JP2014504876A

JP2014504876A - Ｌ−アミノ酸の生産能が向上した微生物、及びそれを用いてｌ−アミノ酸を生産する方法

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Publication number: JP2014504876A
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Inventors: ホリー、カン; チュルリー、クン; ミュンリー、ソク; ビンホワン、ヤン
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Abstract

本発明は、ＮＡＤキナーゼの活性が強化され、ｔｅｈＢ遺伝子によりコードされる配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素の活性が不活性化されるように形質転換された、Ｌ−アミノ酸の生産能が向上したエシェリキア属微生物、及び前記エシェリキア属微生物を用いてＬ−アミノ酸を生産する方法を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、還元力の増加により細胞活性が改善され、菌体培養時間の短縮により有用アミノ酸の生産効率が向上した微生物、及びそれを用いたＬ−アミノ酸の生産方法に関する。

発酵により有用産物を生産する微生物は、それらの生合成経路の強化において、ＡＴＰ（Adenosine 5'-triphosphate）エネルギーやＮＡＤＰＨ（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phospate）などの還元剤が大きく求められることが知られている。

微生物の代謝過程において、異化反応（catabolic reaction）で用いられるＮＡＤＨ（nicotinamide adenine dinucleotide）と同化反応（anabolic reaction）で用いられるＮＡＤＰＨ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）の細胞内のバランスが非常に重要であることが知られている。そのバランスは、次の反応式に示すＮＡＤのリン酸化又はＮＡＤＰ脱リン酸化反応により調節される。
ＮＡＤ^＋＋ＡＴＰ→ＮＡＤＰ^＋＋ＡＤＰ
ＮＡＤＰ^＋→ＮＡＤ^＋＋リン酸塩

大腸菌において、ＮＡＤのリン酸化はｎａｄＫ（又はｙｆｊＢ）遺伝子によりコードされるＮＡＤキナーゼ（NAD kinase）（EC 2.7.1.23）という酵素により行われることが知られている。ＮＡＤキナーゼは、酵素反応の補助因子（cofactor）としてＭｇ^２＋を用い、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨによりアロステリックに（allosterically）抑制される。ＮＡＤ^＋に対するＫ_ｍ値は２０００μＭであり、ＡＴＰに対するＫ_ｍ値は２５００μＭであることが知られている（非特許文献１）。

ＮＡＤＰ脱リン酸化反応は、代謝経路における核心的な重要性にもかかわらず、ほとんど研究されていない。古細菌であるメタノコッカスジャンナスキー（Methanococcus jannaschii）のＮＡＤキナーゼの類似体（homolog）がＮＡＤＰ脱リン酸化酵素（phosphatase）活性を有するという報告はされているが、そのような活性を有する酵素をコードする遺伝子は真核生物（eukaryote）や真正細菌（eubacteria）においていまだ明らかにされていない。大腸菌においてｃｙｓＱ遺伝子が高いＮＡＤＰ及びＮＡＤＰＨ脱リン酸化酵素活性を示すことはあるが、精製された酵素を用いて行われた反応速度（kinetic）研究において、これらの生物体は真のＮＡＤＰ脱リン酸化酵素でないことが判明した（非特許文献２，非特許文献３）。

ＮＡＤキナーゼの活性は様々な微生物で見出されており、触媒活性のための重要な部位であるＮＡＤ結合部位及びＮＡＤキナーゼの活性部位は、種間で非常に保存性の高いアミノ酸配列を示す。一例として、グラム陽性菌を含む様々な微生物においても、立体構造予測で２番、４番、５番のヘリックス（Helix）（それぞれＨ２、Ｈ４、Ｈ５と表示）は高レベルの相同性（homology）を有することが知られている（非特許文献４）。

ＮＡＤキナーゼにより生産されたＮＡＤＰは最終的に還元力を供給し、特に大腸菌内で有用産物を大量生産するのに必要なＮＡＤＰ^＋／ＮＡＤＰＨは同化反応に必要不可欠な要素である（非特許文献２）。大腸菌において、ＮＡＤＰＨは、１）酸化的ペントースリン酸経路（oxidative pentose phosphate pathway）、２）ＴＣＡ経路のＮＡＤＰ依存性イソクエン酸脱水素酵素（NADP-dependent isocitrate dehydrogenase；Ｉｃｄ遺伝子）、及び３）トランスヒドロゲナーゼ（Transhydrogenase；ｐｎｔＡＢ遺伝子）により主に生産される（非特許文献５）。

これらの反応は、ＮＡＤＰを基質としてＮＡＤＰＨを生産するので、ＮＡＤＰの細胞内の濃度を増加させることにより、ＮＡＤＰＨの濃度を高めることができる。よって、様々な代謝産物の産業的生産のためにＮＡＤＰの細胞内の濃度増加が試みられているが、例えば、１）大腸菌におけるｎａｄＫの過剰発現によるＮＡＤＰＨの増加及びチミジン（thymidine）の生産性向上（非特許文献６）、２）大腸菌におけるｎａｄＫの過剰発現によるＮＡＤＰＨの増加及びＰＨＢ（polyhydroxybutyrate）の生産性向上（非特許文献７）、３）大腸菌におけるｎａｄＫの過剰発現と同様に、コリネ型細菌におけるｐｐｎＫ遺伝子の発現増加によるリジン（lysine）の生産性向上（非特許文献４）などがある。前述した全ての場合において、ｎａｄＫ遺伝子の発現を増加させることが技術の核心となっている。しかし、これらの各場合において、ＮＡＤキナーゼの高発現によりＮＡＤＰのレベルを増加させ、究極的にＮＡＤＰＨの増加により還元力を増加させるには、ＡＴＰなどのリン酸供給源を共に増加しなければならない。

ＡＴＰは、微生物内部で電子伝達系（electron transport system）又は基質レベルのリン酸化（substrate level phosphorylation）により主に生産される。生産されたＡＴＰは、細胞にエネルギーを供給するために分解され、解糖（glycolysis）や酸化的リン酸化（oxidative phosphorylation）により再生産される。これらの事実に基づいて、有用産物の大量生産中にエネルギーを供給するために、バクテリア内部のＡＴＰ再生過程を生産工程に適用する研究も行われてきた（非特許文献８）。

しかし、前述したように、ＮＡＤキナーゼの発現増加と、それに伴う生合成産物の増加による還元力の増加に必須のリン酸供給源を増やす方法に関する研究はいまだ十分でない。また、ＡＴＰの生産によるエネルギー供給の増加も単に細胞にエネルギーを供給するという観点でアプローチされているだけであり、ＡＴＰのリン酸供給源としての活用も当業界でほとんど行われていない状況である。

韓国登録特許第１０−０５７６３４２号公報韓国公開特許第１０−１９９２−０００８３６５号公報韓国登録特許第１０−０７９２０９５号公報韓国公開特許第１０−２０１０−００９２７６５号公報

Eur. J. Biochem., (2001) 268: 4359-4365 Biochem J., (2007) 402: 205-218 Biosci. Biotechnol. Biochem., (2008) 72: 919-930 Appl Microbiol Biotechnol (2010) 87: 583-593 J Biol Chem., (2004) 279: 6613-6619 Biotechnol Lett., (2009) 31: 1929-1936 Appl Microbiol Biotechnol., (2009) 83: 939-947 Biosci Biotechnol Biochem., (1997) 61: 840-845 FEMS Microbiol Lett., (2009) 297: 217-224 Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97: 6640-6645 Gene, (2000) 247, 255-264 BMC Biotechnology (2001) 1: 7

よって、Ｌ−アミノ酸を高濃度で生産する微生物を開発するために、本発明者らは様々なエネルギー及び還元力代謝に関与する遺伝子を対象に研究を行った。その結果、本発明者らは、ｎａｄＫによりコードされるＮＡＤキナーゼの発現が強化され、ｔｅｈＢ遺伝子によりコードされる配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素の活性が不活性化された微生物が高濃度のＬ−アミノ酸を効果的に生産することを確認し、これらの事実に基づいてリン酸供給源であるＡＴＰを効果的に増加させることにより、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリキア属（genus Escherichia）微生物の還元力を増加させるために、ＮＡＤＰを生合成する過程で減少するＡＴＰを追加供給することにより、微生物内の還元力を効率的に増加させて目的とするアミノ酸の生産を増加させる方法に関する。

よって、本発明は、ＮＡＤキナーゼの活性を強化し、ｔｅｈＢ遺伝子によりコードされる配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素の活性を不活性化することにより、細胞内還元力が強化されるように形質転換されてＬ−アミノ酸の生産性が向上したエシェリキア属微生物を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記エシェリキア属微生物を用いてＬ−アミノ酸を生産する方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は、ＮＡＤキナーゼの活性が強化され、ｔｅｈＢ遺伝子によりコードされる配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素の活性が不活性化されるように形質転換された、Ｌ−アミノ酸の生産性が向上したエシェリキア属微生物を提供する。

また、本発明は、前記エシェリキア属微生物を用いてＬ−アミノ酸を生産する方法を提供する。

本発明によれば、Ｌ−アミノ酸生産能を有する微生物の細胞内エネルギー代謝における還元剤であるＮＡＤＰＨの補充はＮＡＤＰの強化により発生し、これに伴うＡＴＰの不足はｔｅｈＢ遺伝子によりコードされる配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素の活性を不活性化することにより補充され、エネルギー代謝のバランス回復、細胞活性の増加、培養時間の短縮により、Ｌ−アミノ酸の生産性が向上する。

大腸菌のｎａｄＫ遺伝子のコピー数を増加させるベクターｎａｄＫ−ｐＩＮＴ１７Ｅを示す図である。

本発明は、Ｌ−アミノ酸の生産能が向上した微生物、及びそれを用いてＬ−アミノ酸を生産する方法を提供する。

本発明において、Ｌ−アミノ酸を生産する微生物は、原核微生物か真核微生物であればいかなるものであってもよく、例えば、エシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物菌株が含まれる。本発明の微生物は、エシェリキア属に属する微生物が好ましく、大腸菌がより好ましい。

本発明において、前記Ｌ−アミノ酸はＬ−トレオニン又はＬ−トリプトファンであることが好ましい。

本発明の好ましい実施形態において、本発明は、ＮＡＤキナーゼの活性が強化され、ｔｅｈＢ遺伝子によりコードされる配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素の活性が不活性化されるように形質転換することにより、細胞内還元力が強化されてＬ−アミノ酸生産能が向上したエシェリキア属微生物を提供する。

本発明において、前記ＮＡＤキナーゼ（NAD Kinase）とは、ＡＴＰ又は他の化合物に由来するリン酸基を用いてＮＡＤ（nicotinamide adenine dinucleotide）をＮＡＤＰ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）にする活性を有する酵素をいう。

ＮＡＤキナーゼの活性を有するタンパク質の配列は、具体的には配列番号４のアミノ酸配列で示され、前記ＮＡＤキナーゼをコードするｎａｄＫ遺伝子は、配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチドであることが好ましい。

本発明において、Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリキア属微生物のＮＡＤキナーゼの活性を強化する方法には、当該分野で周知の様々な方法を適用することができる。例えば、前記方法には、ＮＡＤキナーゼをコードする塩基配列とそれ自体の又は外部から導入された発現調節部位を含むポリヌクレオチドを染色体に追加挿入する方法、ベクターシステムに導入することによりコピー数を増加させる方法、遺伝子の発現を調節する発現調節部位の他の調節配列への置換、発現調節部位の塩基配列全体又は一部の突然変異が誘発された変形、遺伝子自体の変異導入による酵素活性強化などによる方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明は、Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリキア属微生物のＮＡＤキナーゼの活性を強化するために、ＮＡＤキナーゼをコードする塩基配列を菌体の染色体ＤＮＡに導入することによりコピー数を増加させる方法を用いることがより好ましい。

当業者であれば、染色体ＤＮＡ内部のＮＡＤキナーゼの増加したコピー数は、染色体外部ベクターによるＮＡＤキナーゼの増加したコピー数と、又は染色体内外部でＮＡＤキナーゼをコードするｎａｄＫ遺伝子の発現調節部位の変形もしくは遺伝子自体の変異による増加した発現レベルと同じ効果を奏するものと予測することができる。ベクターを用いる場合、Ｌ−アミノ酸生産能を有するエシェリキア属微生物が塩基配列を導入した組換えベクターに形質転換されることにより、ＮＡＤキナーゼの活性が強化されたエシェリキア属微生物が製造される。

本発明に用いることのできるベクターは特に限定されるものではなく、公知の発現ベクターを用いることができる。ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８ベクターなどを用いることが好ましい。

本発明の一実施形態によれば、形質転換によるＮＡＤキナーゼの活性の強化は、菌株の細胞内ＮＡＤＰ及びＮＡＤＰＨの濃度を増加させる。

また、本発明者らは、ＡＴＰの生産性を向上させるために、ｔｅｈＢ遺伝子によりコードされる酵素の活性を不活性化する方法を適用した。

本発明において、前記ｔｅｈＢ遺伝子（NCBI Gene ID: 945979）は、テルライト耐性タンパク質（tellurite resistance protein）、又はＳ−アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼと推定される酵素（predicted S-adenosyl-L-methioninedependent methyltransferase）をコードする遺伝子として知られているが、正確な機能はいまだ明らかにされていない。

しかし、最近の文献によれば、大腸菌のｔｅｈＢ遺伝子を欠失させた場合、ＡＴＰの生産量が母菌株と比較して１５０％向上したことを示す研究結果があり、これらの結果はメチオニンからＳ−アデノシルメチオニン（S-adenosyl methionine）を生合成する際に必要なＡＴＰの需要減少によるものであるものと考えられている（非特許文献９）。

具体的には、Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼと推定される酵素の配列は、配列番号２のアミノ酸配列で示される。また、前記酵素をコードするｔｅｈＢ遺伝子は、大腸菌に由来するものであり、配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドであることが好ましい。

前記ｔｅｈＢ遺伝子によりコードされる酵素の活性を不活性化する方法は、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子によりコードされる酵素が生成されないように該当遺伝子を変形させる方法を全て包括するものである。前記方法には、相同組換えによる遺伝子の一部又は全体欠失、該当遺伝子内部へのトランスポゾン（transposon）の挿入による酵素発現抑制、抗生物質耐性遺伝子の挿入による酵素発現抑制などがあるが、これらに限定されるものではない。

本願における「形質転換」という用語は、遺伝子を宿主細胞内に導入して宿主細胞内で発現させることを意味する。形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入された遺伝子や染色体の他の部分に位置する遺伝子などを全て含むものである。また、前記遺伝子は、ポリペプチドをコードすることのできるポリヌクレオチドとして、ＤＮＡやＲＮＡを含むものである。前記遺伝子は、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記遺伝子は、自ら発現する上で必要な全ての要素を含むポリヌクレオチド構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入される。通常、前記発現カセットは、前記遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記遺伝子は、それ自体又はポリヌクレオチド構造体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよい。

本発明の好ましい実施形態において、前記方法により形質転換された微生物は、大腸菌であってもよく、大腸菌ＣＡ０３−４４８（ＫＣＣＭ１１１６７Ｐ）、ＣＡ０３−４４９（ＫＣＣＭ１１１６８Ｐ）又はＣＡ０４−２００１（ＫＣＣＭ１１１６６Ｐ）であることが好ましい。

本発明の好ましい実施形態において、本発明は、向上したＬ−トレオニン又はＬ−トリプトファン生産能を有する組換えエシェリキア属微生物をスクロース又はグルコースが主炭素源として含まれる培地で培養することによりＬ−アミノ酸を生産する方法を提供する。

具体的には、本発明は、炭素源の一部又は全部としてスクロース又はグルコースを含む培養培地に前記組換えエシェリキア属微生物を接種して培養し、前記培養物からＬ−アミノ酸を分離することを特徴とするＬ−アミノ酸の生産方法を提供する。

本発明の前記培養過程は、当業界で知られた適切な培地と培養条件で行われる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。前記培養方法の例としては、回分式、連続式、流加式培養が挙げられるが、これに限定されるものではない。培養に用いられる培地は、特定の菌株の要件を満たさなければならない。

本発明において用いられる培地は、スクロース又はグルコースを主炭素源として含む。また、スクロースを高濃度で含有する糖蜜も炭素源として用いることができ、培地は様々な炭素供給源の適量を用いるものであれば限定されない。用いることのできる窒素源の例としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆ミールなどの有機窒素源、及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウムなどの無機窒素源が挙げられ、これらの窒素源は単独で又は組み合わせて用いることができる。前記培地には、リン源（phosphorus sources）としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又は対応するナトリウム含有塩が含まれる。また、前記培地には、硫酸マグネシウム、硫酸鉄などの金属塩が含まれてもよい。その他、前記培地には、アミノ酸、ビタミン、適切な前駆体などが含まれてもよい。これらの培地又は前駆体は、培養物に回分式又は連続式で添加することができる。

培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培養物に適切な方式で添加し、培養物のｐＨを調整してもよい。さらに、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を添加して気泡生成を抑制してもよい。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素又は酸素含有気体を注入してもよい。嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを培養物に注入してもよい。

培養物の温度は、通常は２７℃〜３７℃、好ましくは３０℃〜３５℃である。培養期間は、目的物質の目標生産量が得られるまで続けてもよく、好ましくは１０〜１００時間である。

本発明の前記培養段階で生産されたＬ−アミノ酸を収集して回収する方法は、培養培地から目的アミノ酸を収集するために、例えば回分式、連続式、又は流加式培養方法などにより当該分野で公知の好適な方法を用いて培養液から回収することができる。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。

大腸菌由来のｔｅｈＢ遺伝子によりコードされる酵素の活性が不活性化されたＬ−トレオニン生産菌株の作製
Ｌ−トレオニン生産菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１（特許文献１）のｔｅｈＢ遺伝子を相同組換え（homologous recombination）により欠失させた。

前記大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１は、Ｌ−トレオニン生産菌株である大腸菌ＫＦＣＣ１０７１８（特許文献２）に由来する菌株であり、その母菌株である大腸菌ＫＦＣＣ１０７１８は、Ｌ−メチオニン類似体に対する耐性、メチオニン栄養要求性、Ｌ−トレオニン類似体に対する耐性、リーキー（leaky）イソロイシン栄養要求性、Ｌ−リジン類似体に対する耐性、及びα−アミノブチル酸に対する耐性を有する、Ｌ−トレオニンを生産する大腸菌である。

欠失対象遺伝子ｔｅｈＢ遺伝子（NCBI Gene ID: 945979）は、Ｓ−アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼと推定される酵素（predicted S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferase）をコードすることでも知られている。前記遺伝子が欠失する際に、Ｓ−アデノシルメチオニンを生産するのに用いられるＡＴＰを必要としないので、ｔｅｈＢ遺伝子がエネルギー消費を減らすための対象遺伝子に選ばれ、これは配列番号１の塩基配列を有する。

不活性化のために、ＤａｔｓｅｎｋｏＫＡなどにより開発されたラムダレッドリコンビナーゼ（lambda Red recombinase）を利用した突然変異作製法であるワンステップ不活性化（one step inactivation）方法を用いた（非特許文献１０）。

遺伝子内部への挿入を確認するために、クロラムフェニコール耐性遺伝子をマーカーとして用いた。前記クロラムフェニコール耐性遺伝子の除去のために、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換えシステム（site-specific recombination system）を用いた（非特許文献１１）。

ｐＭｌｏｘＣｍベクターを鋳型として、前記ｔｅｈＢ遺伝子の一部分とクロラムフェニコール（Chloramphenicol）耐性遺伝子の一部の塩基配列を有する次のプライマー１及びプライマー２を用いることにより重合酵素連鎖反応法（以下、「ＰＣＲ」法という）を行った。９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合の条件を３０回繰り返し、約１２００ｂｐの遺伝子断片を増幅した。

また、ＰＣＲ増幅により得られたＤＮＡ断片は、０．８％アガロースゲル電気泳動後に溶出し、２次ＰＣＲの鋳型として用いた。２次ＰＣＲは、前記溶出した１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、１次ＤＮＡ断片の５’及び３’領域の２０ｂｐの相補的塩基配列と、さらにｔｅｈＢ遺伝子の５’及び３’領域を有する次のプライマー３及びプライマー４とを用いることにより、次の条件で行った。９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合の条件を３０回繰り返し、約１３００ｂｐの遺伝子断片を増幅した。前記過程を経て得られたＤＮＡ断片は、０．８％アガロースゲル電気泳動後に溶出し、これを組換えに用いた。

ＤａｔｓｅｎｋｏＫＡなどにより開発された方法（非特許文献１０）（GenBank No. AY048746）によりｐＫＤ４６プラスミドで形質転換された、トレオニン生産能を有する大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１は、形質転換菌株（competent strain）として製造され、形質転換は、ＰＣＲ法で得られた１３００ｂｐのサイズの遺伝子断片を流入することにより行った。得られた菌株は、クロラムフェニコールが含まれるＬＢ培地で選別した。次のプライマー５及びプライマー６を用いたＰＣＲ法で得られたサイズが約２０００ｂｐのＰＣＲ産物によりｔｅｈＢ遺伝子の欠失を確認した。

ｐＫＤ４６プラスミドを除去し、その後クロラムフェニコールに耐性を有する１次組換え大腸菌菌株に、クロラムフェニコールマーカー遺伝子を菌体から除去するために、ｐＪＷ１６８プラスミドを導入した（非特許文献１２）。８３２ｂｐのＰＣＲ産物を得るために、プライマー５及びプライマー６を用いたＰＣＲ法を行い、最終的に得られた菌体に意図した欠失が生じた。

大腸菌のｎａｄＫ遺伝子の染色体内コピー数増加のためのベクターの作製
遺伝子ｎａｄＫは、アメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection: ATCC）から購入した大腸菌Ｗ３１１０菌株の染色体（GenBank accession number: AC000091）を鋳型としてＰＣＲ法で増幅した。

具体的には、次のプライマー７及びプライマー８を用い、次の条件でＰＣＲ法を行った。９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合の条件を３０回繰り返し、１４０７ｂｐの断片を増幅した（配列番号５）。

増幅した配列は、ｎａｄＫのコード配列だけでなく、自己プロモーターと推定される部位の５０１ｂｐを共に含む。また、プライマー７はＥｃｏＲＩに対する制限酵素認識部位を有し、プライマー８はＸｂａＩに対する制限酵素認識部位を有する。

得られたポリヌクレオチドは、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩの制限酵素で処理し、ｐＩＮＴ１７ＥベクターのＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、大腸菌ＢＷ２５１１３に形質転換した。その後、細胞をＬＢＣｍ固体培地（LB + chloramphenicol agar plate）に塗抹した。クローニングしたベクターは標準ミニプレップ法を用いてコロニーから取得するが、これはｎａｄＫ＿ｐＩＮＴ１７Ｅと表示される。図１にベクターの模式図を示す。

大腸菌由来のｔｅｈＢ遺伝子によりコードされる酵素の活性が不活性化され、染色体内コピー数増加によりＮＡＤキナーゼの活性が強化されたＬ−トレオニン生産菌株の作製
ＮＡＤキナーゼのコピー数を増加させるために、実施例１に記載した方法により作製したｔｅｈＢ遺伝子欠失菌株と、実施例２に記載した方法により作製したベクターｎａｄＫ＿ｐＩＮＴ１７Ｅとを用いた。

まず、実施例１に記載した方法により作製したｔｅｈＢ遺伝子欠失菌株にｐＫＤ４６プラスミドを導入して形質転換菌株（competent strain）とし、前記菌株をｎａｄＫ＿ｐＩＮＴ１７Ｅベクターに形質転換させた。コロニーを得るために、３７℃で１〜２日間培養した。

得られたコロニーの染色体内部に前記遺伝子が正しく挿入されたことを確認するために、プライマー８及びプライマー９を用いてＰＣＲ法を行った。ＰＣＲ法は次の条件で行った。９４℃で３０秒間の変性、５５℃で４５秒間のアニーリング、７２℃で２分間の重合の条件を３０回繰り返し、約２０００ｂｐの断片を増幅した。

クロラムフェニコール耐性を有する１次組換え菌株からｐＫＤ４６プラスミドを除去し、その後クロラムフェニコールマーカー遺伝子を菌体から除去するために、ｐＪＷ１６８プラスミドを導入した（非特許文献１２）。約１５００ｂｐのＰＣＲ産物を得るためにＰＣＲ法を行い、ｎａｄＫ遺伝子の連続した2つのコピーが意図した通り染色体内に存在することを確認した。

前記形質転換された大腸菌をＫＣＣＭ１０５４１ΔｔｅｈＢｎａｄＫ２ｃｏｐｙ（ＣＡ０３−４４８）と命名した。

大腸菌由来のｔｅｈＢ遺伝子によりコードされる酵素の活性が不活性化され、染色体内コピー数増加によるＮＡＤキナーゼの活性が強化されたＬ−トリプトファン生産菌株の作製
Ｌ−トリプトファン生産菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２を用いたことを除いては、実施例１〜３と同様の方法を用いて形質転換された大腸菌を作製した。

本実施例において用いられた母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２Ｐは、Ｌ−フェニルアラニン生産能を有する大腸菌変異株（ＫＦＣＣ１００６６）に由来する菌株であり、染色体上のトリプトファン要求性が解除され、ｐｈｅＡ、ｔｒｐＲ、ｍｔｒ、ｔｎａＡＢ遺伝子が不活性化され、ａｒｏＧ、ｔｒｐＥ遺伝子が変異したことを特徴とするＬ−トリプトファン生産能を有する組換え大腸菌である（特許文献３）。

前記形質転換された大腸菌をＫＣＣＭ１０８１２ΔｔｅｈＢｎａｄＫ２ｃｏｐｙ（ＣＡ０４−２００１）と命名した。

比較例１：ｔｅｈＢ遺伝子によりコードされる酵素の活性が不活性化されたＬ−トレオニン又はＬ−トリプトファン生産菌株の作製
ｔｅｈＢ遺伝子を欠失させるために、実施例１で示したトレオニン生産菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１と、トリプトファン生産菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２とを用いた。ＤａｔｓｅｎｋｏＫＡなどにより開発されたラムダレッドリコンビナーゼ（lambda Red recombinase）を利用した突然変異作製法であるワンステップ不活性化（one step inactivation）方法（非特許文献１０）と、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換えシステム（site-specific recombination system）（非特許文献１１）とを用いた。

８３２ｂｐのＰＣＲ産物を得るために、プライマー５及びプライマー６を用いてＰＣＲ法を行い、最終的に得られた菌株に意図した通り欠失が生じたことを確認し、前記菌株をそれぞれＫＣＣＭ１０５４１ΔｔｅｈＢ及びＫＣＣＭ１０８１２ＰΔｔｅｈＢと命名した。

比較例２：ＮＡＤキナーゼの活性が強化されたＬ−トレオニン又はＬ−トリプトファン生産菌株の作製
ＮＡＤキナーゼの活性が強化された菌株を作製するために、実施例３に記載した方法により、トレオニン及びトリプトファン生産菌株の染色体上のｎａｄＫ遺伝子のコピー数を２コピーに増加させた。

トレオニン生産菌株であるＫＣＣＭ１０５４１とトリプトファン生産菌株であるＫＣＣＭ１０８１２にｐＫＤ４６プラスミドを導入した状態で形質転換細胞（competent cells）を作製し、その後前記菌株をベクターｎａｄＫ＿ｐＩＮＴ１７Ｅで形質転換させた。その後、コロニーを得るために、３７℃で１〜２日間培養した。得られたコロニーの染色体内部に前記遺伝子が正しく挿入されたことを確認するために、プライマー８及びプライマー９を用いてＰＣＲ法を行った。

クロラムフェニコール耐性を有する１次組換え菌株からｐＫＤ４６プラスミドを除去し、その後前記菌株からクロラムフェニコールマーカー遺伝子を除去するために、ｐＪＷ１６８プラスミドを導入した。（非特許文献１２）。約１５００ｂｐのＰＣＲ産物を得るためにプライマー１０及びプライマー１１を用いてＰＣＲ法を行い、ｎａｄＫ遺伝子の連続した２つのコピーが意図した通り染色体内に存在することを確認した。作製された菌株をＫＣＣＭ１０５４１ｎａｄＫ２コピー及びＫＣＣＭ１０８１２ｎａｄＫ２ｃｏｐｙと命名した。

実験例１：ＮＡＤキナーゼの活性が強化され、ｔｅｈＢ遺伝子によりコードされる酵素の活性が不活性化されたＬ−トレオニン生産菌株の力価確認
まず、スクロース同化能（sucrose-assimilating ability）を有するＬ−トレオニン生産菌株を提供するために、ｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋベクター（特許文献４）（配列番号２１）を次の通り作製した。

ｐＡｃｓｃＢＡＲを作製し、その後ｐＡｃｓｃＢＡＲにｍａｋ遺伝子をクローニングした。ｐＡｃｓｃＢＡＲの作製のために、プライマー１２及びプライマー１３を用い、ｃｓｃＫ部位が除去されたｃｓｃＢ部位のポリヌクレオチドを増幅した。

ＰＣＲは次の条件下で行った。９４℃で３分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分３０秒間の重合を２５回繰り返し、その後７２℃で７分間重合反応を行い、その結果１５２１ｂｐのポリヌクレオチドを増幅した。得られたポリヌクレオチドとｐＡｃｓｃＢＡＲをそれぞれＥｃｏＲＶ及びＥａｇＩの制限酵素で処理し、その後クローニングして大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。ｐＡｃｓｃＢＡＲを含むコロニーは、ＬＢ培地で成長したコロニーを用いたＰＣＲ法により選別し、プラスミドは、標準プラスミドミニプレップ法を用いて得られた。得られたｐＡｃｓｃＢＡＲプラスミドのＸｂａＩ及びＥａｇＩ部位に連結されたｃｓｃＢＡＲの塩基配列分析により、変異がないことを確認した。

ｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋベクターを作製するために、プライマー１４及びプライマー１５と大腸菌Ｗ３１１０の染色体を、ｍａｋ遺伝子を含むポリヌクレオチドを増幅する鋳型として用い、ｐＡｃｓｃＢＡＲのＰｓｔＩとＥａｇＩの制限酵素部位にクローニングした。

ＰＣＲ法は次の条件下で行った。９４℃で３分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分３０秒間の重合を２５回繰り返し、その後７２℃で７分間重合反応を行い、その結果１３８８ｂｐのポリヌクレオチドを増幅した。得られたポリヌクレオチドとｐＡｃｓｃＢＡＲをそれぞれＰｓｔＩ及びＥａｇＩの制限酵素で処理し、その後クローニングして大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。ｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋを含むコロニーは、ＬＢ培地で成長したコロニーを用いたＰＣＲ法により選別し、プラスミドは、標準プラスミドミニプレップ法を用いて得られた。得られたｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋプラスミドのＸｂａＩ及びＥａｇＩ部位に連結されたｃｓｃＢＡＲ−ｍａｋの塩基配列分析により、変異がないことを確認した。

実施例３の組換え大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１ΔｔｅｈＢｎａｄＫ2ｃｏｐｙ菌株、母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１菌株、比較例１〜２により製造されたｔｅｈＢ遺伝子が欠失したＫＣＣＭ１０５４１菌株（ＫＣＣＭ１０５４１ΔｔｅｈＢという）、及びｎａｄＫ遺伝子のコピー数が増加したＫＣＣＭ１０５４１菌株（ＫＣＣＭ１０５４１ｎａｄＫ２ｃｏｐｙという）にそれぞれ前記作製されたｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋベクターを導入し、その後力価評価を行った。

異なる遺伝的形質を有する前記菌株は、３３℃の培養器内のＬＢ固体培地で一晩培養した。その後、表９の組成のようにスクロースを含む２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、次いでこれを３３℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表１０に示す。全ての結果は、３つのフラスコの平均値で示す。

表１０に示すように、ｔｅｈＢ遺伝子のみを欠失させた場合、スクロースの同化能（assimilation ability）は母菌株の同化能に類似する。しかし、ＮＡＤキナーゼの活性を強化した場合、スクロースの同化能は母菌株と比較して約２ｇ増加した。

さらに、ｔｅｈＢ遺伝子を欠失させた場合、母菌株と比較して細胞密度は約６％減少したが、トレオニンの生産量は母菌株と同程度であった。しかし、２種類の変異を同時に導入した場合、母菌株と比較して細胞密度は約８％減少し、スクロースの同化能は約８％増加し、トレオニンの生産量も９％増加した。

また、実施例３の組換え大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１ΔｔｅｈＢｎａｄＫ２ｃｏｐｙ菌株、母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１菌株、比較例１〜２により製造されたｔｅｈＢ遺伝子が欠失したＫＣＣＭ１０５４１菌株（ＫＣＣＭ１０５４１ΔｔｅｈＢという）、及びｎａｄＫ遺伝子のコピー数が増加したＫＣＣＭ１０５４１菌株（ＫＣＣＭ１０５４１ｎａｄＫ２ｃｏｐｙという）を対象に、ブドウ糖を炭素源とする力価評価を行った。異なる遺伝的形質を有する前記菌株は、３３℃の培養器内のＬＢ固体培地で一晩培養した。その後、表１１の組成のようにブドウ糖を含む２５ｍＬの力価培地に１白金耳ずつ接種し、次いでこれを３３℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養した。その結果を表１２に示す。全ての結果は、３つのフラスコの平均値で示す。

前記ｔｅｈＢ遺伝子が欠失し、ＮＡＤキナーゼの活性が強化された、ブドウ糖同化能を有するＬ−トレオニン生産大腸菌ＫＣＣＭ１０５４１ΔｔｅｈＢｎａｄＫ２ｃｏｐｙをＣＡ０３−４４８と命名し、該当菌株にスクロース同化能を有する菌株であるＫＣＣＭ１０５４１ΔｔｅｈＢｎａｄＫ２ｃｏｐｙ／ｐＡｃｓｃＢＡＲ’−ｍａｋをＣＡ０３−４４９と命名した。これを２０１１年１月１０日付けで韓国ソウル特別市西大門区弘済１洞３６１−２２１番地所在の国際寄託機関である韓国種菌協会付設韓国微生物保存センターにそれぞれ寄託し、それぞれ受託番号ＫＣＣＭ１１１６７Ｐ、ＫＣＣＭ１１１６８Ｐが付与された。

