CN103443267B - L-氨基酸生产力增强的微生物及利用其产生l-氨基酸的方法 - Google Patents

L-氨基酸生产力增强的微生物及利用其产生l-氨基酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种L-氨基酸生产力增强的埃希氏菌属微生物及利用所述埃希氏菌属微生物生产L-氨基酸的方法，其中将所述微生物转化为具有增强的NAD激酶活性和tehB基因编码的具有SEQ？ID？NO.2氨基酸序列的酶失活。

Description

L-氨基酸生产力增强的微生物及利用其产生L-氨基酸的方法
技术领域
本发明涉及一种有用氨基酸生产力增强的微生物及利用其产生L-氨基酸的方法，由于还原力增加致使细胞活性提高并缩短细胞培养时间。
背景技术
已知微生物通过发酵作用产生有用产物，需要大量的能量，如ATP(5’-三磷酸腺苷)或还原力，如NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)，以增强其生物合成途径。
在微生物的代谢过程中，分解反应所用的NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和合成反应所用的NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)二者在细胞内的平衡是非常重要的。该平衡通过下式所示的NAD磷酸化或NADP的去磷酸化进行控制。
NAD++ATP→NADP++ADP
NADP+→NAD++磷酸盐
在大肠杆菌(E.coli)中，已知NAD的磷酸化被nadK(或yfjB)基因编码的NAD激酶(EC2.7.1.23)催化。NAD激酶利用Mg2+作为酶反应的辅助因子，并被NADPH和NADH别构抑制。现已知NAD+的Km值是2000μM，ATP的Km值是2500μM(Eur.J.Biochem.,(2001)268:4359-4365)。
尽管其在代谢途径中具有明显的重要性，然而，对NADP的去磷酸化的研究却很少。虽然古生菌詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)的NAD激酶同系物，经证明具有NADP磷酸酶活性，然而在真核生物和真细菌中仍然未鉴定到编码具有这类活性的酶的基因。在大肠杆菌中，cysQ基因的产物显示出高NADP和NADPH磷酸酶活性，但纯化的酶的动力学研究表明，它不是所述有机体真正的NADP磷酸酶(BiochemJ.,(2007)402:205-218,Biosci.Biotechnol.Biochem.,(2008)72:919-930)。
在许多微生物中发现了NAD激酶活性，对催化活性具有重要意义的NAD-结合位点和NAD激酶的活性位点显示了物种之间高度保守的氨基酸序列。例如，各种微生物，包括革兰氏阳性菌，都显示在螺旋2、4和5(其各自以H2、H4和H5表示)的三级结构预测中显示出高度的同源性(ApplMicrobiolBiotechnol(2010)87:583-593)。
NAD激酶产生的NADP最后提供还原力，特别是在大肠杆菌中大量产生有用产物所需的NADP+/NADPH是合成代谢反应的必需元素(BiochemJ.,(2007)402:205-218)。在大肠杆菌中，NADPH主要通过以下方式产生：1)氧化磷酸戊糖途径，2)TCA循环中的NADP依赖性异柠檬酸脱氢酶(icd基因)，以及3)转氢酶(pntAB基因)(JBiolChem.,(2004)279:6613-6619)。
这些反应使用NADP作为底物产生NADPH，从而通过增加NADP的细胞内水平来增加NADPH的水平。因此，为了各种代谢物质的工业化生产，在增加NADP的细胞内水平上做了许多尝试，如，1)通过在大肠杆菌中超表达nadK增加NADPH和胸苷产量(BiotechnolLett.,(2009)31:19291936)，2)通过在大肠杆菌中超表达nadK增加NADPH和PHB(聚羟基丁酸酯)的产量(ApplMicrobiolBiotechnol.,(2009)83:939947)，以及3)与在大肠杆菌中超表达nadK相似，通过在棒状杆菌(Corynebacterium)中超表达ppnK增加赖氨酸产量。以上尝试的关键点在于增加nadK基因的表达。然而，在上述每种情况下，还必须增加诸如ATP的磷酸源，以通过增加NADPH的水平来增加还原力，其源于通过NAD激酶的高表达而增加的NADP水平。
在微生物中，ATP主要通过电子传递系统或底物水平磷酸化产生。产生的ATP通过分解为细胞提供能量，也通过糖酵解反应或氧化磷酸化反应重新生成。基于这一事实，已经对将细菌ATP再生系统应用到生产过程中进行了研究，以便在有用产物的大量生产过程中提供能量(BiosciBiotechnolBiochem.,(1997)61:840-845)。然而，如上所述，有关增加磷酸源方法的研究很少，而增加磷酸源是通过NAD激酶的高表达来增加还原力以及随后增加生物合成产物所需的。此外，在向细胞供应能量方面，对通过大量产生ATP来增加能量供应的研究很少，并且相关技术中也没有进行利用ATP作为磷酸源的研究。
发明内容
技术问题
因此，为了研发产生高浓度L-氨基酸的微生物，本发明人已经研究了参与各种能量和还原力代谢的基因。结果，本发明人发现了一种能够有效产生高浓度的L-氨基酸的微生物，其具有增强的nadK编码的NAD激酶的表达，并且tehB基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2的酶失活，并在此基础上，能够有效地增加磷酸源ATP，从而完成了本发明。
换而言之，本发明涉及通过在微生物中有效增加还原力来增加所需氨基酸产量的方法，其中，额外供应在NADP生物合成过程中待还原的ATP，以增加具有L-氨基酸生产力的埃希氏菌属(Escherichia)的还原力。
因此，本发明的目的在于提供一种L-氨基酸生产力增强的埃希氏菌属微生物，其中所述微生物经转化而具有增强的NAD激酶活性并且tehB基因编码的具有SEQIDNO.2氨基酸序列的酶失活，从而具有增强的还原力。
本发明的另一个目的在于提供一种利用所述埃希氏菌属微生物产生L-氨基酸的方法。
技术方案
为了实现以上目的，本发明提供了具有增强的L-氨基酸生产力的埃希氏菌属微生物，其中所述微生物经转化具有增强的NAD激酶活性且tehB基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2的酶失活。本发明的另一目的是，提供利用所述埃希氏菌属微生物产生L-氨基酸的方法。
有益效果
根据本发明，通过增强NADP，在具有L-氨基酸生产力的微生物的细胞内能量代谢中补充还原剂NADPH，并且通过使tehB基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2的酶失活，来供应随后缺乏的ATP，从而通过恢复能量代谢平衡、增加细胞活性及减少培养时间，来提高L-氨基酸生产力。
附图说明
图1为所示为用于增加大肠杆菌nadK基因拷贝数的载体nadK-pINT17E。
最佳实施方式
本发明提供了具有增强的L-氨基酸生产力的微生物和利用所述微生物产生L-氨基酸的方法。
本发明的产生L-氨基酸的微生物包括任何原核或真核微生物，其实例包括属于埃希氏菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗威登斯菌属(Providencia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和短杆菌属(Brevibacterium)的菌株。本发明的微生物优选是属于埃希氏菌属的微生物，更优选为大肠杆菌。
在本发明中，L-氨基酸优选为L-苏氨酸或L-色氨酸。
在本发明优选的实施方案中，本发明提供了具有增强的L-氨基酸生产力的埃希氏菌属微生物，其中所述微生物经转化具有增强的NAD激酶活性且tehB基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2的酶失活，从而提高还原力。
本发明中，NAD激酶是指一种具有利用来自于ATP或其他化合物的磷酸基团将NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)转换为NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)活性的酶。
本发明具体公开的具有NAD激酶活性的蛋白质序列为SEQIDNO.4的氨基酸序列，并且编码所述NAD激酶的nadK基因优选为具有SEQIDNO.3的碱基序列的多核苷酸。
在本发明中，可以通过本领域公知的各种方法增强具有L-氨基酸生产力的埃希氏菌属的NAD激酶活性。例如，所述方法可以包括但并不限于：在染色体中插入编码NAD激酶的碱基序列本身或包括外源表达调控区的多核苷酸的方法，通过将其导入载体系统增加拷贝数的方法，或者通过用其他调控序列取代基因表达调控区、修饰全部或部分的表达调节序列或基因本身突变来增强酶活性的方法。
