BR112013018385B1

BR112013018385B1 - Microrganismo com produtividade de l-aminoácidos aumentada e processo para a produção de l-aminoácidos usando o mesmo

Info

Publication number: BR112013018385B1
Application number: BR112013018385-3A
Authority: BR
Inventors: Kwang Ho Lee; Keun Chul Lee; Seok Myung Lee; Young Bin Hwang
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2011-01-18
Filing date: 2012-01-18
Publication date: 2021-04-27
Also published as: JP5740488B2; EP2665809A2; JP2014504876A; RU2013134401A; KR20120083795A; US20140024087A1; ES2664837T3; BR112013018385A2; US8835154B2; HUE036527T2; WO2012099396A3; CN103443267B; MY170507A; CN103443267A; DK2665809T3; EP2665809B1; RU2549689C2; PL2665809T3; EP2665809A4; KR101261147B1

Abstract

microrganismo com produtividade de l-aminoácidos aumentada e processo para a produção de l-aminoácidos usando o mesmo. a presente invenção fornece um microrganismo do gênero escherichia com produtividade de l-aminoácido aprimorada,em que o microrganismo é transformado para ter atividade nad quinase aumentada e atividade inativada de uma enzima que tem uma sequência de aminoácidos da seq id no. 2 codificada pelo gene tehb e um método para produzir l-aminoácidos usando o microrganismo do gênero escherichia.

Description

Campo técnico

A presente invenção refere-se a um microrganismo com produtividade aumentada de aminoácidos úteis através de atividade celular aumentada e tempo de cultura de células reduzido devido a um maior potencial de redução, e um método para a produção de L-aminoácidos usando o mesmo. /

Técnica Anterior

Microrganismos que produzem produtos úteis por meio de fermentação são conhecidos por exigir uma grande quantidade de energia, como ATP (5'-trifosfato de adenosina) ou potencial de redução, como NADPH (fosfato de dinucleotideo de nicotinamida e adenina) para intensificar a via biossintética do mesmo.

Durante o metabolismo dos microrganismos, o equilíbrio intracelular da NADH (nicotinamida adenina dinucleotideo) usada nas reações catabólicas e NADPH (fosfato de dinucleotideo de nicotinamida e adenina) usado nas reações anabólicas é muito importante. 0 equilíbrio é controlado pela fosforilação do NAD ou pela desfosforilação do NADP, conforme mostrado na fórmula abaixo. NAD+ + ATP - NADP+ + ADP NADP+ -» NAD+ + fosfato

Em E. coli, fosforilação da NAD é conhecida por ser catalisada por uma enzima chamada de NAD quina.se (EC 2.7.1.23), codificada pelo gene nadK (ou yfjB). A NAD quinase utiliza Mg2+ como um cofator de uma reação enzimática e é inibida alostericamente por NADPH e NADH. Sabe-se que o valor de Km para NAD+ é 2000 μM, e que para o ATP ele é 2500 μM (Eur. J. Biochem. , (2001) 268: 43594365).

A desfosforilação da NADP raramente foi estudada, apesar de sua importância crucial na via metabólica. Embora um homólogo da NAD quinase na archaebactéria Methanococcus jannaschii tenha demonstrado ter atividade NADP fosfatase, os genes que codificam a enzima com tal atividade ainda não estão identificados em fontes eucarióticas e de eubactérias. Em E. coli, o produto do gene cysQ apresentou altas atividades de NADP e NADPH fosfatase, porém estudos cinéticos da enzima purificada sugeriram que esta não é a verdadeira NADP fosfatase deste organismo (Biochem J., 402:205 (2007)-218, Biosci. Biotechnol. Biochem., (2008) 72 :919-930) .

Atividades da NAD quinase são encontradas em muitos microrganismos, e o sitio de ligação ao NAD e o sitio ativo da NAD quinase que são importantes para a atividade catalítica mostram sequências de aminoácidos altamente conservadas entre as espécies. Por exemplo, vários microrganismos, incluindo bactérias gram-positivas, apresentam um alto nivel de homologia na previsão da estrutura terciária das hélices, 2, 4 e 5 (cada uma delas é indicada por H2, H4 e H5) (Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) 87:583-593).

O NADP gerado pela NAD quinase por fim fornece um potencial de redução e, em particular, o NADP+/NADPH necessário para produção em massa de produtos úteis em E. coli, é um elemento essencial para reações anabólicas (Biochem J., (2007) 402:205-218). Em E. coli, o NADPH é produzido principalmente pela 1) via oxidativa das pentoses fosfato, 2) isocitrato desidrogenase dependente de NADP do ciclo TCA (gene icdj e 3) trans-hidrogenase (gene pntAB) (J Biol Chem., (2004) 279: 6613-6619).

Estas reações produzem NADPH usando NADP como substrato e, portanto, o nivel de NADPH pode aumentar pelo aumento do nivel intracelular de NADP. Portanto, muitas tentativas foram feitas para aumentar o nivel intracelular de NADP para a produção industrial de vários metabólitos, por exemplo, 1) produção de NADPH e timidina aumentada pela superexpressão de nadK em E. coli (Biotechnol Lett., (2009) 31:19291936), 2) a quantidade de produção de NADPH e PHB (poli-hidroxibutirato) aumentada pela superexpressão de nadK em E. coli (Appl Microbiol Biotechnol., (2009) 83:939947) e 3) produção de lisina aumentada pela superexpressão de Corynebacterium, semelhante à superexpresão de nadK em E. coli. 0 ponto chave em todos os casos acima é aumentar a expressão do gene nadK. No entanto, em cada um desses casos, uma fonte de fosfato, como ATP, também deve ser aumentada a fim de aumentar o potencial de redução através do aumento do nivel de NADPH, resultante do aumento do nivel de NADP causado pela alta expressão da NAD quinase.