実験例２：ＮＡＤキナーゼの活性が強化され、ｔｅｈＢ遺伝子によりコードされる酵素の活性が不活性化されたＬ−トリプトファン生産菌株の力価確認
実施例４の組換え大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２ΔｔｅｈＢｎａｄＫ２ｃｏｐｙ菌株、母菌株である大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２菌株、比較例１〜２により製造されたｔｅｈＢ遺伝子が欠失したＫＣＣＭ１０８１２菌株（ＫＣＣＭ１０８１２ΔｔｅｈＢという）、及びｎａｄＫ遺伝子のコピー数が増加したＫＣＣＭ１０８１２菌株（ＫＣＣＭ１０８１２ｎａｄＫ２ｃｏｐｙという）を対象に、グルコースを炭素源とする力価評価を行った。

前記力価評価のために、菌体を白金耳で接種し、その後ＬＢ固体培地で一晩培養した。次に、表１３の組成からなる２５ｍｌのフラスコ力価培地に１白金耳ずつ接種し、その後３７℃、２００ｒｐｍで４８時間培養した。得られた結果を表１４に示す。全ての結果は、３つのフラスコの平均値で示す。

表１４に示すように、ｔｅｈＢ遺伝子を欠失させた場合、細胞密度は母菌株と比較して約１０％増加した。ＮＡＤキナーゼの活性を強化した場合、グルコースの同化能は改善されるが、トリプトファンの生産量は母菌株と比較して大きな変化がなかった。

しかし、２種類の変異を同時に導入した場合、細胞密度が増加し、グルコースの同化能も改善され、トリプトファンの生産量が約１４％増加した。

前記ｔｅｈＢ遺伝子が欠失し、ＮＡＤキナーゼの活性が強化された菌株であるＬ−トリプトファン生産大腸菌ＫＣＣＭ１０８１２ＰΔｔｅｈＢｎａｄＫ２ｃｏｐｙをＣＡ０４−２００１と命名し、これを２０１１年１月１０日付けで韓国ソウル特別市西大門区弘済１洞３６１−２２１番地所在の国際寄託機関である韓国種菌協会付設韓国微生物保存センターに寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１１６６Ｐが付与された。

本発明の範囲及び核心から逸脱することなく様々な変形及び変更を行うことができることは当業者にとって自明である。よって、前記例はあらゆる面において限定的なものでなく、例示的なものと理解されるべきである。本発明の範囲は、前述した詳細な説明ではなく、特許請求の範囲により解釈されるので、特許請求の範囲内の又はその等価概念に含まれるあらゆる変更及び変形は、特許請求の範囲に含まれるものである。

Claims

ＮＡＤキナーゼの活性が強化され、ｔｅｈＢ遺伝子によりコードされる配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素の活性が不活性化されるように形質転換された、Ｌ−アミノ酸生産能が向上したエシェリキア属微生物。
前記ＮＡＤキナーゼが、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質である、請求項１に記載の微生物。
前記ＮＡＤキナーゼの活性が、染色体挿入又はベクター導入によるコピー数増加、発現調節部位の置換又は変形、及び遺伝子突然変異による方法の少なくとも１つの方法により強化されたものである、請求項１に記載の微生物。
前記不活性化が、相同組換えによる遺伝子の一部又は全体欠失、該当遺伝子内部へのトランスポゾン（transposon）挿入による酵素発現抑制、及び抗生物質耐性遺伝子の挿入による酵素発現抑制による方法の少なくとも１つの方法により行われるものである、請求項１に記載の微生物。
前記エシェリキア属微生物が大腸菌である、請求項１に記載の微生物。
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トレオニン又はＬ−トリプトファンである、請求項１に記載の微生物。
前記エシェリキア属微生物が、スクロース同化能（assimilation ability）が付与されたものである、請求項６に記載の微生物。
前記エシェリキア属微生物は、Ｌ−トレオニン生産大腸菌であり、受託番号ＫＣＣＭ１１１６７Ｐを有するＣＡ０３−４４８、又は受託番号ＫＣＣＭ１１１６８Ｐを有するＣＡ０３−４４９である、請求項１に記載の微生物。
前記エシェリキア属微生物が、Ｌ−トリプトファン生産大腸菌であり、受託番号ＫＣＣＭ１１１６６Ｐを有するＣＡ０４−２００１である、請求項１に記載の微生物。
炭素源の一部又は全部としてスクロース又はグルコースを含む培養培地に、請求項１〜９のいずれか１項のエシェリキア属微生物を接種して培養する段階と、前記培養培地からＬ−アミノ酸を分離する段階とを含む、Ｌ−アミノ酸を生産する方法。
前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−トレオニン又はＬ−トリプトファンである、請求項１０に記載の方法。