DE10112100A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen - Google Patents
Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren SalzenInfo
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Abstract
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen oder diese enthaltende Futtermitteladditive durch Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere solchen, die bereits D-Pantothensäure produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß man das (die) für die pckA-Gen kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) in den Mikroorganismen abschwächt, insbesondere ausschaltet.
Description
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen
Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen oder
diese enthaltende Mischungen unter Verwendung von
Microorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen
mindestens das pckA-Gen abgeschwächt wird.
Pantothensäure wird weltweit in einer Größenordnung von
mehreren tausend Tonnen pro Jahr produziert. Es wird unter
anderem in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen
Industrie und in der Lebensmittelindustrie verwendet. Ein
großer Teil der produzierten Pantothensäure wird für die
Ernährung von Nutztieren wie Geflügel und Schweine
verwendet. Der Bedarf steigt.
Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder
biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen
in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Bei der
chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige
Vorstufe. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus
Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt, in
weiteren Verfahrensschritten das racemische Gemisch
aufgetrennt, das D-Pantolacton mit β-Alanin kondensiert und
so D-Pantothensäure erhalten.
Die typische Handelsform ist das Calcium-Salz der D-
Pantothensäure. Das Calcium-Salz des racemischen Gemisches
der D,L-Pantothensäure ist ebenfalls gebräuchlich.
Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch
Mikroorganismen liegt in der direkten Bildung der
gewünschten stereoisomeren Form, nämlich der D-Form, die
frei von L-Pantothensäure ist.
Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Escherichia coli
(E. coli), Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium
erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen,
wie z. B. Debaromyces castellii können wie in EP-A 0 493 060
gezeigt, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure
und β-Alanin enthält, D-Pantothensäure produzieren. EP-A 0 493 060
zeigt weiterhin, daß bei E. coli durch
Amplifikation von Pantothensäure-Biosynthesegenen aus E.
coli, die auf den Plasmiden pFV3 und pFV5 enthalten sind,
in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β-
Alanin enthält, die Bildung von D-Pantothensäure verbessert
wird.
EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 beschreiben von E.
coli Stamm IFO3547 abgeleitete Mutanten, wie FV5714, FV525,
FV814, FV521, FV221, FV6051 und FV5069, die Resistenzen
gegen verschiedene Antimetabolite wie Salizylsäure, α-
Ketobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure, O-Methylthreonin
und α-Ketoisovaleriansäure tragen. Sie produzieren in einer
Nährlösung, die Glucose enthält, Pantoinsäure, und in einer
Glucose- und β-Alanin-haltigen Nährlösung D-Pantothensäure.
In EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 wird weiterhin
angegeben, daß nach Amplifikation der Pantothensäure-
Biosynthesegene panB, panc und panD, die auf dem Plasmid
pFV31 enthalten sein sollen, in den oben genannten Stämmen
in Glucose-haltigen Nährlösungen, die Produktion von D-
Pantoinsäure und in einer Nährlösung, die Glucose und β-
Alanin enthält, die Produktion von D-Pantothensäure
verbessert wird.
Weiterhin wird in der WO 97/10340 über die förderliche
Wirkung der Verstärkung des ilvGM-Operons auf die
Produktion von D-Pantothensäure berichtet. In der EP-A-
1001027 wird schließlich über die Wirkung der Verstärkung
des panE-Gens auf die Bildung der D-Pantothensäure
berichtet.
Nach dem Stand der Technik wird die D-Pantothensäure oder
das entsprechende Salz aus der Fermentationsbrühe isoliert
und gereinigt (EP-A-0590857 und WO 96/33283) und
dementsprechend in gereinigter Form verwendet oder die D-
Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe wird insgesamt
getrocknet (EP-A-1050219) und insbesondere als
Futtermitteladditiv verwendet.
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue
Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von D-
Pantothensäure und/oder deren Salzen bzw. diese enthaltende
Tierfuttermittel-Additive bereitzustellen.
Wenn im Folgenden D-Pantothensäure oder Pantothensäure oder
Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freien
Säuren, sondern auch die Salze der D-Pantothensäure wie
z. B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz
gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder
deren Salzen unter Verwendung von Mikroorganismen der
Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits D-
Pantothensäure produzieren und in denen die für das pckA-
Gen kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) abgeschwächt,
insbesondere ausgeschaltet werden.
Insbesondere handelt es sich um ein Verfahren, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man folgende Schritte durchführt:
- a) Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen das pckA-Gen abgeschwächt wird, ggf. in Kombination mit der Abschwächung oder Verstärkung weiterer Gene, und
- b) gegebenenfalls in Gegenwart von Erdalkaliverbindungen, wobei diese in vorzugsweise stöchiometrischen Mengen kontinuierlich oder diskontinuierlich hinzugefügt werden,
- c) Anreicherung der D-Pantothensäure bzw. des entsprechenden Salzes im Medium bzw. der Fermentationsbrühe oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae und
- d) nach Abschluß der Fermentation Isolieren der D- Pantothensäure, und/oder des entsprechenden Salzes.
Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren, bei dem
nach Abschluß der Fermentation die Biomasse teilweise oder
insgesamt in der Fermentationsbrühe verbleibt und die so
erhaltene Brühe gegebenenfalls nach dem Aufkonzentrieren zu
einer festen D-Pantothensäure und/oder deren Salze
enthaltenden Mischung, die auch weitere Bestandteile der
Fermentationsbrühe enthält, verarbeitet wird.
Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der
intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme
(Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel
verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit
einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende
Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls
diese Maßnahmen kombiniert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können D-Pantothensäure aus Glucose,
Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke,
Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es
handelt sich um Vertreter der Enterobacteriaceae,
insbesondere der Gattung Escherichia. Bei der Gattung
Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli zu
nennen. Innerhalb der Art Escherichia coli sind die
sogenannten K-12 Stämme, wie z. B. die Stämme MG1655 oder
W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli and Salmonella.
Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington
D. C.)) oder der Escherichia coli Wildtypstamm IFO3547
(Institut für Fermentation, Osaka, Japan) und davon
abgeleitete Mutanten geeignet, die die Fähigkeit besitzen
D-Pantothensäure zu produzieren.
Geeignete D-Pantothensäure produzierende Stämme der Gattung
Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind
beispielsweise
Escherichia coli FV5069/pFV31
Escherichia coli FV5069/pFV202
Escherichia coli FE6/pFE80 und
Escherichia coli KE3
Escherichia coli FV5069/pFV31
Escherichia coli FV5069/pFV202
Escherichia coli FE6/pFE80 und
Escherichia coli KE3
Es wurde gefunden, daß Enterobacteriaceae nach Abschwächung
des für die Phosphoenolpyruvat Carboxykinase (EC
4.1.1.49) kodierenden pckA-Gens in verbesserter Weise D-
Pantothensäure produzieren.
Die Nukleotidsequenz des pckA-Gens von Escherichia coli
wurde von Medina et al. (Journal of Bacteriology 172, 7151-
7156 (1990) publiziert und kann ebenfalls der von Blattner
et al. (Science 277, 1453-1462 (1997) publizierten
Genomsequenz von Escherichia coli unter der Accession
Number AE000416 entnommen werden.
Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen pckA-Gene
können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können
Allele des pckA-Gens verwendet werden, die sich aus der
Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch
funktionsneutrale Sinnmutationen (sense mutations) ergeben.
Zur Erzielung einer Abschwächung können beispielsweise die
Expression des pckA-Gens oder die katalytischen
Eigenschaften des Enzymproteins herabgesetzt bzw.
ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen
kombiniert werden.
Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete
Kulturführung, durch genetische Veränderung (Mutation) der
Signalstrukturen der Genexpression oder auch durch
Antisense-RNA Technik erfolgen. Signalstrukturen der
Genexpression sind beispielsweise Repressorgene,
Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren,
Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren.
Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem
beispielsweise bei Jensen und Hammer (Biotechnology and
Bioengineering 58: 191-195 (1998)), bei Carrier und
Keasling (Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999), Franch
und Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3, 159-164
(2000)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie beispielsweise dem Lehrbuch von
Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme
Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von
Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft,
Weinheim, Deutschland, 1990).
Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der
katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind
aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die
Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological
Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings
of the National Academy of Sciences, USA 95, 5511-5515
(1998), Wente und Schachmann (Journal of Biological
Chemistry 266, 20833-20839 (1991) genannt. Zusammenfassende
Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine
Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen
werden.
Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen,
Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von
der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die
Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense
mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations")
gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens
einem Basenpaar in einem Gen führen zu
Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"),
die dazu führen, daß falsche Aminosäuren eingebaut werden
oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von
mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem
vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur
Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der
Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und
Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Geeignete Mutationen im pckA-Gen wie beispielsweise
Deletionsmutationen können durch Gen- bzw. Allelaustausch
in geeignete Stämme eingebaut werden.
Eine gebräuchliche Methode ist die von Hamilton et al.
(Journal of Bacteriology 174, 4617-4622 (1989))
beschriebene Methode des Genaustauschs mit Hilfe eines
konditional replizierenden pSC101-Derivates pMAK705. Andere
im Stand der Technik beschriebene Methoden wie
beispielsweise die von Martinez-Morales et al. (Journal of
Bacteriology 1999, 7143-7148 (1999)) oder die von Boyd et
al. (Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000)) können
gleichfalls benutzt werden.
Es ist ebenfalls möglich, Mutationen im pckA-Gen oder
Mutationen, die die Expression des pckA-Gens betreffen,
durch Konjugation oder Transduktion in verschiedene Stämme
zu überführen.
Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure
mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft
sein, zusätzlich zur Abschwächung des pckA-Gen ein oder
mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Acetohydroxysäure-Synthase II kodierende ilvGM-Operon (WO 97/10340)
- - das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen (US-A-5,518,906),
- - das für die Ketopantoat-Reduktase kodierende panE-Gen (EP-A-1001027)
- - das für die Aspartat-Decarboxylase kodierende panD-Gen (US-A-5,518,906),
- - das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen (US-A-5,518,906),
- - das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC- Gen (Duncan und Coggins, Biochemical Journal 234: 49-57 (1986)),
- - die für das Glycin-Spaltungssystem (glycine-cleavage system) kodierenden Gene gcvT, gcvH und gcvP (Okamura- Ikeda et al., European Journal of Biochemistry 216, 539- 548 (1993)), und
- - das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen (Plamann et al (Nucleic Acids Research 11(7): 2065-2075(1983)))
zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang
die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder
mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die
durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man
beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene
erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel
verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein
mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese
Maßnahmen kombiniert.
Schließlich kann es für die Produktion von D-Pantothensäure
mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft
sein, zusätzlich zur Abschwächung des pckA-Gens
- - das für die Transaminase C kodierende avtA-Gen (EP-A-1001027) und
- - das für die Pyruvat Oxidase kodierende poxB-Gen (Grabau und Cronan, Nucleic Acids Research. 14 (13), 5449 ä5460 (1986))
abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder auf
niedrigem Niveau zu exprimieren.
Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure
vorteilhaft sein neben der Abschwächung des pckA-Gens
unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama:
"Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in:
Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta,
Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982). In dem
erfindungsgemäßen Verfahren können Bakterien eingesetzt
werden in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise
ausgeschaltet sind, die die Bildung des D-Pantothensäures
verringern.
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im
batch-Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch
(Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch-Verfahren
(repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine
Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im
Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in
die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,
1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und
periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im
Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA,
1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und
Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose,
Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und
Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und
Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure
und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und
organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden.
Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet
werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff haltige
Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff
oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und
Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder
die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten
wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das
Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle
Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den
oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies Vorstufen der D-Pantothensäure wie
Aspartat, β-Alanin, Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure oder
Pantoinsäure und gegebenenfalls deren Salze zugesetzt
zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur
Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder
in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert
werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw.
Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt.
Es ist gleichfalls möglich, zur Darstellung der
Erdalkalisalze der Pantothensäure, insbesondere des
Calciumsalzes, während der Fermentation die Suspension oder
Lösung einer Erdalkali-haltigen anorganischen Verbindung
wie beispielsweise Calciumhydroxid oder einer organischen
Verbindung wie dem Erdalkalisalz einer organischen Säure
beispielsweise Calciumacetat, kontinuierlich oder
diskontinuierlich zu versetzen. Auf diese Weise wird das
zur Darstellung des gewünschten Erdalkalisalzes der D-
Pantothensäure nötige Kation direkt in der gewünschten
Menge, bevorzugt in stöchiometrischen Mengen, in die
Fermentationsbrühe eingetragen.
Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel
wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur
Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika
hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen
aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff
haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die
Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an D-
Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise
innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die in der Fermentationsbrühe enthaltene D-Pantothensäure
bzw. die entsprechenden Salze der D-Pantothensäure kann
anschließend nach dem Stand der Technik isoliert und
gereinigt werden.
Es ist ebenso möglich, die D-Pantothensäure und/oder deren
Salze enthaltenden Fermentationsbrühen vorzugsweise
zunächst durch bekannte Separationsmethoden wie zum
Beispiel der Zentrifugation, der Filtration, dem
Dekantieren oder einer Kombination hieraus vollständig oder
zum Teil von der Biomasse zu befreien. Es ist jedoch auch
möglich, die Biomasse gänzlich in der Fermentationsbrühe zu
belassen. Im allgemeinen wird die Suspension oder Lösung
vorzugsweise aufkonzentriert und beispielsweise mit Hilfe
eines Sprühtrockners oder einer Gefriertrocknungsanlage zu
einem Pulver aufgearbeitet. Anschließend wird dieses Pulver
im allgemeinen durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-
Verfahren z. B. auch Aufbaugranulation in ein
gröberkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und
weitgehend staubfreies Produkt mit der gewünschten
Korngrößenverteilung von gegebenenfalls 20 bis 2000 µm
überführt. Vorteilhaft bei der Granulation oder
Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder
anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie
Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen
Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder
Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder
Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren
Stoffen wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten oder
Stearaten.
Alternativ kann das Fermentationsprodukt mit oder ohne
weitere der üblichen Fermentationsbestandteile auf einen in
der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen
organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel
Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken
Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen
Verdickungs- oder Bindemitteln stabilisiert werden.
Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der
Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49,
Seite 817) beschrieben.
Gegebenenfalls wird auf einer geeigneten Verfahrensstufe
D-Pantothensäure oder das gewünschte Salz der
D-Pantothensäure oder eine diese Verbindungen enthaltende
Zubereitung hinzugefügt, um den gewünschten Gehalt an
Pantothensäure oder dem gewünschten Salz im Endprodukt zu
erzielen bzw. einzustellen.
Der gewünschte Gehalt liegt im allgemeinen im Bereich von
20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse).
Die Konzentration an Pantothensäure kann mit bekannten
chemischen (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560
(1992)) oder mikrobiologischen Verfahren wie z. B. dem
Lactobacillus plantarum Test (DIFCO MANUAL, 10th Edition,
S. 1100-1102; Michigan, USA) bestimmt werden.
Claims (10)
1. Verfahren zu Herstellung von D-Pantothensäure und/oder
deren Erdalkalisalzen oder diese enthaltende
Futtermitteladditive durch Fermentation von
Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae,
insbesondere solchen, die bereits D-Pantothensäure
produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) mindestens das (die) in den Mikroorganismen für die pckA-Gen kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) abschwächt, insbesondere ausschaltet,
- b) die D-Pantothensäure und/oder deren Salze im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen anreichert, und
- c) die gewünschten Produkte nach Abschluß der Fermentation isoliert, wobei man die Biomasse und/oder weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe in dem Produkt beläßt oder gegebenenfalls vollständig oder teilweise abtrennt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Fermentation in Gegenwart von Erdalkalisalzen
durchführt, wobei diese kontinuierlich oder
diskontinuierlich in insbesondere stöchiometrischen
Mengen zugeführt werden, und ein Erdalkalisalze der D-
Pantothensäure enthaltendes oder daraus bestehendes
Produkt gewinnt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen der Familie
Enterobacteriaceae der Gattung Escherichia angehören.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß
die Mikroorganismen aus der Gattung Escherichia,
insbesondere der Art Escherichia coli stammen.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man zusätzlich zur Abschwächung pckA-Gens ein oder
mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe, verstärkt
insbesondere überexprimiert:
- 1. 5.1 das für die Acetohydroxysäure-Synthase II kodierende ilvGM-Operon,
- 2. 5.2 das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen,
- 3. 5.3 das für die Ketopantoat-Reduktase kodierende panE-Gen,
- 4. 5.4 das für die Aspartat-Decarboxylase kodierende panD-Gen,
- 5. 5.5 das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen,
- 6. 5.6 das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC-Gen,
- 7. 5.7 die für das Glycin Spaltungssystem kodierenden Gene gcvT, gcvH und gcvP, einzeln oder gemeinsam,
- 8. 5.8 das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege
zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung
der D-Pantothensäure verringern, insbesondere das für
- 1. 6.1 die Transaminase C kodierende avtA-Gen und
- 2. 6.2 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Expression des (der) Polynukleotids (e),
das (die) für das pckA-Gen kodiert (kodieren)
abschwächt, insbesondere ausschaltet.
8. Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder
deren Salze enthaltenden Futtermittel-Additiven, gemäß
Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass man
- a) aus einer durch Fermentation gewonnenen D- Pantothensäure-haltigen Fermentationsbrühe, gegebenenfalls vollständig oder teilweise, die Biomasse und/oder einen Teil der Inhaltsstoffe abtrennt,
- b) das so erhaltene Gemisch gegebenenfalls aufkonzentriert, und
- c) das die Pantothensäure und/oder das Pantothenat enthaltende Futtermitteladditiv durch geeignete Maßnahmen in eine rieselfähige Form überführt, und
- d) durch geeignete Maßnahmen ein rieselfähiges Tierfuttermittel-Additiv mit einer Korngrößenverteilung von 20 bis 2000 µm gewinnt.
9. Verfahren zur Herstellung von Tierfuttermittel-
Additiven gemäß Anspruch 8 mit einem Gehalt an D-
Pantothensäure und/oder deren Salze ausgewählt aus der
Gruppe Magnesium- oder Calciumsalz in dem Bereich von
etwa 20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse) aus
Fermentationsbrühen, gekennzeichnet durch die Schritte
- a) gegebenenfalls Entfernen von Wasser aus der Fermentationsbrühe (Aufkonzentration),
- b) Entfernen der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von ≧ 0 bis 100%,
- c) gegebenenfalls Zusatz von einer oder mehreren der genannten Verbindungen zu den gemäß a) und b) erhaltenen Fermentationsbrühen, wobei die Menge der zugesetzten Verbindungen so bemessen ist, dass deren Gesamtkonzentration im Tierfuttermittel- Additiv im Bereich von etwa 20 bis 80 Gew.-% liegt, und
- d) Gewinnung des Tierfuttermittel-Additivs in der gewünschten Pulver- oder bevorzugt Granulatform.
10. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
man aus der Fermentationsbrühe gegebenenfalls nach
Zusatz von D-Pantothensäure und/oder deren Salze und
gegebenenfalls nach Zusatz von organischen oder
anorganischen Hilfsstoffen durch
- a) Trocknen und Kompaktieren, oder
- b) Sprühtrocknen, oder
- c) Sprühtrocknen und Granulieren, oder
- d) Sprühtrocknen und Aufbaugranulieren,
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |