DE10106459A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen - Google Patents
Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren SalzenInfo
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Abstract
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen oder diese enthaltende Futtermitteladditive durch Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere solchen, die bereits D-Pantothensäure produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine der für die Gene gcvT, gcvH und gcvP kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) in dem Mikroorganismen verstärkt, insbesondere überexprimiert.
Description
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen
Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen oder
diese enthaltende Mischungen unter Verwendung von
Microorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen
mindestens eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der
Gruppe gcvT, gcvH und gcvP verstärkt wird.
Pantothensäure wird weltweit in einer Größenordnung von
mehreren tausend Tonnen pro Jahr produziert. Es wird unter
anderem in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen
Industrie und in der Lebensmittelindustrie verwendet. Ein
großer Teil der produzierten Pantothensäure wird für die
Ernährung von Nutztieren wie Geflügel und Schweine
verwendet. Der Bedarf steigt.
Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder
biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen
in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Bei der
chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige
Vorstufe. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus
Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt, in
weiteren Verfahrensschritten das racemische Gemisch
aufgetrennt, das D-Pantolacton mit β-Alanin kondensiert und
so D-Pantothensäure erhalten.
Die typische Handelsform ist das Calcium-Salz der D-
Pantothensäure. Das Calcium-Salz des racemischen Gemisches
der D,L-Pantothensäure ist ebenfalls gebräuchlich.
Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch
Mikroorganismen liegt in der direkten Bildung der
gewünschten stereoisomeren Form, nämlich der D-Form, die
frei von L-Pantothensäure ist.
Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Escherichia coli
(E. coli), Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium
erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen,
wie z. B. Debaromyces castellii können wie in EP-A 0 493 060
gezeigt, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure
und β-Alanin enthält, D-Pantothensäure produzieren. EP-A 0 493 060
zeigt weiterhin, daß bei E. coli durch
Amplifikation von Pantothensäure-Biosynthesegenen aus E.
coli, die auf den Plasmiden pFV3 und pFV5 enthalten sind,
in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β-
Alanin enthält, die Bildung von D-Pantothensäure verbessert
wird.
EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 beschreiben von E.
coli Stamm IFO3547 abgeleitete Mutanten, wie FV5714, FV525,
FV814, FV521, FV221, FV6051 und FV5069, die Resistenzen
gegen verschiedene Antimetabolite wie Salizylsäure, α-
Ketobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure, O-Methylthreonin
und α-Ketoisovaleriansäure tragen. Sie produzieren in einer
Nährlösung, die Glucose enthält, Pantoinsäure, und in einer
Glucose- und β-Alanin-haltigen Nährlösung D-Pantothensäure.
In EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518, 906 wird weiterhin
angegeben, daß nach Amplifikation der Pantothensäure-
Biosynthesegene panB, panC und panD, die auf dem Plasmid
pFV31 enthalten sein sollen, in den oben genannten Stämmen
in Glucose-haltigen Nährlösungen, die Produktion von D-
Pantoinsäure und in einer Nährlösung, die Glucose und β-
Alanin enthält, die Produktion von D-Pantothensäure
verbessert wird.
Weiterhin wird in der WO 97/10340 über die förderliche
Wirkung der Verstärkung des ilvGM-Operons auf die
Produktion von D-Pantothensäure berichtet. In der EP-A-
1001027 wird schließlich über die Wirkung der Verstärkung
des panE-Gens auf die Bildung der D-Pantothensäure
berichtet.
Nach dem Stand der Technik wird die D-Pantothensäure oder
das entsprechende Salz aus der Fermentationsbrühe isoliert
und gereinigt (EP-A-0590857 und WO 96/33283) und
dementsprechend in gereinigter Form verwendet oder die D-
Pantothensäure-haltige Fermentationsbrühe wird insgesamt
getrocknet (EP-A-1050219) und insbesondere als
Futtermitteladditiv verwendet.
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue
Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von D-
Pantothensäure und/oder deren Salzen bzw. diese enthaltende
Tierfuttermittel-Additive bereitzustellen.
Wenn im Folgenden D-Pantothensäure oder Pantothensäure oder
Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freien
Säuren, sondern auch die Salze der D-Pantothensäure wie
z. B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz
gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder
deren Salzen unter Verwendung von Mikroorganismen der
Familie Enterobacteriaceae, die insbesondere bereits D-
Pantothensäure produzieren, und in denen mindestens eines
der für die Gene, ausgewählt aus der Gruppe gcvT, gcvH und
gcvP kodierende(n) Nukleotidsequenz(en) verstärkt,
insbesondere überexprimiert wird.