O ATP é produzido principalmente por um sistema de transporte de elétrons ou fosforilação a nivel do substrato em microrganismos. 0 ATP produzido é decomposto para fornecer energia às células e reproduzido através de glicólise ou fosforilação oxidativa. Baseando-se neste fato, um estudo da aplicação de um sistema de regeneração de ATP bacteriano em um processo de produção foi feito a fim de fornecer energia durante a produção em massa de produtos úteis (Biosci Biotechnol Biochem., (1997) 61: 840-845) .

No entanto, conforme descrito acima, existem poucos estudos sobre o método de aumentar uma fonte de fosfato, que é necessária para um aumento do potencial de redução pela alta expressão da NAD quinase e um subsequente aumento dos produtos biossintéticos. Além disso, um aumento na oferta de energia através de alta produção de ATP foi meramente estudado em termos de fornecimento de energia para as células, e o uso de ATP como uma fonte de fosfato não foi estudado na técnica relacionada.

Divulgação da Invenção Problema Técnico

Nesse sentido, para o desenvolvimento de microrganismos produtores de alta concentração de L- aminoácidos, os presentes inventores fizeram estudos sobre os genes que estão envolvidos em vários metabolismos de energia e de potencial de redução. Como resultado, descobriu-se que um microrganismo com expressão aumentada de NAD quinase codificado pelo na.dK e a inativação de uma enzima de uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 2 codificada pelo gene tehB é capaz de efetivamente produzir uma alta concentração de L-aminoácidos, e baseando-se nisso, uma fonte de fosfato de ATP pode ser efetivamente aumentada, completando assim, a presente invenção.

Ou seja, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a produção de um aminoácido desejado, aumentando eficientemente o poder redutor em um microrganismo, no qual o ATP a ser reduzido durante o processo biossintético de NADP é adicionalmente fornecido para aumentar o potencial de redução do gênero Escherichia com produtividade de L-aminoácido.

Portanto, um objeto da presente invenção é fornecer um microrganismo do gênero Escherichia, que tem produtividade de L-aminoácido aumentada, em que o microrganismo é transformado para ter atividade NAD quinase aumentada e uma atividade inativada de uma enzima que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 2 codificada pelo gene tehB, desse modo apresentando maior potencial de redução.

Outro objeto da presente invenção é fornecer um método para a produção de L-aminoácidos usando o microrganismo do gênero Escherichia.

Solução para o Problema

Para atingir os objetos acima, a presente invenção fornece um microrganismo do gênero Escherichia com produtividade de L-aminoácido aprimorada em que o microrganismo é transformado para ter uma atividade de NAD quinase aumentada e uma atividade inativada de uma enzima com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 2 codificada pelo gene tehB.

A presente invenção também fornece um método para a produção de L-aminoácidos usando o microrganismo do gênero Escherichia.

Efeitos Vantajosos da Invenção

De acordo com a presente invenção, um suplemento de um agente redutor NADPH no metabolismo energético intracelular de um microrganismo com produtividade de L-aminoácido é criado pelo aumento do NADP e a subsequente falta de ATP é fornecida pela inativação de uma enzima com uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 2 codificada pelo gene tehB, e assim, a produtividade do L-aminoácido pode ser melhorada pelo restabelecimento do equilíbrio do metabolismo energético e a crescente atividade celular, e por uma redução do tempo de cultivo.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 é um diagrama mostrando um vetor nadK- pINT17E para aumentar o número de cópias do gene nadK de E. coli.

Melhor Forma para Realizar a Invenção

A presente invenção fornece um microrganismo com produtividade de L-aminoácido aumentada e um método para a produção de L-aminoácidos usando o mesmo.

O microrganismo produtor de L-aminoácidos da presente invenção compreende qualquer microrganismo procarioto ou eucarioto, e exemplos dos mesmos incluem as cepas de microrganismos pertencentes ao gênero Escherichia, Serratia, Erwinia, Providencia, Corynebacterium e Brevibacterium. 0 microrganismo da presente invenção é, preferencialmente, um microrganismo pertencente ao gênero Escherichia e, mais preferencialmente, E. coli.

Na presente invenção, o L-aminoácido é preferencialmente L-treonina ou L-triptofano.

Na modalidade preferencial da presente invenção, a presente invenção fornece um microrganismo do gênero Escherichia com produtividade de L-aminoácido aprimorada, em que o microrganismo é transformado para ter uma atividade de NAD quinase aumentada e uma atividade inativada de uma enzima que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 2 codificada pelo gene tehB, desse modo apresentando maior potencial de redução.

Na presente invenção, a NAD quinase refere-se a uma enzima com atividade de conversão de NAD (nicotinamida adenina dinucleotideo) em NADP (fosfato de dinucleotideo de nicotinamida e adenina) usando um grupo fosfato derivado de ATP ou outros compostos.

Uma sequência da proteina tendo atividade NAD quinase é especificamente divulgada como uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 4, e o gene nadK que codifica a NAD quinase é preferencialmente um polinucleotideo que tem uma sequência de base da SEQ ID No. 3.

Na presente invenção, o aumento da atividade NAD quinase do gênero Escherichia com produtividade de L- aminoácido pode ser realizado por vários métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o método pode incluir um método de inserção de uma sequência base que codifica a NAD quinase propriamente dita ou um polinucleotideo incluindo uma região reguladora de expressão estrangeira em um cromossomo, um método de aumento do número de cópias pela introdução dela em um sistema vetor ou um método de aumento da atividade enzimática pela substituição da região reguladora da expressão gênica com outra sequência de regulação, modificação de toda ou parte da sequência de regulação da expressão ou mutação do gene em si, mas não está limitado aos mesmos.

Mais preferencialmente, a presente invenção pode usar o método de aumento do número de cópias através da introdução da sequência base que codifica NAD quinase no DNA cromossômico de uma cepa para melhorar a atividade NAD quinase do microrganismo que pertence ao gênero Escherichia que tem produtividade de L-aminoácido.

Será percebido pelas pessoas versadas na técnica que o número de cópias aumento da NAD quinase no DNA cromossômico apresenta o mesmo efeito que o número de cópias aumento de NAD quinase por um vetor extracromossômico, ou como no nivel de expressão aumentado pela modificação da região reguladora de expressão do gene nadK que codifica a NAD quinase e o sitio intra ou extacromossômico ou mutação do gene em si. Se um vetor é usado, o gênero Escherichia com produtividade de L-aminoácido é transformado com o vetor recombinante introduzido da sequência base, deste modo preparando um microrganismo do gênero Escherichia com atividade NAD quinase aumentada.

O vetor a ser utilizado na presente invenção não é particularmente limitado, e qualquer vetor de expressão conhecido pode ser usado. Preferencialmente, o vetor pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322 ou pMW118 pode ser utilizado.

De acordo com uma modalidade da presente invenção, a melhoria da atividade NAD quinase pela transformação aumenta os niveis intracelulares de NADP e NADPH em uma cepa.

Para aumentar a produção de ATP, os presentes inventores também aplicaram um método de inativação da atividade de uma enzima codificada pelo gene tehB.

Na presente invenção, o gene tehB (Gene NCBI ID: 945979) é conhecido como um gene que codifica uma proteina de resistência a telurita ou uma metiltransferase dependente de S-adenosil-L-metionina prevista, mas suas funções ainda permanecem não esclarecidas.

No entanto, estudos recentes relataram que uma eliminação do gene tehB em E. coli apresenta um aumento de 150 % na produção de ATP em comparação com uma cepa de origem, e sugeriram que este resultado é atribuido a uma diminuição do ATP necessário para a biossintese de S- adenosilmetionina a partir da metionina (FEMS Microbiol Lett., (2009) 297:217-224).

Especificamente, uma sequência da metiltransferase dependente de S-adenosil-L-metionina prevista pode ser divulgada por uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 2. Além disso, o gene tehB que codifica a enzima é derivado de E. coli e, preferencialmente, de um polinucleotideo que tem uma sequência base da SEQ ID No. 1.

O método de inativação de uma atividade da enzima codificada pelo gene tehB engloba todos os métodos para modificar o gene correspondente para impedir a produção da enzima codificada pelo gene com a sequência base da SEQ ID No. 1. Os métodos podem ser exemplificados pela eliminação de uma parte ou de todo o gene por recombinação homóloga, supressão da expressão da enzima por inserção de transposon no gene correspondente, supressão da expressão da enzima por inserção dos genes de resistência aos antibióticos ou similares, mas não estão limitados aos mesmos.

Conforme usado neste documento, o termo "transformação" significa um método no qual um gene é introduzido em uma célula hospedeira a ser expressada na célula hospedeira. Os genes transformados, se estiverem no estado de serem expresso na célula hospedeira, compreendem qualquer um dos genes inseridos no cromossomo da célula hospedeira ou posicionados em outras partes do cromossomo.

Além disso, o gene compreende DNA e RNA como um polinucleotideo capaz de codificar um polipeptideo. Desde que o gene possa ser introduzido na célula hospedeira e nela expresso, o gene é introduzido em qualquer tipo. Por exemplo, o gene pode ser introduzido na célula hospedeira no tipo de cassete de expressão que é um expressoma de polinucleotideo que compreende, por si só, elementos para expressar o gene. 0 cassete de expressão compreende um promotor que está operativamente ligado ao gene, sinal de término de transcrição, sitio de ligação ao ribossomo e sinal de terminação de tradução. 0 cassete de expressão pode estar no tipo do vetor de expressão capaz de realizar autoclonagem. O gene também pode ser introduzido na célula hospedeira em si ou estar no tipo de expressoma de polinucleotideo a ser operavelmente conectado à sequência necessária para expressão na célula hospedeira.

Na modalidade preferencial da presente invenção, o microrganismo transformado pelo método pode ser E. coli e, preferencialmente, E. coli CA03-448 (KCCM11167P), CA03-449 (KCCM11168P) ou CA04-2001 (KCCM11166P).

Na modalidade preferencial da presente invenção, a presente invenção fornece o método para produzir L- aminoácidos pelo cultivo do microrganismo recombinante do gênero Escherichia com produtividade aumentada de L- treonina ou L-triptofano em um meio que compreende sacarose ou glicose como a fonte de carbono principal.

Especificamente, a presente invenção fornece um método para a produção de L-aminoácidos que compreende as etapas de inocular e cultivar o microrganismo recombinante do gênero Escherichia em um meio de cultura que contém totalmente ou parcialmente sacarose ou glicose como fonte de carbono; e separar os L-aminoácidos do meio de cultura.

Os procedimentos de cultivo da presente invenção podem ser realizados em meios adequados e em condições de cultura conhecidas na técnica. De acordo com as cepas utilizadas, os procedimentos de cultivo podem ser prontamente ajustados pelas pessoas versadas na técnica. Exemplos dos procedimentos de cultivo incluem os meios de cultivo em lote, continuo e de lote alimentado, mas não estão limitados aos mesmos. Os meios utilizados no método de cultura devem preferencialmente atender aos requisitos de uma cepa especifica.

O meio utilizado na presente invenção contém sacarose ou glicose como fonte principal de carbono. E melaço contendo uma alta concentração de sacarose também pode ser usado como uma fonte de carbono, e o meio pode conter uma quantidade adequada de diferentes fontes de carbono sem limitação. Exemplos de uma fonte de nitrogênio capaz de ser usada incluem uma fonte de nitrogênio orgânico como peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, milhocina e farelo de soja, e uma fonte de nitrogênio inorgânico como ureia, sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, carbonato de amónio e nitrato de amónio, e podem ser usadas isoladamente ou em qualquer combinação das mesmas. Ao meio, fontes de fósforo como di-hidrogenofosfato de potássio, hidroenofosfato dipotássico ou sais contendo sódio correspondente podem ser adicionados. Além disso, o meio pode conter sais metálicos tais como sulfato de magnésio e sulfato ferroso. Além disso, o meio pode ser suplementado com aminoácidos, vitaminas e precursores apropriados. Estes meios ou precursores podem ser adicionados às culturas por um método tipo lote ou tipo continuo.

Durante o cultivo, compostos como hidróxido de amónio, hidróxido de potássio, amónia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico podem ser adicionados adequadamente a fim de ajustar o pH das culturas. Além disso, durante a cultura, agentes de eliminação de espuma como éster poliglicólico de ácido graxo pode ser corretamente adicionado a fim de reduzir a formação de espumas nas culturas. Para manter as culturas nos estados aeróbicos, oxigênio ou gás contendo oxigênio pode ser injetado nas culturas. Para manter as culturas nos estados anaeróbico e microaeróbico, nenhum gás pode ser injetado ou gás nitrogênio, hidrogênio ou dióxido de carbono podem ser injetados nas culturas.

As culturas são mantidas a 27 a 37 °C e, preferencialmente, de 30 a 35 °C. O cultivo pode ser continuado até à obtenção de uma quantidade desejada do material desejado, e preferencialmente, durante 10 a 100 horas.

O método de coleta e recuperação dos aminoácidos produzidos na etapa de cultivo da presente invenção pode ser realizado por um método adequado conhecido na técnica, dependendo dos procedimentos de cultivo, por exemplo, tipo batelada, tipo continuo ou tipo batelada alimentada, a fim de coletar o aminoácido desejado do meio de cultura.

Modo para a Invenção

Doravante, a presente invenção será descrita detalhadamente com referência aos Exemplos. No entanto, estes exemplos são apenas para fins ilustrativos, e a invenção não se destina a ser limitada por esses Exemplos.

Exemplo 1: Preparação de cepa produtora de L-treonina com inativação da enzima codificada pelo gene tehB derivado de E. coli

O gene tehB de uma cepa produtora de L-treonina, E. coli KCCM10541 (patente coreana No. 10-0576342) foi eliminado por recombinação homóloga.

A E. coli KCCM10541 é uma cepa derivada de uma cepa produtora de L-treonina, E. coli KFCC10718 (Publicação de Patente Coreana No. 10-1992-0008365) e sua cepa de origem, E. coli KFCC 10718 tem uma resistência a um análogo de L- metionina, um fenótipo auxotrófico de metionina, uma resistência a um análogo de L-treonina, um fenótipo auxotrófico de isoleucina leaky, resistência a um análogo de L-lisina e uma resistência ao ácido a-aminobutirico, e é capaz de produzir L-treonina.

O gene tehB (Gene NCBI ID: 945979) a ser excluido é conhecido por codificar uma metiltransferase dependente de S-adenosil-L-metionina prevista. Quando o gene é eliminado, o ATP usado na produção de S-adenosilmetionina não é necessário, e deste modo, o gene tehB foi selecionado como um gene alvo para redução do consumo de energia, e ele tem uma sequência base de SEQ ID No. 1.

Para inativação, a inativação em uma etapa, que é uma técnica para construir um mutante usando lambda red recombinase desenvolvida por Datsenko KA et al. (Proc Natl Acad Sei USA., (2000) 97:6640 6645), foi utilizada.

Para confirmar a inserção no gene, um gene de resistência ao cloranfenicol foi usado como um marcador. Para a remoção do gene de resistência ao cloranfenicol, um sistema de recombinação sitio-especifico Cre/loxP foi usado (BMC Biotechnology (2001) 1:7).

A reação em cadeia da polimerase (doravante conhecida como "PCR") foi realizada pelo uso e um vetor pMloxCm como um molde e o iniciador 1 e o iniciador 2 a seguir com uma parte do gene tehB e uma parte da sequência do gene de resistência ao cloranfenicol sob as condições: 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, recozimento a 55 °C durante 30 segundos e alongamento a 72 °C durante 1 minuto, resultando na amplificação de um fragmento do gene de cerca de 1200 bp.

Além disso, o fragmento de DNA obtido pela amplificação por PCR foi submetido a eletroforese em gel de agarose 0,8 % e, em seguida, eluido e usado como molde para o PCR secundário. O PCR secundário foi realizado usando o produto de PCR primário eluido como um molde e o iniciador 3 e o iniciador 4 a seguir, com 20 pb de uma sequência complementar às regiões 5' e 3' do fragmento de DNA primário e tendo ainda as regiões 5' e 3' do gene tehB sob as condições: 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, recozimento a 55 °C durante 30 segundos e alongamento a 72 °C durante 1 minuto, resultando na amplificação de um fragmento de gene de cerca de 1300 bp. O fragmento de DNA obtido pelo procedimento acima foi submetido a eletroforese em um gel de agarose 0,8 % e, em seguida, eluido e utilizado na recombinação.

E. coli KCCM 10541 com produtividade de treonina, que foi transformada com um plasmideo pKD4 6 de acordo com o método desenvolvido por Datsenko KA et al. Proc. Natl. Acad. Sci.(2000) 97:6640-6645, No. GenBank AYO48746), foi preparada como uma cepa competente, e a transformação foi realizada através da introdução do fragmento do gene de 1300 bp obtido por PCR. As cepas obtidas foram selecionadas em meio LB suplementado com cloranfenicol. Uma eliminação do gene tehB foi confirmada por um produto PCR de cerca de 2000 bp obtido por PCR usando o iniciador 5 e o iniciador 6 a seguir.

