、β-丙氨酸 2.5 g/L、碳酸钙15 g/L、1 mL微量元素溶液，溶剂为水，pH自然。

通常，所述基因工程菌发酵前，先将平板上的新鲜单菌落接种到试管LB培养基中，在37 ℃、200 rpm震荡培养过夜，然后按1%接种量接种到100 mL的LB培养基中，37 ℃震荡培养过夜，作为发酵种子液。

本发明改造了枯草芽孢杆菌中的D-泛酸合成网络，通过Cre/loxP基因编辑系统利用起始密码子TTG替换原始coaA基因原始起始密码子GTG，弱化D-泛酸的降解，提高D-泛酸的积累；敲除coaX进一步弱化D-泛酸的降解；将ilvE基因的原始启动子替换成更弱的启动子P_resD，减弱了支链氨基酸代谢流；在此基础上进一步敲除ilvK，进一步减弱了支链氨基酸代谢流，为D-泛酸的合成提供充分的代谢流；敲除了乙酸和乳酸等有机酸的合成途径，减少了D-泛酸合成的代谢流的损失；加强D-泛酸合成途径关键基因表达，强化D-泛酸合成代谢流。

本发明的有益效果主要体现在：本发明利用起始密码子TTG替换原始coaA基因原始起始密码子GTG，弱化了泛酸激酶的表达，减少了D-泛酸的降解，提高D-泛酸的产量；敲除coaX基因，减少了D-泛酸的降解，提高D-泛酸的产量；利用P_resD弱起始密码子替换ilvE原始启动子，弱化支链氨基酸异亮氨酸和缬氨酸代谢流，提高D-泛酸代谢流流量；敲除ilvK基因，进一步弱化链氨基酸代谢流，提高D-泛酸代谢流流量；敲除乙酸和乳酸等有机酸的合成途径，为D-泛酸合成提供充分的碳流量；加强D-泛酸合成途径关键基因表达，强化D-泛酸合成代谢流，最终使得D-泛酸产量相较于出发菌株从几乎检测不到提高到了67.4 g/L。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌合成D-泛酸改造策略图；

图2为高产D-泛酸的基因工程枯草芽孢杆菌发酵结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明亲本菌株Bacillus subtilis ATCC 6633来自ATCC。

表1：基因编辑所涉及的基因及其相应途径

基因名称	基因ID	涉及途径
			coaA	938704	D-泛酸降解途径
coaX	936960	D-泛酸降解途径
			ilvE	938420	异亮氨酸和缬氨酸等支链氨基酸合成途径
ilvK	937372	异亮氨酸和缬氨酸等支链氨基酸合成途径
			poxB	938239	乙酸合成途径
lctE	938348	乳酸合成途径
			panB	939032	D-泛酸合成途径
panC	939032	D-泛酸合成途径

实施例1：D-泛酸含量的测定

检测方法如下：

流动相配置：乙腈：甲醇：水=949:50:1；

样品处理：将样品浓度稀释到0.1-1 g/L；

检测条件：流动相流速0.9 mL/min，C18柱（250*4.6 mm*5 μm，安捷伦），波长200nm，柱温30 ℃。

实施例2：构建产D-泛酸底盘菌株DPA1 （coaA ^*）

根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的泛酸激酶编码基因coaA的上游序列及下游coaA基因的起始密码子GTG替换为TGG序列，以及博来霉素抗性基因的序列lox71-zeo-lox66，构建序列如SEQ ID NO.3所示的敲除框。

将构建好的敲除框转化至枯草芽孢杆菌B. subtilis ATCC 6633中，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证。转入带环化重组酶Cre基因的pDG148质粒，将含有pDG148质粒的转化子接种于含0.2 mmol/L IPTG的液体LB中，培养24 h以表达环化重组酶促进lox71位点及lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因。之后，取1 μL培养液接种于2 mL新鲜的LB液体培养基中，在50 ℃、220 rpm 条件下振荡培养10 h后于无抗LB固体平板划线；用10 μL枪头将无抗LB固体平板上长出来的菌落分别点于博来霉素、卡那霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的才为敲除目的基因、消除pDG148质粒的工程B. subtilis菌株，得到无质粒的重组枯草芽孢杆菌DPA1 （coaA ^*）。

实施例3：构建产D-泛酸底盘菌株DPA2 （coaA ^*ΔcoaX）

根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的泛酸激酶编码基因coaX的上下游序列，以及博来霉素抗性基因的序列lox71-zeo-lox66，构建序列如SEQ IDNO.4所示的敲除框。

将构建好的敲除框转化至枯草芽孢杆菌DPA1（coaA ^*）中，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证。之后的博来霉素抗性基因回收具体步骤见实施例2，得到无质粒的重组枯草芽孢杆菌DPA2 （coaA ^*ΔcoaX）。

实施例4：构建产D-泛酸底盘菌株DPA3 （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*）

根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的异亮氨酸-缬氨酸氨基转移酶/芳香族氨基酸氨基转移酶编码基因ilvE启动子的上下游序列，以及博来霉素抗性基因的序列lox71-zeo-lox66，结合双组分反应调节蛋白编码基因resD序列前的启动子P_resD序列，构建序列如SEQ ID NO.5所示的启动子替换框。

将构建好的敲除框转化至枯草芽孢杆菌DPA2 （coaA ^*ΔcoaX）中，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证。之后的博来霉素抗性基因回收具体步骤见实施例2，得到无质粒的重组枯草芽孢杆菌DPA3 （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*）。

实施例5：构建产D-泛酸底盘菌株DPA4 （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvK）

根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的支链氨基酸氨基转移酶编码基因ilvK的上下游序列，以及博来霉素抗性基因的序列lox71-zeo-lox66，构建序列如SEQ ID NO.6所示的敲除框。

将构建好的敲除框转化至枯草芽孢杆菌DPA3 （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*）中，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证。之后的博来霉素抗性基因回收具体步骤见实施例2，得到无质粒的重组枯草芽孢杆菌DPA4 （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvK）。

实施例6：构建产D-泛酸底盘菌株DPA5 （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxB）

根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的丙酮酸氧化酶编码基因poxB的上下游序列，以及博来霉素抗性基因的序列lox71-zeo-lox66，构建序列如SEQ IDNO.7所示的敲除框。

将构建好的敲除框转化至枯草芽孢杆菌DPA4 （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvK）中，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证。之后的博来霉素抗性基因回收具体步骤见实施例2，得到无质粒的重组枯草芽孢杆菌DPA5 （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxB）。

实施例7：构建产D-泛酸底盘菌株DPA6 （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctE）

根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的L-乳酸脱氢酶编码基因lctE的上下游序列，以及博来霉素抗性基因的序列lox71-zeo-lox66，构建序列如SEQ IDNO.8所示的敲除框。

将构建好的敲除框转化至枯草芽孢杆菌DPA5 （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxB）中，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证。之后的博来霉素抗性基因回收具体步骤见实施例2，得到无质粒的重组枯草芽孢杆菌DPA6 （coaA ^*ΔcoaXilvE ^* ΔilvKΔpoxBΔlctE）。

实施例8：构建产D-泛酸底盘菌株DPA7 （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctEpanB ^*）

根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的酮泛解酸羟甲基转移酶编码基因panB启动子的上下游序列，以及博来霉素抗性基因的序列lox71-zeo-lox66，结合脂肽合成酶编码基因srfAA序列前的启动子P_srfA序列，构建序列如SEQ ID NO.9所示的启动子替换框。

将构建好的启动子替换框转化至枯草芽孢杆菌DPA6 （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctE）中，通过博来霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证。之后的博来霉素抗性基因回收具体步骤见实施例2。得到无质粒的重组枯草芽孢杆菌DPA7（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctEpanB ^*），并对其进行D-泛酸的摇瓶发酵验证。其发酵培养基配方如下：

LB液体培养基：10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。LB固体培养基为在LB培养基中加入20 g/L的琼脂粉。

MS发酵培养基：葡萄糖20 g/L，酵母提取物3 g/L，（NH₄）₂SO₄ 16 g/L、KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄ 0.5 g/L、CaCO₃ 15 g/L、2.5 g/L β-丙氨酸、1 ml/L微量元素溶液，利用去离子水溶解，无需调节pH值。微量元素溶液组成为：0.15 g/L Na₂MoO₄·2H₂O、2.5 g/L H₃BO₃、0.7g/L CoCl₂·6H₂O、0.25 g/L CuSO₄·5H2O、1.6 g/L MnCl₂·4H₂O、0.3 g/L ZnSO₄·7H₂O，溶剂为去离子水。

将重组枯草芽孢杆菌DPA7于LB固体培养基平板进行划线分离单菌落，37 ^oC培养8h。挑单菌落转接于50 mL三角烧瓶中，其中含LB液体培养基10 mL，37 ^oC培养8 h得到种子液。按照接种量1%接种于500 mL三角烧瓶中，其中含MS发酵培养基50 mL，37 ^oC发酵培养48h后离心取上清，检测D-泛酸产量为0.83 g/L。

实施例9：构建产D-泛酸底盘菌株DPA8 （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctE panB ^*-panBC）及发酵

根据NCBI上公布的谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的酮泛解酸羟甲基转移酶及泛酸合成酶编码的panB （基因: Cgl0114，其蛋白ID: BAB97507.1）及panC （基因: Cgl0113，其蛋白ID: BAB97506.1）基因对其进行PCR得到如SEQ ID NO.10所示的panBC表达框，通过一步克隆方法（诺维赞的ClonExpress II One Step CloningKit试剂盒）连接到pMA5质粒上的Hpa II启动子后面，构建得到pMA5-panBC质粒。

将构建好的启动子替换框转化至枯草芽孢杆菌DPA7 （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctEpanB ^*）中，通过卡那霉素抗性平板筛选、菌落PCR验证。得到含质粒的重组枯草芽孢杆菌DPA8（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctEpanB ^*-panBC），并对其进行D-泛酸的发酵验证。其发酵培养基配方如下：

LB液体培养基：10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。

MS发酵培养基：葡萄糖20 g/L，酵母提取物3 g/L，（NH₄）₂SO₄ 16 g/L、KH₂PO₄ 1 g/L、MgSO₄ 0.5 g/L、CaCO₃ 15 g/L、2.5 g/L β-丙氨酸、1 ml/L微量元素溶液，利用去离子水溶解，无需调节pH值。微量元素溶液组成为：0.15 g/L Na₂MoO₄·2H₂O、2.5 g/L H₃BO₃、0.7g/L CoCl₂·6H₂O、0.25 g/L CuSO₄·5H2O、1.6 g/L MnCl₂·4H₂O、0.3 g/L ZnSO₄·7H₂O，溶剂为去离子水。

5-L发酵罐培养基：葡萄糖20 g/L，酵母提取物3 g/L，（NH₄）₂SO₄ 16 g/L、KH₂PO₄ 1g/L、MgSO₄ 0.5 g/L、CaCO₃ 15 g/L、1 ml/L微量元素溶液，利用去离子水溶解，无需调节pH值；

补料培养基：葡萄糖500 g/L，酵母提取物3 g/L，（NH₄）₂SO₄ 16 g/L、KH₂PO₄ 14 g/L、MgSO₄ 8 g/L，β-丙氨酸 30 g/L，利用去离子水溶解。

将重组枯草芽孢杆菌DPA8于带卡那霉素抗性的LB固体培养基平板进行划线分离单菌落，37 ^oC培养8 h。挑单菌落转接于50 mL三角烧瓶中，其中含带卡那霉素抗性的LB液体培养基10 mL，37 ^oC培养8 h得到种子液。按照接种量1%接种于500 mL三角烧瓶中，其中含带卡那霉素抗性的MS发酵培养基50 mL，37 ^oC发酵培养48 h后离心取上清，检测D-泛酸产量为7.39 g/L。

进一步在5 L发酵罐中进行发酵：将单菌落接种于500 mL三角烧瓶中，其中含带卡那霉素抗性的LB液体培养基100 mL，37 ^oC培养8 h得到种子液。于5 L发酵罐中配制2 L发酵培养基，1000 mL补料培养基，用50% 的氨水调节pH为6.8，将上罐种子液按体积比15% 接种，进行溶氧联控补料发酵，将溶氧控制在20%左右，培养72 h。其发酵过程中的发酵曲线见图2，72 h后D-泛酸的产量为67.4 g/L。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种高产D-泛酸的基因工程菌、构建方法其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 82