Insbesondere handelt es sich um ein Verfahren, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man folgende Schritte durchführt:
- a) Fermentation von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, in denen mindestens eines der Gene, ausgewählt aus der Gruppe gcvT, gcvH und gcvP verstärkt (überexprimiert) wird, ggf. in Kombination mit weiteren Genen,
- b) gegebenenfalls in Gegenwart von Erdalkaliverbindungen, wobei diese in vorzugsweise stöchiometrischen Mengen kontinuierlich oder diskontinuierlich der Fermentationsbrühe hinzugefügt werden,
- c) Anreicherung der D-Pantothensäure bzw. des entsprechenden Salzes im Medium bzw. der Fermentationsbrühe oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae und
- d) nach Abschluß der Fermentation Isolieren der D- Pantothensäure, und/oder des entsprechenden Salzes Gegenstand der Erfindung ist ebenso ein Verfahren, bei dem nach Abschluß der Fermentation die Biomasse teilweise oder insgesamt in der Fermentationsbrühe verbleibt, und die so erhaltene Brühe gegebenenfalls nach dem Aufkonzentrieren zu einer festen D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Mischung, die bevorzugt weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe enthält, verarbeitet wird.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang
die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder
mehrerer Enzyme bzw. Proteine in einem Mikroorganismus, die
durch die entsprechende DNA kodiert werden, indem man
beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene
erhöht, einen starken Promotor oder ein Gen oder Allel
verwendet, das für ein entsprechendes Enzym bzw. Protein
mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese
Maßnahmen kombiniert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können D-Pantothensäure aus Glucose,
Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke,
Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es
handelt sich um Vertreter der Enterobacteriaceae,
insbesondere der Gattung Escherichia. Bei der Gattung
Escherichia ist insbesondere die Art Escherichia coli zu
nennen. Innerhalb der Art Escherichia coli sind die
sogenannten K-12 Stämme, wie z. B. die Stämme MG1655 oder
W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli and Salmonella.
Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington
D.C.)) oder der Escherichia coli Wildtypstamm IFO3547
(Institut für Fermentation, Osaka, Japan) und davon
abgeleitete Mutanten geeignet, die die Fähigkeit besitzen
D-Pantothensäure zu produzieren.
Geeignete D-Pantothensäure produzierende Stämme der Gattung
Escherichia, insbesondere der Art Escherichia coli sind
beispielsweise
Escherichia coli FV5069/pFV31
Escherichia coli FV5069/pFV202
Escherichia coli FE6/pFE80 und
Escherichia coli KE3
Escherichia coli FV5069/pFV31
Escherichia coli FV5069/pFV202
Escherichia coli FE6/pFE80 und
Escherichia coli KE3
Es wurde gefunden, daß Enterobacteriaceae nach Verstärkung,
insbesondere Überexpression eines oder mehrerer der für das
Glycin-Spaltungssystem (glycine-cleavage system)
kodierenden Gene gcvT, gcvH und gcvP in verbesserter Weise
D-Pantothensäure produzieren.
Die Nukleotidsequenzen der Gene gcvT, gcvH und gcvP von
Escherichia coli wurde von Okamura-Ikeda et al. (European
Journal of Biochemistry 216, 539-548 (1993)) publiziert und
kann ebenfalls der von Blattner et al. (Science 277, 1453-
1462 (1997) publizierten Genomsequenz von Escherichia coli
unter der Accession Number AE000341 entnommen werden.
Die in den angegbenen Textstellen beschriebenen Gene können
erfindungsgemäß verwendet werden. Weiterhin können Allele
verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit des
genetischen Codes oder durch funktionsneutrale
Sinnmutationen (sense mutations) ergeben.
Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der
entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die
Promotor- und Regulationsregion oder die
Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des
Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise
wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des
Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare
Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im
Verlaufe der fermentativen D-Pantothensäure-Produktion zu
steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer
der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert.
Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des
Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die
Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit
unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom
integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann
weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch
Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung
erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei
Chang und Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156
(1978)), bei Hartley und Gregori (Gene 13: 347-353 (1981)),
bei Amann und Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), bei de
Broer et al. (Proceedings of the National of Sciences of
the United States of America 80: 21-25 (1983)), bei
LaVallie et al. (BIO/TECHNOLOGY 11, 187-193 (1993)), in
PCT/US97/13359, bei Llosa et al. (Plasmid 26: 222-224
(1991)), bei Quandt und Klipp (Gene 80: 161-169 (1989)), bei
Hamilton (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622 (1989), bei
Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58,
191-195 (1998) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie.
In Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren wie
z. B. von pACYC184 abgeleitete Kloniervektoren (Bartolomé et
al.; Gene 102, 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann et al.; Gene
69: 301-315 (1988)) oder pSC101-Derivate (Vocke und Bastia,
Proceedings of the National Academy of Science USA 80
(21): 6557-6561 (1983)) können verwendet werden. In einem
erfindungsgemäßen Verfahren kann man einen mit einem
Plasmidvektor transformierten Stamm einsetzen, wobei der
Plasmidvektor mindestens eines oder mehrere der für die
Gene ausgewählt aus der Gruppe gcvT, gcvH und gcvP
kodierenden Nucleotidsequenzen trägt.
Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure
mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein
zusätzlich zur Verstärkung mindestens eines der Gene,
ausgewählt aus der Gruppe gcvT, gcvH und gcvP, ein oder
mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe
- - das für die Acetohydroxysäure-Synthase II kodierende ilvGM-Operon (WO 97/10340)
- - das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen (US-A-5, 518,906),
- - das für die Ketopantoat-Reduktase kodierende panE-Gen (EP-A-1001027)
- - das für die Aspartat-Decarboxylase kodierende panD-Gen (US-A-5,518,906)
- - das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen (US-A-5,518,906),
- - das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC- Gen (Duncan und Coggins, Biochemical Journal 234: 49-57 (1986)) und
- - das für das Serinhydroxymethyltransferase kodierende
glyA-Gen (Plamann et al., Nucleic Acids Research
11(7): 2065-2075(1983))
zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren.
Schließlich kann es für die Produktion von D-Pantothensäure
mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae vorteilhaft sein
zusätzlich zur Verstärkung mindestens eines der Gene,
ausgewählt aus der Gruppe gcvT, gcvH und gcvP,
- - das für die Transaminase C kodierende avtA-Gen (EP-A- 1001027)
abzuschwächen, insbesondere auszuschalten oder auf
niedrigem Niveau zu exprimieren.
Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der
intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme
(Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
einen schwachen Promotor verwendet oder ein Gen bzw. Allel
verwendet, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit
einer niedrigen Aktivität kodiert bzw. das entsprechende
Gen oder Enzym (Protein) inaktiviert und gegebenenfalls
diese Maßnahmen kombiniert.
Weiterhin kann es für die Produktion von D-Pantothensäure
vorteilhaft sein neben der Überexpression eines oder
mehrere der Gene des Glycin-Spaltungssystem (glycine
cleavage system) unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten
(Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing
Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products,
Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London,
UK, 1982). In dem erfindungsgemäßen Verfahren können
Bakterien eingesetzt werden in denen die Stoffwechselwege
zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Bildung der
D-Pantothensäure verringern.
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können im
batch - Verfahren (Satzkultivierung), im fed batch
(Zulaufverfahren) oder im repeated fed batch - Verfahren
(repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine
Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im
Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in
die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart,
1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und
periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im
Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA,
1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und
Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose,
Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und
Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und
Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure
und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und
organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden.
Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet
werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff haltige
Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff
oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und
Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder
die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen
enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die
für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können
essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine
zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden.
Dem Kulturmedium können überdies Vorstufen der D-
Pantothensäure wie Aspartat, β-Alanin, Ketoisovalerat,
Ketopantoinsäure oder Pantoinsäure und gegebenenfalls deren
Salze zugesetzt zugesetzt werden. Die genannten
Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen
Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der
Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw.
Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt.
Es ist gleichfalls möglich, zur Darstellung der
Erdalkalisalze der Pantothensäure, insbesondere des
Calciumsalzes, während der Fermentation die Suspension oder
Lösung einer Erdalkali-haltigen anorganischen Verbindung
wie beispielsweise Calciumhydroxid oder einer organischen
Verbindung wie dem Erdalkalisalz einer organischen Säure
beispielsweise Calciumacetat, kontinuierlich oder
diskontinuierlich zu zusetzen. Auf diese Weise wird das zur
Darstellung des gewünschten Erdalkalisalzes der D-
Pantothensäure nötige Kation direkt in der gewünschten
Menge, bevorzugt in stöchiometrischen Mengen, in die
Fermentationsbrühe eingetragen.
Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel
wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur
Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika
hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen
aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff
haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 25°C bis 45°C und vorzugsweise bei 30°C bis 40°C. Die
Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an D-
Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise
innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die in der Fermentationsbrühe enthaltene D-Pantothensäure
bzw. die entsprechenden Salze der D-Pantothensäure können
anschließend nach dem Stand der Technik isoliert und
gereinigt werden.
Es ist ebenso möglich, die D-Pantothensäure und/oder deren
Salze enthaltenden Fermentationsbrühen vorzugsweise
zunächst durch bekannte Separationsmethoden wie zum
Beispiel der Zentrifugation, der Filtration, dem
Dekantieren oder einer Kombination hieraus vollständig oder
zum Teil von der Biomasse zu befreien. Es ist jedoch auch
möglich, die Biomasse gänzlich in der Fermentationsbrühe zu
belassen. Im allgemeinen wird die Suspension oder Lösung
vorzugsweise aufkonzentriert und beispielsweise mit Hilfe
eines Sprühtrockners oder einer Gefriertrocknungsanlage zu
einem Pulver aufgearbeitet. Anschließend wird dieses Pulver
im allgemeinen durch geeignete Kompaktier- oder Granulier-
Verfahren z. B. auch Aufbaugranulation in ein
gröberkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und
weitgehend staubfreies Produkt mit einer
Korngrößenverteilung von 20 bis 2000 µm, insbesondere 100
bis 1400 µm überführt. Vorteilhaft bei der Granulation oder
Kompaktierung ist der Einsatz von üblichen organischen oder
anorganischen Hilfsstoffen, beziehungsweise Trägern wie
Stärke, Gelatine, Cellulosederivaten oder ähnlichen
Stoffen, wie sie üblicherweise in der Lebensmittel- oder
Futterverarbeitung als Binde-, Gelier-, oder
Verdickungsmittel Verwendung finden, oder von weiteren
Stoffen wie zum Beispiel Kieselsäuren, Silikaten oder
Stearaten.
Alternativ kann das Fermentationsprodukt mit oder ohne
weitere der üblichen Fermentationsbestandteile auf einen in
der Futtermittelverarbeitung bekannten und üblichen
organischen oder anorganischen Trägerstoff wie zum Beispiel
Kieselsäuren, Silikate, Schrote, Kleien, Mehle, Stärken
Zucker oder andere aufgezogen und/oder mit üblichen
Verdickungs- oder Bindemitteln stabilisiert werden.
Anwendungsbeispiele und Verfahren hierzu sind in der
Literatur (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49,
Seite 817) beschrieben.
Gegebenenfalls wird in einer geeigneten Verfahrensstufe
D-Pantothensäure und oder das gewünschte Salz der
D-Pantothensäure oder eine diese Verbindungen enthaltende
Zubereitung dem Produkt hinzugefügt, um den gewünschten
Gehalt an Pantothensäure oder dem gewünschten Salz zu
erzielen bzw. einzustellen.
Der gewünschte Gehalt liegt im allgemeinen im Bereich von
20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse).
Die Konzentration an Pantothensäure kann mit bekannten
chemischen (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560
(1992)) oder mikrobiologischen Verfahren wie z. B. dem
Lactobacillus plantarum Test (DIFCO MANUAL, 10th Edition,
S. 1100-1102; Michigan, USA) bestimmt werden.
Claims (10)
1. Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder
deren Erdalkalisalzen oder diese enthaltende
Futtermitteladditive durch Fermentation von
Mikroorganismen der Familie Enterobactericeae,
insbesondere solchen, die bereits D-Pantothensäure
produzieren,
dadurch gekennzeichnet, daß man
- a) mindestens eines der Gene, ausgewählt aus der Gruppe gcvT, gcvH und gcvP verstärkt, insbesondere überexprimiert,
- b) die D-Pantothensäure und/oder deren Salze im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen anreichert und
- c) die gewünschten Produkte nach Abschluß der Fermentation isoliert, wobei man die Biomasse und/oder weitere Bestandteile der Fermentationsbrühe in dem Produkt beläßt oder gegebenfalls vollständig oder teilweise abtrennt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die Fermentation in Gegenwart von
Erdalkalisalzen durchführt, wobei diese kontinuierlich
oder diskontinuierlich insbesondere in
stöchiometrischen Mengen zugeführt werden, und ein
Erdalkalisalze der D-Pantothensäure enthaltendes oder
daraus bestehendes Produkt gewinnt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Mikroorganismen der Familie Enterobactericeae
der Gattung Escherichia angehören.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Mikroorganismen aus der Gattung Escherichia,
insbesondere der Art Escherichia coli stammen.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man zusätzlich zu einem oder mehreren der Gene,
ausgewählt aus der Gruppe gcvT, gcvH und gcvP, eines
oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe:
- 1. 5.1 das für die Acetohydroxysäure-Synthase II kodierende ilvGM-Operon
- 2. 5.2 das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen,
- 3. 5.3 das für die Ketopantoat-Reduktase kodierende panE-Gen
- 4. 5.4 das für die Aspartat-Decarboxylase kodierde panD-Gen
- 5. 5.5 das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen
- 6. 5.6 das für die Phosphoserin-Transaminase kodierende serC-Gen
- 7. 5.7 das für das Serinhydroxymethyltransferase kodierende glyA-Gen
6. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien einsetzt, in denen die
Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet
sind, die die Bildung der D-Pantothensäure verringern,
und insbesondere das für die Transaminase C kodierende
avtA-Gen abschwächt, insbesondere ausschaltet oder auf
niedrigem Niveau exprimiert.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man einen mit einem Plasmidvektor transformierten
Stamme einsetzt, und der Plasmidvektor die für das
glyA-Gen kodierende Nukleotidsequenz trägt.
8. Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder
deren Salze enthaltenden Futtermittel-Additiven, gemäß
Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass man
- a) aus einer durch Fermentation gewonnenen D- Pantothensäure-haltigen Fermentationsbrühe, gegebenenfalls vollständig oder teilweise, die Biomasse und/oder einen Teil der Inhaltsstoffe abtrennt,
- b) das so erhaltene Gemisch gegebenenfalls aufkonzentriert, und
- c) das die Pantothensäure und/oder das Pantothenat enthaltende Futtermitteladditiv durch geeignete Maßnahmen in eine rieselfähige Form überführt, und
- d) durch geeignete Maßnahmen ein rieselfähiges Tierfuttermittel-Additiv mit einer Korngrößenverteilung von 20 bis 2000 µm gewinnt.
9. Verfahren zur Herstellung von Tierfuttermittel-
Additiven gemäß Anspruch 8 mit einem Gehalt an D-
Pantothensäure und/oder deren Salze ausgewählt aus der
Gruppe Magnesium- oder Calziumsalz in dem Bereich von
etwa 20 bis 80 Gew.-% (Trockenmasse) aus
Fermentationsbrühen, gekennzeichnet durch die Schritte
- a) gegebenenfalls Entfernen von Wasser aus der Fermentationsbrühe (Aufkonzentration),
- b) Entfernen der während der Fermentation gebildeten Biomasse in einer Menge von 0 bis 100%,
- c) gegebenenfalls Zusatz von einer oder mehreren der genannten Verbindungen zu den gemäß a) und b) erhaltenen Fermentationsbrühen, wobei die Menge der zugesetzten Verbindungen so bemessen ist, dass deren Gesamtkonzentration im Tierfuttermittel-Additiv im Bereich von etwa 20 bis 80 Gew.-% liegt, und
- d) Gewinnung des Tierfuttermittel-Additivs in der gewünschten Pulver- oder bevorzugt Granulatform.
10. Verfahren gemäß Anspruch 8,
dadurch gekennzeichnet,
daß man aus der Fermentationsbrühe gegebenenfalls nach
Zusatz von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen und
gegebenenfalls nach Zusatz von organischen oder
anorganischen Hilfsstoffen durch
- a) Trocknen und Kompaktieren, oder
- b) Sprühtrocknen, oder
- c) Sprühtrocknen und Granulieren, oder
- d) Sprühtrocknen und Aufbaugranulieren, ein Tierfuttermittel-Additiv mit der gewünschten Korngröße gewinnt.
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8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |