DE60208015T2

DE60208015T2 - Verfahren zur fermentativen herstellung von d-pantothensäure und/oder deren salzen

Info

Publication number: DE60208015T2
Application number: DE60208015T
Authority: DE
Inventors: Mechthild Rieping; Thomas Hermann
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-02-13
Filing date: 2002-01-11
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2022-01-12
Also published as: WO2002072838A3; DK1383898T3; ATE312930T1; US6686183B2; EP1383898A2; US20030054502A1; AU2002244645A1; DE10106459A1; WO2002072838A2; EP1383898B1; DE60208015D1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder ihren Salzen oder diese enthaltenden Gemischen unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen das Gen gcvT überexprimiert wird.
Stand der Technik
Pantothensäure wird weltweit in einer Größenordnung von mehreren tausend Tonnen pro Jahr produziert. Sie wird unter anderem in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und in der Nahrungsmittelindustrie verwendet. Ein großer Teil der produzierten Pantothensäure wird für die Ernährung von Nutztieren, wie etwa Geflügel und Schweinen, verwendet. Der Bedarf steigt.
Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen in geeigneten Nährmedien hergestellt werden. Bei der chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige Vorstufe. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt; in weiteren Verfahrensschritten wird das racemische Gemisch aufgetrennt, das D-Pantolacton mit β-Alanin kondensiert und so D-Pantothensäure erhalten.
Die typische Handelsform ist das Calciumsalz der D-Pantothensäure. Das Calciumsalz des racemischen Gemisches von D,L-Pantothensäure ist ebenfalls gebräuchlich.
Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch Mikroorganismen liegt in der direkten Bildung der gewünschten stereoisomeren Form, nämlich der D-Form, die frei von L-Pantothensäure ist.
Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Escherichia coli (E. coli), Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen, wie z. B. Debaromyces castellii, können, wie in der EP-A 0 493 060 gezeigt, in einem Nährmedium, das Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthält, D-Pantothensäure produzieren. Die EP-A 0 493 060 zeigt weiterhin, daß bei E. coli durch Amplifikation von Pantothensäure-Biosynthesegenen aus E. coli, die auf den Plasmiden pFV3 und pFV5 enthalten sind, in einem Nährmedium, das Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthält, die Bildung von D-Pantothensäure verbessert wird.
Die EP-A 0 590 857 sowie das US-Patent 5,518,906 beschreiben vom E.-coli-Stamm IFO3547 abgeleitete Mutanten, wie etwa FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 und FV5069, die Resistenzen gegen verschiedene Antimetabolite, wie etwa Salicylsäure, α-Ketobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure, O-Methylthreonin und α-Ketoisovaleriansäure, tragen. Sie produzieren in einem Nährmedium, das Glucose enthält, Pantoinsäure und in einem Glucose- und β-Alanin-haltigen Nährmedium D-Pantothensäure. In der EP-A 0 590 857 und dem US-Patent 5,518,906 wird weiterhin angegeben, daß nach Amplifikation der Pantothensäure-Biosynthesegene panB, panC und panD, die auf dem Plasmid pFV31 vorhanden sein sollen, in den oben genannten Stämmen in Glucosehaltigen Nährmedien die Produktion von D-Pantoinsäure und in einem Nährmedium, das Glucose und β-Alanin enthält, die Produktion von D-Pantothensäure verbessert wird.
Weiterhin wird in der WO 97/10340 über die förderliche Wirkung der Verstärkung des ilvGM-Operons auf die Produktion von D-Pantothensäure berichtet. In der EP-A-1001027 wird schließlich über die Wirkung der Verstärkung des panE-Gens auf die Bildung von D-Pantothensäure berichtet.
Nach dem Stand der Technik wird die D-Pantothensäure oder das entsprechende Salz aus der Fermentationsbrühe isoliert und gereinigt (EP-A-0590857 und WO 96/33283) und danach in gereinigter Form verwendet, oder die D-Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe wird insgesamt getrocknet (EP-A-1050219) und insbesondere als Nahrungsmittelzusatz verwendet.
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder ihren Salzen bzw. diese enthaltenden Tierfuttermittelzusätze bereitzustellen.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Wenn im folgenden D-Pantothensäure oder Pantothensäure oder Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freien Säuren, sondern auch die Salze der D-Pantothensäure, wie z. B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz, gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder ihren Salzen oder zusätzlich zu diesen weitere Bestandteile aus der Fermentation enthaltenden Nahrungsmittelzusätzen durch Fermentation rekombinanter Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits D-Pantothensäure produzieren, wobei man in dem Verfahren

a) die für das endogene Gen gcvT codierende Nukleotidsequenz in den Mikroorganismen unter für die Produktion des Genprodukts (Proteins) geeigneten Bedingungen überexprimiert,
b) D-Pantothensäure und/oder ihre Salze im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen anreichert und
c) die D-Pantothensäure und/oder ihre Salze nach Beendigung der Fermentation isoliert, wobei eine Menge von ≥0 bis 100 der Biomasse und/oder gegebenenfalls weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe abgetrennt werden,

Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren, bei dem nach Abschluß der Fermentation die Biomasse teilweise oder insgesamt in der Fermentationsbrühe verbleibt und die so erhaltene Brühe gegebenenfalls nach Auf konzentrieren zu einem festen, D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Gemisch, das bevorzugt weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält, verarbeitet wird.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der zellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet und gegebenenfalls diese Schritte kombiniert.
Als Ergebnis des Verstärkungsschritts, insbesondere der Überexpression, steigt die Aktivität bzw. Konzentration des entsprechenden Proteins gegenüber der des Wildtypproteins oder gegenüber der Aktivität bzw. Konzentration des Proteins im ursprünglichen Mikroorganismus im allgemeinen um wenigstens 10%, 25%, 50 %, 75%, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 % oder 500%, höchstens bis zu 1000 oder 2000%, an.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können D-Pantothensäure aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich dabei um Vertreter der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere aus der Gattung Escherichia. Aus der Gattung Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli zu nennen. Innerhalb der Art Escherichia coli sind die sogenannten K-12-Stämme, wie z. B. die Stämme MG1655 oder W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli and Salmonella. Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington D.C.)) oder der Escherichia-coli-Wildtypstamm IFO3547 (Institut für Fermentation, Osaka, Japan) und davon abgeleitete Mutanten geeignet, welche die Fähigkeit zur Produktion von D-Pantothensäure besitzen.
Geeignete D-Pantothensäure produzierende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli, sind beispielsweise
Escherichia coli FV5069/pFV31
Escherichia coli FV5069/pFV202
Escherichia coli FE6/pFE80 und
Escherichia coli KE3.
Es stellte sich heraus, daß Enterobacteriaceae nach Überexpression des für das Glycin-Spaltungssystem (glycine-cleavage system) kodierenden Gens gcvT in verbesserter Weise D-Pantothensäure produzieren.
Die Nukleotidsequenzen in den Genen gcvT, gcvH und gcvP aus Escherichia coli wurde von Okamura-Ikeda et al. (European Journal of Biochemistry 216, 539-548 (1993)) veröffentlicht und können auch der von Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997) unter Accession Number AE000341 veröffentlichten Genomsequenz für Escherichia coli entnommen werden.
Die in den oben angegebenen Textstellen beschriebenen Gene können erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen (sense mutations) ergeben.
Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann der Promotor- und Regulationsbereich oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Mittels induzierbarer Promotoren ist es auch möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen D-Pantothensäure-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird die Expression ebenfalls verbessert. Weiterhin wird durch Hemmung des Abbaus des Enzymproteins auch die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Als Alternative kann eine Überexpression der beteiligten Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)), bei Amann und Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), bei de Broer et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America 80: 21-25 (1983)), bei LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)), in der PCT/US97/13359, bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224 (1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), bei Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989), bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998) sowie in allgemein bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Es lassen sich in Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren, wie z. B. von pACYC184 abgeleitete Kloniervektoren (Bartolomé et al.; Gene 102, 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) oder pSC101-Derivate (Vocke und Bastia, Proceedings of the National Academy of Science USA 80 (21): 6557-6561 (1983)), verwenden. In einem erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen mit einem Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzen, wobei der Plasmidvektor die für das Gen gcvT codierende Nucleotidsequenz aufweist.
Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression des endogenen Gens gcvT ein endogenes Gen oder mehrere endogene Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• das für die Acetohydroxysäure-Synthase II codierende ilvGM-Operon (WO 97/10340),
• das für Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase codierende Gen panB (US-A-5,518,906),
• das für Ketopantoat-Reduktase codierende Gen panE (EP-A-1001027),
• das für Aspartat-Decarboxylase codierende Gen panD (US-A-5,518,906),
• das für Pantothenat-Synthetase codierende Gen panC (US-A-5,518,906),
• das für Phosphoserin-Transaminase codierende Gen serC (Duncan und Coggins, Biochemical Journal 234: 49-57 (1986)) und
• das für Serin-Hydroxymethyltransferase codierende Gen glyA (Plamann et al., Nucleic Acids Research 11(7): 2065-2075(1983)),

Schließlich kann es für die Produktion von D-Pantothensäure mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression des Gens gcvT

• das für Transaminase C codierende Gen avtA (EP-A-1001027)

Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit einer geringeren Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert, und gegebenenfalls diese Schritte kombiniert.
Die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins wird durch den Abschwächungsschritt im allgemeinen auf 0 bis 75 %, 0 bis 50 %, 0 bis 25 %, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität bzw. Konzentration des Wildtypproteins oder der Aktivität bzw. Konzentration des Proteins im Ausgangsmikroorganismus erniedrigt.
Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure vorteilhaft sein, neben der Überexpression des Gens gcvT im Glycin-Spaltungssystem (glycine cleavage system) unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (Hrsg.), Academic Press, London, UK, 1982). In dem erfindungsgemäßen Verfahren können Bakterien eingesetzt werden, in denen die Stoffwechselwege, die die Bildung von D-Pantothensäure verringern, zumindest teilweise ausgeschaltet sind.
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können in Satzkultivierung („batch process"), im Zulaufverfahren („fed batch process") oder im repetitiven Zulaufverfahren („repeated fed batch process") kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen des jeweiligen Stamms genügen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) aufgeführt. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate, wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie z. B. Glycerin und Ethanol, sowie organische Säuren, wie z. B. Essigsäure, verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen, wie etwa Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff, oder anorganische Verbindungen, wie etwa Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können zusätzlich zu den oben genannten Stoffen essentielle Wuchsstoffe, wie etwa Aminosäuren und Vitamine, eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies Vorstufen der D-Pantothensäure, wie etwa Aspartat, β-Alanin, Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure oder Pantoinsäure, und gegebenenfalls deren Salze zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes gegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zum Kulturmedium zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen, wie etwa Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser, oder saure Verbindungen, wie etwa Phosphorsäure oder Schwefelsäure, in geeigneter Weise eingesetzt.
Es ist gleichfalls möglich, zur Darstellung der Erdalkalisalze der Pantothensäure, insbesondere des Calciumsalzes, während der Fermentation eine Suspension oder Lösung einer erdalkalihaltigen anorganischen Verbindung, wie beispielsweise Calciumhydroxid, oder einer organischen Verbindung, wie etwa dem Erdalkalisalz einer organischen Säure, beispielsweise Calciumacetat, kontinuierlich oder diskontinuierlich zuzusetzen. Auf diese Weise wird das zur Darstellung des gewünschten Erdalkalisalzes der D-Pantothensäure nötige Kation direkt in der gewünschten Menge, im allgemeinen im Verhältnis von 0,8 zu 1 in bezug auf die Pantothensäure, vorzugsweise in stöchiometrischen Mengen, in die Fermentationsbrühe eingetragen.
Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasgemische, wie beispielsweise Luft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 25 °C bis 45 °C und vorzugsweise bei 30 °C bis 40 °C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an D-Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die in der Fermentationsbrühe enthaltene D-Pantothensäure bzw. die entsprechenden Salze der D-Pantothensäure können anschließend nach dem Stand der Technik isoliert und gereinigt werden.
Es ist ebenso möglich, die D-Pantothensäure und/oder ihre Salze enthaltende Fermentationsbrühe vorzugsweise zunächst durch bekannte Trennmethoden, wie zum Beispiel Zentrifugation, Filtration, Dekantieren oder eine Kombination hieraus, zum Teil (≥ 0 bis 100%) oder vollständig von der Biomasse zu befreien. Es ist jedoch auch möglich, die Biomasse gänzlich in der Fermentationsbrühe zu belassen. Im allgemeinen wird die Suspension oder Lösung vorzugsweise auf konzentriert und beispielsweise mit Hilfe eines Sprühtrockners oder einer Gefriertrocknungsanlage zu einem Pulver aufgearbeitet. Anschließend wird dieses Pulver mit geeigneten Kompaktierungs- oder Granulationsverfahren, z. B. auch Aufbaugranulation, in ein grobkörniges, sehr rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt mit einer Korngrößenverteilung von 20 bis 2000 μm, insbesondere 100 bis 1400 μm, überführt. Vorteilhaft bei der Granulation oder Kompaktierung ist der Einsatz herkömmlicher organischer oder anorganischer Hilfsstoffe, beziehungsweise von Trägern, wie etwa Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen Stoffen, wie sie herkömmlicherweise in der Nahrungsmittel- oder Tierfutterverarbeitung als Binde-, Gelier- oder Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren Stoffen, wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten oder Stearaten.
Als Alternative kann das Fermentationsprodukt mit weiteren herkömmlichen Fermentationsbrühenbestandteilen oder ohne diese auf einen in der Nahrungsmittelverarbeitung bekannten und herkömmlicherweise verwendeten organischen oder anorganischen Trägerstoff, wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikate, Schrot, Kleie, Mehl, Stärke, Zucker oder dergleichen, aufgezogen und/oder mit herkömmlichen Verdickungs- oder Bindemitteln stabilisiert werden. Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817) beschrieben.
Gegebenenfalls wird in einer geeigneten Verfahrensstufe D-Pantothensäure und/oder das gewünschte Salz der D-Pantothensäure oder eine diese Verbindungen enthaltende Zubereitung dem Produkt hinzugefügt, um die gewünschte Konzentration an Pantothensäure oder dem gewünschten Salz zu erhalten bzw. einzustellen.
Die gewünschte Konzentration liegt im allgemeinen im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse).
Die Konzentration an Pantothensäure kann mit bekannten chemischen (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)) oder mikrobiologischen Verfahren, wie z. B. dem Lactobacillus-plantarum-Test (DIFCO MANUAL, 10. Auflage, S. 1100-1102; Michigan, USA) bestimmt werden.
Eine Reinkultur des folgenden Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig) am 8. September. 2000 gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt:

• Escherichia-coli-K12-Stamm FE6-1, als DSM 13721.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Arbeitsbeispielen ausführlicher erläutert.
Das Minimalmedium (M9) sowie das Vollmedium (LB) für Escherichia coli sind bei J. H. Miller (A short course in bacterial genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben. Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie alle Techniken für die Restriktion sowie für die Behandlung mit Klenow und alkalischer Phosphatase werden nach Sambrook et al. (Molecular cloning – A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) durchgeführt. Die Transformation von Escherichia coli erfolgt, falls nicht anders beschrieben, nach Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1989) 86: 2172-2175).
Beispiel 1
Konstruktion des Expressionplasmids pTrc99AgcvT
Das Gen gcvT aus E. coli K12 wird mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) und synthetischer Oligo nukleotide durchgeführt. Dabei werden, ausgehend von der Nukleotidsequenz für das gcvT-Gen in E. coli K12 MG1655 (Accession Number AE000374, Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997),) PCR-Primer synthetisiert (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland):
gcvT1: 5'-CCGGCTTATTCAATGAGGAC-3'
gcvT2: 5'-GCTGGTACGTTGCTCATCAATC-3'
Die für die PCR verwendete chromosomale DNA von E. coli K12 MG1655 wird mit „Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) gemäß vom Hersteller zur Verfügung gestellten Daten isoliert. Ein ungefähr 1200 bp großes DNA-Fragment läßt sich mit spezifischen Primern unter PCR-Standardbedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) unter Verwendung von Pfu-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) amplifizieren. Das PCR-Produkt wird unter Verwendung des Vektors pCR-Blunt II-TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) gemäß vom Hersteller zur Verfügung gestellten Daten ligiert und in den E.-coli-Stamm TOP 10 transformiert. Die Selektion von das Plasmid tragenden Zellen wird auf LB-Agar, der mit 50 μg/ml Kanamycin behandelt wurde, vorgenommen. Der Vektor pCR-Blunt II-TOPOgcvT wird nach Isolierung der Plasmid-DNA mit den Restriktionsenzymen PstI und BamHI geschnitten und das gcvT-Fragment nach Trennung in einem 0,8%igen Agarosegel mit dem „QIAquick Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Der Vektor pTrc99A (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) wird mit den Enzymen PstI und BamHI geschnitten und mit dem isolierten gcvT-Fragment ligiert. Der E.-coli-Stamm XL 1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, USA) wird mit dem Ligationsgemisch transformiert, und das Plasmid tragende Zellen werden auf LB-Agar, der mit 50 μg/ml Ampicillin behandelt wurde, selektioniert. Nach der Plasmid-DNA-Isolierung läßt sich die erfolgreiche Klonierung mittels Kontrollspaltung mit dem Enzym SspI nachweisen. Das Plasmid wird mit pTrc99AgcvT bezeichnet (1).
Beispiel 2
Herstellung des Stamms FE6-1/pTrc99AgcvT
Bei dem E.-coli-Stamm FE6 handelt es sich um eine Valin-resistente Mutante von E. coli K12 MG1655 (US-B-6171845), die als DSM12379 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) hinterlegt ist. Ausgehend von FE6 werden nach Inkubation bei 37 °C auf Minimalagar, der mit 2 g/l Glucose und 1 g/l β-Hydroxyasparaginsäure behandelt wurde, Spontanmutanten isoliert. Anschließend wird eine ausgewählte, gegen β-Hydroxyasparaginsäure resistente Einzelkolonie bei 37 °C auf Minimalagar, der 2 g/l Glucose und 0,2 g/l O-Methylthreonin enthält, inkubiert. Eine mit FE6-1 bezeichnete Mutante ist nach diesem Schritt resistent gegen Valin, α-Ketoisovaleriansäure, β-Hydroxyasparaginsäure und O-Methylthreonin. Das Plasmid pTrc99AgcvT wird in den Stamm FE6-1 transformiert, und das Plasmid tragende Zellen werden auf LB-Agar, der mit 50 μg/ml Ampicillin behandelt wurde, selektioniert. Der erhaltene Stamm wird mit FE6-1/pTrc99AgcvT bezeichnet.
Beispiel 3
Herstellung des Stamms FE6-1/pTrc99AgcvT,pACYC184panBC
Der D-Pantothensäure produzierende E.-coli-Stamm FV5069/pFV31 ist in der EP-A-0590857 beschrieben und als FERM BP 4395 gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt. Das Plasmid pFV31 wird aus FV5069/pFV31 isoliert und mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten. Nach Trennung in einem 0,8%igen Agarosegel wird das ungefähr 2600 bp große DNA-Fragment, auf dem die panBC-Gene liegen, mit dem „QIAquick Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert. Der Vektor pACYC184 (Chang, A. C. Y. und Cohen, S. N., Journal of Bacteriology 134, 1141-1156 (1978); ATCC37033 (American Type Culture Collection, Manassas, USA)) wird mit dem Enzym EcoRI geschnitten und mit dem isolierten panBC-Fragment ligiert. Der E.-coli-Stamm FE6-1 wird mit dem Ligationsgemisch transformiert, und das Plasmid tragende Zellen werden auf LB-Agar, der mit 10 μg/ml Tetracyclin behandelt wurde, selektioniert. Nach der Plasmid-DNA-Isolierung läßt sich die erfolgreiche Klonierung mittels Kontrollspaltung mit den Enzymen EcoRV und EcoRI nachweisen. Das Plasmid wird mit pACYC184panBC bezeichnet (2). Der in Beispiel 2 beschriebene Stamm FE6-1/pTrc99AgcvT wird mit dem Plasmid pACYC184panBC transformiert. Die Selektion erfolgt auf LB-Agar, der mit 50 μg/ml Ampicillin und 10 μg/ml Tetracyclin behandelt wurde. Der auf diese Weise erhaltene Stamm wird mit FE6-1/pTrc99AgcvT, pACYC184panBC bezeichnet.
Beispiel 4
Produktion von D-Pantothensäure mit von FE6-1 abgeleiteten Stämmen
Die Pantothenatproduktion der E.-coli-Stämme FE6-1, FE6-1/pTrc99AgcvT, FE6-1/pACYC184panBC, FE6-1/pTrc99AgcvT, pACYC184panBC wird in in 100-ml-Erlenmeyerkolben enthaltenen Satzkulturen von jeweils 10 ml überprüft. Hierzu werden 10 ml Vorkulturmedium in der Zusammensetzung 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l MgSO₄·7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose mit einer Einzelkolonie angeimpft und 20 Stunden bei 33 °C und 200 UpM in einem ESR-Inkubator der Firma Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. 10 ml Produktionsmedium (25 g/l (NH₄)₂SO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄·7H₂O, 0,03 g/l FeSO₄·7H₂O, 0,018 g/l MnSO₄·1H₂O, 30 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 20 g/l β-Alanin, 250 mg/l Thiamin) werden jeweils mit Portionen von jeweils 200 μl dieser Vorkultur angeimpft und 48 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Medien werden während der Inkubation von FE6-1/pTrc99AgcvT auch mit jeweils 50 mg/l Ampicillin, während der Inkubation von FE6-1/pACYC184panBC auch mit jeweils 10 mg/l Tetracyclin und während der Inkubation von FE6-1/pTrc99AgcvT,pACYC184panBC auch mit jeweils 50 mg/l Ampicillin und 10 mg/l Tetracyclin versetzt. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension bei einer Testwellenlänge von 660 nm mit einem LP2W-Photometer der Firma Dr. Lange Co. (Düsseldorf, Deutschland) bestimmt.
Anschließend wird die Konzentration des in der sterilfiltrierten Kulturüberstandsflüssigkeit gebildeten D-Pantothenats unter Verwendung der Lactobacillus-plantarum-ATCC8014-Pantothenat-Tests nach Daten von DIFCO (DIFCO MANUAL, 10. Auflage, S. 1100-1102; Michigan, USA) ermittelt. Für Kalibrierungszwecke wird das Calciumsalz von D(+)-Pantothensäure-Hydrat (Katalognummer 25,972-1, Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland) verwendet.
Die Ergebnisse des Tests sind in Tabelle 1 beschrieben.
Tabelle 1
Kurze Beschreibung der Figuren:
1: Karte des das gcvT-Gen enthaltenden Plasmids pTrc99AgcvT
2: Karte des das panBC-Gen enthaltenden Plasmids pACYC184panBC
Daten im Zusammenhang mit Längenangaben sind als Näherungswerte aufgeführt. Es werden die folgenden Abkürzungen und Namen verwendet:

• Amp: Ampicillinresistenz-Gen
• Tc: Tetracyclinresistenz-Gen
• lacI: Gen für das Repressorprotein des trc-Promotors
• Ptrc: trc-Promotorbereich, mit IPTG induzierbar
• gcvT: Codierender Bereich des gcvT-Gens
• 5S: 5S-rRNA-Bereich
• rrnBT: rRNA-Terminatorbereich
• panB: Codierender Bereich des panB-Gens
• panC: Codierender Bereich des panC-Gens

Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme sind wie folgt:

• BamHI: Restriktionsendonuklease aus Bacillus amyloliquefaciens
• BglII: Restriktionsendonuklease aus Bacillus globigii
• ClaI: Restriktionsendonuklease aus Caryphanon latum
• EcoRI: Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli
• EcoRV: Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli
• HindIII: Restriktionsendonuklease aus Haemophilus influenzae
• KpnI: Restriktionsendonuklease aus Klebsiella pneumoniae
• PstI: Restriktionsendonuklease aus Providencia stuartii
• PvuI: Restriktionsendonuklease aus Proteus vulgaris
• SacI: Restriktionsendonuklease aus Streptomyces achromogenes
• SalI: Restriktionsendonuklease aus Streptomyces albus
• SmaI: Restriktionsendonuklease aus Serratia marcescens
• XbaI: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas badrii
• XhoI: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas holcicola

Claims

Verfahren zur Produktion von D-Pantothensäure und/oder ihre Salze umfassenden Futtermittelzusätzen durch Fermentation rekombinanter Mikroorganismen aus der Familie Enterobacteriaceae, bei dem man a) die für das endogene Gen gcvT codierende Nukleotidsequenz in den Mikroorganismen unter für die Produktion des Genprodukts (Proteins) geeigneten Bedingungen überexprimiert, b) D-Pantothensäure und/oder ihre Salze im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen anreichert und c) die D-Pantothensäure und/oder ihre Salze nach Beendigung der Fermentation isoliert, wobei eine Menge von 0 bis 100% der Biomasse und/oder weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe abgetrennt werden, wobei die Mikroorganismen D-Pantothensäure produzieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei man die Fermentation in Gegenwart von Erdalkalisalzen durchführt, wobei diese in der benötigten Menge kontinuierlich oder diskontinuierlich zugeführt werden und ein ein Erdalkalisalz der D-Pantothensäure enthaltendes oder daraus bestehendes Produkt erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mikroorganismen zur Gattung Escherichia gehören.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Mikroorganismen zur Spezies Escherichia coli gehören.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zusätzlich zur Überexpression des gcvT-Gens eines oder mehrere der endogenen Gene, ausgewählt aus der Gruppe: 5.1 das für Acetohydroxysäure-Synthase II codierende ilvGM-Operon, 5.2 das für Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase codierende Gen panB, 5.3 das für Ketopantoat-Reduktase codierende Gen panE, 5.4 das für Aspartat-Decarboxylase codierende Gen panD, 5.5 das für Pantothenat-Synthetase codierende Gen panC, 5.6 das für Phosphoserin-Transaminase codierende Gen serC, überexprimiert wird bzw. werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Bakterien, in denen das für Transaminase codierende Gen avtA attenuiert ist, verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konzentration des Produkts (Proteins) des Gens gcvT in bezug auf die des Wildtyp-Proteins um 10 bis 2000 erhöht ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei transformierte Stämme, in denen die für das Gen gcvT codierende Nukleotidsequenz auf einem Plasmidvektor oder im Chromosom integriert vorhanden ist und überexprimiert wird, verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Mikroorganismen, die vor ihrer Transformation D-Pantothensäure produzieren, fermentiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei man die Überexpression durch Erhöhen der Kopienzahl des Gens gcvT erreicht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei man a) 0 bis 100 der Biomasse und/oder des Inhalts der Fermentationsbrühe von der Fermentationsbrühe, die durch Fermentation erhaltene D-Pantothensäure und/oder Salze davon enthält, trennt, b) das Pantothensäure und/oder Pantothenat enthaltende Gemisch mit geeigneten Maßnahmen in eine frei fließende Form umwandelt und c) daraus einen frei fließenden Tierfutterzusatz mit einer Teilchengrößenverteilung von 20 bis 2000 μm produziert.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei man nach Abtrennen der Biomasse und/oder weiterer Bestandteile in einer Menge von 0 bis 100% das Gemisch auf konzentriert.
Verfahren zur Produktion von Futtermittelzusätzen nach Anspruch 2 mit einem Gehalt an D-Pantothensäure und/oder ihren Salzen, gewählt aus der Gruppe der Magnesium- oder Calciumsalze, wobei man a) 0 bis 100% der während der Fermentation gebildeten Biomasse abtrennt, b) eine oder mehrere der Verbindungen D-Pantothensäure und/oder ihre Salze zu der gemäß a) behandelten Fermentationsbrühe gibt, wobei die Verbindungen in einer solchen Menge zugegeben werden, daß deren Gesamtkonzentration in dem Tierfutterzusatz im Bereich von etwa 20 bis 80 Gew.-% (Trockengewicht) liegt, und c) den Tierfutterzusatz in der gewünschten Pulver- oder vorzugsweise Granulatform produziert.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei man vor Abtrennen der Biomasse Wasser aus der Fermentationsbrühe entfernt.
Verfahren nach Anspruch 13 und 14, wobei man einen Tierfutterzusatz in der gewünschten Pulver- oder Granulatform durch a) Trocknung und Kompaktierung oder b) Sprühtrocknung oder c) Sprühtrocknung und Granulierung oder d) Sprühtrocknung und Pelletierung aus der Fermentationsbrühe gewinnt.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei man vor dem Umwandeln mittels Kompaktierungs- oder Granulierungsverfahren eine organische oder anorganische Hilfssubstanz zugibt.
Verfahren nach Anspruch 15 bis 16, wobei man vor dem Umwandeln mittels Kompaktierungs- oder Granulierungsverfahren D-Pantothensäure und/oder ihre Salze zugibt.