CN114276972A - 高产d-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用 - Google Patents

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CN114276972A CN202210078213.0A CN202210078213A CN114276972A CN 114276972 A CN114276972 A CN 114276972A CN 202210078213 A CN202210078213 A CN 202210078213A CN 114276972 A CN114276972 A CN 114276972A
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柳志强
吴梓丹
张博
杨辉
李世蓉
王丽芳
郑裕国
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本发明涉及一种高产D‑泛酸的基因工程菌株及其构建方法，以及其在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。本发明通过使用来源于pP43NMK的P43启动子和RBS序列置换ilvC、ilvD基因的原有启动子，强化了泛酸合成途径中的α‑酮异戊酸生成量；通过使用来源于pP43NMK的P43启动子和RBS序列置换panB、panE基因的原有启动子，强化了泛解酸的合成；通过使用来源于pP43NMK的P43启动子和RBS序列置换了panD基因的原有启动子，强化了β‑丙氨酸的合成。同时强化glyA和serA基因的表达，增加胞内丝氨酸的水平。由此达到了高产D‑泛酸的目的。

Description

高产D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用
技术领域
本发明涉及一种高产D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用。
背景技术
在自然界中，泛酸主要存在两种构型：D-泛酸和L-泛酸。在生物体内只有D-泛酸具有生物活性。D-泛酸（D-Pantothenic Acid）又称维生素B5，属于维生素B族水溶性维生素，广泛存在于多种食物中，是人体必需的13种维生素之一。D-泛酸在生物体内可作为辅酶A（CoA）的前体，在几乎所有的生物过程中均发挥着关键作用，推动生物体内的能源代谢和能量交换。泛酸的磷酸化产物巯基乙胺可以合成4-磷酸泛酰巯基乙胺，为辅酶A（CoA）及酰基载体蛋白（ACP） 的组成部分，而CoA及ACP作为构成酰基转移酶的辅酶，广泛参与糖、脂类、蛋白质代谢及肝脏的生物转化作用，对生物体的生长能够起到显著的促进作用。当前发现泛酸只能由植物和微生物合成，动物不能合成泛酸，只能从外界摄取，因此D-泛酸在医药行业、食品工业和饲料工业中的应用有较大潜力。
目前D-泛酸的生产主要有三种方法：化学合成拆分法，生物拆分法以及生物发酵法。化学合成拆分法主要通过两条途径生产D-泛酸：1、以甲醛和异丁醛为起始原料，经醛缩合、腈化以及内酯化等反应生成DL-泛解酸内酯，再进行化学拆分得到D-泛解酸内酯，最后通过与β-丙氨酸钙直接缩合得到D-泛酸钙；2、通过DL-泛解酸内酯与β-丙氨酸钙合成DL-泛酸钙后再诱导结晶，最后通过物理拆分法得到；生物拆分法使用D-立体专一性内酯水解酶水解DL-泛解酸内酯，得到D-泛解酸，再经内酯化反应生成D-泛解酸内酯，最后与β-丙氨酸钙合成得到D-泛酸钙；生物发酵法则是通过添加前体进行发酵，发酵葡萄糖生成D-泛解酸，同时在发酵液中添加β-丙氨酸，最后就可以直接得到D-泛酸。
随着基因工程技术的发展，使用微生物产D-泛酸因其优势日益受到了人们的广泛关注，但利用野生细菌发酵远远不能达到高产D-泛酸的要求，因此需要通过代谢改造的方式来获得高产D-泛酸的工程菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产D-泛酸的基因工程菌株及其构建方法，以及其在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
本发明采用的技术方案是：
高产D-泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
（1）以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为底盘菌，将其基因组中的panB基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panB）；
（2）将工程菌Bacillus subtilis（P43-panB）基因组中的panC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanC）；
（3）将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanC）基因组中的panD基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanD）；
（4）将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanD）基因组中的panE基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanE）；
（5）将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanE）基因组中的ilvC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvC）；
（6）将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvC）基因组中的ilvD基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD）；
（7）将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD）基因组中的serA基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）；
（8）将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）基因组中的glyA基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanC panDpanEilvCilvDserAglyA），即为所述的高产D-泛酸的基因工程菌。
本发明通过使用来源于pP43NMK的P43启动子和RBS序列置换ilvC、ilvD基因的原有启动子，强化了泛酸合成途径中的α-酮异戊酸生成量；通过使用来源于pP43NMK的P43启动子和RBS序列置换panB、panE基因的原有启动子，强化了泛解酸的合成；通过使用来源于pP43NMK的P43启动子和RBS序列置换panD基因的原有启动子，强化了β-丙氨酸的合成。同时强化了glyA和serA基因的表达，增加胞内丝氨酸的水平，由此达到了高产D-泛酸的目的。
本发明还涉及构建所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
（1）以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为底盘菌，运用Cre/loxP基因编辑系统将其基因组中的panB基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panB）；
（2）运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis（P43-panB）基因组中的panC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanC）；
（3）运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanC）基因组中的panD基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanD）；
（4）运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanD）基因组中的panE基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanE）；
（5）运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanE）基因组中的ilvC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvC）；
（6）运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvC）基因组中的ilvD基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD）；
（7）运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD）基因组中的serA基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）；
（8）运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）基因组中的glyA基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserAglyA），此即为所述的高产D-泛酸的基因工程菌。
优选的 ，所述底盘菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 6633。
优选的，所述P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还涉及所述基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
具体的，所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种于发酵培养基中，于30~50℃、180~300 rpm条件下进行发酵培养，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到所述D-泛酸。
优选的，所述发酵培养基组成如下：葡萄糖50~60g/L、大豆粉10~30g/L、1×PSTE、5~10g/L （NH4）2SO4，3~6g/L谷氨酸盐，同时添加10 mM镁以及1.4 mM 钙，溶剂为去离子水，pH值由0.1 M pH 7.2磷酸盐以及0.3 M pH 7.2 MOPS进行调节，维持pH值为6~7。
通常，所述基因工程菌发酵前，先接种至LB培养基中，于温度43℃、转速300 rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度2.5%接种量接种到发酵培养基中培养。
本发明的有益效果主要体现在：本发明通过使用来源于pP43NMK的P43启动子和RBS序列置换panB、panC、panD、panE、ilvC、ilvD、serA以及glyA的原有启动子，强化了D-泛酸生物合成途径中关键酶的表达，最后通过强化α-酮异戊酸以及泛解酸合成途径，最终使得D-泛酸产量相较于出发菌株从0.5g/L提高到了2.63g/L。
附图说明
图1为D-泛酸代谢途径图以及本发明的改造位点；
图2为亚甲基四氢叶酸合成途径以及本发明的改造位点；
图3实施例2所构建工程菌OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量；
图4为实施例3所构建工程菌OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量；
图5为实施例4所构建工程菌OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量；
图6为实施例5所构建工程菌OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量；
图7为实施例6所构建工程菌OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量；
图8为实施例7所构建工程菌OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量；
图9为实施例8所构建工程菌OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量；
图10为实施例9所构建工程菌OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明亲本菌株Bacillus subtilis ATCC 6633来自ATCC。
表1：基因编辑涉及的基因及相应途径
基因名称 涉及途径
<i>panB</i> 酮泛解酸合成
<i>panC</i> 泛酸合成
<i>panD</i> β-丙氨酸合成
<i>panE</i> 泛解酸合成
<i>ilvD</i> α-酮异戊酸合成
<i>ilvBNC</i> 乙酰乳酸、α,β-二羟基异戊酸合成
<i>serA、glyA</i> 丝氨酸合成
表2：引物序列
引物名称 引物序列（5’→3’）
<i>panB</i>-L-F GTGATGGGCCAGCATCTTATT
<i>panB</i>-L-R cgtataatgtatgctatacgaacggtaGGTTTTCTCCTCCTCATGTTTAGAGG
<i>panB</i>-zeo-F CCTCTAAACATGAGGAGGAGAAAACtaccgttcgtatagcatacattatacg
<i>panB</i>-zeo-R caagcgaaaacataccacctatcattcgtataatgtatgctatacg
<i>panB</i>-P43-F cgtatagcatacattatacgaatgataggtggtatgttttcgcttg
<i>panB</i>-P43-R AGAAAATCCAGTTTTGTTTTCATgtgtacattcctctcttacctataatggta
<i>panB</i>-F taccattataggtaagagaggaatgtacacATGAAAACAAAACTGGATTTTCT
<i>panB</i>-R TTATTTTCCCCCGTACAAGCC
<i>panC</i>-L-F TGTTGGTACAAGCCCGTTGAT
<i>panC</i>-L-R cgtataatgtatgctatacgaacggtaCTTATTTTCCCCCGTACAAG
<i>panC</i>-zeo-F CTTGTACGGGGGAAAATAAGtaccgttcgtatagcatacattatacg
<i>panC</i>-zeo-R caagcgaaaacataccacctatcattcgtataatgtatgctatacg
<i>panC</i>-P43-F cgtatagcatacattatacgaatgataggtggtatgttttcgcttg
<i>panC</i>-P43-R GTGAAATATCAGTAATCTGTCTCATgtgtacattcctctcttacctataatggta
<i>panC</i>-F taccattataggtaagagaggaatgtacacATGAGACAGATTACTGATATTTCAC
<i>panC</i>-R TTATATTCTCTCCATTTCTCGAATAT
<i>panD</i>-L-F GTGATGGGCCAGCATCTTATT