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

gtcctttgaa agcgacacag ttctcaaact ttctcacgat ttgataaaat gaaagtaaca 60

gaaggaaagc agggggaaaa ca 82

<210> 2

<211> 575

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

agacgctctt cgcaagggtg tctttttttg cctttttttc ggtttttgcg cggtacacat 60

agtcatgtaa agattgtaaa ttgcattcag caataaaaaa agattgaacg cagcagtttg 120

gtttaaaaat ttttattttt ctgtaaataa tgtttagtgg aaatgattgc ggcatcccgc 180

aaaaaatatt gctgtaaata aactggaatc tttcggcatc ccgcatgaaa cttttcaccc 240

atttttcggt gataaaaaca tttttttcat ttaaactgaa cggtagaaag ataaaaaata 300

ttgaaaacaa tgaataaata gccaaaattg gtttcttatt agggtggggt cttgcggtct 360

ttatccgctt atgttaaacg ccgcaatgct gactgacggc agcctgcttt aatagcggcc 420

atctgttttt tgattggaag cactgctttt taagtgtagt actttgggct atttcggctg 480

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ggtttctttt ttgttcataa atcagacaaa acttttctct tgcaaaagtt tgtgaagtgt 960

tgcacaatat aaatgtgaaa tacttcacaa acaaaaagac atcaaagaga aacataccct 1020

ggaaggatga ttataccgtt cgtatagcat acattatacg aagttatctt gatatggctt 1080

tttatatgtg ttactctaca tacagaaagg aggaactaaa tatggccaag ttgaccagtg 1140

ccgttccggt gctcaccgcg cgcgacgtcg ccggagcggt cgagttctgg accgaccggc 1200

tcgggttctc ccgggacttc gtggaggacg acttcgccgg tgtggtccgg gacgacgtga 1260

ccctgttcat cagcgcggtc caggaccagg tggtgccgga caacaccctg gcctgggtgt 1320

gggtgcgcgg cctggacgag ctgtacgccg agtggtcgga ggtcgtgtcc acgaacttcc 1380

gggacgcctc cgggccggcc atgaccgaga tcggcgagca gccgtggggg cgggagttcg 1440

ccctgcgcga cccggccggc aactgcgtgc acttcgtggc cgaggagcag gactgaataa 1500

cttcgtatag catacattat acgaacggta ccgcaacttt agagtaaagg gctgattgtc 1560

aatgtgggag cagttgtatg atccgtttgg aaacgagtat gtgagcgcac ttgtggcgct 1620

cactccgatt ctcttttttc ttttggcttt aactgttttg aaaatgaaag gcattcttgc 1680

ggcatttctt accctagccg tcagtttctt cgtctccgtt tgggcatttc atatgccggt 1740

tgaaaaagcg atttcttctg ttttgttagg aatcgggagc gggctgtggc ccattggcta 1800

catcgtcctg atggcggtgt ggctgtataa aatcgccgtg aaaaccggga aatttaccat 1860

tattcggtcc agcattgccg gcatttcgcc tgaccaacga ttacagctat tattaattgg 1920

tttttgtttt aacgcgtttt tagaaggcgc ggccggtttt ggtgttccga ttgcgattag 1980

tgcggcgctg ctcgtcgaac ttggttttaa accgttaaaa gcggcggcgc tctgcttgat 2040

tgcaaacgct gcctccggag cctttggggc gattgggatt cctgtcatca caggggcgca 2100

gattggtgat ttgtctgctc ttgagctgtc tcggacatta atgtggacac tgccgatgat 2160

ctcattttta ataccattcc tgcttgtatt cttattagac cgaatgaaag gaatcaaaca 2220

gacatggccc gctcttctgg ttgtgagcgg tgggtataca gcggttcaga cactgacaat 2280

ggcggtgctc gggccggaat tagcaaacat tttggcggcc ttattcagca tgggcgggct 2340

tgccctcttc ctccgcaaat ggcagccgaa agagatttac cgcgaggaag gggccggcga 2400

tgctggtgag aaaaaggcat accgtgccgc tgacattgcg aaagcgtggt ctcctttcta 2460

cattttaact gcggcgatca ccatctggag ccttcctgcc ttcaaagcgc ttttccaaga 2520

aggcgggctg t 2531

<210> 9

<211> 3077

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

aaaatactca taataacggc gtcgttttct tgtcttgctt tgtctgctaa ggttaaatgc 60

ccctcatgca gaaaccccat cgtcggaaca aatccgattg acttgccctc tgaatggtat 120

tgttttatgg cttctttcag ctgtgaaata tcagtaatct gtctcatctt attttccccc 180

gtacaagccg tcaagcactg tctggttcat ttgaaaggaa tgcttttgtt cagggaaagc 240

acgatgtctt acatcctgaa catatccgct gattgctgtt tcgatggttt catcaatgcg 300

cgtatattgc tttacaaatt taggtgttct ctcaacaccg tggccgataa tatcatgata 360

aacgagaact tgtccgtccg ctttcacacc agccccgatt ccaatgaccg gtatgcttag 420

cgtctcggca attttggctg tgagttctgc cggcacacat tccagcacaa gcatcatagc 480

tcctgcttct tcgcatttta tactgtcttc tattaatttt ttggcgcttt gttcgtcttt 540

gccctgtact ttatagccgc ccagtacgcc gactgactgc ggtgtcaaac ctaagtgact 600

gactactgga atgcctccaa gcgtcaatgc gcgaatggat tcaaacacgc cttctccgcc 660

ctcaagcttc agtgcgtcag ctccgctttc ctgaacgata gccgctgcat ttttcagcgt 720

atcttcctta gacaggtgat aagacataaa cggcatatct gtcacaataa aggtattcgg 780

cgcacccctt ttaacggctt ttgtatgatg gatcatgtcc gcaactgtca caccgacagt 840

tgaatcaagg ccgaggacga ccattccaag tgaatcaccg actaaaatca tgtcaactcc 900

cgcttgttca gcaagtttag ctgccggata atcataagcg gtcagcatga caatcggttc 960

ttcagactcc ttcattttta gaaaatccag ttttgttttc attaccgttc gtatagcata 1020

cattatacga agttatcttg atatggcttt ttatatgtgt tactctacat acagaaagga 1080

ggaactaaat atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc 1140

cggagcggtc gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga 1200

cttcgccggt gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt 1260

ggtgccggac aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga 1320

gtggtcggag gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat 1380

cggcgagcag ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca 1440

cttcgtggcc gaggagcagg actgaataac ttcgtatagc atacattata cgaacggtat 1500

attgtcatac ctcccctaat ctttataagc agtgaacatg tgcaacgcat tttctctttc 1560

ttatccatat cagcttttaa ttcttatgaa ctaacagccg aaatagccca aagtactaca 1620

cttaaaaagc agtgcttcca atcaaaaaac agatggccgc tattaaagca ggctgccgtc 1680

agtcagcatt gcggcgttta acataagcgg ataaagaccg caagacccca ccctaataag 1740

aaaccaattt tggctattta ttcattgttt tcaatatttt ttatctttct accgttcagt 1800

ttaaatgaaa aaaatgtttt tatcaccgaa aaatgggtga aaagtttcat gcgggatgcc 1860

gaaagattcc agtttattta cagcaatatt ttttgcggga tgccgcaatc atttccacta 1920

aacattattt acagaaaaat aaaaattttt aaaccaaact gctgcgttca atcttttttt 1980

attgctgaat gcaatttaca atctttacat gactatgtgt accgcgcaaa aaccgaaaaa 2040

aaggcaaaaa aagacaccct tgcgaagagc gtctttagcc caattcgata tcggcagaat 2100

agattttttt aatgccttcg ttcgtttcta aaagcagaac gccttcatca tctataccta 2160

acgccttacc gtaaaaggtt ccgtttaacg ttctggctct catattagtg ccaataccga 2220

gcgcatagct ttcccataaa agcttaatcg gcgtaaatcc gtgcgtcata taatcccggt 2280

accgtttctc aaagcatagt aaaatatgct ggatgacgcc ggcccgatca attttttccc 2340

cagcagcttg gctgaggctt gtcgcgatgt ccttcaattc atctggaaaa tcattaggct 2400

gctggttaac gttaatgccg atcccaatga tcactgaacg tacgcggtct tcttcagcct 2460

gcatttccgt taggataccg actgtttttt ttccgttaat caaaatatca tttggccatt 2520

taatatccgt ttggatgcct gctgcctctt ctattccctg cacaacagct actgcagcaa 2580

gcagagtcag ctgcggtgtt ttttggagcg gaatgtcagg ccgcaaaatc aggctcatcc 2640

aaacaccgtt tccttcttga gaatgccata ccctagacat tcggcccctt ccggctgttt 2700

gtttgtcagc caccacaagg gtgccttccg gtgcgttatt attcgcgagc tcatgagccg 2760

ttttttgcgt gcttgaaaga acgtcatggt aaataagatg ctggcccatc acttccgttt 2820

ttaatccaaa acgaatttcg ctttcactga gttttccggg ttttttgatg agccgatatc 2880

cttttcttct aacggcttct acttcataac cctctttccg aagctcttca atatgcttcc 2940

acacagcagt tcttgaacag ccgagagcat cactgatttt ttggccggaa ataaattcat 3000

tgccggcctg agaaaataat tcaataaggt cttttcttaa tgttgaccgc atgtcttcag 3060

ccactcctct atgtgtt 3077

<210> 10

<211> 1655

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

atgcccatgt caggcattga tgcaaagaaa atccgcaccc gtcatttccg cgaagctaaa 60

gtaaacggcc agaaagtttc ggttctcacc agctatgatg cgctttcggc gcgcattttt 120

gatgaggctg gcgtcgatat gctccttgtt ggtgattccg ctgccaacgt tgtgctgggt 180

cgcgatacca ccttgtcgat caccttggat gagatgattg tgctggccaa ggcggtgacg 240

atcgctacga agcgtgcgct tgtggtggtt gatctgccgt ttggtaccta tgaggtgagc 300

ccaaatcagg cggtggagtc cgcgatccgg gtcatgcgtg aaacgggtgc ggctgcggtg 360

aagatcgagg gtggcgtgga gatcgcgcag acgattcgac gcattgttga tgctggaatt 420

ccggttgtcg gccacatcgg gtacaccccg cagtccgagc attccttggg cggccacgtg 480

gttcagggtc gtggcgcgag ttctggaaag ctcatcgccg atgcccgcgc gttggagcag 540

gcgggtgcgt ttgcggttgt gttggagatg gttccagcag aggcagcgcg cgaggttacc 600

gaggatcttt ccatcaccac tatcggaatc ggtgccggca atggcacaga tgggcaggtt 660

ttggtgtggc aggatgcctt cggcctcaac cgcggcaaga agccacgctt cgtccgcgag 720

tacgccacct tgggcgattc cttgcacgac gccgcgcagg cctacatcgc cgatatccac 780

gcgggtacct tcccaggcga agcggagtcc ttttaatgca ggtagcaacc acaaagcagg 840

cgcttatcga cgccctcctc caccacaaat ccgtcgggct cgtccccacc atgggtgcgc 900

tacacagcgg acacgcctcg ttggttaaag cagcacgcgc tgaaaacgac actgttgtag 960

ccagtatttt tgtcaatccc ctgcagtttg aagcactcgg tgattgcgat gattaccgca 1020

actatccccg ccaactcgac gccgatttag cactgcttga agaggcaggt gtggatattg 1080

tgttcgcacc cgatgtggag gaaatgtacc ccggtggctt gccactagtg tgggcgcgca 1140

ccggttccat cggaacaaaa ttggagggtg ccagcaggcc tggccatttc gatggtgtgg 1200

ctaccgtggt ggcgaagctg ttcaatttgg tgcgccctga tcgtgcatat tttggacaaa 1260

aagatgctca gcaggttgcg gtgattcggc gattggttgc cgatctagac attcccgtgg 1320

agattcgtcc cgttccgatt attcgtggcg ccgatggctt agccgaatcc agccgcaatc 1380

aacgtctttc tgcggatcag cgagcgcaag ctctggtgct gccgcaggtg ttgagtgggt 1440

tgcagcgtcg aaaagcagct ggtgaagcgc tagatatcca aggtgcgcgc gacaccttgg 1500

ccagcgccga cggcgtgcgc ttggatcacc tggaaattgt cgatccagcc accctcgaac 1560

cattagaaat cgacggcctg ctcacccaac cagcgttggt ggtcggcgcg attttcgtgg 1620

ggccggtgcg gttgatcgac aatatcgagc tctag 1655

Claims (7)

1.高产D-泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：

（1）以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为底盘菌，将其基因组中的coaA基因原始起始密码子GTG替换为起始密码子TTG，得到工程菌Bacillus subtilis（coaA ^*），记为DPA1；

（2）将工程菌DPA1基因组中的coaX基因敲除，得到工程菌Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaX），记为DPA2；

（3）将工程菌DPA2基因组中的ilvE基因的原始启动子替换为弱启动子P_resD，构建菌株Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*），记为DPA3；

（4）将工程菌DPA3基因组中的ilvK基因敲除，构建菌株Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvK），记为DPA4；

（5）将工程菌DPA4基因组中的poxB基因敲除，构建菌株Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxB），记为DPA5；

（6）将工程菌DPA5基因组中的lctE基因敲除，构建菌株Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctE），记为DPA6；

（7）将工程菌DPA6基因组中的panB基因的原始启动子替换为强启动子P_srfA，构建菌株Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctEpanB ^*），记为DPA7；

（8）在工程菌DPA7基因组中过表达来源于谷氨酸棒杆菌的panB及panC基因，构建菌株Bacillus subtili（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctEpanB ^*-panBC），记为DPA8，即为所述的高产D-泛酸的基因工程菌。

2.构建权利要求1所述基因工程菌的方法，所述方法包括：

（1）以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为底盘菌，应用Cre/loxP基因编辑方法，将其基因组中的coaA基因原始起始密码子GTG替换为起始密码子TTG，得到工程菌Bacillus subtilis （coaA ^*），记为DPA1；

（2）应用Cre/loxP基因编辑方法，将工程菌DPA1基因组中的coaX基因敲除，得到工程菌Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaX），记为DPA2；

（3）应用Cre/loxP基因编辑方法，将工程菌DPA2基因组中的ilvE基因的原始启动子替换为弱启动子P_resD，构建菌株Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*），记为DPA3；

（4）应用Cre/loxP基因编辑方法，将工程菌DPA3基因组中的ilvK基因敲除，构建菌株Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvK），记为DPA4；

（5）应用Cre/loxP基因编辑方法，将工程菌DPA4基因组中的poxB基因敲除，构建菌株Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxB），记为DPA5；

（6）应用Cre/loxP基因编辑方法，将工程菌DPA5基因组中的lctE基因敲除，构建菌株Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctE），记为DPA6；

（7）应用Cre/loxP基因编辑方法，将工程菌DPA6基因组中的panB基因的原始启动子替换为强启动子P_srfA，构建菌株Bacillus subtilis（coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctEpanB ^*），记为DPA7；

（8）将来源于谷氨酸棒杆菌的panB及panC基因构建到pMA5质粒上得到pMA5-panB- panC，在工程菌DPA7基因组中过表达panB及panC基因，构建菌株Bacillus subtili （coaA ^*ΔcoaXilvE ^*ΔilvKΔpoxBΔlctEpanB ^*-panBC），记为DPA8，即为所述的高产D-泛酸的基因工程菌。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述底盘菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 6633。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述启动子P_resD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述启动子P_srfA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.权利要求1所述基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种于发酵培养基中，于25~32℃、180~300 rpm条件下进行发酵培养48~60h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到所述D-泛酸。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖 10~30 g/L、硫酸铵10~20 g/L、KH₂PO₄ 0.1~1.5 g/L、硫酸镁0.1~2.0 g/L、酵母粉1~5 g/L、β-丙氨酸1~5 g/L、碳酸钙10~20 g/L、0.5~2mL微量元素溶液，溶剂为水，pH自然；微量元素溶液组成为：10 g/L CaCl₂，10 g/L FeSO₄•7H₂O，1 g/L ZnSO₄•7H₂O，0.2 g/L CuSO₄，0.02 g/LNiCl₂•7H₂O，溶剂为去离子水。