CN1142997C - 生产d-泛解酸和d-泛酸或其盐的方法 - Google Patents

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Abstract

有一个公开的生产D-泛解酸或D-泛酸的方法，利用微生物的能力合成D-泛解酸或D-泛酸。根据此方法，(a)D-泛解酸由多种碳源如葡萄糖生物合成以便在培养基中积累之，或(b)β-丙氨酸通过，例如，将β-丙氨酸加入到培养基中从而与微生物进行接触，导致生物合成的D-泛解酸与β-丙氨酸凝聚下来从而在培养基中积累D-泛解酸。

Description

生产D-泛解酸和D-泛酸或其盐的方法
                      发明领域
本发明涉及一种生产D-泛解酸和/或D-泛酸，或其盐的新方法。泛酸是有用的维生素，泛解酸是生产泛酸或辅酶A的一种重要的中间产物。
                       发明背景
D-泛酸是有用的维生素。现有技术生产D-泛酸的方法包括(1)一种包含旋光拆开DL-泛内酯(pantolactone)并利用在甲醇中β-丙氨酸或其盐与如此形成的D-泛内酯化学缩合的方法，(2)一种包含利用微生物或酶水解D-泛酸酯以获得D-泛酸，或者仅选择性地水解DL-泛酸酯的D-异构体以获得D-泛酸的方法(JP-Al-228487，JP-Al-2284488)，(3)一种包含在Tris缓冲液中使D-泛解酸钾，β-丙氨酸和ATP与一种微生物的静止细胞或其酶进行接触的方法(Journal of Biological Chemistry，Vol.198，p.23(1952)，Abstracts of Papers 176th American Chemical Society NationalMeeting，Division of Microbial and Biochemical Technology，Vol.48(1978)，etc.)，(4)一种包含在DL-泛解酸和β-丙氨酸存在的情况下培养一种特定的微生物及用β-丙氨酸特异性地凝聚D-泛解酸以获得D-泛酸的方法(JP-A5-23191)，和(5)一种包含在β-丙氨酸存在的情况下培养一种特定的微生物以获得D-泛酸的方法(JP-A6-216772)。
生产D-泛解酸和/或D-泛内酯的方法包括(6)一种包含利用一种分解剂例如奎宁和番木鳖碱旋光拆开化学合成的DL-泛内酯的方法，(7)一种包含利用一种特定的微生物仅分解DL-泛内酯中的L-泛内酯以获得反D-泛内酯的方法，(8)一种包含利用一种特定的微生物仅氧化DL-泛内酯中的L-泛内酯以获得酮泛内酯，然后非对称地还原成D-泛内酯的方法(JP-A47-19745)，(9)一种包含利用一种特定的微生物非对称地还原化学合成的酮泛内酯以获得D-泛内酯的方法(JP-B61-14797)，(10)一种包含利用一种特定的微生物选择性地和非对称地水解DL-泛内酯中的L-泛内酯以获得D-泛内酯的方法(JP-A57-152895和JP-A62-294092)，(11)一种包含利用一种特定的微生物选择性地和非对称地水解DL-泛内酯中的D-泛内酯以获得D-泛解酸的方法(JP-B3-65198)，和(12)一种包含培养一种特定的微生物从葡萄糖中生物合成D-泛解酸的方法(JP-A6-261772)。
在D-泛酸(从此以后皆包括其盐的形式)的工业生产过程中，以上方法(1)不仅需要复杂的步骤来合成主要的原料DL-泛内酯，而且包含复杂而困难的旋光拆开步骤。以上方法(2)不利地需要一个步骤以便从DL-泛内酯生产D-泛酸酯或DL-泛酸酯。以上方法(3)不利地使用昂贵的ATP和Tris缓冲液，并且它是一个不实用的方法，因为它从昂贵的起始材料D-泛解酸中仅能产生少量的泛酸。以上方法(4)比其它方法都简单，但是它需要步骤来生产DL-泛酸和消旋。以上方法(5)比以上方法(4)更加简单，然后，位于泛酸生物合成途径上游的缬氨酸生物合成途径的活性在培养的后期阶段消失，并且泛酸的生产随着缬氨酸的耗尽而终止。因而产量是有限的。
大多数生产D-泛解酸和/或泛内酯的方法不利地使用了需要经过复杂的步骤才能合成的起始材料DL-泛内酯。另外，以上方法(6)不利地使用了昂贵的分解剂并且很难回收D-泛内酯。以上方法(7)由于半数的DL-泛内酯被损失掉因而是不利的。以上方法(8)、(9)、(10)和(11)因为将使用的微生物的特性和泛内酯或泛解酸的特性，很难在培养液中以100％的旋光产出率仅生产出D-异构体。再者，以上方法(6)，(10)和(11)需要额外的复杂步骤来恢复和回收剩余的L-异构体。在以上方法(12)中D-泛解酸的生产依赖于正如以上泛酸生产方法(5)中的缬氨酸生物合成的活性。
                        发明概述