更优选地，本发明可以利用通过将编码NAD激酶的碱基序列导入菌株的染色体DNA上以增加拷贝数的方法来增强具有L-氨基酸生产力的属于埃希氏菌属微生物的NAD激酶活性。
本领域技术人员应当理解，染色体DNA内NAD激酶拷贝数增加，与通过染色体外载体增加NAD激酶拷贝数，具有相同的效果，或与通过在染色体内或染色体外位点修饰编码NAD激酶的nadK基因的表达调控区通过基因本身突变而增加表达水平，具有相同的效果。当使用载体时，用导入碱基序列的重组载体转化具有L-氨基酸生产力的埃希氏菌属微生物，从而制备NAD激酶活性增强的埃希氏菌属的微生物。
本发明所用的载体没有特别的限定，可以使用任何已知的表达载体。优选地，可以使用pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322或pMW118载体。
根据本发明的一个实施方案，通过转化增强NAD激酶活性，增加了菌株的细胞内NADP和NADPH水平。
为了增加ATP的产生，本发明还应用了使tehB基因编码的酶活性失活的方法。
在本发明中，已知tehB基因(NCBIGeneID:945979)为编码碲酸盐抗性蛋白或预测的S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的基因，但他的作用至今尚不清楚。
然而，最近的研究报告称，大肠杆菌tehB基因的缺失，与亲本菌株相比，表现出ATP产量增加150％，这意味着，该结果归因于由甲硫氨酸生物合成S-腺苷甲硫氨酸所需的ATP减少(FEMSMicrobiolLett.,(2009)297:217-224)。
具体而言，预测的S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶的序列可能由SEQIDNO.2的氨基酸序列所披露。另外，编码所述酶的tehB基因来自于大肠杆菌，优选地，具有SEQIDNO.1的碱基序列的多核苷酸。
使tehB基因编码的酶活性失活的方法，包括修饰相应基因以防止产生具有SEQIDNO.1的碱基序列的基因编码的酶的所有方法。所述方法的示例为，通过同源重组的方法缺失全部或部分基因，或通过在相应基因内插入转座子以抑制酶的表达，或通过插入抗生素抗性基因以抑制酶的表达，但并不限于此。
如本发明所用的术语“转化”是指一种将基因导入到宿主细胞中以在宿主细胞中表达的方法。如果转化的基因在宿主细胞中处于表达的状态，则所述转化的基因包括插入到宿主染色体或位于该染色体其他部分上的任何基因。此外，所述基因包括DNA和RNA，作为能编码多肽的多核苷酸。只要该基因可以被导入宿主细胞并在其中表达，则基因可以以任何形式被导入。例如，基因可以以表达盒的方式被导入宿主细胞，所述表达盒是自身包含用于表达该基因的全部元件的多核苷酸表达体(expressome)。表达盒包含与基因可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。所述表达盒可以采用能够自我克隆的表达载体类型。所述基因也可以通过自身或以待可操作地连接于在宿主细胞表达所需序列的多核苷酸表达体形式，导入宿主细胞。
在本发明优选的实施方案中，所述方法转化的微生物可以为大肠杆菌，优选为大肠杆菌(E.coli)CA03-448(KCCM11167P)、CA03-449(KCCM11168P)或CA04-2001(KCCM11166P)。
本发明还提供了利用埃希氏菌属微生物产生L-氨基酸的方法。
在本发明优选的实施方案中，本发明提供了生产L-氨基酸的方法，其通过在包含蔗糖或葡萄糖作为主要碳源的培养基中培养L-苏氨酸或L-色氨酸生产力增强的埃希氏菌属的重组微生物，产生L-氨基酸。具体而言，本发明提供了产生L-氨基酸的方法，所述方法包括如下步骤：将埃希氏菌属的重组微生物接种和培养于全部或部分含有蔗糖或葡萄糖作为碳源的培养基中，以及从该培养基中分离L-氨基酸。
本发明的培养过程，可以在本领域已知的合适培养基和培养条件下进行。根据所用的菌株，本领域技术人员可容易地对培养过程进行调整。培养过程的实例包括分批式、连续式和补料分批型，但并不限于此。培养方法所用的培养基应当优选满足特定菌株的要求。
