CN106604987A - 产l‑色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物和使用其生产l‑色氨酸的方法 - Google Patents

产l‑色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物和使用其生产l‑色氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及埃希氏杆菌属的微生物，其中通过灭活磷酸酶活性提高L‑色氨酸生产力。进一步，本发明涉及使用该埃希氏杆菌属的微生物生产L‑色氨酸的方法。

Description

产L-色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物和使用其生产L-色氨酸 的方法
技术领域
本发明涉及修饰的产L-色氨酸的埃希氏杆菌属(genus Escherichia)的微生物——其中磷酸酶的活性被灭活，和使用该埃希氏杆菌属的微生物生产L-色氨酸的方法。
背景技术
L-色氨酸，是一种必需氨基酸，已经被广泛地用作饲料添加剂、药品比如输液剂等的基础材料、和保健功能食品等的基础材料。虽然这种L-色氨酸可以通过化学合成、酶反应、发酵方法等生产，但是目前L-色氨酸主要通过使用微生物的直接发酵生产。在早期阶段，开发产L-色氨酸菌株通过突变选择进行(韩国专利申请公布号1987-0001813)。连同遗传工程的开发一起，产色氨酸菌株的开发通过经由增强代谢过程中的酶合成——如增强色氨酸生物合成酶的表达——克服生物合成途径中酶的色氨酸反馈抑制的方法进行。但是，仍然需要开发具有高效生产力的用于工业用途的产色氨酸菌株。
具体而言，已知参与通过微生物的色氨酸生物合成期间的最终反应阶段的色氨酸合酶(EC 4.2.1.20)使用磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶。进一步，在丝氨酸被用作色氨酸合酶反应的底物的情况下，由serC编码的磷酸羟基苏氨酸转氨酶(EC 2.6.1.52)使用PLP作为辅酶，并且因此，PLP被认为是色氨酸生物合成的重要辅酶。
因此，预期维持适当的PLP浓度在相应酶的有效反应和期望产物的生物合成反应中起着重要作用。但是，除了色氨酸生产之外，辅酶还有助于多种反应，并且因此，适当地维持PLP水平的方法还没有被发现。此外，产色氨酸微生物中PLP水平的维持是否可以导致L-色氨酸生产力的增加还有待阐明。
发明内容
[技术问题]
本发明人已经进行了大量的努力来开发高效率地生产L-色氨酸的方法。他们灭活了由SEQ ID NO：1的氨基酸序列表示的蛋白质的活性，所述氨基酸序列由目前为止功能尚不清楚的yigL基因编码，以便通过抑制为辅酶的PLP的分解来增加色氨酸生产能力，并且适当地维持细胞内PLP浓度。结果，他们确认了L-色氨酸生产能力被提高，因而完成了本发明。
[技术方案]
本发明的目标是提供产L-色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物。
本发明的另一目标是提供使用产L-色氨酸的微生物生产L-色氨酸的方法。
[有益效果]
本发明提供了修饰的产L-色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物，其中由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的磷酸酶的活性被灭活。本发明示出了有效地和经济地生产L-色氨酸的效果，导致使用埃希氏杆菌属的微生物的更高产率。如上所述生产的L-色氨酸不仅可以被应用至动物饲料或饲料添加剂，而且还可以被应用至多种产品，比如人食品或其食品添加剂、药品等。
[具体实施方式]
为了实现上述目标，在一方面，提供了修饰的产L-色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物，其中由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的磷酸酶的活性被灭活。例如，修饰的产L-色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物可以是与未修饰的埃希氏杆菌属的微生物相比具有增加的色氨酸生产能力的微生物。
如本文所使用的，术语“L-色氨酸”指的是α-氨基酸，是不在体内合成的必需氨基酸，并且是化学式为C11H12N2O2的芳香族L-氨基酸。为了增加微生物中的L-色氨酸生产能力，先前已经使用了包括增强产色氨酸途径中生物合成酶的表达和阻断侧链途径的方法。
如本文所使用的，术语“磷酸酶”可以指的是催化用于从底物去除磷酸基团的蛋白质。在本发明中，“包括SEQ ID NO：1的氨基酸的磷酸酶”是由yigL基因编码的蛋白质，预测其催化将底物PLP分解为吡哆醛和磷酸的反应。由于由yigL编码的蛋白质在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中被命名为磷酸吡哆醛磷酸酶(NCBI基因ID：12930615)但是在EcoCyc数据库(http://www.ecocyc.org)中被命名为磷酸糖(phosphosugar)磷酸酶，所以哪种功能是该蛋白质的主要功能还是未知的。根据当前研究，报道了yigL表达由热休克诱发(J.Gen.Appl.Microbiol.,(2005)V51,pp.93-103)并且存在公开以下的研究结果：yigL的翻译由sgrS——其是一类sRNA——激活，从而分解细胞内磷酸糖(J.Bacteriol.(2013)V195,pp.4804-4815)。但是，清楚的功能仍有待阐明。
因此，除了由SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列之外，酶是与上述序列具有70％或更多、具体地80％或更多、更具体地90％或更多、甚至更具体地95％或更多、甚至仍更具体地98％或更多、和还甚至更具体地99％或更多的同源性的氨基酸，并且可以非限制性地包括酶，只要其具有与上述酶基本上相同或相应的效果。此外，在具有上述同源性并显示与酶相应效果的氨基酸序列的情况下，显而易见的是具有带有部分缺失、修饰、置换或添加的氨基酸序列的任何修饰的酶包括在本发明的范围内。
可以非限制性地包括编码由SEQ ID NO：1表示的磷酸酶的基因，只要其是可以编码该酶的序列和其可以指示为yigL基因。具体而言，除了由SEQ ID NO：2表示的核苷酸序列之外，编码该酶的基因是与上述列举的序列具有80％或更多、具体地90％或更多、更具体地95％或更多、甚至更具体地98％或更多、和还甚至仍更具体地99％或更多的同源性的核苷酸序列。可以非限制性地包括基因序列，只要其编码具有与上述酶基本上相同或相应的效果的酶。此外，在具有上述同源性的核苷酸序列的情况下，显而易见的是具有部分缺失、修饰、置换或添加的核苷酸序列包括在本发明的范围内。
如本文所使用，术语“同源性”指的是两个多核苷酸或多肽部分之间同一性的百分比。来自一部分与另一部分的序列之间的同源性可以通过本领域中已知的技术测定。例如，同源性可以通过使用容易获得并且能够排列(arrange)序列信息的计算机程序(例如：BLAST 2.0)在两个多核苷酸分子或两个多肽分子之间直接地排列序列信息(即，参数，比如得分、同一性、相似性等)测定。除此之外，多核苷酸之间的同源性还可以通过下述进行测定：在用于在同源区域之间形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸和利用单链特异性核酸酶解装配，然后测定解装配的片段的大小。
如本文所使用的，术语“内源活性”指的是天然状态下或修饰之前微生物具有的酶的活性状态。
术语“灭活”指的是其中与天然状态下或修饰之前的菌株相比编码酶的基因完全不表达的情况，和/或其中即使基因表达，酶具有降低的活性或无活性的情况。
因此，相对于内源活性，灭活的活性指的是与天然状态下或修饰之前微生物最初具有的酶的活性相比，降低的活性或无活性。降低是宽泛的概念，其包括其中由于编码酶的基因的修饰等酶本身的活性低于微生物最初具有的酶的活性的情况；其中由于编码酶的基因的表达的抑制或翻译的抑制细胞内酶活性的总体水平低于天然状态下或修饰之前的菌株的总体水平的情况；和其组合。
灭活酶活性的修饰方法可以通过应用本领域中熟知的多种方法实现。虽然不限于此，但是方法的实例可以包括用于将染色体上编码酶的基因替换为突变以降低其酶活性的基因的方法，包括其中酶活性被去除的情况；用于使编码酶的部分或全部基因缺失的方法；用于将编码酶的基因的表达控制序列替换为具有弱活性或无活性的序列的方法；用于在染色体上编码酶的基因的表达控制序列中引入修饰的方法；用于使染色体上编码酶的部分或全部基因缺失的方法；用于引入反义寡核苷酸(例如，反义RNA)的方法，所述反义寡核苷酸通过互补结合至染色体上基因的转录物抑制从mRNA至酶的翻译；用于人工并入互补序列至编码酶的基因的SD序列的SD序列上游，形成二级结构，从而抑制核糖体附着的方法；和在相应序列中的开放阅读框(ORF)的3’端处并入启动子进行反转录的反转录工程化(RTE)方法；和其组合。
具体地，用于使编码酶的部分或全部基因缺失的方法可以通过如下进行：通过用于细菌内染色体插入的载体将染色体中编码内源靶蛋白的多核苷酸替换为具有部分缺失的核酸序列的多核苷酸或标记基因。通过同源重组使基因缺失的方法可以用作使部分或全部基因缺失的方法。
