DE10133161A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen - Google Patents

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen oder diese enthaltende Futtermitteladditive durch Fermentation von Mikroorganismen der Bacillus-Gruppe, insbesondere solchen, die bereits D-Pantothensäure produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere der für das Gen bzw. ORF ybbT, ywkA, yjmC, ytsJ, mdh, cysK, iolJ, pdhD, yuiE, dhaS, adk, yusH, yqhJ, yqhK und yqhI kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) in den Mikroorganismen verstärkt, insbesondere überexprimiert.

Description

• Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen oder diese enthaltende Mischungen unter Verwendung von Mikroorganismen der Bacillus-Gruppe, in denen mindestens eines oder mehrere der Gene oder offenen Leserahmen (ORF), ausgewählt aus der Gruppe ybbT, ywkA, yjmC, ytsJ, mdh, cysK, iolJ, pdhD, yuiE, dhaS, adk, yusH, yqhJ, yqhK und yqhI verstärkt wird.
• Stand der Technik
• Pantothensäure wird weltweit in einer Größenordnung von mehreren tausend Tonnen pro Jahr produziert. Es wird unter anderem in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und in der Lebensmittelindustrie verwendet. Ein großer Teil der produzierten Pantothensäure wird für die Ernährung von Nutztieren wie Geflügel und Schweine verwendet.
• Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Bei der chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige Vorstufe. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt, in weiteren Verfahrensschritten das racemische Gemisch aufgetrennt, das D-Pantolacton mit β-Alanin kondensiert und so D-Pantothensäure erhalten.
• Eine typische Handelsform ist das Calcium-Salz der D- Pantothensäure. Das Calcium-Salz des racemischen Gemisches der D,L-Pantothensäure ist ebenfalls gebräuchlich.
• Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch Mikroorganismen liegt in der direkten Bildung der gewünschten stereoisomeren Form, nämlich der D-Form, die frei von L-Pantothensäure ist.
• Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Escherichia coli (E. coli), Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis und auch Hefen, wie z. B. Debaromyces castellii können D-Pantothensäure produzieren.
• Anleitungen zur Verbesserung der fermentativen Produktionsverfahren sind beispielsweise der EP-A 0 493 060, EP-A-0590857, US-A-5,518,906, WO 97/10340, WO 01/21772 oder US-A-6,184,007.
• Nach Fermentation wird die D-Pantothensäure oder das entsprechende Salz aus der Fermentationsbrühe isoliert und gereinigt (EP-A-0590857 und WO 96/33283). Die D- Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe kann auch mit der bei der Fermentation erzeugten Biomasse getrocknet (US-A- 6,238,714) und dann insbesondere als Futtermitteladditiv verwendet werden.
Aufgabe der Erfindung
• Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von D- Pantothensäure und/oder deren Salzen bzw. diese enthaltende Tierfuttermittel-Additive bereitzustellen.
• Beschreibung der Erfindung
• Wenn im Folgenden D-Pantothensäure oder Pantothensäure oder Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freien Säuren, sondern auch die Salze der D-Pantothensäure wie z. B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz gemeint.
• Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen unter Verwendung von Mikroorganismen der Bacillus-Gruppe, die insbesondere bereits D-Pantothensäure produzieren, und in denen mindestens eine oder mehrere der für das/den ybbT-ORF, ywkA-ORF, yjmC-ORF, ytsJ-ORF, mdh- Gen, cysK-Gen, iolJ-Gen, pdhD-Gen, yuiE-ORF, dhaS-Gen, adk- Gen, yusH-ORF, yqhJ-ORF, yqhK-ORF und yqhI-ORF kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
• Insbesondere handelt es sich um ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man folgende Schritte durchführt:
  
• a) Fermentation von Mikroorganismen der Bacillus- Gruppe, in denen mindestens ein oder mehrere der Gene oder offenen Leserahmen, ausgewählt aus der Gruppe ybbT, ywkA, yjmC, ytsJ, mdh, cysK, iolJ, pdhD, yuiE, dhaS, adk, yusH, yqhJ, yqhK und yqhI, verstärkt, insbesondere überexprimiert werden, gegebenenfalls in Kombination mit der Abschwächung oder Verstärkung weiterer Gene oder offenen Leserahmen,
• b) gegebenenfalls in Gegenwart von Erdalkaliverbindungen, wobei diese in vorzugsweise stöchiometrischen Mengen kontinuierlich oder diskontinuierlich der Fermentationsbrühe hinzugefügt werden,
• c) Anreicherung der D-Pantothensäure bzw. des entsprechenden Salzes im Medium bzw. der Fermentationsbrühe oder gegebenenfalls in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae und
• d) nach Abschluß der Fermentation Isolieren der D- Pantothensäure, und/oder (der) des entsprechenden Salze(s).
• Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren, bei dem nach Abschluß der Fermentation die Biomasse teilweise oder insgesamt (0 bis 100%) in der Fermentationsbrühe verbleibt, und die so erhaltene Brühe gegebenenfalls nach dem Aufkonzentrieren zu einer festen D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Mischung, die gegebenenfalls weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält, verarbeitet wird.
• Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene, des offenen Leserahmens (ORF) bzw. der ORFs erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel oder ORF verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
• Als offener Leserahmen (ORF, open reading frame) wird ein Abschnitt einer Nukleotidsequenz bezeichnet, der für ein Protein beziehungsweise Polypeptid oder Ribonukleinsäure kodiert oder kodieren kann, dem (der) nach dem Stand der Technik keine Funktion zugeordnet werden kann. Nach Zuordnung einer Funktion zu dem betreffenden Abschnitt der Nukleotidsequenz wird im allgemeinen von einem Gen gesprochen.
• Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere Überexpression, wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis 1000% oder 2000% bezogen auf die des Wildtyp- Proteins beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus erhöht.
• Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können D-Pantothensäure aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der Bacillus-Gruppe, insbesondere der Gattung Bacillus vorzugsweise der Art Bacillus subtilis.
• Zur Bacillus Gruppe gehören unter anderem Bacillus subtilis, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus firmus, Bacillus pantothenticus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus halodurans, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus Bacillus pulvifaciens und andere sogenannte Gruppe 1 Bacillus Species, die durch den entsprechenden 16S rRNA Typ charakterisiert sind (Priest (1993), In: Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, eds. Sonenshein et al., ASM, Washington, D. C., USA).
• Geeignete D-Pantothensäure produzierende Stämme der Bacillus-Gruppe, insbesondere der Art Bacillus subtilis sind unter anderen beispielsweise die in der WO 01/21772 genannten Stämme
  Bacillus subtilis Stamm PA 221
  Bacillus subtilis Stamm PA 248
  Bacillus subtilis Stamm PA 236
  Bacillus subtilis Stamm PA 221/pAN429-4
  Bacillus subtilis Stamm PA 413-4
  Bacillus subtilis Stamm PA 236-1
  Bacillus subtilis Stamm PA 340
  Bacillus subtilis Stamm PA 377
  Bacillus subtilis Stamm PA 365
  Bacillus subtilis Stamm PA 377-2
  Bacillus subtilis Stamm PA 824-2.
• Es wurde gefunden, daß Mikroorganismen der Bacillus-Gruppe nach Verstärkung, insbesondere Überexpression eines oder mehrerer der Gene oder ORFs, beziehungsweise der dafür kodierenden Nukleotidsequenzen, ausgewählt aus der Gruppe ybbT, ywkA, yjmC, ytsJ, mdh, cysK, iolJ, pdhD, yuiE, dhaS, adk, yusH, yqhJ, yqhK und yqhI, in verbesserter Weise D- Pantothensäure produzieren.
• Die Nukleotidsequenzen der Gene oder offenen Leserahmen (ORF) von Bacillus subtilis gehören zum Stand der Technik und können ebenfalls der von Kunst et al. (Nature 390, 249-256 (1997) publizierten Genomsequenz von Bacillus subtilis entnommen werden.
• ybbT-ORF:
  Bezeichnung: offener Leserahmen unbekannter Funktion, Ähnlichkeit zur Phosphoglucomutase
  Referenz: Kunst et al.; Nature 390: 237-8 (1997)
  Accession No.: Z99104
• ywkA-ORF:
  Bezeichnung: offener Leserahmen unbekannter Funktion, Ähnlichkeit zur Malat Dehydrogenase
  Referenz: Kunst et al., Nature 390: 249-256 (1997)
  Accession No.: Z99122, Z99123
• yjmC-ORF:
  Bezeichnung: offener Leserahmen unbekannter Funktion, Ähnlichkeit zur Malat Dehydrogenase von Methanococcus jannaschii
  Referenz: Kunst et al., Nature 390: 249-256 (1997)
  Accession No.: AF015825, Z99110
• ytsJ-ORF:
  Bezeichnung: offener Leserahmen unbekannter Funktion, Ähnlichkeit zur Malat Dehydrogenase (NADP+) von Anas platyrhynchos
  Referenz: Abe et al., Microbiology 141, 1433-1442 (1995)
  Accession No.: AF008220
• mdh-Gen:
  Bezeichnung: Malat Dehydrogenase
  EC-Nr.: 1.1.1.37
  alternativer Genname: citH
  Referenz: Jin et al.; Journal of Bacteriology 178: 560-563 (1996)
  Accession No.: AF008220
• cysK-Gen:
  Bezeichnung: Cystein Synthase A
  Synonyme: Cystein synthetase A, O-Acetylserin Sulfhydrylase A, O-Acetylserine (Thiol)-Lyase, (CSase), Superoxid induzierbares Protein 11, (SOI11)
  EC-Nr.: 4.2.99.8
  Referenz: Ogasawara et al.; DNA Research 1: 1-14 (1994)
  Accession No.: Z99104
• iolJ-Gen:
  Bezeichnung: Fructose-1,6-Bisphosphat Aldolase (Klasse II)
  alternative Gennamen: fbaB, yxdI, alf2,
  EC-Nr.: 4.1.2.13
  Referenz: Yoshida et al.; Microbiology 140: 2289-2298 (1994)
  Accession No.: Z99124
• pdhD-Gen:
  Bezeichnung: Dihydrolipoamid Dehydrogenase E3 Untereinheit sowohl des Pyruvat Dehydrogenase- als auch des 2- Oxoglutarat-Dehydrogenasekomplexes
  alternative Gennamen: citL, dld1, aceD
  EC-Nr.: 1.8.1.4
  Referenz: Hemila et al., Journal of Bacteriology 172: 5052-5063 (1990)
  Accession No.: AF012285
• yuiE-ORF:
  Bezeichnung: offener Leserahmen unbekannter Funktion, Ähnlichkeit zur Leucyl Aminopeptidase, Leucin Aminopeptidase (LAP)
  EC-Nr.: 3.4.11.1
  Referenz: Kunst et. al., Nature 390: 237-8 (1997)
  Accession No.: Z99120
• dhaS-Gen:
  Bezeichnung: Aldehyd-Dehydrogenase
  Referenz: Kunst et al., Nature 390: 237-8 (1997)
  Accession No.: AF027868, Z99114
• adk-Gen:
  Bezeichnung: Adenylat Kinase, ATP-AMP Transphosphorylase, Superoxid induzierbares Protein 16 (SOI16)
  EC-Nr.: 2.7.4.3
  Referenz: Nakamura et al.; Journal of Biochemistry 107: 603-607 (1990)
  Accession No.: Z99104
• yusH-ORF:
  Bezeichnung: offener Leserahmen unbekannter Funktion, Ähnlichkeit zum Protein H des Glycin-Spaltungssystem
  alternativer Genname: gcvH
  Referenz: Kunst et al., Nature 390: 237-8 (1997)
  Accession No.: Z99120
• yqhJ-ORF:
  Bezeichnung: offener Leserahmen unbekannter Funktion, Ähnlichkeit zur Untereinheit 1 der Glycin Dehydrogenase/Decarboxylase bzw. des Protein P des Glycin- Spaltungssystem
  alternative Gennamen: gcvP, gcvPA, gcs1
  EC-Nr.: 1.4.4.2
  Referenz: Kunst et al., Nature 390: 249-256 (1997)
  Accession No.: Z99116
• yqhK-ORF:
  Bezeichnung: offener Leserahmen unbekannter Funktion, Ähnlichkeit zur Untereinheit 2 der Glycin Dehydrogenase/Decarboxylase bzw. des Protein P des Glycin- Spaltungssystem
  alternative Gennamen: gcvP, gcvPB, gcs2
  EC-Nr.: 1.4.4.2
  Referenz: Kunst et al., Nature 390: 249-256 (1997)
  Accession No.: Z99116
• yqhI-ORF:
  Bezeichnung: offener Leserahmen unbekannter Funktion, Ähnlichkeit zur Aminomethyltransferase des Protein T des Glycin Spaltungssystems
  alternative Gennamen: gcvT, gcsT
  EC-Nr.: 2.1.2.10
  Referenz: Kunst et. al., Nature 390: 249-256 (1997)
  Accession No.: Z99116
• Die Nukleinsäuresequenzen können den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA), der Nukleotidsequenz-Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) oder der DNA Datenbank von Japan (DDBJ, Mishima, Japan) entnommen werden. Weiterhin kann die Sequenz-Datenbank "SubtiList" des Pasteur-Institut (Paris, Frankreich) verwendet werden.
• Die in den angegebenen Textstellen beschriebenen Gene oder offenen Leserahmen können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele der Gene oder offene Leserahmen verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen (sense mutations) ergeben.
• In gleicher Weise können Nukleinsäuren beziehungsweise Polynukleotide verwendet werden, die für Proteine beziehungsweise Polypeptide kodieren, die zu mindestens 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder 100% identisch, homolog oder ähnlich sind, aus Stämmen der Bacillus-Gruppe stammen und die entsprechende Funktion besitzen.
• Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen D-Pantothensäure-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
• In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen mit einem oder mehreren Plasmidvektoren, insbesondere Expressionsvektoren, transformierten Stamm einsetzen, wobei der (die) Plasmidvektoren mindestens eine der für die Gene oder offenen Leserahmen ybbT, ywkA, yjmC, ytsJ, mdh, cysK, iolJ, pdhD, yuiE, dhaS, adk, yusH, yqhJ, yqhK und yqhI kodierende Nucleotidsequenzen trägt (tragen).
• In einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahren kann man die Ribosomenbindungsstellen eines oder mehrerer der Gene oder offenen Leserahmen, ausgewählt aus der Gruppe ybbT, ywkA, yjmC, ytsJ, mdh, cysK, iolJ, pdhD, yuiE, dhaS, adk, yusH, yqhJ, yqhK und yqhI, optimieren.
• In einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen zusätzlichen Promotor vor eines oder mehrerer der Gene oder offenen Leserahmen, ausgewählt aus der Gruppe ybbT, ywkA, yjmC, ytsJ, mdh, cysK, iolJ, pdhD, yuiE, dhaS, adk, yusH, yqhJ, yqhK und yqhI, setzen.
• In einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahren kann man mindestens eine weitere Kopie eines oder mehrerer der Gene oder offenen Leserahmen, ausgewählt aus der Gruppe ybbT, ywkA, yjmC, ytsJ, mdh, cysK, iolJ, pdhD, yuiE, dhaS, adk, yusH, yqhJ, yqhK und yqhI, dem Chromosom des Wirtes hinzufügen.
• Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen der Bacillus-Gruppe vorteilhaft sein zusätzlich zur Verstärkung eines oder mehrerer der Gene oder offenen Leserahmen, ausgewählt aus der Gruppe ybbT, ywkA, yjmC, ytsJ, mdh, cysK, iolJ, pdhD, yuiE, dhaS, adk, yusH, yqhJ, yqhK und yqhI, eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe
  
• - das für die Ketopantoat-Reduktase kodierende panE-Gen (WO/0121772)
• - das vom offenen Leserahmen ylbQ beziehungsweise apbA-Gen kodierte Polypeptid (Kunst et. al. Nature 20; 390(6657): 249-256 (1997) Accession No. Z99111)
• - das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen (Sorokin et al., Microbiology 142: 2005-2016 (1996); WO 01/21772; Accession No.: L47709)
• - das für die Aspartat 1-Decarboxylase kodierende panD-Gen (Sorokin et al., Microbiology 142: 2005-2016 (1996); WO 01/21772; Accession No.: L47709)
• - das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen (Sorokin et al., Microbiology 142: 2005-2016 (1996); WO 01/21772; Accession No.: L47709)
• - die für die Acetohydroxysäure-Synthetase kodierenden Gene ilvE und ilvN (Wipat et. al., Microbiology 142: 3067-3078 (1996); Accession No.: Z75208)
• - das für die α-Acetolactat-Synthase kodierende alsS-Gen (Renna et al., Journal of Bacteriology 175: 3863-3875 (1993); Accession No.: Z93767)
• - das für die Acetohydroxysäure-Isomeroreduktase kodierende ilvC-Gen (Wipat et. al., Microbiology 142: 3067-3078 (1996); Accession No.: Z75208)
• - das für die Dihydroxysäure-Dehydratase kodierende ilvD- Gen (Sorokin et al., Microbiology 142: 2005-2016 (1996); Accession No.: Z99115)
• - das für die Phosphoglycerat Dehydrogenase kodierende serA-Gen (Sorokin et al., Molecular Microbiology 10: 385- 395 (1993); Accession No.: L47648)
• - das für die Phosphoserin-Aminotransferase kodierende serC-Gen (Noback et. al., Microbiology 144: 859-875 (1998); Sorokin et al., Molecular Microbiology 10: 385- 395 (1993); Accession No.: Z99109)
• - den offenen Leserahmen ywpJ (Presecan et al. Microbiology 143: 3313-3328 (1997); Accession No.: Z83337)
• - das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen (Kunst et. al., Nature 390: 249-256 (1997); Accession No.: Z99122)
• einzeln oder gemeinsam zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren.
• Schließlich kann es für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen der Bacillus-Gruppe vorteilhaft sein, zusätzlich zur Verstärkung eines oder mehrerer der Gene oder offenen Leserahmen, ausgewählt aus der Gruppe ybbT, ywkA, yjmC, ytsJ, mdh, cysK, iolJ, pdhD, yuiE, dhaS, adk, yusH, yqhJ, yqhK und yqhI, oder dafür kodierender Nukleotidsequenzen ein oder mehrere der Gene oder offenen Leserahmen ausgewählt aus der Gruppe
  
• - das vom ywaA-ORF kodierte Protein (Glaser et al., Molecular Microbiology 10: 371-384 (1993); Tobisch et al. Journal of Bacteriology 179: 496-506 (1997); Accession No. Z49992)
• - das vom ybgE-ORF kodierte Protein (Kunst et al., Nature 390, 249-256 (1997); Accession No. Z99105)
• - das für die L-Aspartase kodierende ansE-Gen (Sun und Seflow, Journal of Bacteriology 173: 3831-3845 (1991); Accession No.: D84432)
• - das für die Acetolactat Decarboxylase kodierende alsO- Gen (Renna et al., Journal of Bacteriology 175: 3863-3875 (1993); Accession No.: Z93767)
• - das für die Pantothensäure Kinase kodierende coaA-Gen bzw. yqjS-ORF (Kunst et al., Nature 390, 249-256 (1997); Accession No.: Z99116)
• - das für die coaX- Pantothensäure Kinase kodierende coaX- Gen bzw. yacB-ORF (Kunst et al., Nature 390, 249-256 (1997); Accession No.: Z99104; WO 01/21772)
einzeln oder gemeinsam abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder auf niedrigem Niveau zu exprimieren.
• Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel oder ORF verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder ORF oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
• Die Verringerung der Genexpression kann durch geeignete Kulturführung, durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression oder auch durch Antisense-RNA Technik erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren.
• Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften bzw. Aktivitäten von Proteinen bzw. Enzymen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt.
• Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Aktivität wird von Fehlsinnmutationen ("missense mutations") oder Nichtsinnmutationen ("nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen ("frame shift mutations"), die dazu führen, daß falsche Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Entsteht als Folge der Mutation ein Stop-Kodon im Kodierbreich, so führt dies ebenfalls zu einem vorzeitige Abbruch der Translation Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Aktivität.
• Durch die Maßnahmen der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp- Proteins, beziehungsweise der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangs-Mikroorganismus, herabgesenkt.
• Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure vorteilhaft sein neben der Verstärkung eines oder mehrere der Gene oder offenen Leserahmen, ausgewählt aus der Gruppe ybbT, ywkA, yjmC, ytsJ, mdh, cysK, iolJ, pdhD, yuiE, dhaS, adk, yusH, yqhJ, yqhK und yqhI, unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982). In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Bakterien eingesetzt werden in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der D-Pantothensäure verringern.
• Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im batch-Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch (Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
• Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Die in der WO 01/21772 beschriebenen Medien können ebenfalls verwendet werden. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
• Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
• Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies Vorstufen der D- Pantothensäure wie Aspartat, β-Alanin, Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure oder Pantoinsäure und gegebenenfalls deren Salze zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
• Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt.
• Es ist gleichfalls möglich, zur Darstellung der Erdalkalisalze der Pantothensäure, insbesondere des Calciumsalzes oder Magnesiumsalzes, während der Fermentation die Suspension oder Lösung einer Erdalkali- haltigen anorganischen Verbindung wie beispielsweise Calciumhydroxid oder MgO oder einer organischen Verbindung wie dem Erdalkalisalz einer organischen Säure beispielsweise Calciumacetat, kontinuierlich oder diskontinuierlich zu versetzen. Zu diesem Zweck wird das zur Darstellung des gewünschten Erdalkalisalzes der D- Pantothensäure nötige Kation direkt in der gewünschten Menge, bevorzugt in einer Menge von 0,95 bis 1,1 Äquivalenten, in die Fermentationsbrühe eingetragen.
• Die Salze können jedoch auch nach Abschluß der Fermentation durch Zugabe der anorganischen oder organischen Verbindungen zur Fermentationsbrühe gebildet werden, aus der gegebenenfalls die Biomasse zuvor entfernt wurde.
• Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff- haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 15°C bis 95°C, insbesondere 15°C bis 70°C, bevorzugt bei 20°C bis 55°C, ganz besonders bevorzugt bei 30°C bis 50°C oder 30°C bis 45°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an D-Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
• Die in der Fermentationsbrühe enthaltene D-Pantothensäure bzw. die entsprechenden Salze der D-Pantothensäure können anschließend nach dem Stand der Technik isoliert und gereinigt werden.
• Es ist ebenso möglich, die D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Fermentationsbrühen vorzugsweise zunächst durch bekannte Separationsmethoden wie zum Beispiel der Zentrifugation, der Filtration, dem Dekantieren oder einer Kombination hieraus vollständig oder zum Teil von der Biomasse zu befreien. Es ist jedoch auch möglich, die Biomasse gänzlich in der Fermentationsbrühe zu belassen. Im allgemeinen wird die Suspension oder Lösung vorzugsweise aufkonzentriert und anschließend beispielsweise mit Hilfe eines Sprühtrockners oder einer Gefriertrocknungsanlage zu einem Pulver aufgearbeitet. Anschließend wird dieses Pulver im allgemeinen durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-Verfahren z. B. auch Aufbaugranulation in ein gröberkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt mit einer Korngrößenverteilung von bevorzugt 20 bis 2000 µm, insbesondere 100 bis 1400 µm überführt. Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten oder Stearaten.
• Alternativ kann das Fermentationsprodukt mit oder ohne weitere der üblichen Fermentationsbestandteile auf einen in der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen Verdickungs- oder Bindemitteln stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.
• Gegebenenfalls wird in einer geeigneten Verfahrensstufe während oder nach der Fermentation D-Pantothensäure und/oder das gewünschte Salz der D-Pantothensäure oder eine diese Verbindungen enthaltende Zubereitung hinzugefügt, um den in dem Produkt gewünschten Gehalt an Pantothensäure oder dem gewünschten Salz zu erzielen bzw. einzustellen.
• Der gewünschte Gehalt an Pantothensäure und/oder dem gewünschten Salz liegt im allgemeinen im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% (bevorzugt auf die gesamte Trockenmasse).
• Die Konzentration an Pantothensäure kann mit bekannten chemischen (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)) oder mikrobiologischen Verfahren wie z. B. dem Lactobacillus plantarum Test (DIFCO MANUAL, 10^th Edition, S. 1100-1102; Michigan, USA) bestimmt werden.

Claims (9)

1. Verfahren zu Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Erdalkalisalzen oder diese enthaltende Futtermitteladditive durch Fermentation von Mikroorganismen der Bacillus-Gruppe, insbesondere solchen, die bereits D-Pantothensäure produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) in den Mikroorganismen mindestens eine oder mehrere der für das ybbT-ORF, ywkA-ORF, yjmC-ORF, ytsJ-ORF, mdh-Gen, cysK-Gen, iolJ-Gen, pdhD-Gen, yuiE-ORF, dhaS-Gen, adk-Gen, yusH-ORF, yqhJ-ORF, yqhK-ORF und yqhI-ORF kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) verstärkt, insbesondere überexprimiert,

b) die D-Pantothensäure und/oder deren Salze in der Fermentationsbrühe oder in den Zellen der Mikroorganismen anreichert, und

c) die gewünschten Produkte nach Abschluß der Fermentation isoliert, wobei man die Biomasse und/oder weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe in dem Produkt beläßt oder gegebenenfalls vollständig oder teilweise abtrennt (0 bis 100%).

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation in Gegenwart von Erdalkalisalzen durchführt, wobei diese kontinuierlich oder diskontinuierlich in insbesondere stöchiometrischen Mengen äquivalent zur gebildeten D-Pantothensäure zugeführt werden, und ein Erdalkalisalze der D- Pantothensäure enthaltendes oder daraus bestehendes Produkt gewinnt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen aus der Gattung Bacillus, insbesondere der Art Bacillus subtilis stammen.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig zusätzlich eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe, verstärkt, insbesondere überexprimiert:

1. 4.1 das für die Ketopantoat-Reduktase kodierende panE-Gen,

2. 4.2 den offenen Leserahmen ylbQ,

3. 4.3 das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen,

4. 4.4 das für die Aspartat-Decarboxylase kodierende panD-Gen,

5. 4.5 das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen,

6. 4.6 die für die Acetohydroxysäure-Synthetase kodierenden Gene ilvB und ilvN,

7. 4.7 das für die a-Acetolactat-Synthase kodierende alsS-Gen,

8. 4.8 das für die Acetohydroxysäure-Isomeroreduktase kodierende ilvC-Gen,

9. 4.9 das für die Dihydroxysäure-Dehydratase kodierende ilvD-Gen,

10. 4.10 das für die Phosphoglycerat Dehydrogenase kodierende serA-Gen,

11. 4.11 das für die Phosphoserin-Aminotransferase kodierende serC-Gen,

12. 4.12 den offenen Leserahmen ywpJ, und

13. 4.13 das für die Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man gleichzeitig zusätzlich eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe, abschwächt:

1. 5.1 das vom ywaA-ORF kodierte Protein,

2. 5.2 das vom ybgE-ORF kodierte Protein,

3. 5.3 das für die L-Aspartase kodierende ansB-Gen,

4. 5.4 das für die Acetolactat-Decarboxylase kodierende alsD-Gen,

5. 5.5 das für die Pantothensäure-Kinase kodierende coaA-Gen, und

6. 5.6 das für die coaX-Pantothensäure-Kinase kodierende coaX-Gen.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Überexpression einer oder mehrerer der für die Gene, ausgewählt aus der Gruppe ybbT, ywkA, yjmC, ytsJ, mdh, cysK, iolJ, pdhD, yuiE, dhaS, adk, yusH, yqhJ, yqhK und yqhI, kodierenden Nukleotidsequenz(en) dadurch erzielt, daß man eine oder mehrere der Maßnahmen ausgewählt aus der Gruppe Verwendung eines Plasmidvektors, Optimierung der Ribosomenbindungsstelle, Verwendung eines zusätzlichen Promotors und Einbau mindestens einer weiteren Genkopie durchführt.

7. Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Futtermittel-Additiven, gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass man

a) aus einer durch Fermentation gewonnenen D- Pantothensäure-haltigen Fermentationsbrühe, gegebenenfalls vollständig oder teilweise (0 bis 100%), die Biomasse und/oder einen Teil der Inhaltsstoffe abtrennt,

b) das so erhaltene Gemisch gegebenenfalls aufkonzentriert, und

c) das die Pantothensäure und/oder das Pantothenat enthaltende Futtermitteladditiv durch geeignete Maßnahmen in eine rieselfähige Form überführt, und

d) durch geeignete Maßnahmen ein rieselfähiges Tierfuttermittel-Additiv mit einer Korngrößenverteilung von 20 bis 2000 µm gewinnt.

8. Verfahren zur Herstellung von Tierfuttermittel- Additiven gemäß Anspruch 8 mit einem Gehalt an D- Pantothensäure und/oder deren Salze ausgewählt aus der Gruppe Magnesium- oder Calciumsalz aus Fermentationsbrühen, gekennzeichnet durch die Schritte

a) gegebenenfalls Entfernen von Wasser aus der Fermentationsbrühe (Aufkonzentration),

b) Entfernen der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von ≥ 0 bis 100%,

c) gegebenenfalls Zusatz von einer oder mehreren der genannten Verbindungen zu den gemäß a) und b) erhaltenen Fermentationsbrühen, wobei die Menge der zugesetzten Verbindungen so bemessen ist, dass deren Gesamtkonzentration im Tierfuttermittel- Additiv bevorzugt im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% liegt, und

d) Gewinnung des Tierfuttermittel-Additivs in der gewünschten Pulver- oder bevorzugt Granulatform.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der Fermentationsbrühe gegebenenfalls nach Zusatz von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen und gegebenenfalls nach Zusatz von organischen oder anorganischen Hilfsstoffen durch

a) Trocknen und Kompaktieren, oder

b) Sprühtrocknen, oder

c) Sprühtrocknen und Granulieren, oder

d) Sprühtrocknen und Aufbaugranulieren,

ein Tierfuttermittel-Additiv mit der gewünschten Korngröße gewinnt.