CN111100834A - 一种提高基因工程菌泛酸产量的构建方法及菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高基因工程菌泛酸产量的构建方法及菌株，以及该基因工程菌在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。本发明通过(1)加强lpd基因的表达(2)敲除glk、galP破坏葡萄糖非PTS转运系统，加强ptsG基因的表达而加强葡萄糖PTS转运系统(3)敲除yfbQ、ppsA基因(4)敲除poxB、pflB、ldhA基因(4)敲除ilvE基因(5)在质粒上引入异源的乙酰乳酸合酶基因alsS(6)在质粒上引入异源的泛酸转运体panT，最终得到最优的D‑泛酸高产大肠杆菌基因工程菌株。D‑泛酸效价从2.76g/L提高到6.33g/L。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种提高基因工程菌泛酸产量的构建方法及菌株，以及该基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
(二)背景技术
泛酸，也称作维生素B5，是生物体内广泛存在的一种酸性物质，是辅酶A生物合成的重要前提物质，对生物体的生长起到显著的促进作用，但目前发现泛酸只能由植物和微生物合成。泛酸可广泛应用于食品、饲料、化妆品以及制药行业，具有良好的市场价值。有报道表明可以在甲醇或者乙醇环境中通过加热混合物D-泛解酸和β-丙氨酸从而获得饲料级D-泛酸，并且已投入工业化生产。光学纯的D-泛解酸内脂可以由化学拆分DL-泛解酸内脂获得，但是由于化学拆分试剂昂贵、条件苛刻，因此工业上普遍采用酶解法获得高纯度的D-泛解酸内脂。工业上以异丁醛和甲醛为原料，在酸性条件下经醛缩合、氰化氢加成和皂化反应合成DL-泛解酸内脂，再利用来自Fusarium moniliforme CGMCC的D-lactonohydrolase酶解获得D-泛解酸内脂。而另一底物β-丙氨酸目前也是由化学法合成，即利用丙烯酸、丙烯腈、β-氨基丙腈等腈类物质通过高温，高压，加入强酸、强碱的方法合成，或丙烯腈氨水解法。
现有的D-泛酸生产方法是化学合成法与酶法相结合，异丁醛与甲醛在碱性、高温条件下羟醛缩合形成羟基特戊醛，再添加氢氰酸，在酸性条件下进行醇氰化反应形成氰醇；氰醇在酸性条件下通过水解环化得到DL-泛解酸内酯，DL-泛解酸内酯经L-泛解酸内酯水解酶水解，留下D-泛解酸内酯，产生的L-泛解酸再经化学内酯、外消旋转为DL-泛解酸内酯。得到的D-泛解酸内酯与β-氨基丙酸钙缩合直接制得D-泛酸钙。综合考虑D-泛酸现有生产方法的回收率和环境因素，以可再生的廉价基质用微生物发酵生产D-泛酸受到越来越多的关注。
大肠杆菌W3110中泛酸的合成途径可分为泛解酸和β-丙氨酸两个模块，我们把这两个模块途径看成是整个D-PA代谢途径中的“并联路线”。首先胞外葡萄糖经糖运输系统进入胞内(PTS系统和非PTS系统)，后经糖酵解途径生成磷酸烯醇式丙酮酸(以下简称PEP)，在泛解酸模块中，PEP在丙酮酸激酶(由pykAF编码表达)的作用下反应生成丙酮酸(以下简称PYR)，PYR在乙酰乳酸合酶(由ilvGMIHBN编码表达)的作用下反应生成乙酰乳酸，再经两步反应生成α-酮异戊酸(以下简称2-KIV)，2-KIV在α-酮异戊酸羟甲基转移酶(由panB编码表达)、2-脱氢泛解酸还原酶(由panE、ilvC编码表达)的作用下生成泛解酸。在β-丙氨酸模块中，PEP在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(由ppc编码表达)作用下与HCO3-反应产生草酰乙酸(以下简称OAA)，OAA在天冬氨酸转氨酶(由aspC编码表达)作用下发生转氨反应生成天冬氨酸(以下简称ASP)，ASP在天冬氨酸脱羧酶(由panD编码表达)作用下发生脱羧反应生成β-丙氨酸。最后，泛解酸和β-丙氨酸在泛酸合成酶(由panC编码表达)的作用下消耗一分子ATP反应生成一分子D-泛酸。
除了主要合成途径(磷酸烯醇式丙酮酸到β-丙氨酸，丙酮酸到泛解酸)之外，D-泛酸的生物合成还跟NADPH和亚甲基四氢叶酸的供给相关，同时支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)的合成支路对D-泛酸的生物合成有着强烈的竞争作用，随着生物发酵技术理念的发展，以及近年来化学法生产受限于环保和成本问题，D-泛酸的发酵法生产也越来越具有可行性。
自上个世纪90年代开始，一些著名的化学制药公司BASF、DSM和Degussa AG等开始关注D-泛酸发酵法合成。Miki Hiroshi等人在E.coli IFO3547(缬氨酸高产菌)的基础上运用紫外诱变和亚硝基胍诱变技术与特殊培养基筛选相结合进行高产D-泛解酸菌株的选育，在经过含水杨酸、α-酮异戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羟基天冬氨酸和O-甲基苏氨酸等培养基筛选得到E.coli FV5069，并转化pFV31质粒(含泛酸合成基因)得到E.coliFV5069/pFV31，通过外源添加β-丙氨酸在经过72h补料发酵后D-泛酸产量达65.4g/L。而Rogers R.Yocum等人则致力于构建高产D-泛酸的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，通过解除panBCD、ilvBNC、panE和ilvD的调控来增强D-泛酸合成，构建过表达panBD的质粒，在进行发酵培养基条件优化方法发现采用麦芽糖替换葡萄糖和添加丝氨酸能有效促进D-泛酸积累，同时发现从丝氨酸出发的一碳单位合成途径与D-泛酸有密切联系，并做了一系列研究发现serA和glyA的过表达会有利于D-泛酸的合成，但并未见到放大报道。ChristopheChassagnole等人在敲除ilvA的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)上共表达pECM3-ilvBNCD和pEKEx2-panBC质粒，在发酵工程中外源添加β-丙氨酸，用于生产D-泛酸，但最终产量却不足2g/L除此之外，另外还有很多关于α-酮异戊酸生成等相关的有利于提高D-泛酸发酵效价的专利报道。
(三)发明内容
本发明的目的在于代谢工程和基因编辑技术，一种提高基因工程菌泛酸产量的构建方法及菌株，以及该基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
本发明采用的技术方案是：
在生产泛酸的基因工程菌的基础上继续改造代谢途径中的关键基因得到泛酸产量更高的基因工程菌。所述高产泛酸的基因工程菌由如下方法构建而成：
一种提高基因工程菌泛酸产量的构建方法及菌株，由如下方法构建获得：
(1)以菌株CCTCC NO：M 2018914(即E.coli W3110Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG*/ΔavtA，记为DPA9)/ilvE*/coaA*/ΔilvA)为底盘菌株，将其基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9Trc-lpd，记为DPA10；
(2)将DPA9Trc-lpd基因组中的glk基因敲除，得到DPA9Trc-lpd/△glk，记为DPA11；
(3)将DPA9Trc-lpd/Δglk基因组中galP基因敲除，得到DPA9Trc-lpd/△glk/ΔgalP，记为DPA12；
(4)将DPA9Trc-lpd/Δglk/ΔgalP基因组中的ptsG基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-ptsG，记为DPA13；
(5)将DPA9Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-ptsG基因组中的pykA基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-ptsG/Trc-pykA，记为DPA14；
(6)将DPA9Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-pykA/Trc-pykF基因组中的pykF基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-ptsG/Trc-pykA/Trc-pykF，记为DPA15；
(7)将DPA9Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-ptsG/Trc-pykA/Trc-pykF基因组中的yfbQ基因敲除，得到DPA9Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-ptsG/Trc-pykA/Trc-pykF/△yfbQ，记为DPA16；
(8)将DPA9Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-pykA/Trc-pykF/Trc-ptsG/△yfbQ基因组中的ppsA基因敲除，得到DPA9Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-ptsG/Trc-pykA/Trc-pykF/△yfbQ/△ppsA，记为DPA17；
(9)将DPA9Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-pykA/Trc-pykF/Trc-ptsG/△yfbQ/△ppsA基因组中的poxB、pflB、ldhA基因依次敲除，得到新的基因工程菌株DPA9Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-ptsG/Trc-pykA/Trc-pykF/△yfbQ/△ppsA/△poxB/△pflB/△ldhA，记为DPA20；
(10)将DPA9Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-pykA/Trc-pykF/Trc-ptsG/ΔyfbQ/ΔppsA/ΔpoxB/ΔpflB/ΔldhA基因组中的ilvE基因敲除，得到新的基因工程菌株DPA9Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-ptsG/Trc-pykA/Trc-pykF/ΔyfbQ/ΔppsA/ΔpoxB/ΔpflB/△ldhA/△ilvE，记为DPA21；
(11)在质粒pTrc99a-panBC(CG)上增加来自枯草芽孢杆菌的alsS基因,得到新的质粒pTrc99a-panBC(CG)-alsS(BS)，记为pBCS；
(12)在质粒pTrc99a-panBC(CG)-alsS(BS)上增加来自Streptococcusintermedius B196的panT基因得到新的质粒pTrc99a-panBC(CG)-alsS(BS)-panT，记为pBCST；
(13)将步骤(12)构建好的质粒pBCST导入步骤(10)获得的菌株DPA21中，得到菌株DPA21/pBCST，即为所述高产泛酸的基因工程菌。
优选的，所述菌株为大肠杆菌W3110DPA21/pBCST(Escherichia coliW3110DPA21/pBCST)，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2019年12月9日，保藏编号：CCTCC NO：M20191027。该菌株D-泛酸效价可达6.33g/L。
本发明通过(1)加强lpd基因的表达而确保辅因子亚甲基四氢叶酸的供应，(2)敲除glk、galP破坏葡萄糖非PTS转运系统，加强ptsG基因的表达而加强葡萄糖PTS转运系统，伴随着磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化成丙酮酸(PYR)，加强了底物池PYR的积累，(3)敲除yfbQ、ppsA基因，阻断PYR的旁路途径而强化泛解酸通路，(4)根据副产物有机酸的检测，敲除poxB、pflB、ldhA基因，解除副产物有机酸(乙酸、甲酸、乳酸)对泛解酸途径碳流的竞争作用，(4)根据副产物氨基酸的检测，敲除ilvE基因，解除支链氨基酸(缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)支路对泛解酸主路途径碳流的竞争作用，(5)在质粒上引入异源的乙酰乳酸合酶基因alsS加强关键酶的酶活，(6)在质粒上引入异源的泛酸转运体panT加强泛酸的外运，最终得到最优的D-泛酸高产大肠杆菌基因工程菌株。
本发明还涉及构建所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
(1)以菌株DPA9(E.coli W3110Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG*/ΔavtA/ilvE*/coaA*/ΔilvA)为底盘菌株(保藏编号：CCTCC NO：M 2018914)为底盘菌株，应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将其基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9Trc-lpd，记为DPA10；
(2)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将DPA10基因组中的glk基因敲除，得到DPA9Trc-lpd/Δglk，记为DPA11；
(3)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将DPA11基因组中galP基因敲除，得到DPA9Trc-lpd/Δglk/ΔgalP，记为DPA12；
(4)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将DPA12基因组中的ptsG基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-ptsG，记为DPA13；
(5)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将DPA13基因组中的pykA基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-ptsG/Trc-pykA，记为DPA14；
(6)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将DPA14基因组中的pykF基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-ptsG/Trc-pykA/Trc-pykF，记为DPA15；
(7)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将DPA15基因组中的yfbQ基因敲除，得到DPA9Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-ptsG/Trc-pykA/Trc-pykF/ΔyfbQ，记为DPA16；
(8)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术DPA16基因组中的ppsA基因敲除，得到DPA9Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-ptsG/Trc-pykA/Trc-pykF/ΔyfbQ/ΔppsA，记为DPA17；
(9)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将DPA17基因组中的poxB、pflB、ldhA基因依次敲除，得到新的基因工程菌株DPA9Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-ptsG/Trc-pykA/Trc-pykF/ΔyfbQ/ΔppsA/ΔpoxB/ΔpflB/ΔldhA，记为DPA20；
(10)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将DPA20基因组中的ilvE基因敲除，得到新的基因工程菌株DPA9Trc-lpd/△glk/ΔgalP/Trc-ptsG/Trc-pykA/Trc-pykF/ΔyfbQ/ΔppsA/△poxB/△pflB/△ldhA/△ilvE，记为DPA21；
(11)采用克隆技术在质粒pTrc99a-panBC(CG)上增加来自枯草芽孢杆菌的alsS基因,得到新的质粒pTrc99a-panBC(CG)-alsS(BS)，记为pBCS；
(12)采用克隆技术在质粒pTrc99a-panBC(CG)-alsS(BS)上增加来自Streptococcus intermedius B196的panT基因得到新的质粒pTrc99a-panBC(CG)-alsS(BS)-panT，记为pBCST；
(13)将步骤(12)构建好的质粒pBCST导入步骤(10)获得的菌株DPA21中，得到菌株DPA21/pBCST，即为所述高产泛酸的基因工程菌。
具体的，所述Trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述alsS基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述panT基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
具体的，所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种至含有kan抗性的发酵培养基中，25～30℃、100～200rpm条件下进行发酵培养OD600＝0.8～1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至24～48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到D-泛酸。
所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 0.8g/L、MgSO40.5g/L、酵母提取物2g/L、CaCO3 10g/L，1ml/L微量金属盐溶液，溶剂为去离子水；微量金属盐溶液组成为：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
通常，所述基因工程菌发酵前，先接种至LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5％接种量接种到发酵培养基中培养。
本发明改造了大肠杆菌的葡萄糖摄取途径相关基因，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术将来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列替换基因组上lpd、ptsG、pykA、pykF基因的原有启动子，增强了辅因子亚甲基四氢叶酸的供给以及丙酮酸底物池的积累。通过敲除yfbQ、ppsA基因，阻断丙酮酸的旁路途径更有利于丙酮酸的积累。通过敲除poxB、pflB、ldhA基因，阻断了丙酮酸到有机酸的合成途径，避免其对泛酸合成途径碳流的竞争作用。为了解除支链氨基酸缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸的合成途径对碳流的争夺，通过敲除ilvE来阻断支链氨基酸的合成途径。在质粒上引入异源的乙酰乳酸合酶基因alsS加强关键酶的酶活，引入筛选到的最优的异源泛酸转运体panT基因从而加强D-泛酸的外运。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明通过改造大肠杆菌的葡萄糖摄取途径，加强PTS转运系统而阻断非PTS转运系统，以此消耗PEP产生PYR使其底物池积累；通过敲除yfbQ、ppsA基因来阻断PYR的旁路途径从而进一步集中加强泛解酸途径的通量；通过敲除poxB、pflB、ldhA基因，阻断了丙酮酸到有机酸的合成途径，避免对泛酸合成途径碳流的竞争作用。为了解除支链氨基酸缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸的合成途径对碳流的争夺，通过敲除ilvE来阻断支链氨基酸的合成途径。在质粒上引入异源的乙酰乳酸合酶基因alsS加强关键酶的酶活，引入筛选到的最优的异源泛酸转运体panT基因从而加强D-泛酸的外运。最终D-泛酸效价从2.8g/L提高到6.33g/L。
(四)附图说明
图1为基因组编辑操作流程；
图2为D-泛酸代谢途径图和改造位点；
图3为DPA10/pBC的OD600和D-泛酸效价变化；
图4为DPA11/pBC的OD600和D-泛酸效价变化；
图5为DPA12/pBC的OD600和D-泛酸效价变化；
图6为DPA13/pBC的OD600和D-泛酸效价变化；
图7为DPA14/pBC的OD600和D-泛酸效价变化；
图8为DPA15/pBC的OD600和D-泛酸效价变化；
图9为DPA16/pBC的OD600和D-泛酸效价变化；
图10为DPA17/pBC的OD600和D-泛酸效价变化；
图11为DPA17/pBCS的OD600和D-泛酸效价变化；
图12为DPA20/pBCS的OD600和D-泛酸效价变化。
图13为DPA21/pBCS的OD600和D-泛酸效价变化。
图14为DPA21/pBCST的OD600和D-泛酸效价变化。
图15为菌株DPA21/pBCST的5L发酵罐的分批补料发酵产量。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下实施例中，所述卡那霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述壮观霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述卡那霉素在培养基中终浓度为0.10mg/L。
本发明所述亲本菌株E.coli DPA9来自中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M 2018914，已在中国专利CN109868254A中公开。
菌株E.coliW3110来自耶鲁大学CGSC保藏中心(Coli Genetic Stock Center)，保藏日期1975年8月5日，保藏编号CGSC#4474，已在专利US 2009/0298135 A1，US 2010/0248311 A1中公开。
实施例1-13中使用的引物序列信息如表2所示：
表1：基因编辑涉及的基因及相应途径
表2：引物序列
pT-X-F/R为pTatget质粒的突变引物，其中X为携带基因组的目的基因所含PAM位点(NGG)前20bp序列；pTD-X P1/P2为目的基因的上游同源臂(约500bp)上下游引物；pTD-XP3/P4为目的基因的下游同源臂(约500bp)上下游引物；X VF/VR为目的基因的验证引物。
实施例1：HPLC法测定发酵液中D-泛酸含量
检测方法如下：
样品处理：取1ml发酵液离心取上清，将上清液用超纯水稀释合适倍数，保持D-泛酸含量在0.05g/L到0.40g/L之间；
色谱条件：C18柱(250×4.6mm,particle size 5μm,Agilent Technologies Co.,Santa Clara,CA,USA)、检测波长：200nm、柱温：30℃、流速：0.9ml/min；
流动相：乙腈/水/磷酸：(50/949/1)；
数据采集时间：23min。
实施例2：过表达lpd基因的菌株DPA10的构建及摇瓶发酵
以基因工程菌DPA9(即CCTCC NO：M 2018914)为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术如图1(Yu Jiang et al.2015Multigene Editing in the Escherichiacoli Genome via the CRISPR-Cas9System.Applied Environmental Microbiology.81:2506-2514)，用来源于pTrc99A的Trc启动子(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)，在基因组替换lpd基因的天然启动子，以增强lpd基因的表达强度。
(1)构建pTarget-panC质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-lpd F/pT-lpd R为引物PCR扩增，得到的PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态中，壮观酶素(SD)平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-lpd质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-lpd质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-lpd P1与pTD-lpd P2为引物扩增获得donor DNA的上游同源臂(A)，pTD-lpd P3和pTD-lpd P4为引物扩增获得donor DNA的下游同源臂(C)，胶回收纯化PCR片段得到同源臂A和C；pTarget-lpd质粒经过Xba I和Pst I在37℃保温8h，Clean up试剂盒回收DNA片段；按照
(One stepclone kit，Vazyme Biotech，Nanjing，China)说明书将pTarget-panC质粒、同源臂A和C连接在一起，导入E.coli DH5α化转感受态中，菌落pcr筛选阳性克隆子，通过测序验证得到pTD-lpd质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入DPA9化转感受态中，挑取阳性克隆转接到含0.05mg/L卡那霉素的LB试管中，30℃过夜培养；再以体积浓度1％的接种量接种到含50mL LB培养基的250mL摇瓶中，并加入500μl 1mol/L的L-阿拉伯糖，150rpm、30℃培养至OD600 0.4～0.6；4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102)的描述。