Após a remoção do plasmideo pKD4 6, a cepa de E. coli primária recombinante com resistência ao cloranfenicol foi introduzida com um plasmideo pJW168 a fim de remover o gene marcador de cloranfenicol da cepa (Gene, (2000) 247, 255264) . PCR foi realizado utilizando os iniciadores 5 e 6 para obter um produto de PCR de 832 bp, indicando que a cepa finalmente obtida teve a eliminação tencionada.

Exemplo 2: Construção do vetor para aumentar o número de cópias do gene nadK de E. coli no cromossomo

O gene nadK foi amplificado por PCR usando o cromossomo da cepa de E. coli W3110 (número de registro GeneBank: AC000091) comprado junto à Coleção Americana de Cultura de Células (ATCC) como modelo.

Especificamente, a PCR foi realizada usando os seguintes iniciadores 7 e 8 sob as seguintes condições: 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, recozimento a 55 °C durante 30 segundos e alongamento a 72 °C durante 1 minuto, resultando na amplificação de um fragmento de gene de 1407 pb (SEQ ID NO. 5).

A sequência amplificada contém a sequência codificadora de nadK, bem como 501 bp da região autopromotora prevista. Além disso, o iniciador 7 tem um sitio de reconhecimento de enzima de restrição para EcoR I, e o iniciado 8 tem um sitio de reconhecimento de enzima de restrição para Xba I.

O polinucleotideo obtido foi tratado com as enzimas de restrição Xba I e EcoR I, e foi clonado nos sitios Xba I e EcoR I do vetor pINT17E, seguido por transformação em E. coli BW25113. Em seguida, as células foram espalhadas em meio sólido LB Cm (placa de ágar LB + cloranfenicol) . Os vetores clonados foram obtidos a partir das colônias usando procedimentos padrão miniprep, e designados como nadK_pINT17E. O diagrama do vetor é mostrado na Figura 1.

Exemplo 3: Preparação de cepa produtora de L-treonina com inativação da enzima codificada pelo gene tehB derivado de E. coli e atividade NAD quinase aumentada pelo aumento de seu número de cópias no cromossomo

A cepa sem o gene tehB preparada de acordo com o método descrito no Exemplo 1 e o vetor nadK_pINT17E preparado de acordo com o método descrito no Exemplo 2 foram usados para aumentar o número de cópias da NAD quinase.

Primeiro, o plasmideo pKD46 foi introduzido na cepa sem o gene tehB preparada de acordo com o método descrito no Exemplo 1, e foi preparada como uma cepa competente, e a cepa foi transformada com o vetor nadK_pINT17E. O cultivo foi realizado a 37 °C durante 1 ~ 2 dias para obter as colônias. A PCR foi realizada utilizando os iniciadores 8 e 9 para confirmar se o gene é inserido no cromossomo das colônias obtidas. A PCR foi realizada sob as seguintes condições: 30 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, recozimento a 55 °C durante 45 segundos e alongamento a 72 °C durante 2 minutos, resultado na amplificação de um fragmento do gene de cerca de 2000 bp.

Depois que o plasmideo pKD4 6 foi removido da cepa recombinante primária com resistência ao cloranfenicol, o plasmideo pJW168 foi introduzido para remover o gene marcador de cloranfenicol da cepa (Gene, (2000) 247, 255264) . PCR foi realizado utilizando os iniciadores 10 e 11 para obter um produto de PCR de cerca de 1500 bp, indicando que duas cópias consecutivas do gene nadK estão desejavelmente presentes no cromossomo.

A E. coli transformada foi designada como KCCM1054IΔtehBnadK 2copy (CA03-448).

Exemplo 4: Preparação de cepa produtora de L- triptofano com inativação da enzima codificada pelo gene tehB derivado de E. coli e atividade NAD quinase aumentada pelo aumento de seu número de cópias no cromossomo

Uma E. coli transformada foi preparada da mesma forma que nos Exemplos 1 a 3, exceto pelo uso de uma cepa produtora de L-triptofano, E. coli KCCM 10812.

A cepa original utilizada neste exemplo, E. coli KCCM 10812P, é uma cepa derivada da E. coli mutante com produtividade de L-fenilalanina (KFCC 10066) e caracterizada pelo fato de que a auxotrofia de triptofano é liberada, os genes pheA, trpR, mtr e tnaAB são inativados e os genes aroG e trpE são modificados no cromossomo (Patente Coreana No. 10-0792095).

A E. coli transformada foi designada como KCCM10812ΔteAB nadK 2copy (CA04-2001).

Exemplo Comparativo 1: Preparação de cepa produtora de L-treonina ou L-triptofano com inativação da enzima codificada pelo gene tehB

A fim de eliminar o gene tehB, a cepa produtora de treonina, E. coli KCCM10541 e a cepa produtora de triptofano, E. coli KCCM10812 foram usadas conforme descrito no Exemplo 1. Uma inativação em uma etapa, que é uma técnica para construir um mutante usando lambda red recombinase desenvolvida por Datsenko KA et al. (Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97: 6640-6645) e o sistema de recombinação sitio especifico Cre/loxP (BMC Biotechnology. (2001) 1:7) foram utilizados.

PCR foi realizada utilizando os iniciadores 5 e 6 para obter os produtos de PCR de 832 bp, indicando que as cepas finalmente obtidas tinham a eliminação pretendida, e as cepas foram designadas como KCCM10541ΔtehB e KCCM10812PΔtehB, respectivamente.

Exemplo Comparativo 2: Preparação da cepa produtora de L-treonina ou L-triptofano com atividade NAD quinase aumentada

De acordo com o método descrito no Exemplo 3, o número de cópias do gene nadK aumentou para duas cópias no cromossomo de cepas produtoras de treonina e triptofano a fim de preparar as cepas com atividade NAD quinase aumentada.

O plasmideo pKD46 foi introduzido na cepa produtora de treonina, KCCM10541, e a cepa produtora de triptofano, KCCM10812, e preparado como células competentes, e as cepas foram transformadas com o vetor nadK_pINT17E. Posteriormente, o cultivo foi realizado a 37 °C durante 1 a 2 dias para obter colônias. A PCR foi realizada utilizando os iniciadores 8 e 9 para confirmar se o gene é inserido no cromossomo das colônias obtidas.

Depois que o plasmideo pKD4 6 foi removido da cepa recombinante primária com resistência ao cloranfenicol, o plasmideo pJW168 foi introduzido para remover o gene marcador de cloranfenicol da cepa (Gene, (2000) 247, 255264) . PCR foi realizada utilizando os iniciadores 10 e 11 para obter os produtos de PCR de cerca de 1500 bp, indicando que duas cópias consecutivas do gene nadK estão desejavelmente presentes no cromossomo. As cepas preparadas foram designadas como KCCM10541 nadK 2copy e KCCM10812 nadK 2copy, respectivamente.

Exemplo Experimental 1: Titulação da cepa produtora de L-treonina com atividade NAD quinase aumentada e inativação da enzima codificada pelo gene tehB

Primeiramente, para fornecer a cepa produtora de L- treonina com capacidade de assimilação de sacarose, um vetor pAcscBAR' (Publicação de Patente NO. 10-2010-0092765) (SEQ ID NO. 21) foi construído da seguinte forma:

Após a construção de pAcscBAR, o gene mak foi clonado em pAcscBAR. Para a construção de pAcscBAR, os iniciadores 12 e 13 foram utilizados para amplificar um polinucleoideo da região cscB, onde cscK foi removido.

PCR foi realizado sob as seguintes condições: após desnaturação a 94 °C durante 3 minutos, seguido por 25 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, recozimento a 56 °C durante 30 segundos e alongamento a 72 °C durante 1 minuto e 30 segundos e, posteriormente, alongamento a 72 °C durante 7 minutos, resultando na amplificação de um polinucleotideo de 1521 pb. O polinucleotideo e pAcsBAR obtidos foram tratados com as enzimas de restrição EcoRV e EagI, respectivamente, e clonados e transformados em E. coli DH5α. Colônias contendo pAcscBAR foram selecionadas por PCR usando as colônias crescidas em meio LB, e plasmideos foram obtidos utilizando procedimentos de minipreparação de plasmideos padrão. Nenhuma mutação foi confirmada por análise de sequência de cscBAR ligado aos sitios Xbal e EagI do plasmideo pAcscBAR obtido.

Os iniciadores 14 e 15 e o cromossomo de E. coli W3110 como um modelo foram usados para amplificar uma polinucleotideo contendo o gene mak e clonado nos sitios de enzima de restrição, PstI e EagI de pAcscBAR, a fim de construir o vetor pAcscBAR'-mak.

PCR foi realizado sob as seguintes condições: após desnaturação a 94 °C durante 3 minutos, seguido por 25 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 segundos, recozimento a 56 °C durante 30 segundos e alongamento a 72 °C 1 minuto e 30 segundos, e posteriormente, alongamento a 72 °C durante 7 minutos, resultando na amplificação de um polinucleotideo de 1388 pb. O polinucleotideo e pAcsBAR obtidos foram tratados com as enzimas de restrição PstI e EagI, respectivamente, e clonados e transformados em E. coli DH5ot. Colônias contendo pAcscBAR' -mak foram selecionadas por PCR usando as colônias crescidas em meio LB, e plasmideos foram obtidos utilizando procedimentos de minipreparação de plasmideos padrão. Nenhuma mutação foi confirmada por análise de sequência de cscBAR-mak ligado aos sitios Xbal e EagI do plasmideo pAcscBAR'-mak obtido.

O pAcscBAR'-mak construído foi introduzido na cepa KCCM10541ΔtehB nadK 2copy de E. coli recombinante do Exemplo 3, a cepa de origem E. coli KCCM10541, e a cepa KCCM10541 sem o gene tehB (designada como KCCM1054lΔtehB) e a cepa KCCM10541, tendo número de cópias aumentado do gene nadK (designado como KCCM10541 nadK 2copy), preparada nos Exemplos Comparativos 1 e 2, respectivamente e, em seguida, titulação foi realizada.

Cada uma das cepas com características genéticas diferentes foi cultivada em meios sólidos LB em uma incubadora a 33 °C de um dia para o outro. Depois disso, 1 alça de platina da mesma foi inoculada a 25 mL de meio de titulo contendo sacarose, conforme mostrado na Tabela 9 a seguir, e cultivada na incubadora a 33 °C e 200 rpm durante 48 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 10. Todos os resultados foram representados pelo valor médio obtido a partir de três frascos.

* valor medido de 24 h ** valor medido de 48 h

Como mostrado na Tabela 10, quando apenas o gene tehB foi eliminado, a capacidade de assimilação de sacarose foi semelhante à da cepa original. No entanto, quando a atividade da NAD quinase foi reforçada, a capacidade de assimilação de sacarose foi aumentada até cerca de 2 g em comparação com a cepa original.

Além disso, quando o gene tehB foi eliminado, a densidade celular foi reduzida até cerca de 6 o <5 em comparação com a cepa original, mas a sua produtividade de treonina foi semelhante à da cepa original. No entanto, quando as duas mutações foram introduzidas ao mesmo tempo, a densidade celular foi reduzida até cerca de 8 %, a capacidade de assimilação de sacarose aumentou para cerca de 8 % e a produtividade de treonina também aumentou para 9 % em comparação com a cepa original.

Além disso, a cepa de E. coli KCCM10541ΔtehB nadK 2copy recombinante do Exemplo 3, a cepa de E. coli KCCM10541 original e a cepa KCCM10541ΔtehB e a cepa KCCM10541 nadK 2copy preparada nos Exemplos Comparativos 1 e 2 foram testadas por titulação usando glicose como fonte de carbono. Cada uma das cepas com características genéticas diferentes foi cultivada em meios sólidos LB em uma incubadora a 33 °C de um dia para o outro. Depois disso, 1 alça de platina da mesma foi inoculada a 25 mL de meio de titulo contendo glicose, conforme mostrado na Tabela 11 a seguir, e cultivada na incubadora a 33 °C e 200 rpm durante 48 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 12. Todos os resultados foram representados pelo valor médio obtido a partir de três frascos.

* valor medido de 24 h ** valor medido de 48 h

A cepa de KCCM10541 ΔtehB nadK 2copy, a E. coli produtora de L-treonina com gene tehB eliminado e a atividade NAD quinase aumentada com capacidade deassimilação de glicose foi designada como CA03-448, e a cepa de KCCM10541 ΔtehB nadJQcopy/pAcscBAR' -mak, a cepa de KCCM10541 ΔtehB nadK 2copy fornecida com capacidade de assimilar sacarose, foi designada como CA03-449. E elas foram depositadas na autoridade depositária internacional, centro de cultura de microrganismos coreano, que é a coleção de cultura subsidiária da Korean Federation of Culture Collections (localizada em 361-221, Hongje-l-dong, Seodaemon-gu, Seul, Coreia) em 10 de janeiro de 2011, e receberam os números de depósito KCCM11167P e KCCM11168P,respectivamente.

Exemplo Experimental 2:Titulação da cepa produtora de L-triptofano com atividade NAD quinase aumentada e inativação da enzima codificada pelo gene tehB

A cepa de E. coli recombinante KCCM10812ΔtehB nadK 2copy do Exemplo 4, a cepa de E. coli KCCM10812 original e a cepa KCCM10812ΔtehB e a cepa KCCM10812 nadK 2copy preparadas nos Exemplos Comparativos 1 e 2 foram testadas 5 por titulação usando glicose como fonte de carbono.

Para a titulação, 1 alça de platina da cepa foi inoculada e cultivada em meios sólidos LB de um dia para o outro. Depois disso, 1 alça de platina da mesma foi inoculada em 25 mL de meio de titulo do frasco com a 10 composição da Tabela 13 a seguir e, em seguida, cultivada a 37 °C e 200 rpm durante 48 horas. Os resultados são mostrados na Tabela 14. Todos os resultados foram representados pelo valor médio obtido a partir de três frascos.

1 valor medido de 33 h 2 * valor medido de 48 h

Como mostrado na Tabela 14, quando o gene tehB foi eliminado, a densidade celular aumentou até cerca de 10 % em comparação com a cepa original. Quando a atividade NAD quinase foi aumentada, a capacidade de assimilação de glicose melhorou mas não houve diferença na produtividade de triptofano em comparação com a cepa original.

No entanto, quando as duas mutações foram introduzidas ao mesmo tempo, a densidade celular aumentou, a capacidade de assimilação de glicose também aumentou a produtividade de triptofano aumentou até cerca de 14 %.

A cepa de KCCM10812P ΔtehB nadK 2copy, a E. coli produtora de L-triptofano com gene tehB eliminado e atividade NAD quinase aumentada foi designada como CAO4- 2001, e ela foi depositada na autoridade depositária internacional, centro de cultura de microrganismos coreano, que é a coleção de cultura subsidiária da Korean Federation of Culture Collections (localizada em 361-221, Hongje-1- dong, Seodaemon-gu, Seul, Coreia) em 10 de janeiro de 2011, e recebeu o número de registro KCCM11166P.

Será evidente pelas pessoas versadas na técnica que várias modificações e alterações podem ser feitas sem se afastar do escopo e do espirito da invenção. Portanto, deve ser compreendido que a modalidade acima não é limitativa, 5 mas sim ilustrativa em todos os aspectos. 0 escopo da invenção é definido pelas reivindicações em anexo ao invés de pela descrição que as precede, e, portanto, todas as alterações e modificações que se enquadram nas áreas e limites das reivindicações ou equivalentes de tais áreas e 10 limites são, portanto, destinadas a serem englobadas pelas reivindicações.

TRATADO DE BUDAPESTE RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DE DEPÓSITO DE MICRORGANISMOS PARA FINS DE PROCEDIMENTO DE PATENTES FORMULÁRIO INTERNACIONAL

Para: CJ Cheiljedang Corporation 500-5 GA Namdaemum-RO, Chung-ku, Seoul, República da Coréia Recibo no caso de um original - Emitido de acordo com a Norma 7.1 pela Autoridade Depositária Internacional, identificada ao pé da folha. I. Identificação do microrganismo: Referência de identificação fornecida pelo depositante: Escherichia coli CA04-2001 Número de acesso fornecido pela Autoridade Depositária Internacional: KCCM11166P II. Descrição Cientifica e/ou designação toxonômica proposta: - descrição cientifica: não marcado - designação taxonômica proposta: não marcado III - Recibo e Aceitação A Autoridade Depositária Internacional aceita o microrganismo identificado no item I acima, tendo sido recebido pela mesma em 10 de janeiro de 2011. (data do depósito original)1 IV. Autoridade Depositária Internacional Denominação: Korean Culture Center of Microorganisms Endereço: 361-221, Yurim B/D Hongje-I-dong, Seodaemum- gu, Seoul, 120-091, República da Coréia. Assinatura - de um representante da Autoridade Depositária Internacional ou oficial autorizado: Consta carimbo - Data: 10 de janeiro de 2011. Constam as letras: KCM Nota de Rodapé: 1 Quando a Norma 6.4(d) for aplicável, tal data será a data na qual o estado da autoridade depositária internacional foi obtido; quando um depósito for feito fora do Tratado de Budapeste, após a aquisição do estado da autoridade depositária internacional, o mesmo será convertido em um depósito de acordo com o Tratado de Budapeste, tal data sendo a data na qual o microrganismo foi recebido pela autoridade depositária internacional.

Para: CJ Cheiljedang Corporation 500-5 GA Namdaemum-RO, Chung-ku, Seoul, República da Coréia Recibo no caso de um original - Emitido de acordo com a Norma 7.1 pela Autoridade Depositária Internacional, identificada ao pé da folha. I. Identificação do microrganismo: Referência de identificação fornecida pelo depositante: Escherichia coli CA03-448 Número de acesso fornecido pela Autoridade Depositária Internacional: KCCM11167P II. Descrição Cientifica e/ou designação toxonômica proposta: - descrição cientifica: não marcado - designação taxonômica proposta: não marcado III - Recibo e Aceitação A Autoridade Depositária Internacional aceita o microrganismo identificado no item I acima, tendo sido recebido pela mesma em 10 de janeiro de 2011. (data do depósito original)! IV. Autoridade Depositária Internacional Denominação: Korean Culture Center of Microorganisms Endereço: 361-221, Yurim B/D Hongje-I-dong, Seodaemum- gu, Seoul, 120-091, República da Coréia. Assinatura de um representante da Autoridade Depositária Internacional ou oficial autorizado: Consta carimbo - Data: 10 de janeiro de 2011. Constam as letras: KCM Nota de Rodapé: 1 Quando a Norma 6.4(d) for aplicável, tal data será a data na qual o estado da autoridade depositária internacional foi obtido; quando um depósito for feito fora do Tratado de Budapeste, após a aquisição do estado da autoridade depositária internacional, o mesmo será convertido em um depósito de acordo com o Tratado de Budapeste, tal data sendo a data na qual o microrganismo foi recebido pela autoridade depositária internacional.

Para: CJ Cheiljedang Corporation 500-5 GA Namdaemum-RO, Chung-ku, Seoul, República da Coréia Recibo no caso de urn original - Emitido de acordo com a Norma 7.1 pela Autoridade Depositária Internacional, identificada ao pé da folha. I. Identificação do microrganismo: Referência de identificação fornecida pelo depositante: Escherichia coli CA03-449 Número de acesso fornecido pela Autoridade Depositária Internacional: KCCM11168P II. Descrição Cientifica e/ou designação toxonômica proposta: - descrição cientifica: não marcado - designação taxonômica proposta: não marcado III - Recibo e Aceitação A Autoridade Depositária Internacional aceita o microrganismo identificado no item I acima, tendo sido recebido pela mesma em 10 de janeiro de 2011. (data do depósito original)1 IV. Autoridade Depositária Internacional Denominação: Korean Culture Center of Microorganisms

Endereço: 361-221, Yurim B/D Hongje-I-dong, Seodaemum- gu, Seoul, 120-091, República da Coréia.

Assinatura de um representante da Autoridade Depositária Internacional ou oficial autorizado: Consta carimbo - Data: 10 de janeiro de 2011. Constam as letras: KCM Nota de Rodapé: 1 Quando a Norma 6.4(d) for aplicável, tal data será a data na qual o estado da autoridade depositária internacional foi obtido; quando um depósito for feito fora do Tratado de Budapeste, após a aquisição do estado da 5 autoridade depositária internacional, o mesmo será convertido em um depósito de acordo com o Tratado de Budapeste, tal data sendo a data na qual o microrganismo foi recebido pela autoridade depositária internacional.

Claims

1. Microorganismo recombinante do gênero Escherichia tendo produtividade de L-aminoácido aprimorada, CARACTERIZADO pelo fato de que uma atividade NAD quinase é aumentada e uma atividade de uma enzima que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 2 codificada pelo gene tehB é inativada.

2. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a NAD quinase é uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos da SEQ ID No. 4.

3. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a atividade NAD quinase é aumentada por um ou mais métodos de aumento do número de cópia por inserção cromossômica ou introdução, substituição ou modificação de vetor da região reguladora de expressão, e mutação genética.

4. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a inativação é realizada por um ou mais métodos de eliminação de uma parte ou de todo o gene por recombinação homóloga, supressão da expressão enzimática por inserção de transposon no gene correspondente e supressão da expressão enzimática por inserção de genes de resistência aos antibióticos.

5. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorganismo do gênero Escherichia é E. coli.

6. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o L-aminoácido é L-treonina ou L-triptofano.

7. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorganismo do gênero Escherichia é fornecido com capacidade de assimilação de sacarose.

8. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorganismo do gênero Escherichia é uma E. coli produtora de L-treonina, CA03-448 com número de depósito KCCM11167P ou CA03-449, com número de depósito KCCM11168P.

9. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorganismo do gênero Escherichia é uma E. coli produtora de L-triptofano, CAO4- 2001, com número de depósito KCCM11166P.

10. Método de produção de L-aminoácidos, CARACTERIZADO pelo fato de compreender as etapas de inocular e cultivar o microorganismo do gênero Escherichia conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 em um meio de cultura que contém totalmente ou parcialmente sacarose ou glicose como fonte de carbono; e separar o L-aminoácido do meio de cultura.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o L-amino é L-treonina ou L- triptofano.