如上面所指示的，术语“部分”可以根据多核苷酸的类型而改变，但是可以具体地是1到300，更具体地1到100，和甚至更具体地1到50，但不限于此。
如上面所指示的，术语“同源重组”指的是通过彼此在具有同源性的遗传链的基因座处的交换发生的遗传重组。
具体地，用于修饰表达控制序列的方法可以通过在表达控制序列的核酸序列中经由缺失、插入、非保守性或保守性替换、或其组合诱导修饰，或用显著更弱的启动子替换等进行。表达控制序列可以包括启动子、操纵基因序列、编码核糖体结合区的序列、和控制转录和翻译终止的序列。
此外，用于修饰染色体上的基因序列的方法可以通过在序列中经由缺失、插入、非保守性或保守性替换、或其组合诱导修饰以进一步降低酶活性，或用已经被改进为具有较弱活性的基因序列或已经被改进为不具有活性的基因序列替换进行。
在本发明的示例性实施方式中，确认了多种产色氨酸的大肠杆菌——其中编码相应磷酸酶的yigL已经缺失以灭活由SEQ ID NO：1的氨基酸序列表示的磷酸酶的内源活性——与其中yigL没有缺失的亲本菌株相比具有增加的L-色氨酸生产能力，从而确认了产L-色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物——其中该微生物已经被修饰以灭活内源磷酸酶活性——可以有效地生产L-色氨酸。
在本发明中，产L-色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物指的是可以由培养基中的碳源生产L-色氨酸的微生物。进一步，产L-色氨酸的微生物可以是重组微生物。具体地，类型没有特别地被限制，只要可以生产L-色氨酸，但是微生物可以属于肠细菌属(genusEnterbacter)、埃希氏杆菌属、欧文氏菌属(genus Erwinia)、沙雷氏菌属(genusSerratia)、普罗维登斯菌属(genus Providencia)、棒状杆菌属(genusCorynebacterium)、短杆菌属(genus Brevibacterium)，和具体地，埃希氏杆菌属。
更具体地，埃希氏杆菌属的微生物可以是大肠杆菌，但是可以非限制性地包括由于灭活磷酸酶活性可以具有增加的L-色氨酸生产能力的埃希氏杆菌属的微生物。
具体地，在本发明中，埃希氏杆菌属的微生物的亲本菌株——其由于灭活磷酸酶活性而具有L-色氨酸生产能力——没有被具体地限制，只要它是产色氨酸的微生物。例如，产色氨酸的微生物可以被修饰以减弱或灭活竞争途径中基因的活性、色氨酸操纵子定向途径中调节子的活性、色氨酸的输入蛋白(importer)的活性、和色氨酸流入(influx)和分解基因的活性和/或以过表达色氨酸操纵子活性。用于减弱或灭活激活的方法与上面描述的相同，并且可以非限制性地包括已知的方法。进一步，非限制性地包括过表达色氨酸操纵子活性的已知方法，但是实例可以包括用于进一步将操纵子基因的部分或全部基因序列或包含从外部引入的表达控制区的多核苷酸插入染色体的方法，用于通过引入载体系统而增加拷贝数的方法；利用其它控制序列替换控制基因表达的表达控制区；其中表达控制区中部分或全部基因序列中的修饰被诱导的修饰；和通过引入基因自身的修饰增强操纵子活性，但是实例不限于此。具体地，其可以是大肠杆菌，其中部分或全部pheA、trpR、mtr和/或tnaAB基因已经缺失和/或色氨酸操纵子已经过表达。
在本发明中，除了pheA、trpR、mtr和tnaAB基因之外，色氨酸操纵子、由这些编码的蛋白序列、用于本发明的基因序列和蛋白序列可以从已知的数据库(即，NCBI的GenBank等)获得，但是实例不限于此。此外，关于pheA、trpR、mtr和tnaAB基因等的详细信息可以参考在韩国专利号10-0792095和韩国专利公布号10-2013-0082121中公开的内容，并且整个说明书可以被包括作为本发明的参考。
关于本发明的示例性实施方式，由于灭活多种亲本菌株中的磷酸酶活性，在产L-色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物的情况下，确认了当磷酸酶活性被灭活时，不管亲本菌株的类型如何，L-色氨酸生产能力显著地提高。
在本发明的另一方面，提供了生产L-色氨酸的方法，其包括在培养基中培养修饰的产L-色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物，其中由SEQ ID NO：1表示的磷酸酶活性被灭活；和从培养的微生物和培养基获得L-色氨酸。
可以非限制性地使用用于培养本发明的微生物的任何培养基或培养条件，只要它们是用于培养埃希氏杆菌属的微生物的常规培养基，但是具体地，本发明的微生物可以在常规培养基中在同时控制温度、pH等的需氧条件下培养，所述常规培养基包含充足的碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素等。
在本发明中，碳源可以包括糖类，比如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇等；醇类，比如糖醇、丙三醇、丙酮酸、乳酸、柠檬酸等；和氨基酸，比如有机酸、谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等。进一步，可以使用天然有机营养源，比如玉米淀粉水解产物、糖蜜、赤糖糊、米糠、木薯、甘蔗渣和玉米浆，并且具体地，可以使用糖类，比如葡萄糖、无菌预处理的糖蜜(即，转化为还原糖的糖蜜等)，并且可以非限制性地广泛使用足量的除了列举之外的碳源。这些碳源可以单独使用或者以至少两种类型的组合使用，但是不限于此。
对于氮源，可以使用无机氮源，比如氨、硫酸铵、氯化铵、醋酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等；氨基酸，比如谷氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺等；和有机氮源，比如蛋白胨、NZ-胺、肉汁、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、干酪素水解物、鱼或其分解产物、和脱脂豆饼或其分解产物。这些氮源可以单独使用或者以至少两种类型的组合使用，但是不限于此。
对于磷源，可以包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、相应的含钠的盐等。对于无机化合物，可以使用氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等，并且除此之外，可以包括氨基酸、维生素、合适的前体等。这些培养基或前体可以作为分批培养物或连续培养物添加至培养产物。
在本发明中，在微生物的培养期间，为了调节培养产物的pH，可以通过适合的方法将化合物，比如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸、硫酸等添加至培养产物。进一步，在培养的过程中，可以使用消泡剂比如脂肪酸聚乙二醇醚抑制泡沫形成。此外，氧气或含氧气体可以被注入培养产物以维持培养产物的需氧条件，或者氮气、氢气和二氧化碳气体或者没有气体可以被注入以维持厌氧或微量需氧条件。
培养产物的温度的范围可以具体地从27℃到40℃，更具体地从30℃到37℃，但不限于此。可以继续培养直到获得期望生产量的有用产物，并且可以具体地继续培养10小时到100小时，但不限于此。
用于获得L-色氨酸的上述步骤可以使用本发明的培养方法——例如，分批培养、连续培养、补料分批培养等——基于本技术领域已知的适合的方法从培养的微生物和培养基获得期望的L-色氨酸。获得步骤可以包括纯化过程。纯化过程可以使用本领域已知的适合方法纯化获得的L-色氨酸。
[实施本发明的模式]
在下文中，本发明将参照下面的实施例进行详细地描述。但是，这些实施例仅出于说明性的目的，并且本发明的范围不限于这些实施例。
实施例1：制备磷酸酶缺陷的野生型菌株
在本实施例中，其中磷酸酶活性被灭活的菌株从产色氨酸的菌株制备。
预计编码磷酸酶的yigL基因通过在W3110trpΔ2菌株中同源重组而缺失(韩国专利申请公布号10-2013-0082121)，其中编码分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(CM-PDT)的pheA基因(NCBI基因ID：12934467)、编码色氨酸酶的tnaA基因(NCBI基因ID：12933600)和tnaAB基因——其是编码色氨酸输入蛋白的tnaB基因(NCBI基因ID：12933602)的操纵子形式——从W3110菌株缺失，以便增强色氨酸生产能力，所述W3110菌株是大肠杆菌野生型菌株——埃希氏杆菌属的代表性微生物。
具体地，使用涉及由Datsenko KA等开发的λ红色重组酶的一步灭活方法以使包含SEQ ID NO：2的基因序列的yigL基因缺失(Proc Natl Acad Sci USA,(2000)V97,pp6640-6645)。对于用于确认基因插入的标记，将rmf启动子连接至pUC19(New England Biolabs(USA))，并且使用pUCprmfmloxP的氯霉素基因，其通过连接由pACYC184(New EnglandBiolab)获得的突变loxP-CmR-loxP盒而获得(韩国专利公布号10-2009-0075549)。
首先，使用包含部分yigL基因和pUCprmfmloxP基因的氯霉素抗性基因的部分基因序列的SEQ ID NO：3和4的引物的组合，指定pUCprmfmloxP为模板。然后，ΔyigL1st，大约1.2kb的聚合酶链反应(下文称‘PCR’)产物，由初次PCR获得，该初次PCR重复30个循环的94℃下变性30秒、55℃下退火30秒和72℃下聚合1分钟。其后，ΔyigL1st，由PCR获得的大约1.2kb的PCR产物，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳、洗脱并用作再次PCR的模板。在再次PCR期间，使用包含从初次PCR获得的PCR产物的5’和3’区中20bp的基因序列的SEQ ID NO：5和6的引物的组合，同时使用洗脱的初次PCR产物作为模板，通过重复30个循环的94℃下变性30秒、55℃下退火30秒和72℃下聚合1分钟，获得ΔyigL，大约1.3kb的PCR产物。如此获得的PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳、洗脱并用于重组。
转化为pKD46载体的大肠杆菌W3110trpΔ2根据由Datsenko KA等开发的一步灭活方法(Proc Natl Acad Sci USA.,(2000)V97,pp.6640-6645)以感受态制备，然后通过从初次和再次PCR获得的1.3kb长的ΔyigL片段转染。其后，将其在包含氯霉素的LB培养基中培养，并且选择具有氯霉素抗性的初级转染子。
在从如此获得的具有氯霉素抗性的初级重组菌株移出pKD46之后，氯霉素标记基因通过引入pJW168载体(Gene,(2000)V247,pp.255-264)从细菌移出(Gene,(2000)V247,pp255-264)。使用SEQ ID NO：7和8的引物，通过PCR确认了yigL基因由从最终获得的细菌获得的大约0.6kb的PCR产物缺失，并命名为W3110trpΔ2yigL。
本实施例中使用的引物序列在下面的表1中示出。
[表1]
引物 序列 SEQ ID NO
yigL-Cm-R2 ttgcgtctgatttagatggcacgttactttctcccgaccatacgttatcctagtggatctgatgggtacc 3
yigL-R1 cccagcggaaaccgctctacagaggtttaaatttcttatgtaccaggttgttgcgtctgatttagatggc 4
yigL-Cm-F2 ccattgtagcgaagtatcaggttgacaactgaccaaataaagaacgattaaggtgacactatagaacgcg 5
yigL-F1 tggtgatgataagtagcgccacaatggaaaactctttgattaacgggtatccattgtagcgaagtatcag 6
yigL conF1 aaccgcatgcatgaccgttt 7
yigL conR1 atatacaggccgaccgtttt 8
实施例2：生产具有灭活的磷酸酶的产色氨酸菌株
在本实施例中，预计编码磷酸酶的yigL基因通过如实施例1的方法中描述的同源重组缺失，同时具有KCCM11166P(韩国专利号10-1261147)作为亲本菌株，其是生产色氨酸的另一个代表性大肠杆菌。
使用SEQ ID NO：7和8的引物，通过PCR确认了yigL基因由从最终获得的细菌获得的大约0.6 kb的PCR产物缺失，并命名为CA04-2803。
实施例3：评估yigL基因缺陷的野生型菌株的色氨酸生产力
将pCL-Dtrp_att-trpEDCBA和pBAC-Dtrp_att-trpDCBA通过转化方法引入每个菌株以比较实施例1中产生的W3110 trpΔ2 yigL和W3110 trpΔ2——其为亲本菌株——之间的色氨酸生产力。引入的载体是如此载体：其通过在色氨酸操纵子控制区中解除控制机制而具有用于色氨酸过量生产的色氨酸操纵子的增强表达(韩国专利公布号10-2013-0082121)。含有引入载体的菌株在根据表2的组成制备的色氨酸测试培养基上培养并且比较它们的产L-色氨酸活性。
[表2]
色氨酸测试培养基的组成
在LB固体培养基上在37℃培育箱中过夜培养的菌株通过一个铂环分别接种入表2的25mL测试培养基中，并且在37℃培育箱中在200rpm下培养48小时。然后，比较色氨酸浓度(表3)。
[表3]
上面的结果显示了与其中磷酸酶激活没有被灭活的菌株相比，其中yigL基因编码的磷酸酶的活性被灭活的菌株显示了色氨酸生产力的60％增加。确认了可以通过灭活由yigL编码的磷酸酶提高色氨酸生产力。这可以被解释为意味着由于作为对色氨酸生物合成重要的辅酶起着重要作用的PLP浓度的增加——因为yigL编码的磷酸酶的灭活，色氨酸生物合成增加。
实施例4：评估yigL基因缺陷的菌株的色氨酸生产力
为了测量实施例2中产生的yigL缺陷的菌株(CA04-2803)和KCCM11166P——其为亲本菌株——的色氨酸效价，将菌株在根据下面示出的表4中的组成制备的色氨酸效价培养基上培养。然后，确认了增强的L-色氨酸生产效率。
[表4]
色氨酸效价培养基的组成
组成 浓度(每升)
葡萄糖 60g
K2HPO4 1g
(NH4)2SO4 10g
NaCl 1g
MgSO4·7H2O 1g
柠檬酸钠 5g
酵母提取物 2g
碳酸钙 40g
柠檬酸钠 5g
苯丙氨酸 0.15g
酪氨酸 0.1g
pH 6.8
在LB固体培养基中在37℃培育箱中培养过夜的大肠杆菌菌株——KCCM 11166P和CA04-2803，通过一个铂环分别接种入表4的25mL效价培养基中，并在37℃培育箱中在200rmp下培养48小时。然后，比较葡萄糖消耗率和色氨酸浓度。
结果，如下面示出的表5中所指示的，与对照KCCM11166P相比，CA04-2803——其是含有灭活的由yigL基因编码的磷酸酶的菌株——的色氨酸浓度显示了大约30％的色氨酸浓度增加。
[表5]
菌株 色氨酸浓度(g/L)
KCCM11166P 7.48
CA04-2803 9.62
本发明人已经确认了色氨酸生产力已经在灭活的菌株——其是编码磷酸酶的yigL缺陷的并且是基于KCCM11166P菌株的——中增加。该菌株命名为“CA04-2803”或“CA04-2803(KCCM11166P_ΔyigL)”并且在2014年12月5日以登录号KCCM11635P保藏于由布达佩斯条约确认的国际保藏机构——韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center ofMicroorganism)。
上述结果暗示，在产L-色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物中，与没有灭活磷酸酶的菌株相比，在具有灭活的磷酸酶活性的菌株中L-色氨酸生产力增加更多。进一步，这类关于色氨酸生产增加的结果由yigL编码的磷酸酶的灭活引起并且被视为由PLP磷酸酶的灭活的功能引起，其是由基因编码的磷酸酶的预期功能中的一种。这很有可能是由于增加的细胞内PLP浓度。
从上面的描述，本发明所属领域的技术人员将能够理解本发明可以在不修改本发明的技术概念或基本特征的情况下以其它具体的形式体现。就此而言，本文公开的示例性实施方式仅出于说明的目的并且不应当被解释为限制本发明的范围。相反，本发明意欲覆盖不仅示例性实施方式而且各种替代方案、修改、等价方案和可以包含在如所附权利要求书限定的本发明的精神和范围内的其它实施方式。
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
国际表格
原始保藏接收证明
由该页下部确定的国际保藏机构根据第7.1条发出
至：CJ第一制糖株式会社
CJ第一制糖中心
330，DONGHO-RO，JUNG-GU，首尔100-400
大韩国民
证明上述翻译与原文内容没有相互违背
2015年5月14日
专利代理人Son Min印。
PCT/RO/134表

Claims (3)

1.一种修饰的产L-色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物，其中包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的磷酸酶的活性被灭活。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述埃希氏杆菌属的微生物是大肠杆菌。
3.生产L-色氨酸的方法，包括：
(i)在培养基中培养根据权利要求1或2所述的埃希氏杆菌属的微生物；和
(ii)从培养的微生物和所述培养基中获得L-色氨酸。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11370746B2 (en) 2018-03-23 2022-06-28 Cj Cheiljedang Corporation Granules comprising L-amino acid and method for preparing the same
KR101991206B1 (ko) * 2018-11-29 2019-06-19 씨제이제일제당 (주) cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법
KR101991207B1 (ko) * 2018-11-29 2019-06-19 씨제이제일제당 (주) cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법
KR101996767B1 (ko) * 2018-11-29 2019-07-04 씨제이제일제당 (주) cAMP 수용 단백질 변이체 및 이를 이용한 L-아미노산 제조방법
KR102284726B1 (ko) * 2021-01-25 2021-08-02 씨제이제일제당 주식회사 신규한 타우토머레이즈 pptA 변이체 및 이를 이용한 L-트립토판 생산 방법

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR870001813B1 (ko) 1985-05-20 1987-10-13 한국과학기술원 발효법에 의한 l-트립토판의 제조방법
KR970001533B1 (en) 1987-01-30 1997-02-11 American Cyanamid Co Dihydro derivatives and pseudoaglycons of ll-e33288 antibiotics and anticancer ages, preparation and purification method thereof
JPH08103283A (ja) * 1994-10-06 1996-04-23 Mitsubishi Chem Corp トリプトファンの製造法
US8372989B2 (en) * 2002-04-23 2013-02-12 Cargill, Incorporated Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of monatin and its precursors
KR101142885B1 (ko) 2003-12-15 2012-05-10 씨제이제일제당 (주) 트립토판 생합성 관련 변이유전자를 함유한 대장균 변이주및 이를 이용한 트립토판 제조방법
KR100792095B1 (ko) 2006-12-29 2008-01-04 씨제이 주식회사 Ｌ-페닐알라닌 생산능을 갖는 대장균 변이주로부터유전자조작된 ｌ-트립토판 생산능을 갖는 재조합 대장균균주 및 이를 이용한 트립토판 제조방법
KR20090075549A (ko) 2008-01-04 2009-07-08 씨제이제일제당 (주) 향상된 ｌ-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균 및 이를 이용한ｌ-쓰레오닌의 생산 방법
KR101261147B1 (ko) * 2011-01-18 2013-05-06 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산의 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
KR101327093B1 (ko) * 2012-01-06 2013-11-07 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산을 생산할 수 있는 미생물 및 이를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
DK2803720T3 (da) * 2012-01-10 2022-04-04 Cj Cheiljedang Corp Mikroorganismer fra escherichia coli med forbedret produktion af l-tryptofan og fremgangsmåde til fremstilling af l-tryptofan dermed
RU2013118637A (ru) * 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
RU2013144250A (ru) * 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLATTNER,F.R.等: "登录号AAT48225.1", 《NCBI GENBANK》 *
KAI PAPENFORT等: "Small RNA-Mediated Activation of Sugar Phosphatase mRNA Regulates Glucose Homeostasis", 《CELL》 *
PENGFEI GU等: "One-step of tryptophan attenuator inactivation and promoter swapping to improve the production of L-tryptophan in Escherichia coli", 《MICROBIAL CELL FACTORIES》 *

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