本发明的发明人已进行了深入的研究以期获得生产泛酸的在工业上有利和有效的方法。因此，在一种包括在含有β-丙氨酸的培养基中培养微生物生产D-泛解酸的方法中，已经发现一种被含有分支的氨基酸生物合成基因转化的细菌菌株能够在培养基中的较高浓度生产D-泛酸或D-泛解酸(和/或D-泛内酯)。质粒的导入增强了缬氨酸生物合成在培养早期的活性并且在中期和后期保持了已增加的活性。泛酸的生产因此持续时间更长，并且最终产物和积累得到增加。
本发明提供了一种生产D-泛解酸或其盐的方法，它包括培养用含有一段具有泛酸生物合成基因区域或其一部分和分支的氨基酸生物合成基因区域或其一部分的DNA的质粒转化的一种微生物，在培养基中生产和积累D-泛解酸或其盐，并且收集D-泛解酸或其盐。
本发明也提供了一种生产D-泛酸或其盐的方法，它包括培养用含有一段具有泛酸生物合成基因区域或其一部分和分支的氨基酸生物合成基因区域或其一部分的DNA的质粒转化的一种微生物，在β-丙氨酸存在时在培养基中生产和积累D-泛酸或其盐，并且收集D-泛酸或其盐。
本发明进一步提供了一种生产D-泛解酸或其盐的方法，它包括培养用含有一段具有泛酸生物合成基因区域或其一部分的DNA的质粒和含有一段具有分支的氨基酸生物合成基因区域或其一部分的DNA的质粒转化的一种微生物，在培养基中生产和积累D-泛解酸或其盐，并且收集D-泛解酸或其盐。
本发明进一步提供了一种生产D-泛酸或其盐的方法，它包括培养用含有一段具有泛酸生物合成基因区域或其一部分的DNA的质粒和含有一段具有分支的氨基酸生物合成基因区域或其一部分的DNA的质粒转化的一种微生物，在β-丙氨酸存在时在培养基中生产和积累D-泛酸或其盐，并且收集D-泛酸或其盐。
另外，本发明提供了一种被以下质粒转化的微生物，(a)含有一段具有泛酸生物合成基因区域或其一部分和分支的氨基酸生物合成基因区域或其一部分的DNA的质粒，或(b)含有一段具有泛酸生物合成基因区域或其一部分的DNA的质粒和含有一段具有分支的氨基酸生物合成基因区域或其一部分的DNA的质粒，并且它可以在β-丙氨酸存在时生产泛解酸或生产泛酸。
优选地，此微生物是大肠埃希氏菌FV5069/pFV202(FERM BP-5227)。
再者，本发明提供了一种质粒，它含有一段具有泛酸生物合成基因区域或其一部分和分支的氨基酸生物合成基因区域或其一部分的DNA。
优选地，此质粒是pFV202。
在本发明中，分支的氨基酸生物合成基因区域或其一部分优选地是ilvGM基因。
本发明可以增加缬氨酸的生产，而这在以上方法(5)和(1 2)中正是一个难题，因此可积累更高浓度的泛酸。
附图简述
图1是被插入到pFV2020中的4．7 kb DNA片段的限制性图谱。
发明详述
在本发明中，  D一泛解酸，  D一泛酸和β一丙氨酸可以以它们的盐的形式存在。术语“D一泛解酸”，  “D一泛酸”和“β一丙氨酸”有在此处包括它们的盐以及它们的游离形式。D一泛解酸，  D一泛酸和凸一丙氨酸的盐的例子包括与碱金属和碱土金属形成的盐。在各种情况下，钙盐，钠盐或钾盐是优选的。
本发明人进行了研究以发展一种有效且经济的方法来通过利用一种属于埃希氏菌属等的微生物进行直接发酵从例如糖类等碳源中生产D一泛解酸。因此，已经发现在被重组DNA技术处理过的微生物中包括一种能够生产出比较高数量的泛解酸的微生物菌株，以不仅增加它们的泛酸生物合成途径而且增加它们位于上游区的缬氨酸生物合成途径。进一步发现通过在含有碳源的培养基中使这样一种微生物与β一丙氨酸接触可以产生大量的D一泛酸。即，本发明生产D一泛酸或D一泛酸的方法利用了微生物的能力来合成D一泛解酸或D一泛酸。由此，  (a)D一泛解酸由各种不同的碳源例如葡萄糖等生物合成出来积累在培养基中，或(b)p一丙氨酸通过，例如，加D一丙氨酸到培养基中，与微生物进行接触从而导致生物合成的D一泛解酸与D一丙氨酸缩合以便在培养基中积累D一泛酸。从而，本发明的方法可以通过利用重组DNA技术提高不仅泛酸生物合成途径活性而且位于其上游区的缬氨酸生物合成途径活性，从而生产出更高浓度的D一泛解酸和D一泛酸。
本发明中使用的微生物包括在β一丙氨酸存在时能够产生D一泛酸的微生物和能够产生D一泛解酸的微生物。为了实际应用，这些微生物优选地是属于肠杆菌科的微生物，例如属于柠檬酸杆菌属，志贺氏菌属，克雷伯氏菌属，肠杆菌属，沙门氏菌属和埃希氏菌属的微生物。更优选的微生物的例子包括属于埃希氏菌属的细菌菌株，例如已知的列在List0f Cultures，8th ed．，1 988(Institute  for  Fermentation，0saka，Japan)上的大肠埃希氏菌菌株(例如，  Escherichia  co“  IFO  3 547)和由此衍生出的菌株。衍生菌株的例子包括大肠埃希氏菌菌株FV5069，它是通过给大肠埃希氏菌IFO3547提供水杨酸抗性，α-酮异戊酸抗性，α-丁酮酸抗性，β-羟基天冬氨酸抗性和o-甲基苏氨酸抗性而获得的，大肠埃希氏菌株FV 5069/pFV202(FERM BP-5227)是通过用含有泛酸生物合成基因区域或其一部分和分支的氨基酸生物合成基因区域或其一部分的质粒pFV 202转化大肠埃希氏菌菌株FV5069而获得的。
含有分支的氨基酸生物合成基因的基因片段可以通过描述在，例如，H.Saito和K.Miura，Biochim.Biophys.Acta，72，619(1963)上的已知方法或其修改的方法进行制备。例如，染色体DNA从供体细胞中提取出来，然后用限制性内切酶HindIII切开。然后，获得的染色体DNA片段被插入到载体DNA中。本发明中使用的载体DNA是从可以在宿主细胞中生长的载体DNA中适当地挑选出来的。在宿主细胞中可以生长的载体DNA包括，例如，pSC101(Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，70，3240(1973))，和pUC18(Gene，33，103(1985))。并不特异性地局限在这些载体DNA中，可以使用那些新分离或新合成的载体DNA，只要它们能够完成本发明的目标。基因片段可以通过描述在，例如，T.Maniatis et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，Todai Shuppankai(1982))等上的已知方法或其修改的方法被插入到这些质粒载体中。已被基因片段插入后的质粒可以通过描述在，例如，J.Mol.Biol.，42，159(1972)等上的已知转化方法或其修改的方法被导入到宿主细胞中。宿主细胞的例子包括已知的细菌菌株例如大肠埃希氏菌株JM 109(J.Mol.Biol.，166(1983))。
被导入含有分支的氨基酸生物合成基因的质粒的菌株可以通过，例如，菌落杂交技术等，利用大肠埃希氏菌株K-12的一部分乙酰羟酸合酶基因序列作为探针，从已转化的菌株中挑选出来。含有如此获得的分支的氨基酸生物合成基因的质粒DNA可以从其宿主细胞中提取出来，并且导入其他宿主细胞中。作为一种替代方法，含有分支的氨基酸生物合成基因的DNA片段可以从提取的质粒DNA中制备，然后连接到其他的载体上。
如此获得的转化菌株的例子包括大肠埃希氏菌株FV5069/pFV202(FERM BP-5227，TFO 15857)。pFV202是一种质粒，含有一个源自大肠埃希氏菌株FV525的泛酸生物合成基因和一个源自大肠埃希氏菌株FV5069的分支的氨基酸生物合成基因(乙酰羟酸合酶同功酶II基因)。大肠埃希氏菌株FV5069/pFV202(FERM BP-5227)是一个通过将pFV202导入大肠埃希氏菌株FV5069后获得的菌株。根据布达佩斯条约，此处所用的IFO号码是Institute for Fermentation Osaka(IFO)(17-5 Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-Ku，Osaka-shi，Japan)的贮藏号，此处所用的FERM BP号码是National Institute ofBioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Scienceand Technology(NIBH)(1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)的贮藏号。尤其，自从1995年9月7日，大肠埃希氏菌株FV5069/pFV202就根据布达佩斯条约以贮藏号FERM BP-5227贮存在NIBH中。
如此获得的细菌菌株可以进行连续或间歇培养按照传统的方法例如摇床培养(例如，在旋转摇床上进行摇床培养)，静止培养和通气摇床培养。使用的培养基可以是使用的微生物能够生长的传统配方。碳源可以适当地选自可同化的碳源例如碳水化合物，油脂，脂肪酸，有机酸和酒精，可以单独使用或使用它们的混合物。氮源包括，例如，有机氮源如蛋白胨，大豆粉，棉子粉，玉米浸液，酵母汁，肉汁，麦芽汁和尿素，以及无机氮源如硫酸铵，氯化铵，硝酸铵和磷酸铵。这些氮源可以单独使用或使用其混合物。使用磷酸二氢钾或磷酸氢二钾作为磷源较为有利。培养基除了碳源、氮源和磷源外，可以含有生长必需的金属盐(例如，硫酸镁)，必需生长因子或生长促进物质如氨基酸和维生素。为了在培养时控制pH值，可适当加入些碱性物质如氢氧化钠，氢氧化钾，氨水，碳酸钙等。抗泡沫剂的加入可以有效地控制产生泡沫。这些物质可以在培养时适当地加入。为了保持通气条件，输入含氧丰富的气体是很有效的。培养温度通常为15℃到45℃，优选地为25℃到40℃。培养持续进行直到获得最大积累的泛酸和/或泛解酸。通常，一个6小时到120小时的培养周期可以达到这一目标。根据本发明，在D-泛酸的生长过程中，可以通过在细菌菌株培养之前或培养过程中的适当阶段加入原料，或将原料加入到经处理的细菌细胞中，使原料β-丙氨酸与细菌细胞接触。经处理后的细菌细胞意谓着清洗通过培养细菌获得的细菌细胞，丙酮干燥细菌细胞，用聚丙烯酰胺凝胶或k-角叉藻聚糖固定化细菌细胞等。原料可以一次性加入或经过适当的一段时间连续地或间歇地以一种在适当溶剂如水中的溶解液或悬浮液形式或以粉末形式加入。
加入培养基中的β-丙氨酸的浓度随着微生物生产率的不同而不同。多节约的观点上，β-丙氨酸的浓度优选地为0.1到6w/v％，更优选地为0.5到4w/v％。
D-泛酸或其盐可以通过传统的方法从以上的培养物或反应混合物中分离出来。例如，从培养物中除去细菌细胞后，剩余物经过已知的分离技术如离子交换色谱，活性炭，合成吸附剂等的吸收，浓缩和结晶以分离D-泛酸或其盐。这些技术可以单独或联合使用。根据JP-B40-2330结晶作用在工业上非常有利，因为它能够高产量地产生可轻易过滤的晶体。根据这种结晶作用方法，可获得每mol泛酸钙中含有4mol甲醇和1mol水的溶解的水合物(Calcium pantothenate·4MeOH·1H2O)作为沉淀的晶体。干燥形成的晶体可除去晶体中的甲醇和水得到泛酸钙(M.Inagaki et al.，Chem.Pharm.Bull.，24，3097-3102(1976))。
例如，D-泛酸钙可以按照下面所述从培养液中进行分离。将已除去细菌细胞的培养液通过一个装有阳离子交换树脂的柱子(例如，Diaion PK-216(H-form)，PK-228(H-form)由Mitsubishi ChemicalCorporation制造)以除去阳离子，然后通过一个装有阳离子交换树脂的柱子(例如，PA-412(H-form)，WA-30(H-form)由MitsubishiChemical Corporation制造)以除去无机阴离子和具有比泛酸更强的酸度的有机酸。将氢氧化钙加入到含有游离泛酸的洗脱物(pH：约2.6)中调整pH到约5.0，然后此混合物被浓缩到泛酸浓度约为25w/v％。然后，加入氢氧化钙调整pH到约7.0，再加入活性炭(例如，例如，ShirasagiA由Takeda Chemical Industries，Ltd.制造)进行脱色。经过滤将活性炭除去后，滤液被浓缩到泛酸浓度约45％到55％(w/w)。然后加入适量的甲醇调整溶液中的含水量到5％到15％，然后，溶液被冷却到约2℃，并加入种子晶体沉淀溶解的水合物泛酸钙的晶体。收集和干燥得到的晶体从而高产量地获得高纯度的D-泛酸。
                            实施例
以下的实施例进一步详细地说明了本发明，但不能被解释为对其范围进行限制。
D-泛酸通过高效液相色谱(柱子：Shimadzu SCR101H(7.9mm，I.D.×30cm)；流动相：0.008N硫酸；流速：0.8ml/min；检测：差示折光仪)和/或生物分析(试验菌：植物乳酸杆菌IFO 3070；培养基：可购买到的定量测定泛酸用培养基(DIFCO生产))。进行测定。培养物中的缬氨酸通过高效液相色谱(柱子：Mitsubishi Chemical CorporationMCI GEL CRS 10W(4.6mmI.D.x5cm)；流动相：1mM-CuSO4/CH3CN＝7/1；流速：0.7ml/min；检测：UV光度计)。
实施例1
(1)染色体DNA的制备
大肠埃希氏菌FV5069被接种到L培养基中(1升)(细菌胰蛋白胨10％，酵母浸汁0.5％，氯化钠0.5％)并在37℃培养过夜。从生成的细菌细胞中，利用酚通过Saito et al.的方法(Biochim.Biophys.Acta.，72，619(1963))得到染色体DNA(最终产量：3.3mg)。
(2)染色体DNA插入到载体质粒pUC18中
以上(1)中获得的每份染色体DNA(10μg)和pUC18(由NipponGene生产)用限制性内切酶HindIII(Nippon Gene生产)进行切割，形成的DNA片段被混合起来并且用源自T4噬菌体的连接酶(NipponGene)进行连接。
(3)染色体DNA片段插入后的质粒DNA的挑选
大肠埃希氏菌株JM109通过感受态细胞方法被在以上(2)中的各种质粒的混合物所转化。然后，一个含有此转化株的悬浮液被涂布在一种含有氨苄青霉素钠盐(50μg/ml)，IPTG(0.5mM)和X-gal(100μg/ml)的L琼脂平板培养基上并且在37℃培养过夜。在形成的菌落中，白色菌落作为被含有染色体DNA片段的质粒DNA转化的转化株被挑选出来。
(4)探针的制备
大约600bp序列的被Rother等测定的大肠埃希氏菌株K-12ilvG基因(乙酰羟酸合酶同功酶II大亚基基因，Nucleic Acids Research，2137，15(1987))通过PCR方法被扩增。扩增后有基因通过随机方法用32P进行标记，并用作探针。
(5)乙酰羟酸合酶同功酶II基因的克隆
放置一层尼龙膜于含有氨苄青霉素钠(50μg/ml)的L琼脂平板培养基上，用以上(3)中得到的白色菌落在其上进行划线，并在37℃培养过夜。此膜用碱处理，中和后在80℃烘烤2小时以固体膜上的细胞内DNA。通过利用以上(4)中的探针，将此膜进行杂交以获得一株比其他菌落发射出明显地更强信号的菌落。
(6)通过Southern杂交进行确定
从以上的菌落中提取出质粒(10μg)，用HindIII切割并进行电泳。插入的片段通过Sonthern杂交进行分析。结果表明这一片段为4.7kb长(含有K-12乙酰羟酸合酶同功酶II基因的HindIII片段也是4.7kb长)并且能与以上(4)中获得的探针高度地杂交。
(7)表达质粒的构建
以上4.7kb插入片段被插入到质粒载体pMW118的HindIII位点，大肠埃希氏菌FV525的2.5kb的泛酸生物合成基因被插入到EcoRI位点。形成的质粒被命名为pFV202。用这种质粒转化泛酸生产菌株FV5069，形成的转化株被命名为FV5069，形成的转化株被命名为FV5069/pFV202。这一转化株的乙酰羟酸合酶同功酶II活性与用pFV31转化的仅插入泛酸生物合成基因的FV5069/pFV31的活性及未经转化的原始菌株FV5069的活性进行比较。
(8)转化株乙酰羟酸合酶活性的测定
测试细菌在生产培养基(A)中培养的48小时，通过超声波处理制备细菌的裂解液。将裂解液US20,000rpm离心1小时得到上清液。按照Jaekson的方法(Methods Enzymol.1988)，利用上清液作为粗酶溶液，形成的乙酰乳酸被转化成3-羟基丁酮。形成的3-羟基丁酮用2-萘酚染色并在530nm波长下进行定量测定。
结果见表1。
由表1可看出，插入到pFV202中的4.7kb的HindIII片段含有编码乙酰羟酸合成酶同功酶II的ilvGM基因。
                       表1
细菌菌株                         比活性(μmol/min.mil)
FV5069                            38.2
FV5069/pFV31                      35.7
FV5069/pFV202                     108.9
(9)含有ilvGM的4.7kb片段的限制图谱
插入到pFV202中的4.7kb DNA片段含有一个Pstl位点，一个SalI位点。图1显示出此片段的限制性图谱。
实施例2
具有表2中显示的成分的液体培养基在高压灭菌锅中加热至121℃15分钟灭菌，以每份20ml分装到200ml的三角瓶中。在培养基中接入从以上实施例1(7)中的斜面培养基上获得的大肠埃希氏菌株FV5069/pFV202(FERM BP-5227)和菌株FV5069/pFV31(FERM BP-4395)每种一接种环，以220rpm在摇床上30℃培养20小时。将种子培养物转接到具有表2中显示的成分的培养基中(20ml)，在200ml的三角瓶中38℃摇床培养72小时。在培养期间，如表3中所示各种不同物质加入其中。表4中显示出在培养结束时产生的泛酸(PaA)数量和缬氨酸(Val)的当量。
                         表2
 培养基成分：
种子培养基：
  CSL                                0.5％
  (NH4)2SO4                      0.5％
  MgSO4·7H2O                     0.001％
  KH2PO4                          0.01％
  K2HPO4                          0.01％
  盐酸硫胺素                         2μg/ml
  葡萄糖                             5％
  CaCO3                             2％
  pH                                 7.0
主培养基：
  CSL                                2％
  (NH4)2SO4                      1.25％
  MgSO4·7H2O                     0.002％
  KH2PO4                          0.01％
  β-丙氨酸                          1％
  盐酸硫胺素                         0.5μg/ml
  葡萄糖                             9％
  CaCO3                             4％
  pH                                 7.0
表3
各种不同物质的加入
培养时间      葡萄糖      盐酸硫胺素    (NH4)2SO4       β-丙氨酸
17小时        6％         0.5μg/ml                         1％
24小时        6％         0.5μg/ml      0.75％             0.5％
41小时        4％         0.5μg/ml                         0.5％
50小时        5％         0.5μg/ml
表4
培养结果
培养时间               FV5069/pFV31                  FV5069/pFV202
             PaA           Val           PaA              Val
24小时     38.7g/l        2.1g/l       29.9g/l           5.2g/l
48小时     52.5g/l        1.1g/l       60.1g/l           2.7g/l
72小时     51.8g/l        0.9g/l       66.0g/l           1/3g/l
如上所述，本发明的方法可以提高位于泛解酸和泛酸生物合成途径上游的缬氨酸生物合成途径的活性的增加缬氨酸的产出率，并且能够生产出更高浓度的泛解酸和泛酸。因此，本发明的方法是一种在工业上有利的和有效的方法。

Claims (3)

1.一种生产D-泛酸或其盐的方法，包括在β-丙氨酸存在时培养一种大肠埃希氏菌株的转化株以在培养基中生产和积累D-泛酸或其盐，并收集此D-泛酸或其盐，所说的转化株被以下质粒所转化(a)一种含有具有泛酸生物合成基因区域和ilvGM基因的DNA的质粒，或(b)一种含有具有泛酸生物合成基因区域的DNA的质粒和一种含有具有ilvGM基因的DNA的质粒，以相比于其亲本菌株增强泛酸生物合成途径和缬氨酸生物合成途径的活性。
2.一株大肠埃希氏菌的转化株，它被以下质粒所转化(a)一种含有具有泛酸生物合成基因区域和ilvGM基因的DNA的质粒，或(b)一种含有具有泛酸生物合成基因区域的DNA的质粒和一种含有具有ilvGM基因的DNA的质粒，以相比于其亲本菌株增强泛酸生物合成途径和缬氨酸生物合成途径的活性，并且它能够在β-丙氨酸存在时产生泛酸。
3.权利要求2中的转化株，它是大肠埃希氏菌FV5069/pFV202，其保藏号为FERM-BP5227。
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19855314A1 (de) * 1998-12-01 2000-06-08 Degussa Verfahren zur fermentiven Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE19855313A1 (de) 1998-12-01 2000-06-08 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure durch Verstärkung des panD-Gens in Mikroorganismen
PL348731A1 (en) 1998-12-25 2002-06-03 Daichi Fine Chemical Co Ltd Method for producing calcium pantothenate
EP1050219B1 (de) * 1999-05-05 2002-11-20 Degussa AG D-Pantothensäure und/oder eines ihrer Salze enthaltende Futtermittel-Additive und Verfahren zu deren Herstellung
HU230509B1 (hu) 1999-09-21 2016-09-28 Basf Aktiengesellschaft Eljárások és mikroorganizmusok panto-vegyületek előállítására
US8232081B2 (en) * 1999-09-21 2012-07-31 Basf Se Methods and microorganisms for production of panto-compounds
DE10021515A1 (de) * 2000-05-03 2001-11-08 Degussa Verfahren zur Herstellung von Erdalkalisalzen der D-Pantothensäure
DE10032349A1 (de) 2000-07-04 2002-01-17 Degussa Rieselfähige D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltende Futtermittel-Additive und Verfahren zu deren Herstellung
PL360590A1 (en) * 2000-09-20 2004-09-06 Basf Aktiengesellschaft Animal feed supplement containing d-pantothenic acid and/or its salts, improved method for the production thereof, and its use
DE10108225A1 (de) 2001-02-21 2002-10-10 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze als Zusatz zu Tierfuttermitteln
HU230180B1 (hu) * 2001-02-21 2015-09-28 Basf Ag Eljárás D-pantoténsav és/vagy sói előállítására állati takarmányadalékként
EP1362116B1 (de) 2001-02-21 2006-12-27 Basf Aktiengesellschaft Verfahren zur herstellung von d-pantothensäure und/oder deren salze als zusatz zu tierfuttermitteln
DE10112100A1 (de) * 2001-03-14 2002-09-19 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen
US6623944B2 (en) 2001-03-14 2003-09-23 Degussa Ag Process for preparation of D-pantothenic acid and/or salts thereof
DE10132178A1 (de) 2001-07-03 2003-01-23 Degussa Verfahren zur fermantativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen
WO2003006664A2 (en) 2001-07-07 2003-01-23 Degussa Ag Process for the preparation of d-pantothenic acid and/or salts thereof
US7989187B2 (en) * 2002-07-03 2011-08-02 Basf Se Microorganisms and processes for enhanced production of pantothenate
WO2007131750A1 (en) 2006-05-16 2007-11-22 Dsm Ip Assets B.V. Process for the production of panthenol
CN109705065B (zh) * 2018-12-29 2022-10-14 上海应用技术大学 一种不对称催化合成d-(-)-泛解酸内酯的方法
KR102389327B1 (ko) * 2020-07-01 2022-04-20 씨제이제일제당 (주) 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도
CN112592290B (zh) * 2020-12-14 2023-08-11 广安摩珈生物科技有限公司 泛酸钙粗品纯化方法
CN115595314A (zh) * 2022-03-07 2023-01-13 中国科学院微生物研究所（Cn） 表达天冬氨酸脱氢酶的工程菌及发酵生产维生素b5的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2748418B2 (ja) * 1988-08-03 1998-05-06 味の素株式会社 組換えｄｎａ、該組換えｄｎａを有する微生物
EP0493060A3 (en) * 1990-12-25 1993-04-14 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production method of d-pantothenic acid and plasmids and microorganisms thereof
JP3710497B2 (ja) * 1992-09-25 2005-10-26 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法

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