本发明所用的培养基含有蔗糖或葡萄糖作为主要碳源。含有高浓度蔗糖的糖蜜也可作为碳源，培养基可以含有适量的各种碳源，并无限制。能够使用的氮源的实例包括，有机氮源，如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆和大豆粗粉，以及无机氮源，如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，并且它们可以单个使用或组合使用。可以向培养基中添加磷源，如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或相应的含钠的盐。此外，培养基还可含有金属盐如硫酸镁和硫酸亚铁。另外，培养基可以补充有氨基酸、维生素和适当的前体。这些培养基或前体可以通过分批式或连续式方法添加到培养物中。
在培养过程中，可以适当添加化合物，如氢氧化铵、氢氧化钾、氨水、磷酸和硫酸，以调节培养物的pH值。进一步，在培养期间，可以适当加入消泡剂，如脂肪酸聚乙二醇酯，以减少培养物中泡沫的形成。为了将培养物维持于有氧状态，可以将氧气或含氧气体注入到培养物中。为了保持培养物处于厌氧及微需氧状态，可以不注入气体，或将氮气、氢气或二氧化碳注入到培养物中。
将培养物维持在27-37℃，优选30-35℃。培养可以持续，直到获得所需量的所需物质，优选培养时间为10-100小时。
可通过本领域已知的适当方法，根据例如分批式、连续式或分批补料类型，实施收集和回收本发明的培养步骤产生的氨基酸的方法，以便从培养基中收集所需氨基酸。
具体实施方式
下文将参照实施例对本发明进行更详细的描述。然而，这些实施例仅供说明之用，并非意图限制本发明的范围。
实施例1.制备源自大肠杆菌(E.coli)的tehB基因编码的酶失活的产L-苏氨酸菌株
通过同源重组，使产L-苏氨酸的菌株即大肠杆菌KCCM10541(KoreanPatentNO.10-0576342)的tehB基因缺失。
大肠杆菌KCCM10541菌株来源于产L-苏氨酸的菌株大肠杆菌KFCC10718(KoreanPatentPublicationNO.10-1992-0008365)的菌株，其亲本菌株大肠杆菌KFCC10718具有L-甲硫氨酸类似物抗性，甲硫氨酸营养缺陷型表型，L-苏氨酸类似物抗性，渗漏异亮氨酸营养缺陷型表型，L-赖氨酸的类似物抗性，和α-氨基丁酸抗性，并能产生L-苏氨酸。
待缺失的tehB基因(NCBI基因ID：945979)已知编码预测的S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖性甲基转移酶。当基因缺失后，不再需要S-腺苷甲硫氨酸的产生中所用的ATP，因此为了减少能量消耗量，选择tehB基因作为靶基因，并且其具有SEQIDNO.1的碱基序列。
对于失活，使用一步失活，其是采用DatsenkoKA等(DatsenkoKAetal.,ProcNatlAcadSciUSA.,(2000)97:66406645)开发的λRed重组酶构建突变体的技术。
为了确认插入到基因中，使用氯霉素抗性基因作为标记。为了除去氯霉素抗性基因，使用Cre/loxP位点特异性重组系统(BMCBiotechnology(2001)1:7)。
聚合酶链式反应(下文称为PCR)通过利用pMloxCm载体为模板和具有部分tehB基因和部分氯霉素抗性基因序列的下述引物1和引物2，在以下反应条件下实施：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环；从而扩增约1200bp的基因片段。
表1
另外，将通过PCR扩增获得的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，然后洗脱并用作第二次PCR的模板。第二次PCR扩增使用洗脱的初级PCR产物作为模板，以及下述引物3和引物4在以下反应条件下实施：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行循环30次；得到约1300bp的扩增基因片段，所述引物3和引物4具有20bp的与初级DNA片段的5'和3'区域互补的序列且还具有tehB基因的5'和3'区域。将通过上述步骤获得的DNA片段在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，然后洗脱，并用于重组。
表2
将具有苏氨酸生产力的大肠杆菌KCCM10541制备为感受态菌株，所述大肠杆菌是根据DatsenkoKA等(DatsenkoKAetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.(2000)97:6640-6645,GenBankNo.AY048746)开发的方法用pKD46质粒进行转化的，所述转化通过导入利用PCR获得的1300bp的基因片段来进行。在补充了氯霉素的LB培养基上筛选获得的菌株。通过利用下述引物5和引物6进行PCR获得约2000bp的PCR产物，以证实tehB基因缺失。
表3
引物5 5'-TTTAGGCGCAGGCGTTTTCT-3'(SEQ ID NO.10)
引物6 5'-TTTTACGTGCCAGCATCGTG-3'(SEQ ID NO.11)
除去pKD46质粒后，用pJW168质粒导入具有氯霉素抗性的初级重组大肠杆菌，以便去除所述菌株中的氯霉素标记基因(Gene,(2000)247,255-264)。使用引物5和引物6进行PCR，得到832bp的PCR产物，这意味着最终得到的菌株具有所需的缺失。
实施例2.构建载体以增加染色体中大肠杆菌nadK基因拷贝数
使用购自美国模式培养物保藏中心(ATCC)的大肠杆菌W3110(GeneBankaccessionnumber:AC000091)的染色体进行PCR，扩增nadK基因。
具体而言，使用下述引物7和引物8，在以下反应条件下进行PCR：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环；扩增了1407bp的基因片段(SEQIDNO.5)。
扩增的序列含有nadK编码序列，以及501bp的预测的自启动子区。此外，在引物7具有EcoRI的限制酶识别位点，引物8具有XbaI的限制酶识别位点。
表4
引物7 5'-CCCGAATTCGCGTCAGCTCAATGCCTTCA-3'(SEQ ID NO.12)
引物8 5'-GGGTCTAGAGCTGGCGTAAAATTAGAATA-3'(SEQ ID NO.13)
将所获得的多核苷酸用限制酶XbaI和EcoRI处理，然后克隆到pINT17E载体的XbaI和EcoRI位点，随后转化到大肠杆菌BW25113中。随后，将细胞涂布于LBCm固体培养基(LB+氯霉素琼脂平板)。使用标准mini-prep程序从菌落中获得克隆的载体，并将其命名为nadK_pINT17E。载体图谱如图1所示。
实施例3.通过增加染色体拷贝数，制备源自大肠杆菌来源的tehB基因编码的酶失活且NAD激酶活性增强的产L-苏氨酸菌株
用在实施例1记载的方法制备的tehB基因缺失菌株和实施例2记载的方法制备的nadK_pINT17E载体，来增加NAD激酶的拷贝数。
首先，将pKD46质粒导入实施例1记载的方法制备的tehB基因缺失菌株中，并制备为感受态菌株，用nadK_pINT17E载体转化所述菌株。在37℃下培养1-2天以获得菌落。使用引物8和引物9进行PCR，以证实基因是否插入到所获菌落的染色体中。PCR反应的条件为：94℃变性30秒，55℃退火45秒，72℃延伸2分钟，进行30个循环；扩增得到约2000bp的基因片段。
表5
引物9 5'-TGGTATTCACTCCAGAGCGA-3'(SEQ ID NO.14)
从具有氯霉素抗性的初级重组菌株除去pKD46质粒后，导入pJW168质粒，以从所述菌株除去氯霉素标记基因(Gene,(2000)247,255-264)。使用引物10和引物11进行PCR，以获得约1500bp的PCR产物，这表明两个连续拷贝的nadK基因令人满意地存在于染色体上。
转化的大肠杆菌被命名为KCCM10541ΔtehBnadK2拷贝(CA03-448)。
表6
引物10 5'-GCATCAGCACCGCGATAAA-3'(SEQ ID NO.15)
引物11 5'-CATGTGTTGTCAGTGCAGT-3'(SEQ ID NO.16)
实施例4.通过增加染色体拷贝数，制备源自大肠杆菌的tehB基因编码的酶失活及NAD激酶活性增强的产L-色氨酸菌株
以与实施例1-3相同的方法制备转化的大肠杆菌，不同之处在于使用产L-色氨酸菌株大肠杆菌KCCM10812。
本实施例使用的亲本菌株大肠杆菌KCCM10812P是来源于具有产L-色氨酸生产力的突变大肠杆菌(KFCC10066)的菌株，其特征是，释放色氨酸营养缺陷型，pheA、trpR、mtr和tnaAB基因失活，aroG和trpE基因在染色体中发生突变(KoreanPatentNO.10-0792095)。
转化的大肠杆菌被命名为KCCM10812ΔtehBnadK2拷贝(CA04-2001)。
比较例1.制备tehB基因编码的酶失活的产L-苏氨酸或L-色氨酸菌株
为了使tehB基因缺失，使用实施例1记载的产苏氨酸菌株大肠杆菌KCCM10541和产色氨酸菌株大肠杆菌KCCM10812。使用一步失活和Cre/loxP位点特异性重组系统(BMCBiotechnology(2001)1:7)，一步失活是采用DatsenkoKA等(DatsenkoKAetal.,ProcNatlAcadSciUSA.,(2000)97:66406645)开发的λRed重组酶构建突变体的技术。
用引物5和引物6进行PCR，获得832bp的PCR产物，这表明最终获得的菌株具有所需的缺失，并将其分别命名为KCCM10541ΔtehB和KCCM10812PΔtehB。
比较例2.制备NAD激酶活性增强的产L-苏氨酸或L-色氨酸菌株
根据实施例3所述的方法，将nadK基因的拷贝数在产苏氨酸和色氨酸菌株的染色体上增加为两个拷贝，从而制备出NAD激酶活性增强的菌株。
将pKD46质粒导入产苏氨酸菌株KCCM10541和产色氨酸菌株KCCM10812中，并制备为感受态细胞，用nadK_pINT17E载体转化转化所述菌株。之后，在37℃下培养1-2天，以获得菌落。然后使用引物8和引物9进行PCR，以检验基因是否插入所获菌落的染色体中。
从具有氯霉素抗性的初级重组菌株除去pKD46质粒后，导入pJW168质粒，以从所述菌株中除去氯霉素标记基因(Gene,(2000)247,255-264)。使用引物10和引物11进行PCR，获得约1500bp的PCR产物，这表明两个连续拷贝的nadK基因令人满意地存在于染色体上。制备得到的菌株分别命名为KCCM10541nadK2拷贝和KCCM10812nadK2拷贝。
实验例1.tehB基因编码的酶失活及NAD激酶活性增强的产L-苏氨酸菌株的滴定
首先，为了提供具有蔗糖同化能力的产L-苏氨酸菌株，pAcscBAR'-mak载体(KoreanPatentPublicationNO.10-2010-0092765)(SEQIDNO.21)构建如下：
构建pAcscBAR之后，将mak基因克隆进pAcscBAR。为了构建pAcscBAR，用引物12和引物13扩增cscB区的多核苷酸，其中cscK区已被除去。
表7
PCR反应的条件为：94℃变性3分钟后；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，进行25个循环；然后72℃延伸7分钟，扩增得到1521bp的多核苷酸。将获得的多核苷酸和pAcscBAR分别用EcoRV和EagI限制酶处理，然后克隆并转化进大肠杆菌DH5α中。使用LB培养基上生长的菌落，通过PCR筛选含有pAcscBAR的菌落，并利用标准质粒mini-prep程序获得质粒。通过连接于所得pAcscBAR质粒XbaI和EagI位点的cscBAR的序列分析，证实没有发生突变。
将大肠杆菌W3110染色体作为模板，使用引物14和引物15扩增含有mak基因的多核苷酸，然后将其克隆到pAcscBAR的PstI和EagI限制酶位点，从而构建pAcscBAR'-mak载体。
表8
引物14 5'-CACTGCAGTGGGGTAAATGCCATCG-3'(SEQ ID NO.19)
引物15 5'-AACGGCCGTCTCGGTGCTCATTACT-3'(SEQ ID NO.20)
PCR反应的条件为：94℃变性3分钟后；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，进行25个循环；然后72℃延伸7分钟，扩增得到1388bp的多核苷酸。获得的多核苷酸和pAcscBAR分别用PstI和EagI限制酶处理，然后克隆并转化进大肠杆菌DH5α。使用LB培养基上生长的菌落，通过PCR筛选含有pAcscBAR'-mak的菌落，并使用标准质粒mini-prep程序获得质粒。通过连接于所得pAcscBAR'-mak质粒XbaI和EagI位点的cscBAR-mak的序列分析，证实没有发生突变。
将构建的pAcscBAR'-mak分别导入以下菌株：实施例3的重组大肠杆菌KCCM10541ΔtehBnadK2拷贝菌株，亲本菌株大肠杆菌KCCM10541，比较例1和2制备的tehB基因缺失KCCM10541菌株(命名为KCCM10541ΔtehB)和nadK基因拷贝数增加的KCCM10541菌株(命名为KCCM10541nadK2拷贝)，然后对其进行滴定。
在33℃恒温培养箱中，将每一个具有不同遗传性状的菌株在LB固体培养基上培养过夜。此后，将一白金环的菌种接种到如表9所示的含有蔗糖的25ml滴定培养基中，在33℃恒温培养箱中200rpm下培养48小时。结果如表10所示。所有结果以从三个烧瓶所获得的平均值表示。
表9
组分 浓度(每升)
蔗糖 70g
KH2PO4 2g
(NH4)2SO4 25g
MgSO47H2O 1g
FeSO47H2O 5mg
MnSO44H2O 5mg
L-甲硫氨酸 0.15g
酵母提取物 2g
碳酸钙 30g
pH 6.8
表10
*24-hr测量值
**48-hr测量值
如表10所示，当仅tehB基因缺失时，蔗糖同化能力与亲本菌株的相似。然而，当NAD激酶活性增强时，蔗糖同化能力比亲本菌株增加了将近2g。
此外，当tehB基因缺失时，细胞密度与亲本菌株相比减少了将近6%，但是其苏氨酸产量却和亲本菌株相当。然而，当同时导入所述两个突变时，与亲本菌株相比，细胞密度减少了将近8%，蔗糖同化能力增加了将近8%，同时苏氨酸产量也增加了9%。
另外，使用葡萄糖作为碳源，通过滴定检测实施例3的重组大肠杆菌KCCM10541ΔtehBnadK2拷贝菌株，亲本菌株大肠杆菌KCCM10541，以及比较例1和2制备的KCCM10541ΔtehB菌株和KCCM10541nadK2拷贝菌株。在33℃恒温培养箱中将每一个具有不同遗传性状的菌株在LB固体培养基中，培养过夜。此后，将一白金环的菌种接种到含有表11所示的葡萄糖的25ml滴定培养基中，并在33℃、200rpm下培养48小时。结果如表10所示。所有结果以从三个烧瓶获得的平均值表示。
表11
组分 浓度(每升)
葡萄糖 70g
KH2PO4 1g
(NH4)2SO4 28g
MgSO47H2O 0.5g
FeSO47H2O 5mg
MnSO44H2O 5mg
酵母提取物 2g
L-甲硫氨酸 0.15g
碳酸钙 30g
pH 6.8
表12
*24-hr测量值
**48-hr测量值
KCCM10541ΔtehBnadK2拷贝菌株被命名为CA03-448，即具有葡萄糖同化能力且NAD激酶活性增强和tehB缺失的产L-苏氨酸大肠杆菌菌株；而KCCM10541ΔtehBnadK2拷贝/pAcscBAR’-mak菌株，提供有蔗糖同化能力的KCCM10541ΔtehBnadK2拷贝菌株，被命名为CA03-449。上述菌株被保存在国际保藏机构韩国微生物培养中心(,KoreanCultureCneterofMicroorganisms,位于361-221,Hongje-1-dong,Seodaemon-gu,Seoul,Korea)，其为韩国菌种保藏联合会(SubsidiaryCultureCollectionoftheKoreanFederationofCultureCollections)附属的培养保藏单位，保藏日期为2011年1月10日，保藏编号分别为KCCM11167P和KCCM11168P。
实验例2.tehB基因编码的酶失活和NAD激酶活性增强的产L-色氨酸菌株的滴定
用葡萄糖作为碳源，通过滴定检测实施例4的重组大肠杆菌KCCM10812ΔtehBnadK2拷贝菌株、亲本菌株大肠杆菌KCCM10812，以及比较例1和2制备的KCCM10812ΔtehB菌株和KCCM10812nadK2拷贝菌株。
为了滴定，将一白金环菌种接种并培养于LB固体培养基，过夜。然后，将一白金环所述菌种接种到具有表13所示组分的25ml烧瓶滴定培养基中，然后在33℃、200rpm下培养48小时。结果如表14所示。所有结果以从三个烧瓶中获得的平均值表示。
表13
组分 浓度(每升)
葡萄糖 60g
K2HPO4 1g
(NH4)2SO4 10g
NaCl 1g
MgSO47H2O 1g
柠檬酸钠 5g
酵母提取物 2g
碳酸钙 40g
柠檬酸钠 5g
苯丙氨酸 0.15g
酪氨酸 0.1g
pH 6.8
表14
*33-hr测量值
**48-hr测量值
如表14所示，当tehB基因缺失时，细胞密度与亲本菌株相比增加了将近10%。当NAD激酶活性增强时，葡萄糖同化能力提高，但是色氨酸产量与亲本菌株相比并无差异。
然而，当同时导入两个突变时，与亲本菌株相比，细胞密度增加，葡萄糖同化能力提高，同时色氨酸生产力增加了将近14%。
KCCM10812PΔtehBnadK2拷贝菌株，即增强NAD激酶活性且tehB缺失的产L-色氨酸的大肠杆菌菌株，被命名为CA04-2001，并被保存在国际权威保藏机构韩国微生物培养中心(位于361-221,Hongje-1-dong,Seodaemon-gu,Seoul,Korea)，其为韩国菌种保藏联合会附属的培养保藏单位，保藏日期为2011年1月10日，保藏编号为KCCM11166P。
对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明范围和实质的情况下，可以进各种修改和改变。因此，应当理解到，上述实施方案就所有方面而言并非限制性的而是说明性的。本发明的范围由所附权利要求书而非权利要求书之前的说明书限定，因此，权利要求书包括落入其发范围内的所有变化和修饰或上述范围的等同范围。
国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约
保藏证明
国际表
至：CJ第一制糖株式会社如果是原菌，按照Rule7.1由
韩国首尔市中区南大门路国际保藏机构发出受理收条
5街500在本页底部进行鉴定
1如果Rule6.4(d)适用，则该日期为国际保藏机构资格获得之日；如果在布达佩斯条约之外进行的保藏在国际保藏机构资格获得后被转化为按照布达佩斯条约的保藏，则该日期为国际保藏机构收到该微生物的日期。
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保藏证明
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至：CJ第一制糖株式会社如果是原菌，按照Rule7.1由
韩国首尔市中区南大门路国际保藏机构发出受理收条
5街500在本页底部进行鉴定
1如果Rule6.4(d)适用，则该日期为国际保藏机构资格获得之日；如果在布达佩斯条约之外进行的保藏在国际保藏机构资格获得后被转化为按照布达佩斯条约的保藏，则该日期为国际保藏机构收到该微生物的日期。
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至：CJ第一制糖株式会社如果是原菌，按照Rule7.1由
韩国首尔市中区南大门路国际保藏机构发出受理收条
5街500在本页底部进行鉴定
1如果Rule6.4(d)适用，则该日期为国际保藏机构资格获得之日；如果在布达佩斯条约之外进行的保藏在国际保藏机构资格获得后被转化为按照布达佩斯条约的保藏，则该日期为国际保藏机构收到该微生物的日期。

Claims (10)

1.一种L-氨基酸生产力增强的埃希氏菌属(Escherichia)微生物，其中所述微生物是具有L-氨基酸生产力的大肠杆菌(E.coli)且其经转化具有增强的NAD激酶表达且tehB基因编码的具有SEQIDNO.2的氨基酸序列的酶失活。
2.根据权利要求1所述的微生物，其中所述NAD激酶为具有SEQIDNO.4的氨基酸序列的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的微生物，其中通过下述一种或多种方法增强所述NAD激酶的表达：通过染色体插入或载体导入增加拷贝数，取代或修饰表达调控区，以及基因突变。
4.根据权利要求1所述的微生物，其中所述失活通过下述方法中的一种或多种进行：通过同源重组缺失部分或全部基因，通过在相应基因中插入转座子抑制酶表达，以及通过插入抗生素抗性基因抑制酶表达。
5.根据权利要求1所述的微生物，其中所述L-氨基酸为L-苏氨酸或L-色氨酸。
6.根据权利要求5所述的微生物，其中所述埃希氏菌属微生物提供有蔗糖同化能力。
7.根据权利要求1所述的微生物，其中所述埃希氏菌属微生物是产L-苏氨酸的大肠杆菌，保藏编号为KCCM11167P的CA03-448，或保藏编号为KCCM11168P的CA03-449。
8.根据权利要求1所述的微生物，其中所述埃希氏菌属微生物是保藏编号为KCCM11166P的产L-色氨酸大肠杆菌CA04-2001。
9.产生L-氨基酸的方法，包括以下步骤：将权利要求1-8中任一项所述的埃希氏菌属微生物接种并培养于全部或部分含有蔗糖或葡萄糖作为碳源的培养基中；和从所述培养基中分离所述L-氨基酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述L-氨基酸为L-苏氨酸或L-色氨酸。
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