DE60211357T2

DE60211357T2 - Verfahren zur herstellung von d-pantothensäure und/oder ihren salzen

Info

Publication number: DE60211357T2
Application number: DE60211357T
Authority: DE
Inventors: Mechthild Rieping
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2001-09-28
Filing date: 2002-08-22
Publication date: 2007-02-22
Anticipated expiration: 2022-08-23
Also published as: EP1430139B1; WO2003029476A3; US20050089971A1; DE60211357D1; DE10147960A1; ATE325886T1; EP1430139A2; WO2003029476A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder ihrer Salze oder diese enthaltenden Gemische unter Verwendung von Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, wobei mindestens das offene ytfP- und/oder yjfA-Leseraster (ORF) durch Mutation abgeschwächt wird.
Stand der Technik
Pantothensäure wird weltweit in einem Maßstab von mehreren tausend Tonnen pro Jahr hergestellt. Sie wird unter anderem in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und in der Nahrungsmittelindustrie verwendet. Ein großer Teil der hergestellten Pantothensäure wird zum Füttern von Nutztieren wie Geflügel und Schweinen verwendet.
Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder biotechnologisch durch Fermentation von geeigneten Mikroorganismen in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. In der chemischen Synthese ist DL-Pantolacton ein wichtiger Vorläufer. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt. In anschließenden Verfahrensschritten wir das racemische Gemisch aufgetrennt und das D-Pantolacton mit β-Alanin unter Erhalt von D-Pantothensäure kondensiert.
Bei der typischen handelsüblichen Form handelt es sich um das Calciumsalz von D-Pantothensäure. Das Calciumsalz des racemischen Gemischs von DL-Pantothensäure ist ebenfalls nützlich.
Der Vorteil der Herstellung durch die Fermentation von Mikroorganismen ist die direkte Bildung der gewünschten stereoisomeren Form, nämlich der D-Form, die frei von L-Pantothensäure ist.
Wie in EP-A 0 493 060 angegeben, können verschiedene Spezies von Bakterien, z.B. Escherichia coli (E. coli), Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium erythrogenes und Brevibacterium ammoniagenes, sowie von Hefen, z.B. Debaromyces castellii, D-Pantothensäure in einer Nährlösung, enthaltend Glucose, DL-Pantothensäure und β-Alanin herstellen. EP-A 0 493 060 gibt ferner an, dass die Bildung von D-Pantothensäure in einer Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthaltenden Nährlösung durch Verstärken der auf den Plasmiden pFV3 und pFV5 enthaltenen Pantothensäurebiosynthesegene von E. coli im Falle von E. coli verbessert wird.
EP-A 0 590 857 und die U.S.-Patentschrift 5,518,906 beschreiben Mutanten, die vom Stamm IFO3547 wie FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 und FV5069 von E. coli abgeleitet sind, die Resistenzen gegen verschiedene Antimetabolite wie Salicylsäure, α-Ketobuttersäure, β-Hydroxyaspartamsäure, O-Methylthreonin und α-Ketoisovalerinsäure tragen. Sie stellen Pantoinsäure in einer Glucose enthaltenden Nährlösung und D-Pantothensäure in einer Glucose und β-Alanin enthaltenden Nährlösung her. EP-A 0 590 857 und die U.S.-Patentschrift 5,518,906 geben ferner an, dass die Herstellung von D-Pantoinsäure in Glucose enthaltenden Nährlösungen und die Herstellung von D-Pantothensäure in einer Glucose und β-Alanin enthaltenden Nährlösung durch eine Verstärkung der Pantothensäurebiosynthesegene panB, panC und panD, die auf Plasmid pFV31 enthalten sein sollen, in den vorstehend erwähnten Stämmen verbessert wird.
Des Weiteren berichtet WO 97/10340 über die nützliche Wirkung der Verstärkung des ilvGM-Operons auf die Herstellung von D-Pantothensäure. Schließlich berichtet EP-A 1 001 027 über die Wirkung der Verstärkung des panE-Gens auf die Bildung von D-Pantothensäure.
Die D-Pantothensäure oder das entsprechende Salz wird aus der Fermentationsbrühe isoliert und wie auf dem Stand der Technik (EP-A 0 590 857 und WO 96/33283) gereinigt und in gereinigter Form geeignet verwendet, oder die gesamte die D-Pantothensäure enthaltende Fermentationsbrühe wird getrocknet (EP-A 1 050 219) und insbesondere als Tierfutterzusatzmittel verwendet.
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder legen die Bereitstellung von neuen Maßnahmen zum Verbessern der Herstellung von D-Pantothensäure und/oder ihrer Salze oder diese enthaltende Tierfutterzusatzmittel durch Fermentation dar.
Zusammenfassung der Erfindung
Wann immer hier anschließend D-Pantothensäure, Pantothensäure oder Pantothenat erwähnt wird, ist dies so zu verstehen, dass damit nicht nur die freien Säuren sondern auch die Salze von D-Pantothensäure, z.B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz gemeint sind.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder ihrer Salze oder diese enthaltende Tierfutterzusatzmittel durch die Fermentation von genetisch modifizierten Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere derjenigen, die schon D-Pantothensäure herstellen, bereit, wobei die Aktivität oder Konzentration der Proteine, die durch das offene ytfP-Leseraster, das die Nukleotidsequenz der Nukleotide 376 bis 714 von SEQ ID NO: 1 aufweist, und das offene yjfA-Leseraster, das die Nukleotidsequenz der Nukleotide 727 bis 461 des Komplements von SEQ ID NO: 1 aufweist, kodiert sind, auf 0 % der Aktivität oder Konzentration der entsprechenden Proteine in den Startmikroorganismen reduziert wird.
Das Verfahren wird in Gegenwart von Erdalkalimetallverbindungen durchgeführt, die kontinuierlich oder chargenweise, vorzugsweise in stoichiometrischen Mengen eingebracht werden.

c) Die D-Pantothensäure oder das entsprechende Salz wird im Medium oder in der Fermentationsbrühe oder in den Zellen der Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae angereichert, und
d) wenn die Fermentation abgeschlossen ist, wird die D-Pantothensäure und/oder das entsprechende Salz isoliert.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, in welchem, wenn die Fermentation abgeschlossen ist, die gesamte oder ein Teil der Biomasse (≥ 0 bis 100%) von der Fermentationsbrühe abgetrennt wird oder wahlweise darin zurück bleibt und die erhaltene Brühe wahlweise nach Konzentration zu einem Feststoffgemisch, enthaltend D-Pantothensäure und/oder ihre Salze zusammen mit anderen Bestandteilen der Fermentationsbrühe verarbeitet wird.
Die Erfindung stellt auch genetisch modifizierte Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, insbesondere der Gattung Escherichia, bereit, in welchen das ytfP-ORF und/oder yifA-ORF oder ihre Genprodukte nicht vorliegen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Im Allgemeinen beschreibt der Begriff „Abschwächung" die Reduktion oder das Abschalten der intrazellulären Aktivität von einem oder mehreren Enzymen oder Proteinen, die durch die geeignete DNA kodiert werden, z.B. durch die Verwendung eines schwachen Promotors oder durch die Verwendung eines Gens oder Allels oder eines offenen Leserasters (ORF), das für ein geeignetes Enzym oder Protein mit einer geringen Aktivität kodiert oder das geeignete Gen, ORF oder Enzym oder Protein inakti viert und wahlweise Kombinieren dieser Maßnahmen in einem Mikroorganismus.
Ein offenes Leseraster (ORF) ist ein Segment einer Nukleotidsequenz, die für ein Protein oder ein Polypeptid oder eine Ribonukleinsäure, welcher keine Funktion gemäß dem Stand der Technik zugeordnet werden kann, kodiert oder kodieren kann. Nachdem dem bestimmten Segment der Nukleotidsequenz eine Funktion zugeordnet wurde, wird im Allgemeinen der Begriff „Gen" verwendet.
