DE10112100A1

DE10112100A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen

Info

Publication number: DE10112100A1
Application number: DE10112100A
Authority: DE
Inventors: Mechthild Rieping
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-03-14
Filing date: 2001-03-14
Publication date: 2002-09-19
Also published as: EP1368485A2; WO2002072854A3; WO2002072854A2; AU2002240930A1

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen oder diese enthaltende Futtermitteladditive durch Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere solchen, die bereits D-Pantothensäure produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß man das (die) für die pckA-Gen kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) in den Mikroorganismen abschwächt, insbesondere ausschaltet.

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen oder diese enthaltende Mischungen unter Verwendung von Microorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen mindestens das pckA-Gen abgeschwächt wird.

Stand der Technik

Pantothensäure wird weltweit in einer Größenordnung von mehreren tausend Tonnen pro Jahr produziert. Es wird unter anderem in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und in der Lebensmittelindustrie verwendet. Ein großer Teil der produzierten Pantothensäure wird für die Ernährung von Nutztieren wie Geflügel und Schweine verwendet. Der Bedarf steigt.

Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Bei der chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige Vorstufe. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt, in weiteren Verfahrensschritten das racemische Gemisch aufgetrennt, das D-Pantolacton mit β-Alanin kondensiert und so D-Pantothensäure erhalten.

Die typische Handelsform ist das Calcium-Salz der D- Pantothensäure. Das Calcium-Salz des racemischen Gemisches der D,L-Pantothensäure ist ebenfalls gebräuchlich.

Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch Mikroorganismen liegt in der direkten Bildung der gewünschten stereoisomeren Form, nämlich der D-Form, die frei von L-Pantothensäure ist.

Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Escherichia coli (E. coli), Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen, wie z. B. Debaromyces castellii können wie in EP-A 0 493 060 gezeigt, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthält, D-Pantothensäure produzieren. EP-A 0 493 060 zeigt weiterhin, daß bei E. coli durch Amplifikation von Pantothensäure-Biosynthesegenen aus E. coli, die auf den Plasmiden pFV3 und pFV5 enthalten sind, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β- Alanin enthält, die Bildung von D-Pantothensäure verbessert wird.

EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 beschreiben von E. coli Stamm IFO3547 abgeleitete Mutanten, wie FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 und FV5069, die Resistenzen gegen verschiedene Antimetabolite wie Salizylsäure, α- Ketobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure, O-Methylthreonin und α-Ketoisovaleriansäure tragen. Sie produzieren in einer Nährlösung, die Glucose enthält, Pantoinsäure, und in einer Glucose- und β-Alanin-haltigen Nährlösung D-Pantothensäure. In EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 wird weiterhin angegeben, daß nach Amplifikation der Pantothensäure- Biosynthesegene panB, panc und panD, die auf dem Plasmid pFV31 enthalten sein sollen, in den oben genannten Stämmen in Glucose-haltigen Nährlösungen, die Produktion von D- Pantoinsäure und in einer Nährlösung, die Glucose und β- Alanin enthält, die Produktion von D-Pantothensäure verbessert wird.

Weiterhin wird in der WO 97/10340 über die förderliche Wirkung der Verstärkung des ilvGM-Operons auf die Produktion von D-Pantothensäure berichtet. In der EP-A- 1001027 wird schließlich über die Wirkung der Verstärkung des panE-Gens auf die Bildung der D-Pantothensäure berichtet.

Nach dem Stand der Technik wird die D-Pantothensäure oder das entsprechende Salz aus der Fermentationsbrühe isoliert und gereinigt (EP-A-0590857 und WO 96/33283) und dementsprechend in gereinigter Form verwendet oder die D- Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe wird insgesamt getrocknet (EP-A-1050219) und insbesondere als Futtermitteladditiv verwendet.

Aufgabe der Erfindung

Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von D- Pantothensäure und/oder deren Salzen bzw. diese enthaltende Tierfuttermittel-Additive bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Wenn im Folgenden D-Pantothensäure oder Pantothensäure oder Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freien Säuren, sondern auch die Salze der D-Pantothensäure wie z. B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz gemeint.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits D- Pantothensäure produzieren und in denen die für das pckA- Gen kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) abgeschwächt, insbesondere ausgeschaltet werden.

Insbesondere handelt es sich um ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man folgende Schritte durchführt:

a) Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen das pckA-Gen abgeschwächt wird, ggf. in Kombination mit der Abschwächung oder Verstärkung weiterer Gene, und
b) gegebenenfalls in Gegenwart von Erdalkaliverbindungen, wobei diese in vorzugsweise stöchiometrischen Mengen kontinuierlich oder diskontinuierlich hinzugefügt werden,
c) Anreicherung der D-Pantothensäure bzw. des entsprechenden Salzes im Medium bzw. der Fermentationsbrühe oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae und
d) nach Abschluß der Fermentation Isolieren der D- Pantothensäure, und/oder des entsprechenden Salzes.

Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren, bei dem nach Abschluß der Fermentation die Biomasse teilweise oder insgesamt in der Fermentationsbrühe verbleibt und die so erhaltene Brühe gegebenenfalls nach dem Aufkonzentrieren zu einer festen D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Mischung, die auch weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält, verarbeitet wird.

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können D-Pantothensäure aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Enterobacteriaceae, insbesondere der Gattung Escherichia. Bei der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli zu nennen. Innerhalb der Art Escherichia coli sind die sogenannten K-12 Stämme, wie z. B. die Stämme MG1655 oder W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington D. C.)) oder der Escherichia coli Wildtypstamm IFO3547 (Institut für Fermentation, Osaka, Japan) und davon abgeleitete Mutanten geeignet, die die Fähigkeit besitzen D-Pantothensäure zu produzieren.

Geeignete D-Pantothensäure produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind beispielsweise
Escherichia coli FV5069/pFV31
Escherichia coli FV5069/pFV202
Escherichia coli FE6/pFE80 und
Escherichia coli KE3

Es wurde gefunden, daß Enterobacteriaceae nach Abschwächung des für die Phosphoenolpyruvat Carboxykinase (EC 4.1.1.49) kodierenden pckA-Gens in verbesserter Weise D- Pantothensäure produzieren.

Die Nukleotidsequenz des pckA-Gens von Escherichia coli wurde von Medina et al. (Journal of Bacteriology 172, 7151- 7156 (1990) publiziert und kann ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli unter der Accession Number AE000416 entnommen werden.

Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen pckA-Gene können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele des pckA-Gens verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen (sense mutations) ergeben.

Zur Erzielung einer Abschwächung können beispielsweise die Expression des pckA-Gens oder die katalytischen Eigenschaften des Enzymproteins herabgesetzt bzw. ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden.

Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung, durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression oder auch durch Antisense-RNA Technik erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem beispielsweise bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)), bei Carrier und Keasling (Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999), Franch und Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3, 159-164 (2000)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie beispielsweise dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990).

Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95, 5511-5515 (1998), Wente und Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), die dazu führen, daß falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.

Geeignete Mutationen im pckA-Gen wie beispielsweise Deletionsmutationen können durch Gen- bzw. Allelaustausch in geeignete Stämme eingebaut werden.

Eine gebräuchliche Methode ist die von Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617-4622 (1989)) beschriebene Methode des Genaustauschs mit Hilfe eines konditional replizierenden pSC101-Derivates pMAK705. Andere im Stand der Technik beschriebene Methoden wie beispielsweise die von Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 1999, 7143-7148 (1999)) oder die von Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000)) können gleichfalls benutzt werden.

Es ist ebenfalls möglich, Mutationen im pckA-Gen oder Mutationen, die die Expression des pckA-Gens betreffen, durch Konjugation oder Transduktion in verschiedene Stämme zu überführen.

Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des pckA-Gen ein oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe

- das für die Acetohydroxysäure-Synthase II kodierende ilvGM-Operon (WO 97/10340)
- das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen (US-A-5,518,906),
- das für die Ketopantoat-Reduktase kodierende panE-Gen (EP-A-1001027)
- das für die Aspartat-Decarboxylase kodierende panD-Gen (US-A-5,518,906),
- das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen (US-A-5,518,906),
- das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC- Gen (Duncan und Coggins, Biochemical Journal 234: 49-57 (1986)),
- die für das Glycin-Spaltungssystem (glycine-cleavage system) kodierenden Gene gcvT, gcvH und gcvP (Okamura- Ikeda et al., European Journal of Biochemistry 216, 539- 548 (1993)), und
- das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen (Plamann et al (Nucleic Acids Research 11(7): 2065-2075(1983)))

zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren.

Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Schließlich kann es für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des pckA-Gens

- das für die Transaminase C kodierende avtA-Gen (EP-A-1001027) und
- das für die Pyruvat Oxidase kodierende poxB-Gen (Grabau und Cronan, Nucleic Acids Research. 14 (13), 5449 ä5460 (1986))

abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder auf niedrigem Niveau zu exprimieren.

Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure vorteilhaft sein neben der Abschwächung des pckA-Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982). In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Bakterien eingesetzt werden in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung des D-Pantothensäures verringern.

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch-Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch (Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies Vorstufen der D-Pantothensäure wie Aspartat, β-Alanin, Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure oder Pantoinsäure und gegebenenfalls deren Salze zugesetzt zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt.

Es ist gleichfalls möglich, zur Darstellung der Erdalkalisalze der Pantothensäure, insbesondere des Calciumsalzes, während der Fermentation die Suspension oder Lösung einer Erdalkali-haltigen anorganischen Verbindung wie beispielsweise Calciumhydroxid oder einer organischen Verbindung wie dem Erdalkalisalz einer organischen Säure beispielsweise Calciumacetat, kontinuierlich oder diskontinuierlich zu versetzen. Auf diese Weise wird das zur Darstellung des gewünschten Erdalkalisalzes der D- Pantothensäure nötige Kation direkt in der gewünschten Menge, bevorzugt in stöchiometrischen Mengen, in die Fermentationsbrühe eingetragen.

Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an D- Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Die in der Fermentationsbrühe enthaltene D-Pantothensäure bzw. die entsprechenden Salze der D-Pantothensäure kann anschließend nach dem Stand der Technik isoliert und gereinigt werden.

Es ist ebenso möglich, die D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Fermentationsbrühen vorzugsweise zunächst durch bekannte Separationsmethoden wie zum Beispiel der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus vollständig oder zum Teil von der Biomasse zu befreien. Es ist jedoch auch möglich, die Biomasse gänzlich in der Fermentationsbrühe zu belassen. Im allgemeinen wird die Suspension oder Lösung vorzugsweise aufkonzentriert und beispielsweise mit Hilfe eines Sprühtrockners oder einer Gefriertrocknungsanlage zu einem Pulver aufgearbeitet. Anschließend wird dieses Pulver im allgemeinen durch geeignete Kompaktier- oder Granulier- Verfahren z. B. auch Aufbaugranulation in ein gröberkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt mit der gewünschten Korngrößenverteilung von gegebenenfalls 20 bis 2000 µm überführt. Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten oder Stearaten.

Alternativ kann das Fermentationsprodukt mit oder ohne weitere der üblichen Fermentationsbestandteile auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.

Gegebenenfalls wird auf einer geeigneten Verfahrensstufe D-Pantothensäure oder das gewünschte Salz der D-Pantothensäure oder eine diese Verbindungen enthaltende Zubereitung hinzugefügt, um den gewünschten Gehalt an Pantothensäure oder dem gewünschten Salz im Endprodukt zu erzielen bzw. einzustellen.

Der gewünschte Gehalt liegt im allgemeinen im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse).

Die Konzentration an Pantothensäure kann mit bekannten chemischen (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)) oder mikrobiologischen Verfahren wie z. B. dem Lactobacillus plantarum Test (DIFCO MANUAL, 10^th Edition, S. 1100-1102; Michigan, USA) bestimmt werden.

Claims

1. Verfahren zu Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Erdalkalisalzen oder diese enthaltende Futtermitteladditive durch Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere solchen, die bereits D-Pantothensäure produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) mindestens das (die) in den Mikroorganismen für die pckA-Gen kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) abschwächt, insbesondere ausschaltet,
b) die D-Pantothensäure und/oder deren Salze im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen anreichert, und
c) die gewünschten Produkte nach Abschluß der Fermentation isoliert, wobei man die Biomasse und/oder weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe in dem Produkt beläßt oder gegebenenfalls vollständig oder teilweise abtrennt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation in Gegenwart von Erdalkalisalzen durchführt, wobei diese kontinuierlich oder diskontinuierlich in insbesondere stöchiometrischen Mengen zugeführt werden, und ein Erdalkalisalze der D- Pantothensäure enthaltendes oder daraus bestehendes Produkt gewinnt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae der Gattung Escherichia angehören.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen aus der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli stammen.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich zur Abschwächung pckA-Gens ein oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe, verstärkt insbesondere überexprimiert:

1. 5.1 das für die Acetohydroxysäure-Synthase II kodierende ilvGM-Operon,
2. 5.2 das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen,
3. 5.3 das für die Ketopantoat-Reduktase kodierende panE-Gen,
4. 5.4 das für die Aspartat-Decarboxylase kodierende panD-Gen,
5. 5.5 das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen,
6. 5.6 das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC-Gen,
7. 5.7 die für das Glycin Spaltungssystem kodierenden Gene gcvT, gcvH und gcvP, einzeln oder gemeinsam,
8. 5.8 das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterien einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der D-Pantothensäure verringern, insbesondere das für

1. 6.1 die Transaminase C kodierende avtA-Gen und
2. 6.2 das für die Pyruvat-Oxidase kodierende poxB-Gen.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Expression des (der) Polynukleotids (e), das (die) für das pckA-Gen kodiert (kodieren) abschwächt, insbesondere ausschaltet.

8. Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Futtermittel-Additiven, gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass man

a) aus einer durch Fermentation gewonnenen D- Pantothensäure-haltigen Fermentationsbrühe, gegebenenfalls vollständig oder teilweise, die Biomasse und/oder einen Teil der Inhaltsstoffe abtrennt,
b) das so erhaltene Gemisch gegebenenfalls aufkonzentriert, und
c) das die Pantothensäure und/oder das Pantothenat enthaltende Futtermitteladditiv durch geeignete Maßnahmen in eine rieselfähige Form überführt, und
d) durch geeignete Maßnahmen ein rieselfähiges Tierfuttermittel-Additiv mit einer Korngrößenverteilung von 20 bis 2000 µm gewinnt.

9. Verfahren zur Herstellung von Tierfuttermittel- Additiven gemäß Anspruch 8 mit einem Gehalt an D- Pantothensäure und/oder deren Salze ausgewählt aus der Gruppe Magnesium- oder Calciumsalz in dem Bereich von etwa 20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse) aus Fermentationsbrühen, gekennzeichnet durch die Schritte

a) gegebenenfalls Entfernen von Wasser aus der Fermentationsbrühe (Aufkonzentration),
b) Entfernen der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von ≧ 0 bis 100%,
c) gegebenenfalls Zusatz von einer oder mehreren der genannten Verbindungen zu den gemäß a) und b) erhaltenen Fermentationsbrühen, wobei die Menge der zugesetzten Verbindungen so bemessen ist, dass deren Gesamtkonzentration im Tierfuttermittel- Additiv im Bereich von etwa 20 bis 80 Gew.-% liegt, und
d) Gewinnung des Tierfuttermittel-Additivs in der gewünschten Pulver- oder bevorzugt Granulatform.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der Fermentationsbrühe gegebenenfalls nach Zusatz von D-Pantothensäure und/oder deren Salze und gegebenenfalls nach Zusatz von organischen oder anorganischen Hilfsstoffen durch

a) Trocknen und Kompaktieren, oder
b) Sprühtrocknen, oder
c) Sprühtrocknen und Granulieren, oder
d) Sprühtrocknen und Aufbaugranulieren,

ein Tierfuttermittel-Additiv in der gewünschten Korngröße gewinnt.