<i>panD</i>-L-R cgtataatgtatgctatacgaacggtaGTTTTCTCCTCCTCATGTTTAG
<i>panD</i>-zeo-F CTAAACATGAGGAGGAGAAAACtaccgttcgtatagcatacattatacg
<i>panD</i>-zeo-R caagcgaaaacataccacctatcattcgtataatgtatgctatacg
<i>panD</i>-P43-F cgtatagcatacattatacgaatgataggtggtatgttttcgcttg
<i>panD</i>-P43-R AGAAAATCCAGTTTTGTTTTCATgtgtacattcctctcttacctataatggta
<i>panD</i>-F taccattataggtaagagaggaatgtacacATGAAAACAAAACTGGATTTTCT
<i>panD</i>-R ATATCAGTAATCTGTCTCATCT
<i>panE</i>-L-F GTCGGAAACTATGATTTCTGG
<i>panE</i>-L-R cgtataatgtatgctatacgaacggtaGTTGTGATCTCCTTTCACA
<i>panE</i>-zeo-F TGTGAAAGGAGATCACAACtaccgttcgtatagcatacattatacg
<i>panE</i>-zeo-R caagcgaaaacataccacctatcattcgtataatgtatgctatacg
<i>panE</i>-P43-F cgtatagcatacattatacgaatgataggtggtatgttttcgcttg
<i>panE</i>-P43-R CTCCGACAACCAAAAATTTCATgtgtacattcctctcttacctataatggta
<i>panE</i>-F taccattataggtaagagaggaatgtacacATGAAATTTTTGGTTGTCGGAG
<i>panE</i>-R TTATTTTTCTGCTTCATACATTTGC
<i>ilvC</i>-L-F ACTTGGAACGATGGGATTCG
<i>ilvC</i>-L-R cgtataatgtatgctatacgaacggtaTTCAATCTCTCCCTTGTTATGT
<i>ilvC</i>-zeo-F ACATAACAAGGGAGAGATTGAAtaccgttcgtatagcatacattatacg
<i>ilvC</i>-zeo-R caagcgaaaacataccacctatcattcgtataatgtatgctatacg
<i>ilvC</i>-P43-F cgtatagcatacattatacgaatgataggtggtatgttttcgcttg
<i>ilvC</i>-P43-R TCACCGTTATAATATACTTTTACCATgtgtacattcctctcttacctataatggta
<i>ilvC</i>-F taccattataggtaagagaggaatgtacacATGGTAAAAGTATATTATAACGGTGA
<i>ilvC</i>-R TTAATTTTGCGCAACGGAGA
<i>ilvD</i>-L-F GCTTCCAATGTTGTGTTTGAG
<i>ilvD</i>-L-R cgtataatgtatgctatacgaacggtaGGTGATCCTCCTAAATTCTTTC
<i>ilvD</i>-zeo-F GAAAGAATTTAGGAGGATCACCtaccgttcgtatagcatacattatacg
<i>ilvD</i>-zeo-R caagcgaaaacataccacctatcattcgtataatgtatgctatacg
<i>ilvD</i>-P43-F cgtatagcatacattatacgaatgataggtggtatgttttcgcttg
<i>ilvD</i>-P43-R TACTGCGTAATTCTGCCATgtgtacattcctctcttacctataatggta
<i>ilvD</i>-F taccattataggtaagagaggaatgtacacATGGCAGAATTACGCAGTA
<i>ilvD</i>-R CTAGATTTTCATAATACCGCC
<i>serA</i>-L-F TTAGTGAGAATACAACCGTAATTAC
<i>serA</i>-L-R cgtataatgtatgctatacgaacggtaCGTTAGATTTCCTCCTAAATTGA
<i>serA</i>-zeo-F TCAATTTAGGAGGAAATCTAACGtaccgttcgtatagcatacattatacg
<i>serA</i>-zeo-R caagcgaaaacataccacctatcattcgtataatgtatgctatacg
<i>serA</i>-P43-F cgtatagcatacattatacgaatgataggtggtatgttttcgcttg
<i>serA</i>-P43-R TGAGACCAATACTCGAAACATgtgtacattcctctcttacctataatggta
<i>serA</i>-F taccattataggtaagagaggaatgtacacATGTTTCGAGTATTGGTCTCA
<i>serA</i>-R TTATGGCAGATCAATGAGCT
<i>glyA</i>-L-F GCATGAGCATTTCCGCTAATA
<i>glyA</i>-L-R cgtataatgtatgctatacgaacggtaCAGCGAGATCCTCTCCTATC
<i>glyA</i>-zeo-F GATAGGAGAGGATCTCGCTGtaccgttcgtatagcatacattatacg
<i>glyA</i>-zeo-R caagcgaaaacataccacctatcattcgtataatgtatgctatacg
<i>glyA</i>-P43-F cgtatagcatacattatacgaatgataggtggtatgttttcgcttg
<i>glyA</i>-P43-R TGCGCAGGTAAATGTTTCATgtgtacattcctctcttacctataatggta
<i>glyA</i>-F taccattataggtaagagaggaatgtacacATGAAACATTTACCTGCGCA
<i>glyA</i>-R GGATCTTAATAATCTAATTCTTTATATAAAGG
实施例中，如未特别说明，所述博来霉素在培养基中终浓度为0.025 mg/L，所述氨苄青霉素在培养基中终浓度为0.1 mg/L，所述IPTG在培养基中终浓度为0.2 mmol/L。
实施例1：D-泛酸含量的测定
检测方法如下：
色谱条件：C18柱（250 × 4.6 mm, particle size 5 μm, AgilentTechnologies Co., Santa Clara, CA, USA）、检测波长：200 nm、柱温：30 ℃；
样品处理：将样品用超纯水稀释，保持D-泛酸含量在0.05 g/L到0.40 g/L之间；
流动相：乙腈/水/磷酸：（50/949/1）；
数据采集时间：18 min。
实施例2：构建有效菌株Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panB）及摇瓶发酵
以Bacillus subtilis ATCC 6633为出发菌株，使用Cre/loxP基因编辑技术，用来源于pP43NMK的P43启动子（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示），在基因组上替换掉panB的原有启动子，以增强panB的表达强度。
（1）目的基因panB上游序列构建：以Bacillus subtilis ATCC 6633基因组为模板，以panB-L-F和panB-L-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（2）lox71-zeo-lox66序列构建：以质粒p7z6为模板，以panB-zeo-F和panB-zeo-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（3）P43启动子序列构建：以质粒pP43NMK为模板，以panB-P43-F和panB-P43-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（4）目的基因panB序列构建：以Bacillus subtilis ATCC 6633基因组为模板，以panB-F和panB-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（5）通过融合PCR技术，将目的基因上游、lox71-zeo-lox66、P43启动子和panB目的基因序列进行融合，获得启动子替换框，将启动子替换框转化至B.subtilis中，使用博来霉素抗性LB平板进行筛选，转化子经PCR验证正确后，转入质粒PDG148；将携带PDG148质粒的转化子接种于含有0.2 mmol/L IPTG的液体LB中，培养24 h以表达环化重组酶促进lox71位点与lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因；之后，取1μL培养液接种于2 mL新鲜的LB液体培养基中，在50℃、220 rpm条件下振荡培养10 h后于无抗LB固体平板划线；用10μL枪头将无抗LB固体平板上长出的菌落分别点于博来霉素、氨苄青霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的才为消除PDG148质粒的工程B.subtilis ATCC 6633（P43-panB）菌株。
（6）将B.subtilis ATCC 6633（P43-panB）菌株，以B.subtilis ATCC 6633为对照组，分别接到10 mL的LB液体培养基中，37℃、200 rpm培养过夜，接种1 mL预培养物到装有40 mL的大豆发酵培养基的500 mL摇瓶中，然后在43℃、300 rpm条件下连续培养48 h；发酵结束后取1 mL发酵液于12000 rpm室温离心3 min，将发酵液上清稀释5倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图3所示。
基因组替换panB基因启动子，D-泛酸的产量从0.5 g/L增加到0.8 g/L，这说明panB基因表达的增强可以有效增加泛酸合成路径上前体酮解泛酸的合成，从而有利于枯草芽孢杆菌D-泛酸的合成。
LB培养基：10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，10 g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。
大豆发酵培养基组成如下：葡萄糖60g/L、20g/L Cargill 200/20豆粉、1×PSTE、8g/L （NH4）2SO4和5g/L谷氨酸盐。pH值由0.1 M pH 7.2磷酸盐以及0.3 M pH 7.2 MOPS进行调节，同时添加10 mM镁以及1.4 mM 钙，溶剂为去离子水。
实施例3：构建有效菌株Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanC）及摇瓶发酵
以B.subtilis ATCC 6633（P43-panB）为出发菌株，使用Cre/loxP基因编辑技术，用来源于pP43NMK的P43启动子（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示），在基因组上替换掉panC的原有启动子，以增强panC的表达强度。
（1）目的基因panC上游序列构建：以Bacillus subtilis ATCC 6633基因组为模板，以panC-L-F和panC-L-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（2）lox71-zeo-lox66序列构建：以质粒p7z6为模板，以panC-zeo-F和panC-zeo-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（3）P43启动子序列构建：以质粒pP43NMK为模板，以panC-P43-F和panC-P43-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（4）目的基因panC序列构建：以B.subtilis ATCC 6633（P43-panB）基因组为模板，以panC-F和panC-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（5）通过融合PCR技术，将目的基因上游、lox71-zeo-lox66、P43启动子和panC目的基因序列进行融合，获得启动子替换框，将启动子替换框转化至B.subtilis ATCC 6633（P43-panB）中，使用博来霉素抗性LB平板进行筛选，转化子经PCR验证正确后，转入质粒PDG148；将携带PDG148质粒的转化子接种于含有0.2 mmol/L IPTG的液体LB中，培养24 h以表达环化重组酶促进lox71位点与lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因；之后，取1μL培养液接种于2 mL新鲜的LB液体培养基中，在50℃、220 rpm条件下振荡培养10 h后于无抗LB固体平板划线；用10μL枪头将无抗LB固体平板上长出的菌落分别点于博来霉素、氨苄青霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的才为消除PDG148质粒的工程Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanC）菌株。
（6）将Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanC）菌株，以B.subtilis ATCC6633（P43-panB）为对照组，分别接到10 mL的LB液体培养基中，37℃、200 rpm培养过夜，接种1 mL预培养物到装有40 mL的大豆发酵培养基的500 mL摇瓶中，然后在43℃、300 rpm条件下连续培养48 h；发酵结束后取1 mL发酵液于12000 rpm室温离心3 min，将发酵液上清稀释5倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图4所示。
由图可见，基因组替换panC基因启动子，D-泛酸的产量从0.8 g/L增加到0.92 g/L，这说明panC基因表达的加强可以有效增强泛解酸和β-丙氨酸向泛酸的转化，从而有利于枯草芽孢杆菌D-泛酸的合成。
实施例4：构建有效菌株Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanD）及摇瓶发酵
以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanC）为出发菌株，使用Cre/loxP基因编辑技术，用来源于pP43NMK的P43启动子（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示），在基因组上替换掉panD的原有启动子，以增强panD的表达强度。
（1）目的基因panD上游序列构建：以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanC）基因组为模板，以panD-L-F和panD-L-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、cleanup纯化保存备用。