(4)取200ng pTD-lpd质粒与100μl电击感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM,BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入预冷的1mL LB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5mL离心管中，30℃复苏2～3h后涂布含0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的LB平板，37℃倒置培养14-18h，以lpd VF和lpdVR为验证引物进行菌落PCR验证，若能成功克隆出一段750bp左右的片段，则证明该单菌落是DPA9(Trc-lpd)的阳性菌落，即编辑成功，得到新的菌株DPA10。
(5)质粒消除：挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，次日菌液划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落其pTarget-lpd质粒成功消除，挑取pTarget-lpd质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，42℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒DPA9(Trc-lpd)(简称DPA10)。
(6)制备菌株DPA10化转感受态，导入pBC质粒，获得菌株DPA10/pBC。以DPA9/pBC为对照组，分别接种到10mL的LB培养基中，37℃、200rpm培养用作种子液；8～12h后，接种1mL种子液到装有20mL的MS培养基的500mL摇瓶中，然后在30℃、150rpm培养发酵到OD600＝0.8～1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养48h；发酵结束后取1mL发酵液测定OD600，取1mL发酵液，12000rpm室温离心3min，将发酵上清稀释10倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图3所示。
由图可见，用Trc启动子替换基因组上lpd基因的天然启动子，对细胞生长无明显作用，但能提高D-泛酸的产量，使得D-泛酸效价从2.76g/L增加到3.13g/L，这说明lpd基因的过表达有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。
MS培养基：葡萄糖20g/L、硫酸铵16g/L、KH2PO4 0.8g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母提取物2g/L、β-丙氨酸2.5g/L、CaCO3 10g/L(单独灭菌)、1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/LCuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
实施例3：敲除glk基因的菌株DPA11的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-glk质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-glk F/pTarget-glk R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-glk质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-glk质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-glk P1、pTD-glk P2、pTD-glk P3和pTD-glk P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-glk质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例2获得的菌株DPA10感受态中，菌株DPA10感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPA11阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPA11。
(6)将构建的菌株DPA11生产菌株转入pBC质粒后得到菌株DPA11/pBC，并以实施例2构建的菌株DPA10/pBC为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图4所示。
由图可见，菌株DPA10基因组上敲除glk基因对细胞生长无明显影响，但D-泛酸效价从3.13g/L增加到3.54mg/L，这说明glk基因的敲除可有效增强胞内泛解酸合成途径，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例4：敲除galP基因的菌株DPA12的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-galP质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-galP F/pTarget-galP R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-galP质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-galP质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-galP P1、pTD-galPP2、pTD-galP P3和pTD-galP P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-galP质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例3获得的菌株DPA11感受态中，菌株DPA11感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPA12阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPA12。
(6)将构建的菌株DPA12生产菌株转入pBC质粒后得到菌株DPA12/pBC，并以实施例3构建的菌株DPA11/pBC为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图5所示。
由图可见，菌株DPA11基因组上敲除galP基因对细胞生长有轻微抑制作用，但D-泛酸效价从3.54g/L增加到3.64mg/L，这说明galp基因的敲除可有效增强胞内泛解酸合成途径，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例5：加强葡萄糖运输PTS系统的菌株DPA13的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-ptsG质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ptsG F/pTarget-ptsG R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-ptsG质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-ptsG质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-ptsG P1、pTD-ptsGP2、pTD-ptsG P3和pTD-ptsG P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-ptsG质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例4获得的菌株DPA12感受态中，菌株DPA12感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPA13阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPA13。
(6)将构建的菌株DPA13生产菌株转入pBC质粒后得到菌株DPA13/pBC，并以实施例4构建的菌株DPA12/pBC为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图6所示。
由图可见，菌株DPA12基因组上用Trc启动子替换ptsG基因天然启动子对细胞生长有促进作用，且D-泛酸效价从3.64g/L增加到4.09mg/L，这说明ptsG基因的过表达可有效增强胞内泛解酸合成途径，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例6：加强丙酮酸合成(Trc-pykA)菌株DPA14的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-pykA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-pykA F/pTarget-pykA R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-pykA质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-pykA质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-pykA P1、pTD-pykAP2、pTD-pykA P3和pTD-pykA P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-pykA质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例5获得的菌株DPA13感受态中，菌株DPA13感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPA14阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPA14。
(6)将构建的菌株DPA14生产菌株转入pBC质粒后得到菌株DPA14/pBC，并以实施例5构建的菌株DPA13/pBC为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图7所示。
由图可见，菌株DPA13基因组上用Trc启动子替换pykA基因天然启动子对细胞生长有促进作用，且D-泛酸效价从4.09g/L增加到4.17g/L，这说明pykA基因的过表达可有效增强胞内泛解酸合成途径，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例7：加强丙酮酸合成(Trc-pykF)菌株DPA15的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-pykF质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-pykF F/pTarget-pykF R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-pykF质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-pykF质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-pykF P1、pTD-pykFP2、pTD-pykF P3和pTD-pykF P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-pykF质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例6获得的菌株DPA14感受态中，菌株DPA14感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPA15阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPA15。
(6)将构建的菌株DPA15生产菌株转入pBC质粒后得到菌株DPA15/pBC，并以实施例6构建的菌株DPA14/pBC为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图8所示。
由图可见，菌株DPA14基因组上用Trc启动子替换pykFA基因天然启动子对细胞生长无明显作用，但D-泛酸效价从4.17g/L增加到4.34g/L，这说明pykF基因的过表达可有效增强胞内泛解酸合成途径，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例8：yfbQ基因敲除菌株DPA16的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-yfbQ质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-yfbQ F/pTarget-yfbQ R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-yfbQ质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-yfbQ质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-yfbQ P1、pTD-yfbQP2、pTD-yfbQ P3和pTD-yfbQ P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-yfbQ质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例7获得的菌株DPA15感受态中，菌株DPA15感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPA16阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPA16。
(6)将构建的菌株DPA16生产菌株转入pBC质粒后得到菌株DPA16/pBC，并以实施例7构建的菌株DPA15/pBC为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图9所示。
由图可见，菌株DPA15基因组上敲除yfbQ基因对细胞生长无明显作用，但D-泛酸效价从4.35g/L增加到4.47g/L，这说明yfbQ基因的敲除可有效增强胞内泛解酸合成途径，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例9：ppsA基因敲除菌株DPA17的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-ppsA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ppsA F/pTarget-ppsA R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-ppsA质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-ppsA质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-ppsA P1、pTD-ppsAP2、pTD-ppsA P3和pTD-ppsA P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-ppsA质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例8获得的菌株DPA16感受态中，菌株DPA16感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPA17阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPA17。
(6)将构建的菌株DPA17生产菌株转入pBC质粒后得到菌株DPA17/pBC，并以实施例8构建的菌株DPA16/pBC为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图10所示。
由图可见，菌株DPA16基因组上敲除ppsA基因对细胞生长无明显作用，但D-泛酸效价从4.47g/L增加到4.59g/L，这说明ppsA基因的敲除可有效增强胞内泛解酸合成途径，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例10：质粒pBCS的构建及摇瓶发酵
(1)构建pBCS质粒：以pBC质粒为模版，以pBC+F/pBC+R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，经Cleaning up后获得pBC质粒框架，用于后续一步克隆连接。
(2)构建alsS目的片段：以Bacillus subtilis基因组为模版，以alsS F/alsS R为引物PCR扩增，经Cleaning up后获得alsS目的基因，用于后续一步克隆连接。
(3)采用一步克隆试剂盒将pBC质粒框架和alsS目的基因连接，37℃反应1h后导入E.coli DH5α化转感受态细胞中。
(4)挑选阳性菌落，经测序验证正确后接种于试管，37℃培养过夜后采用质粒试剂盒提取质粒，获得pBCS质粒，转入菌株DPA17化转感受态中。
(5)挑选阳性菌落DPA17/pBCS，并以实施例9构建的菌株DPA17/pBC为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图11所示。
由图可见，菌株DPA17/pBCS相比于菌株DPA17/pBC对细胞生长有促进作用，且D-泛酸效价从4.59g/L增加到4.71g/L，这说明异源乙酰乳酸合酶的引入可有效增强胞内泛解酸合成途径，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例11：阻断有机酸合成途径的菌株DPA20的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-poxB质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-poxB F/pTarget-poxB R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-poxB质粒，用于后续连接DonorDNA。同理构建pTarget-pflB、pTarget-ldhA。
(2)构建pTD-poxB质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-poxB P1、pTD-poxBP2、pTD-poxB P3和pTD-poxB P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-poxB质粒。同理构建pTD-pflB、pTD-ldhA。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例10获得的菌株DPA17感受态中，菌株DPA17感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPA18阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。同理获得菌株DPA19、DPA20。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPA18、DPA19、DPA20。
(6)将构建的菌株DPA20生产菌株转入pBCS质粒后得到菌株DPA20/pBCS，并以实施例9构建的菌株DPA17/pBC为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图12所示。
由图可见，菌株DPA17基因组上敲除poxB、pflB、ldhA基因对细胞生长有轻微抑制作用，但D-泛酸效价从4.71g/L增加到5.05g/L，这说明有机酸合成途径的阻断可有效增强胞内泛解酸合成途径，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例12：阻断支链氨基酸合成途径的菌株DPA21的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-ilvE质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ilvE F/pTarget-ilvE R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-ilvE质粒，用于后续连接DonorDNA。
(2)构建pTD-ilvE质粒：以E.coli W3110基因组为模版，pTD-ilvE P1、pTD-ilvEP2、pTD-ilvE P3和pTD-ilvE P4为引物，构建步骤同实施例2(2)，得到pTD-ilvE质粒。。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例11获得的菌株DPA20感受态中，菌株DPA20感受态制备方法同实施例2(3)。
(4)构建得到菌株DPA21阳性菌落，构建方法同实施例2(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例2(5)，获得无质粒菌株DPA21。
(6)将构建的菌株DPA21生产菌株转入pBCS质粒后得到菌株DPA21/pBCS，并以实施例9构建的菌株DPA20/pBCS为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图13所示。
由图可见，菌株DPA20基因组上敲除ilvE基因对细胞生长有抑制作用，但D-泛酸效价从5.05g/L增加到6.12g/L，这说明支链氨基酸合成途径的阻断可有效增强胞内泛解酸合成途径，从而有利于大肠杆菌D-泛酸的合成。
实施例13：质粒pBCST的构建及摇瓶发酵
(1)构建pBCS质粒框架：以pBCS质粒为模版，以pBCS+F/pBCS+R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，经Cleaning up后获得pBCS质粒框架，用于后续一步克隆连接。
(2)构建panT目的片段：合成来自Streptococcus intermedius B196的panT，以panT F/panT R为引物PCR扩增，经Cleaning up后获得alsS目的基因，用于后续一步克隆连接。
(3)采用一步克隆试剂盒将pBCS质粒框架和panT目的片段连接，37℃反应1h后导入E.coli DH5α化转感受态细胞中。
(4)挑选阳性菌落，经测序验证正确后接种于LB试管，37℃培养过夜后采用质粒试剂盒提取质粒，获得pBCST质粒，转入菌株DPA21化转感受态中。
(5)挑选阳性菌落DPA21/pBCST，并以实施例12构建的菌株DPA21/pBCS为对照组，按照实施例2(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图14所示。
由图可见，菌株DPA21/pBCST(即CCTCC NO：M 20191027)相比于菌株DPA20/pBCS对细胞生长无显著影响，且D-泛酸效价从6.12g/L增加到6.33g/L，这说明异源泛酸转运体(PanT)的引入可有效增强胞内泛酸的外运，从而提高大肠杆菌胞外D-泛酸的效价。
实施例14：菌株DPA21/pBCST的5L发酵罐的分批补料发酵
(1)挑取DPA21/pBCST(即CCTCC NO：M 20191027)单菌落接种于含0.05mg/L卡那霉素的5mL LB培养基中，37℃培养12h，以10％接种量接种于100mL LB液体培养基培养12h中，共准备3瓶培养基，300mL种子液用于接种5L发酵罐中。5L发酵罐中装液量为2L，培养基配方为：葡萄糖20g/L、硫酸铵16g/L、KH2PO4 0.8g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母提取物2g/L，1mL/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
(2)发酵温度控制在30℃，通过50％氨水控制pH在6.8左右，通过补料培养基控制葡萄糖浓度在5g/L以下，发酵15h时添加0.4g异亮氨酸。补料培养基配方如下：500g/L葡萄糖，10g/L硫酸铵，2g/L酵母粉，14g/L KH2PO4，1mL/L微量元素溶液，8g/L MgSO4。
(3)测定葡萄糖浓度、OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量，如图15所示。
由图可见，DPA21/pBCT3利用发酵培养基在分批补料发酵过程中，保持低糖浓度发酵48h，D-泛酸产量达到32.32g/L，细胞OD600维持在43左右。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种提高基因工程菌泛酸产量的构建方法及菌株
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 74
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 2
<211> 1713
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 2
atgacaaaag caacaaaaga acaaaaatcc cttgtgaaaa acagaggggc ggagcttgtt 60
gttgattgct tagtggagca aggtgtcaca catgtatttg gcattccagg tgcaaaaatt 120
gatgcggtat ttgacgcttt acaagataaa ggacctgaaa ttatcgttgc ccggcacgaa 180
caaaacgcag cattcatggc ccaagcagtc ggccgtttaa ctggaaaacc gggagtcgtg 240
ttagtcacat caggaccggg tgcctctaac ttggcaacag gcctgctgac agcgaacact 300
gaaggagacc ctgtcgttgc gcttgctgga aacgtgatcc gtgcagatcg tttaaaacgg 360
acacatcaat ctttggataa tgcggcgcta ttccagccga ttacaaaata cagtgtagaa 420
gttcaagatg taaaaaatat accggaagct gttacaaatg catttaggat agcgtcagca 480
gggcaggctg gggccgcttt tgtgagcttt ccgcaagatg ttgtgaatga agtcacaaat 540
acgaaaaacg tgcgtgctgt tgcagcgcca aaactcggtc ctgcagcaga tgatgcaatc 600
agtgcggcca tagcaaaaat ccaaacagca aaacttcctg tcgttttggt cggcatgaaa 660
ggcggaagac cggaagcaat taaagcggtt cgcaagcttt tgaaaaaggt tcagcttcca 720
tttgttgaaa catatcaagc tgccggtacc ctttctagag atttagagga tcaatatttt 780
ggccgtatcg gtttgttccg caaccagcct ggcgatttac tgctagagca ggcagatgtt 840
gttctgacga tcggctatga cccgattgaa tatgatccga aattctggaa tatcaatgga 900
gaccggacaa ttatccattt agacgagatt atcgctgaca ttgatcatgc ttaccagcct 960
gatcttgaat tgatcggtga cattccgtcc acgatcaatc atatcgaaca cgatgctgtg 1020
aaagtggaat ttgcagagcg tgagcagaaa atcctttctg atttaaaaca atatatgcat 1080
gaaggtgagc aggtgcctgc agattggaaa tcagacagag cgcaccctct tgaaatcgtt 1140
aaagagttgc gtaatgcagt cgatgatcat gttacagtaa cttgcgatat cggttcgcac 1200
gccatttgga tgtcacgtta tttccgcagc tacgagccgt taacattaat gatcagtaac 1260
ggtatgcaaa cactcggcgt tgcgcttcct tgggcaatcg gcgcttcatt ggtgaaaccg 1320
ggagaaaaag tggtttctgt ctctggtgac ggcggtttct tattctcagc aatggaatta 1380
gagacagcag ttcgactaaa agcaccaatt gtacacattg tatggaacga cagcacatat 1440
gacatggttg cattccagca attgaaaaaa tataaccgta catctgcggt cgatttcgga 1500
aatatcgata tcgtgaaata tgcggaaagc ttcggagcaa ctggcttgcg cgtagaatca 1560
ccagaccagc tggcagatgt tctgcgtcaa ggcatgaacg ctgaaggtcc tgtcatcatc 1620
gatgtcccgg ttgactacag tgataacatt aatttagcaa gtgacaagct tccgaaagaa 1680
ttcggggaac tcatgaaaac gaaagctctc tag 1713
<210> 3
<211> 564
<212> DNA
<213> Streptococcus intermedius
<400> 3
atgaagaagc agagcaatat tgcccagatt gcaatcttct tcgcaattat gctggttatt 60
catctgctga gcagtgttat cttcaatctg ttcccggtgc cgattaaacc gaccattgtg 120
catattccgg ttattattgc cagtattctg tatggtccga aagtgggtgc cctgctgggt 180
gcactgatgg gtgtgattag cctgattacc aataccattg ttctgctgcc gaccagctat 240
ctgttcagtc cgttcgttcc gaatggcaat atctatagtc tgattattgc actgatcccg 300
cgtattctga ttggcattac cccgtacttc gtgtatcgtt atctgaaaaa taagaccggt 360
ctgattctgg ccggtgccat tggtagcctg accaatacca tcttcgttct gggcggcatc 420
ttcctgctgt tcagtaatgt gtataatggt aatatccagc tgctgctggc cagtgtgatt 480
agtaccaata gcattgccga aatgattatt agcgccattc tgaccgtggc aattattccg 540
gccctggaaa aagttcgcaa ataa 564
Claims (8)
1.一种高产泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
(1)以菌株CCTCC NO：M 2018914为底盘菌株，将其基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9 Trc-lpd，记为DPA10；
(2)将DPA9 Trc-lpd基因组中的glk基因敲除，得到DPA9 Trc-lpd/△glk，记为DPA11；
(3)将DPA9 Trc-lpd/△glk基因组中galP基因敲除，得到DPA9 Trc-lpd/△glk/△galP，记为DPA12；
(4)将DPA9 Trc-lpd/△glk/△galP基因组中的pykA基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9 Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-pykA，记为DPA13；
(5)将DPA9 Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-pykA基因组中的pykF基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9 Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-pykA/Trc-pykF，记为DPA14；
(6)将DPA9 Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-pykA/Trc-pykF基因组中的ptsG基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9 Trc-lpd/△glk/ΔgalP/Trc-pykA/Trc-pykA/Trc-ptsGpykF/Trc-ptsG，记为DPA15；
(7)将DPA9 Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-pykA/Trc-pykF/Trc-ptsG基因组中的yfbQ基因敲除，得到DPA9 Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-pykA/Trc-pykA/Trc-ptsG pykF/Trc-ptsG/ΔyfbQ，记为DPA16；
(8)将DPA9 Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-pykA/Trc-pykF/Trc-ptsG/ΔyfbQ基因组中的ppsA基因敲除，得到DPA9 Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-pykA/Trc-pykA/Trc-ptsG pykF/Trc-ptsG/ΔyfbQ/△ppsA，记为DPA17；
(9)将DPA9 Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-pykA/Trc-pykF/Trc-ptsG/ΔyfbQ/ΔppsA基因组中的poxB、pflB、ldhA基因依次敲除，得到新的基因工程菌株DPA9Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-pykA/Trc-pykA/Trc-ptsG pykF/Trc-ptsG/△yfbQ/△ppsA/△poxB/△pflB/△ldhA，记为DPA20；
(10)将DPA9 Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-pykA/Trc-pykF/Trc-ptsG/△yfbQ/△ppsA/△poxB/△pflB/△ldhA基因组中的ilvE基因敲除，得到新的基因工程菌株DPA9Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-pykA/Trc-pykA/Trc-ptsG pykF/Trc-ptsG/△yfbQ/ΔppsA/ΔpoxB/ΔpflB/ΔldhA/ΔilvE，记为DPA21；
(11)在质粒pTrc99a-panBC(CG)上增加来自枯草芽孢杆菌的alsS基因,得到新的质粒pTrc99a-panBC(CG)-alsS(BS)，记为pBCS；
(12)在质粒pTrc99a-panBC(CG)-alsS(BS)上增加来自Streptococcus intermediusB196的panT基因得到新的质粒pTrc99a-panBC(CG)-alsS(BS)-panT，记为pBCST；
(13)将步骤(12)构建好的质粒pBCST导入步骤(10)获得的菌株DPA21中，得到菌株DPA21/pBCST，即为所述高产泛酸的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的高产泛酸的基因工程菌，其特征在于所述菌株为大肠杆菌W3110DPA21/pBCST(Escherichia coli W3110 DPA21/pBCST)，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2019年12月9日，保藏编号：CCTCC NO：M 20191027。
3.构建权利要求1所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
(1)以菌株CCTCC NO：M 2018914为底盘菌株，应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将其基因组中的lpd基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9 Trc-lpd，记为DPA10；
(2)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将DPA10基因组中的glk基因敲除，得到DPA9Trc-lpd/△glk，记为DPA11；
(3)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将DPA11基因组中galP基因敲除，得到DPA9Trc-lpd/△glk/△galP，记为DPA12；
(4)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将DPA12基因组中的ptsG基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9 Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-ptsG，记为DPA13；
(5)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将DPA13基因组中的pykA基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-ptsG/Trc-pykA，记为DPA14；
(6)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将DPA14基因组中的pykF基因的启动子替换为Trc启动子，得到DPA9 Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-ptsG/Trc-pykA/Trc-pykF，记为DPA15；
(7)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将DPA15基因组中的yfbQ基因敲除，得到DPA9Trc-lpd/△glk/△galP/Trc-ptsG/Trc-pykA/Trc-pykF/△yfbQ，记为DPA16；
(8)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术DPA16基因组中的ppsA基因敲除，得到DPA9 Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-ptsG/Trc-pykA/Trc-pykF/ΔyfbQ/ΔppsA，记为DPA17；
(9)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将DPA17基因组中的poxB、pflB、ldhA基因依次敲除，得到新的基因工程菌株DPA9 Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-ptsG/Trc-pykA/Trc-pykF/ΔyfbQ/△ppsA/△poxB/△pflB/ΔldhA，记为DPA20；
(10)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将DPA20基因组中的ilvE基因敲除，得到新的基因工程菌株DPA9 Trc-lpd/Δglk/ΔgalP/Trc-ptsG/Trc-pykA/Trc-pykF/ΔyfbQ/ΔppsA/ΔpoxB/△pflB/△ldhA/△ilvE，记为DPA21；
(11)采用克隆技术在质粒pTrc99a-panBC(CG)上增加来自枯草芽孢杆菌的alsS基因,得到新的质粒pTrc99a-panBC(CG)-alsS(BS)，记为pBCS；
(12)采用克隆技术在质粒pTrc99a-panBC(CG)-alsS(BS)上增加来自Streptococcusintermedius B196的panT基因得到新的质粒pTrc99a-panBC(CG)-alsS(BS)-panT，记为pBCST；
(13)将步骤(12)构建好的质粒pBCST导入步骤(10)获得的菌株DPA21中，得到菌株DPA21/pBCST，即为所述高产泛酸的基因工程菌。
4.如权利要求3所述的方法，所述Trc启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述alsS基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述panT基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.权利要求1或2所述基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种至含有Kan的发酵培养基中，25～30℃、100～200rpm条件下进行发酵培养OD600＝0.8～1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至24～48h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到D-泛酸。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 0.8g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母提取物2g/L、CaCO3 10g/L，1ml/L微量元素溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成为：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述基因工程菌发酵前，先接种至LB培养基中，于温度37℃、转速200rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5％接种量接种到发酵培养基中培养。
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