（2）lox71-zeo-lox66序列构建：以质粒p7z6为模板，以panD-zeo-F和panD-zeo-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（3）P43启动子序列构建：以质粒pP43NMK为模板，以panD-P43-F和panD-P43-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（4）目的基因panD序列构建：以B.subtilis ATCC 6633（P43-panB）基因组为模板，以panD-F和panD-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（5）通过融合PCR技术，将目的基因上游、lox71-zeo-lox66、P43启动子和panD目的基因序列进行融合，获得启动子替换框，将启动子替换框转化至B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanC）中，使用博来霉素抗性LB平板进行筛选，转化子经PCR验证正确后，转入质粒PDG148；将携带PDG148质粒的转化子接种于含有0.2 mmol/L IPTG的液体LB中，培养24 h以表达环化重组酶促进lox71位点与lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因；之后，取1μL培养液接种于2 mL新鲜的LB液体培养基中，在50℃、220 rpm条件下振荡培养10 h后于无抗LB固体平板划线；用10μL枪头将无抗LB固体平板上长出的菌落分别点于博来霉素、氨苄青霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的才为消除PDG148质粒的工程Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanD）菌株。
（6）将Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanD）菌株，以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanC）为对照组，分别接到10 mL的LB液体培养基中，37℃、200 rpm培养过夜，接种1 mL预培养物到装有40 mL的大豆发酵培养基的500 mL摇瓶中，然后在43℃、300 rpm条件下连续培养48 h；发酵结束后取1 mL发酵液于12000 rpm室温离心3 min，将发酵液上清稀释5倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图5所示。
由图可见，基因组替换panD基因启动子，D-泛酸的产量从0.92 g/L增加到1.33 g/L，这说明panD基因表达的加强可以有效增强天冬氨酸向β-丙氨酸的转化，从而有利于枯草芽孢杆菌D-泛酸的合成。
实施例5：构建有效菌株Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanE）及摇瓶发酵
以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanD）为出发菌株，使用Cre/loxP基因编辑技术，用来源于pP43NMK的P43启动子（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示），在基因组上替换掉panE的原有启动子，以增强panE的表达强度。
（1）目的基因panE上游序列构建：以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanD）基因组为模板，以panE-L-F和panE-L-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（2）lox71-zeo-lox66序列构建：以质粒p7z6为模板，以panE-zeo-F和panE-zeo-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（3）P43启动子序列构建：以质粒pP43NMK为模板，以panE-P43-F和panE-P43-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（4）目的基因panE序列构建：以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanD）基因组为模板，以panE-F和panE-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（5）通过融合PCR技术，将目的基因上游、lox71-zeo-lox66、P43启动子和panE目的基因序列进行融合，获得启动子替换框，将启动子替换框转化至B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanD）中，使用博来霉素抗性LB平板进行筛选，转化子经PCR验证正确后，转入质粒PDG148；将携带PDG148质粒的转化子接种于含有0.2 mmol/L IPTG的液体LB中，培养24 h以表达环化重组酶促进lox71位点与lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因；之后，取1μL培养液接种于2 mL新鲜的LB液体培养基中，在50℃、220 rpm条件下振荡培养10 h后于无抗LB固体平板划线；用10μL枪头将无抗LB固体平板上长出的菌落分别点于博来霉素、氨苄青霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的才为消除PDG148质粒的工程Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanD panE）菌株。
（6）将Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanE）菌株，以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanD）为对照组，分别接到10 mL的LB液体培养基中，37℃、200 rpm培养过夜，接种1 mL预培养物到装有40 mL的大豆发酵培养基的500 mL摇瓶中，然后在43℃、300 rpm条件下连续培养48 h；发酵结束后取1 mL发酵液于12000 rpm室温离心3 min，将发酵液上清稀释5倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图6所示。
由图可见，基因组替换panE基因启动子，D-泛酸的产量从1.33 g/L增加到1.51 g/L，这说明panE基因表达的加强可以有效增强酮泛解酸向泛解酸的转化，从而有利于枯草芽孢杆菌D-泛酸的合成。
实施例6：构建有效菌株Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanD panEilvC）及摇瓶发酵
以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanE）为出发菌株，使用Cre/loxP基因编辑技术，用来源于pP43NMK的P43启动子（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示），在基因组上替换掉ilvC的原有启动子，以增强ilvC的表达强度。
（1）目的基因ilvC上游序列构建：以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanE）基因组为模板，以ilvC-L-F和ilvC-L-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（2）lox71-zeo-lox66序列构建：以质粒p7z6为模板，以ilvC-zeo-F和ilvC-zeo-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（3）P43启动子序列构建：以质粒pP43NMK为模板，以ilvC-P43-F和ilvC-P43-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（4）目的基因ilvC序列构建：以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanE）基因组为模板，以ilvC-F和ilvC-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、cleanup纯化保存备用。
（5）通过融合PCR技术，将目的基因上游、lox71-zeo-lox66、P43启动子和ilvC目的基因序列进行融合，获得启动子替换框，将启动子替换框转化至B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanE）中，使用博来霉素抗性LB平板进行筛选，转化子经PCR验证正确后，转入质粒PDG148；将携带PDG148质粒的转化子接种于含有0.2 mmol/L IPTG的液体LB中，培养24 h以表达环化重组酶促进lox71位点与lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因；之后，取1μL培养液接种于2 mL新鲜的LB液体培养基中，在50℃、220 rpm条件下振荡培养10h后于无抗LB固体平板划线；用10μL枪头将无抗LB固体平板上长出的菌落分别点于博来霉素、氨苄青霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的才为消除PDG148质粒的工程Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvC）菌株。
（6）将Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvC）菌株，以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanE）为对照组，分别接到10 mL的LB液体培养基中，37℃、200 rpm培养过夜，接种1 mL预培养物到装有40 mL的大豆发酵培养基的500 mL摇瓶中，然后在43℃、300 rpm条件下连续培养48 h；发酵结束后取1 mL发酵液于12000 rpm室温离心3 min，将发酵液上清稀释5倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图7所示。
由图可见，基因组替换ilvC基因启动子，D-泛酸的产量从1.51 g/L增加到1.82 g/L，这说明ilvC基因表达的加强可以有效增强乙酰乳酸向α,β-二羟基异戊酸的转化，从而有利于枯草芽孢杆菌D-泛酸的合成。
实施例7：构建有效菌株Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanD panEilvCilvD）及摇瓶发酵
以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvC）为出发菌株，使用Cre/loxP基因编辑技术，用来源于pP43NMK的P43启动子（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示），在基因组上替换掉ilvD的原有启动子，以增强ilvD的表达强度。
（1）目的基因ilvD上游序列构建：以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvC）基因组为模板，以ilvD-L-F和ilvD-L-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（2） lox71-zeo-lox66序列构建：以质粒p7z6为模板，以ilvD-zeo-F和ilvD-zeo-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（3） P43启动子序列构建：以质粒pP43NMK为模板，以ilvD-P43-F和ilvD-P43-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（4）目的基因ilvD序列构建：以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvC）基因组为模板，以ilvD-F和ilvD-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（5）通过融合PCR技术，将目的基因上游、lox71-zeo-lox66、P43启动子和ilvD目的基因序列进行融合，获得启动子替换框，将启动子替换框转化至B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvC）中，使用博来霉素抗性LB平板进行筛选，转化子经PCR验证正确后，转入质粒PDG148；将携带PDG148质粒的转化子接种于含有0.2 mmol/L IPTG的液体LB中，培养24 h以表达环化重组酶促进lox71位点与lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因；之后，取1μL培养液接种于2 mL新鲜的LB液体培养基中，在50℃、220 rpm条件下振荡培养10h后于无抗LB固体平板划线；用10μL枪头将无抗LB固体平板上长出的菌落分别点于博来霉素、氨苄青霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的才为消除PDG148质粒的工程Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD）菌株。
（6）将Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD）菌株，以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvC）为对照组，分别接到10 mL的LB液体培养基中，37℃、200 rpm培养过夜，接种1 mL预培养物到装有40 mL的大豆发酵培养基的500 mL摇瓶中，然后在43℃、300 rpm条件下连续培养48 h；发酵结束后取1 mL发酵液于12000 rpm室温离心3 min，将发酵液上清稀释5倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图8所示。
由图可见，基因组替换ilvD基因启动子，D-泛酸的产量从1.82 g/L增加到1.95 g/L，这说明ilvD基因表达的加强可以有效增强α,β-二羟基异戊酸向α-酮异戊酸的转化，从而有利于枯草芽孢杆菌D-泛酸的合成。
实施例8：构建有效菌株Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanD panEilvCilvDserA）及摇瓶发酵
以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD）为出发菌株，使用Cre/loxP基因编辑技术，用来源于pP43NMK的P43启动子（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示），在基因组上替换掉serA的原有启动子，以增强serA的表达强度。
（1）目的基因serA上游序列构建：以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD）基因组为模板，以serA-L-F和serA-L-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（2） lox71-zeo-lox66序列构建：以质粒p7z6为模板，以serA-zeo-F和serA-zeo-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（3） P43启动子序列构建：以质粒pP43NMK为模板，以serA-P43-F和serA-P43-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（4）目的基因serA序列构建：以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD）基因组为模板，以serA-F和serA-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（5）通过融合PCR技术，将目的基因上游、lox71-zeo-lox66、P43启动子和serA目的基因序列进行融合，获得启动子替换框，将启动子替换框转化至B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD）中，使用博来霉素抗性LB平板进行筛选，转化子经PCR验证正确后，转入质粒PDG148；将携带PDG148质粒的转化子接种于含有0.2 mmol/L IPTG的液体LB中，培养24 h以表达环化重组酶促进lox71位点与lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因；之后，取1μL培养液接种于2 mL新鲜的LB液体培养基中，在50℃、220 rpm条件下振荡培养10 h后于无抗LB固体平板划线；用10μL枪头将无抗LB固体平板上长出的菌落分别点于博来霉素、氨苄青霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的才为消除PDG148质粒的工程Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）菌株。
（6）将Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）菌株，以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD）为对照组，分别接到10 mL的LB液体培养基中，37℃、200 rpm培养过夜，接种1 mL预培养物到装有40 mL的大豆发酵培养基的500 mL摇瓶中，然后在43℃、300 rpm条件下连续培养48 h；发酵结束后取1 mL发酵液于12000 rpm室温离心3 min，将发酵液上清稀释5倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图9所示。
由图可见，基因组替换serA基因启动子，D-泛酸的产量从1.95 g/L增加到2.31 g/L，这说明serA基因表达的加强可以有效增加细胞内丝氨酸的水平，从而有利于枯草芽孢杆菌D-泛酸的合成。
实施例9：构建有效菌株Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanD panEilvCilvDserAglyA）及摇瓶发酵
以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）为出发菌株，使用Cre/loxP基因编辑技术，用来源于pP43NMK的P43启动子（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示），在基因组上替换掉glyA的原有启动子，以增强glyA的表达强度。
（1）目的基因glyA上游序列构建：以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）基因组为模板，以glyA-L-F和glyA-L-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（2） lox71-zeo-lox66序列构建：以质粒p7z6为模板，以glyA-zeo-F和glyA-zeo-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（3） P43启动子序列构建：以质粒pP43NMK为模板，以glyA-P43-F和glyA-P43-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（4）目的基因glyA序列构建：以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）基因组为模板，以glyA-F和glyA-R为引物进行PCR扩增，扩增后对产物进行跑胶验证、clean up纯化保存备用。
（5）通过融合PCR技术，将目的基因上游、lox71-zeo-lox66、P43启动子和glyA目的基因序列进行融合，获得启动子替换框，将启动子替换框转化至B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）中，使用博来霉素抗性LB平板进行筛选，转化子经PCR验证正确后，转入质粒PDG148；将携带PDG148质粒的转化子接种于含有0.2 mmol/LIPTG的液体LB中，培养24 h以表达环化重组酶促进lox71位点与lox66位点重组，回收博来霉素抗性基因；之后，取1μL培养液接种于2 mL新鲜的LB液体培养基中，在50℃、220 rpm条件下振荡培养10 h后于无抗LB固体平板划线；用10μL枪头将无抗LB固体平板上长出的菌落分别点于博来霉素、氨苄青霉素和无抗LB固体平板上，只能于无抗固体平板生长的才为消除PDG148质粒的工程Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDse rAglyA）菌株。
（6）将Bacillus subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA
glyA）菌株，以B.subtilis ATCC 6633（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）为对照组，分别接到10 mL的LB液体培养基中，37℃、200 rpm培养过夜，接种1 mL预培养物到装有40 mL的大豆发酵培养基的500 mL摇瓶中，然后在43℃、300 rpm条件下连续培养48 h；发酵结束后取1 mL发酵液于12000 rpm室温离心3 min，将发酵液上清稀释5倍，根据实施例1进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图10所示。
由图可见，基因组替换glyA基因启动子，D-泛酸的产量从2.31 g/L增加到2.63 g/L，这说明glyA基因表达的加强能够与serA基因表达增强发挥同样的效果，能够可以有效增加细胞内丝氨酸的水平，从而有利于枯草芽孢杆菌D-泛酸的合成。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 高产D-泛酸的基因工程菌、构建方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 275
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180
aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240
gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccc 275

Claims (7)

1.高产D-泛酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：
（1）以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为底盘菌，将其基因组中的panB基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panB）；
（2）将工程菌Bacillus subtilis（P43-panB）基因组中的panC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanC）；
（3）将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanC）基因组中的panD基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanD）；
（4）将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanD）基因组中的panE基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanE）；
（5）将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanE）基因组中的ilvC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvC）；
（6）将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvC）基因组中的ilvD基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD）；
（7）将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD）基因组中的serA基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）；
（8）将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）基因组中的glyA基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanD panEilvCilvDserAglyA），即为所述的高产D-泛酸的基因工程菌。
2.构建权利要求1所述基因工程菌的方法，所述方法包括：
（1）以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为底盘菌，运用Cre/loxP基因编辑系统将其基因组中的panB基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panB）；
（2）运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis（P43-panB）基因组中的panC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanC）；
（3）运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanC）基因组中的panD基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanD）；
（4）运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanD）基因组中的panE基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanE）；
（5）运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanE）基因组中的ilvC基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvC）；
（6）运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvC）基因组中的ilvD基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD）；
（7）运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvD）基因组中的serA基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）；
（8）运用Cre/loxP基因编辑系统将工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserA）基因组中的glyA基因的启动子替换为P43启动子，得到工程菌Bacillus subtilis（P43-panBpanCpanDpanEilvCilvDserAglyA），即为所述的高产D-泛酸的基因工程菌。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述底盘菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 6633。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.权利要求1所述基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种于发酵培养基中，于30~50℃、180~300 rpm条件下进行发酵培养，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到所述D-泛酸。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖50~60g/L、大豆粉10~30g/L、1×PSTE、5~10g/L (NH4)2SO4，3~6g/L谷氨酸盐，同时添加10 mM镁以及1.4mM 钙，溶剂为去离子水，pH值由0.1 M pH 7.2磷酸盐以及0.3 M pH 7.2 MOPS进行调节，维持pH值为6~7。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040152173A1 (en) * 2001-07-03 2004-08-05 Georg Thierbach Process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid and/or salts thereof
KR20050021433A (ko) * 2005-01-03 2005-03-07 바스프 악티엔게젤샤프트 판토테네이트의 생산을 향상시키기 위한 미생물 및 방법
CN111100834A (zh) * 2019-12-31 2020-05-05 浙江工业大学 一种提高基因工程菌泛酸产量的构建方法及菌株
CN111172091A (zh) * 2020-02-17 2020-05-19 江南大学 一种5-甲基四氢叶酸产量提高的枯草芽孢杆菌及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040152173A1 (en) * 2001-07-03 2004-08-05 Georg Thierbach Process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid and/or salts thereof
KR20050021433A (ko) * 2005-01-03 2005-03-07 바스프 악티엔게젤샤프트 판토테네이트의 생산을 향상시키기 위한 미생물 및 방법
CN111100834A (zh) * 2019-12-31 2020-05-05 浙江工业大学 一种提高基因工程菌泛酸产量的构建方法及菌株
CN111172091A (zh) * 2020-02-17 2020-05-19 江南大学 一种5-甲基四氢叶酸产量提高的枯草芽孢杆菌及其应用

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