Die Abschwächungsmaßnahmen der Erfindung, einschließlich der Expressionsreduktion, reduzieren die Aktivität oder Konzentration des geeigneten Proteins auf 0 % der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Startorganismus.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Mikroorganismen können D-Pantothensäure aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Molassen, Stärke und Zellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Sie sind Vertreter der Enterobacteriaceae, insbesondere der Gattung Escherichia. Insbesondere kann die Spezies Escherichia coli innerhalb der Gattung Escherichia erwähnt werden. Geeignete Stämme innerhalb der Spezies Escherichia coli sind die so genannten K-12-Stämme, z.B. die Stämme MG1655 oder W3110 (Neidhard et al.: Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington DC)) oder der Stamm IFO3547 vom Wildtyp von Escherichia coli (Institute of Fermentation, Osaka, Japan) und davon abgeleitete Mutanten, die D-Pantothensäure herstellen können.
Beispiele für geeignete D-Pantothensäure herstellende Stämme der Gattung Escherichia, insbesondere der Spezies Escherichia coli sind:
Escherichia coli FV5069/pfV31
Escherichia coli FV5069/pfV202
Escherichia coli FE6/pFE80 und
Escherichia coli KE3.
Es wurde gefunden, dass die Herstellung von D-Pantothensäure durch Enterobacteriaceae nach der Abschwächung der offenen ytfP- und/oder yjfA-Leseraster gemäß den Maßnahmen der Erfindung verbessert wird, wobei die Aktivität und Konzentration der entsprechenden Proteine auf 0 % der Aktivität oder Konzentration der Startmikroorganismen reduziert wird.
Die Nukleotidsequenz des ytfP-ORF ist unter der Zugangsnummer AAC77179 veröffentlicht, und die Nukleotidsequenz des yjfA-ORF ist unter der Zugangsnummer AAC77180 am National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) veröffentlicht. Sie können auch aus der Genomsequenz von Escherichia coli, veröffentlicht von Blattner et al. (Science 277, 1453-1462 (1997)) entnommen werden.
Die in den zitierten Literaturangaben beschriebenen offenen Leseraster können erfindungsgemäß verwendet werden. Es ist auch möglich, Allele zu verwenden, die aus der Entartung des genetischen Codes oder aus Neutral-Sense-Mutationen resultieren.
Die Abschwächung kann im Allgemeinen z.B. durch Reduzieren oder Abschalten der Expression des ytfP-ORF und/oder yjfA-ORF oder der katalytischen Eigenschaften des Proteins erzielt werden. Beide Maßnahmen werden wahlweise kombiniert.
Die Reduktion der Genexpression kann durch eine geeignete Kulturtechnik, durch genetische Modifikation (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression oder durch Antisense-RNA-Technologie erzielt werden. Beispiele für Signalstrukturen der Genexpression sind Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosombindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Der Fachmann kann relevante Details unter anderem z.B. in Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), Carrier and Keasling (Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999)), Franch und Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3, 159-164 (2000)) und in bekannten Fachbüchern der Genetik und Molekularbiologie, z.B. im Fachbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder im Fachbuch von Winnacker („From Genes to Clones", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) finden.
Mutationen, die zu einer Änderung oder Reduktion der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind vom Stand der Technik her bekannt. Beispiele, die erwähnt werden können, sind die Studien von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272, 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95, 5511-5515 (1998)) und Wente und Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991)). Untersuchungen sind in bekannten Fachbüchern der Genetik und Molekularbiologie, z.B. im Fachbuch von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) zu finden.
Bei möglichen erfindungsgemäßen Mutationen handelt es sich um Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen. Je nach Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird der Begriff „Missense-Mutationen" oder „Nonsense-Mutationen" verwendet. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen, wobei es deren Wirkung ist, falsche Aminosäuren einzubringen oder die Translation vorzeitig zu beenden. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Verschwinden der Enzymaktivität. Anweisungen für die Herstellung derartiger Mutationen gehören dem Stand der Technik an und sind in bekannten Fachbüchern der Genetik und Molekularbiologie, z.B. im Fachbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), im Fachbuch von Winnacker („From Genes to Clones", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder im Fachbuch von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) zu finden.
Geeignete Mutationen im ytfP-ORF und/oder yjfA-ORF, z.B. Deletionsmutationen, können durch Gen- oder Allel-Austausch in geeignete Stämme eingebracht werden.
Bei einem üblichen Verfahren handelt es sich um dasjenige des Genaustausches unter Verwendung eines konditionell replizierenden pSC101-Derivats, pMAK705, wie von Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 171, 4617-4622 (1989)) beschrieben. Andere auf dem Stand der Technik beschriebene Verfahren, z.B. dasjenige von Martinez-Morales et al. (Journal of Bacteriology 181, 7143-7148 (1999)) oder dasjenige von Boyd et al. (Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000)) können gleichermaßen verwendet werden.
Ebenso können Mutationen im ytfP-ORF und/oder yjfA-ORF oder Mutationen, die die Expression des ytfP-ORF und/oder yjfA-ORF beeinflussen, durch Konjugation oder Transduktion auf verschiedene Stämme übertragen werden.
Weiterhin kann die Herstellung von D-Pantothensäure mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae nicht nur zum Deletieren des ytfP-ORF und/oder yjfA-ORF, sondern auch zum Verstärken oder insbesondere Überexprimieren von einem oder mehreren endogenen Genen, d.h. Genen, die den bestimmten Spezies innewohnen, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend:

• Das ilvGM-Operon, das für Acetohydroxysäuresynthase II kodiert (WO 97/10340),
• das panB-Gen, das für Ketopantoathydroxymethyltransferase kodiert (US-A-5,518,906),
• das panE-Gen, das für Ketopantoatreduktase kodiert (EP-A-1 001 027),
• das panD-Gen, das für Aspartatdecarboxylase kodiert (US-A-5,518,906),
• das panC-Gen, das für Pantothenatsynthetase kodiert (US-A-5,518,906),
• das serC-Gen, das für Phosphoserintransaminase kodiert (Duncan und Coggins, Biochemical Journal 234, 49-57 (1986)),
• die gcvT-, gcvH- und gcvP-Gene, die für das Glycinspaltungssystem kodieren (Okamura-Ikeda et al., European Journal of Biochemistry 216, 539-548 (1993)), und
• das glyA-Gen, das für Serinhydroxymethyltransferase kodiert (Plamann et al. (Nucleic Acids Research 11(7), 2065-2075 (1983))).

In diesem Zusammenhang beschreibt der Begriff „Verstärkung" die Erhöhung der intrazellulären Aktivität von einem oder mehreren durch die geeignete DNA kodierten Enzymen oder Proteinen in einem Mikroorganismus, z.B. durch Erhöhen der Kopieanzahl des Gens oder der Gene unter Verwendung eines starken Promotors oder eines Gens oder Allels, das für ein geeignetes Enzym oder Protein mit hoher Aktivität kodiert und wahlweise Kombinieren dieser Maßnahmen.
Durch die Maßnahmen der Verstärkung, insbesondere der Überexpression wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im Allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500% und höchstens um 1.000% oder 2.000%, auf der Basis derjenigen des Proteins vom Wildtyp oder der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Startmikroorganismus erhöht.
Schließlich kann die Herstellung von D-Pantothensäure mit Stämmen der Familie Enterobacteriaceae nicht nur zum Abschwächen des ytfP-ORF und/oder yjfA-ORF sondern auch zum Abschwächen von einzelnen oder allen der Folgenden verwendet werden:

• dem avtA-Gen, das für Transaminase-C kodiert (EP-A-1 001 027),
• dem poxB-Gen, das für Pyruvatoxidase kodiert (Grabau und Cronan, Nukleic Acids Research 14 (13), 5449-5460 (1989)), und
• dem pckA-Gen, das für PEP-Carboxykinase kodiert (Medina et al., Journal of Bacteriology 172, 7151 -7156 (1990)).

Weiterhin kann es zur Herstellung von D-Pantothensäure vorteilhaft sein, nicht nur das ytfP-ORF und/oder yjfA-ORF abzuschwächen sondern auch unerwünschte Nebenreaktionen abzuschalten (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (Herausgeber), Academic Press, London, UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können durch das Chargenverfahren, das Zufuhrchargenverfahren oder das wiederholte Zufuhrchargenverfahren gezüchtet werden. Eine Zusammenfassung von bekannten Züchtungsverfahren ist im Fachbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Fachbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) bereitgestellt.
Das zu verwendende Kulturmedium muss geeigneterweise die Anforderungen der bestimmten Stämme erfüllen. Beschreibungen über Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind in „Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981) zu finden. Kohlenstoffquellen, die verwendet werden können, sind Zucker und Kohlehydrate, z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Molassen, Stärke und Zellulose, Öle und Fette, z.B. Sojabohnenöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, z.B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linoleinsäure, Alkohole, z.B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren, z.B. Essigsäure. Diese Substanzen können einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
Stickstoffquellen, die verwendet werden können, sind organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Getreideröstlikör, Sojabohnenmehl und Harnstoff, oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
Phosphorquellen, die verwendet werden können, sind Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natriumsalze. Das Kulturmedium muss auch Metallsalze, z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat enthalten, die für das Wachstum nötig sind. Schließlich können wichtige wachstumsfördernde Substanzen wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Substanzen verwendet werden. D-Pantothensäurevorläufer wie Aspartat, β-Alanin, Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure oder Pantoinsäure und wahlweise deren Salze können ebenfalls dem Kulturmedium zugesetzt werden. Die Zufuhrmaterialien können der Kultur auf einmal oder geeigneterweise während der Züchtung zugeführt werden.
Der pH-Wert der Kultur wird durch die geeignete Verwendung von basischen Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak, oder wässrigem Ammoniak, oder sauren Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefel säure reguliert.
Als weitere Möglichkeit zum Herstellen der Erdalkalimetallsalze von Pantothensäure, insbesondere des Calciumsalzes, wird eine Suspension oder Lösung einer ein Erdalkalimetall, z.B. Calciumhydroxid enthaltenden anorganischen Verbindung oder einer organischen Verbindung wie eines alkalischen Erdalkalimetallsalzes einer organischen Säure, z.B. von Calciumacetat, kontinuierlich oder chargenweise während der Fermentation zugesetzt. Auf diese Weise wird das zur Herstellung des gewünschten Erdalkalimetallsalzes von D-Pantothensäure erforderliche Kation in der gewünschten Menge, im Allgemeinen in einem Verhältnis von 0,8 bis 1,2 auf der Basis der Pantothensäure und vorzugsweise in stöchiometrischen Mengen direkt in die Fermentationsbrühe eingebracht.
Die Schaumbildung kann unter Verwendung von Antischäumungsmitteln wie Fettsäurepolyglycolester reguliert werden. Die Stabilität der Plasmide kann durch Zugabe von geeigneten selektiv wirkenden Substanzen, z.B. Antibiotika zu dem Medium beibehalten werden. Aerobe Bedingungen werden durch Einbringen von Sauerstoff oder sauerstoffhaltigen Gasgemischen, z.B. von Luft in die Kultur beibehalten. Die Temperatur der Kultur beträgt gewöhnlich 25 bis 45 °C und vorzugsweise 30 bis 40 °C. Die Kultur wird fortgesetzt, bis die Bildung von D-Pantothensäure ein Maximum erreicht hat. Diese Aufgabe wird normalerweise innerhalb von 10 bis 160 Stunden erzielt.
Die D-Pantothensäure oder die entsprechenden D-Pantothensäuresalze, die in der Fermentationsbrühe enthalten sind, können dann gemäß dem Stand der Technik isoliert und gereinigt werden.
Es ist auch möglich, die gesamte oder einen Teil der (≥ 0 bis 100%) Biomasse von den Fermentationsbrühen, enthaltend D-Pantothensäure und/oder ihre Salze, vorzugsweise anfänglich durch bekannte Mittel der Abtrennung, z.B. Zentrifugation, Filtration, Dekantierung oder einer Kombination davon, zu entfernen. Eine andere Möglichkeit ist es jedoch, die gesamte Biomasse in der Fermentationsbrühe zu belassen.
Im Allgemeinen wird die Suspension oder Lösung vorzugsweise konzentriert und zu einem Pulver, z.B. unter Verwendung eines Sprühtrockners oder einer Gefriertrocknungseinheit verarbeitet. Dieses Pulver wird dann im Allgemeinen durch geeignete Verdichtungs- oder Granulierungsverfahren, z.B. durch Pelletisieren zu einem gröberen, leicht rieselfähigen, lagerfähigen und größtenteils staubfreien Produkt mit der gewünschten Teilchengrößenverteilung von wahlweise 20 bis 2000 μm, insbesondere 100 bis 1400 μm umgewandelt. Bei der Granulierung im Granulierungs- oder Verdichtungsverfahren ist es vorteilhaft, herkömmliche organische oder anorganische Hilfssubstanzen oder Träger wie Stärke, Gelatine, Cellulosederivate oder ähnliche Substanzen wie diejenigen, die herkömmlich als Bindemittel, Gelbildner oder Verdickungsmittel in Nahrungsmittel- oder Tierfutterverarbeitung verwendet werden, oder andere Substanzen wie Kieselsäuren, Silicate oder Stearate zu verwenden.
Alternativ dazu kann das Fermentationsprodukt mit oder ohne andere herkömmliche Bestandteile der Fermentationsbrühe auf einem organischen oder anorganischen Träger, der bekannt ist und herkömmlich in der Tierfutterverarbeitung verwendet wird, z.B. Kieselsäuren, Silicate, Mehlstoffen, Kleien, Mehlen, Stärken, Zuckern oder dergleichen absorbiert werden und/oder mit herkömmlichen Verdickungsmitteln oder Bindemitteln stabilisiert werden. Relevante Anwendungsbeispiele und Verfahren sind in der Literatur beschrieben (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, Seite 817).
Wahlweise wird zu einer geeigneten Stufe des Verfahrens D-Pantothensäure, das gewünschte D-Pantothensäuresalz oder eine diese Verbindungen enthaltende Zubereitung zugesetzt, um den gewünschten Gehalt an Pantothensäure oder des gewünschten Salzes zu erhalten oder den Gehalt auf den gewünschten Wert im Endprodukt einzustellen.
Der gewünschte Gehalt liegt im Allgemeinen im Bereich von 20 bis 80 Gew.-% (Trockengewicht).
Die Konzentration von Pantothensäure kann durch bekannte chemische Verfahren (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)) oder mikrobielle Verfahren, z.B. den Laktobazillus-Plantarum-Test (DIFCO MANUAL, 10. Auflage, Seite 1100-1102; Michigan, USA) bestimmt werden.
Eine reine Kultur des K-12-Stamms DH5α/pMAK705 von Escherichia coli wurde als DSM 13720 am 8. September 2000 in der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) unter den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt.
Eine reine Kultur des K-12-Stamms FE6-1 von Escherichia coli wurde als DSM 13721 am 8. September 2000 in der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) unter den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung wird detaillierter nachstehend mit Hilfe der Ausführungsbeispiele veranschaulicht.
Das Minimalmedium (M9) und Komplettmedium (LB), die für Escherichia coli verwendet werden, sind von J.H. Miller (A Short Course In Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben. Die Isolierung von Plasmid-DNA von Escherichia coli, sowie die gesamten Techniken zur Restriktion, Ligation, Klenow- Behandlung und alkalischen Phosphatasebehandlung werden gemäß Sambrook et al. (Molecular Cloning – A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) durchgeführt. Wenn nicht anders beschrieben wird die Transformation von Escherichia coli gemäß Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, USA (1989) 86: 2172-2175) durchgeführt.
Die Inkubationstemperatur bei der Herstellung der Stämme und Transformanten beträgt 37 °C. Temperaturen von 30 und 44 °C werden in Genaustauschverfahren gemäß Hamilton et al. verwendet.
Beispiel 1
Konstruktion der Deletionsmutation der ytfP-yjfA-Genregion.
Die ytfP-yjfA-Genregion wird aus Escherichia coli K12 unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und von synthetischen Oligonukleotiden verstärkt. Die folgenden PCR-Primer (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland) werden aus der Nukleotidsequenz der ytfP-yjfA-Genregion in E. coli K12 MG1655 (SEQ ID NO: 1) synthetisiert:
ytfP-1: 5'-GGCGATGTCGCAACAAGCTG-3' (SEQ ID NO: 2)
ytfP-2: 5'-CTGTTCATGGCCGCTTGCTG-3' (SEQ ID NO: 3)
Die für die PCR verwendete chromosomale K12-DNA MG1655 von E. coli wird mit „Qiagen Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Ein DNA-Fragment mit etwa 1250 Bp kann mit den spezifischen Primern unter standardmäßigen PCR-Bedingungen (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) unter Verwendung der Taq-DNA-Polymerase (Gibco-BRL, Eggenstein, Deutschland) verstärkt werden. Das PCR- Produkt wird mit Vektor pCR2.1TOPO (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Groningen, Niederlande) gemäß den Anweisungen des Herstellers ligiert und in den Stamm TOP10F' von E. coli transformiert. Plasmid-tragende Zellen werden auf LB-Agar, welchem 50 μg/ml Ampicillin zugesetzt wurden, selektiert. Nach Isolieren der Plasmid-DNA wird das erfolgreiche Klonieren des PCR-Produkts mit den Restriktionsenzymen RcoRI und NsiI überprüft.
Zum Herstellen einer Deletion mit 337 Bp in der ytfP-yjfR-Region wird der Vektor pCR2.1TOPOytfP-yjfA mit den Restriktionsenzymen NdeI und SspI gespalten und das DNA-Fragment mit 4,8 kbp wird mit dem Klenow-Enzym behandelt und dann ligiert.
Der Stamm DH5α von E. coli wird mit dem Ligierungsgemisch transformiert, und Plasmid-tragende Zellen werden auf LB-Agar, welchem 50 μg/ml Ampicillin zugesetzt wurden, selektiert. Nach der Isolation der Plasmid-DNA, werden Plasmide, in welchen die in SEQ ID NO: 4 dargestellte mutagene DNA-Sequenz in klonierter Form vorliegt, durch Kontrollspaltung mit dem Enzym EcoRi detektiert. Das Plasmid wird pCR2.1TOPOΔyjfA genannt.
Beispiel 2
Konstruktion des Austauschvektors pMAK705ΔyjfA
Das in Beispiel 1 beschriebene ytfP-yjfA-Allel wird nach Restriktion mit den Enzymen SacI und XbaI und Abtrennung in 0,8 %-igem Agarosegel aus Vektor pCR2.1TOPOΔyjfA isoliert und mit Plasmid pMAK705 (Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 171, 4617 -4622), verdaut mit den Enzymen SacI und XbaI, ligiert. Das Ligationsgemisch wird in DH5α transformiert, und Plasmid-tragende Zellen werden auf LB-Agar, welchem 20 μg/ml Chloramphenicol zugesetzt wurden, selektiert. Das erfolgreiche Klonieren wird nach Isolierung der Plasmid-DNA und Spaltung mit den Enzymen SacI und XbaI detektiert. Der gebildete Austauschvektor, pMAK705ΔyjfA (= pMAK705de1tayjfA) ist in 1 dargestellt.
Beispiel 3
Ortsspezifische Mutagenese der ytfP-yjfA-Genregion im Stamm FE6-1 von E. coli
Der Stamm FE6 von E. Coli ist eine Valin-resistente Mutante von E. coli K12 MG1655 (US-B-6171845) und als DSM12379 in der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland), hinterlegt. Spontane Mutanten werden aus FE6 nach Inkubation bei 37 °C auf Minimalagar, welchem 2 g/l Glukose und 1 g/l β-Hydroxyaspartamsäure zugesetzt wurden, isoliert.
Eine ausgewählte β-Hydroxyaspartamsäure-resistente einzelne Kolonie wird dann bei 37 °C auf Minimalagar, enthaltend 2 g/l Glukose und 0,2 g/l O-Methylthreonin, inkubiert. Nach diesem Schritt ist eine Mutante, genannt FE6-1 gegen Valin, α-Ketoisovalerinsäure, β-Hydroxyaspartamsäure und O-Methylthreonin resistent. Zum Austausch der chromosomalen ytfP-yjfA-Genregion mit dem Plasmid-kodierten Deletionskonstrukt, wird FE6-1 mit Plasmid pMAK705ΔyjfA transformiert. Der Genaustausch wird durch das Selektionsverfahren, beschrieben von Hamilton et al. (1989) Journal of Bacteriology 171, 4617-4622, bewirkt und durch standardmäßige PCR-Verfahren (Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press) unter Verwendung der folgenden Oligonukleotidprimer nachgewiesen:
ytfP-1: 5'-GGCGATGTCGCAACAAGCTG-3' (SEQ ID NO: 2)
ytfP-2: 5'-CTGTTCATGGCCGCTTGCTG-3' (SEQ ID NO: 3)
Der erhaltene Stamm wird FE6-1ΔyjfA genannt.
Beispiel 4
Herstellung von D-Pantothensäure mit dem Stamm FE61ΔyjfA/pFV31ilvGM
4.1 Verstärken und Klonieren des ilvGM-Gens
Das ilvGm-Operon von Escherichia coli IF03547, kodierend für Acetohydroxysäuresynthase II (Institute of Fermentation, Osaka, Japan), wird unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und synthetischen Oligonukleotiden verstärkt. PCR-Primer (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland) werden aus der Nukleotidsequenz des ilvGM-Operons in E. coli K12 MG1655 (Genbank: Zugangs Nr: M87049) synthetisiert. Die Sequenz des ilvGM1-Primers wird derart ausgewählt, dass der Primer ein Adenin in Position 8 enthält. Dies erzeugt eine modifizierte Nukleotide mit einer Ribosombindungsstelle an der 7-Poisition stromaufwärts vom Startkodon der ilvG-Proteine.
ilvGM1: 5'-CAGGACGAGGAACTAACTATG-3' (SEQ ID NO: 5)
ilvGM2: 5'-TCACGATGGCGGAATACAAC-3' (SEQ ID NO: 6)
Die für die PCR verwendete chromosomale DNA von E. coli IF03547 wird mit „QIAGEN Genomic-tips 100/G" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Ein die modifizierte Ribosombindungsstelle, die ilvGM-kodierenden Regionen und etwa 180 Bp 3'-Eingrenzungssequenzen umfassendes DNA-Fragment mit etwa 2100 Bp kann mit den spezifischen Primern unter standardmäßigen PCR-Bedingungen (Innis et al.: PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) unter Verwendung von Pfu-DNA-Polymerase (Promega Corporation, Madison, USA) verstärkt werden. Das PC-Produkt wird in Plasmid pCR-BluntII-TOPO kloniert und in den Stamm TOP10 von E. coli (Invitrogen, Groningen, Niederlande, Produktbe schreibung Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, Kat.-Nr: K2800-20) transformiert.
Das erfolgreiche Klonieren wird durch Spaltung von Plasmid-pCR-BluntIFO3547ilvGM mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SphI detektiert. Zur Durchführung dessen wird die Plasmid-DNA durch den „QIAprep Spin Plasmid Kit" (QIAGEN, Hilden, Deutschland) isoliert, gespalten und dann in einem 0,8 %-igen Agarosegel aufgetrennt. Die DNA-Sequenz des verstärkten Fragments wird unter Verwendung der Umkehr- und Universal-Sequenzierungsprimer (QIAGEN, Hilden, Deutschland) bestimmt. Die Sequenz des PCR-Produkts ist in SEQ ID NO: 7 und 9 dargestellt. Das ilvG-Gen oder Allel wird in SEQ ID NO: 7 identifiziert. Das ilvM-Gen oder Allel wird in SEQ ID NO: 9 identifiziert. Die entsprechenden Genprodukte oder Proteine sind in SEQ ID NO: 8 und 10 dargestellt.
4.2 Klonieren der ilvGM-Gene im Expressionsvektor pTrc99A
Zur Expression in Escherichia coli K12 werden die in Beispiel 4.1 beschriebenen ilvGM-Gene in Vektor pTrc99A (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Uppsala, Schweden) kloniert. Dies wird durch Spalten von Plasmid pCR-BluntIFO3547ilvGM mit dem Enzym EcoRI, Abtrennen des Spaltungsgemischs in 0,8 %-igem Agarosegel und Isolieren des ilvGM-Fragments mit 2.1 kbp unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Deutschland) durchgeführt. Vektor pTrc99A wird mit dem Enzym EcoRI gespalten, eine alkalische Phosphatasebehandlung wird durchgeführt und das Produkt wird mit dem isolierten ilvGM-Fragment ligiert. Das Ligationsgemisch wird in den Stamm DH5α von E. coli transformiert. pTrc99A-tragende Zellen werden auf LB-Agar (Lennox, Virology 1: 190 (1955)), welchem 50 μg/ml Ampicillin zugesetzt wurden, selektiert. Das erfolgreiche Klonieren des ilvGM-Operons, kann nach Isolierung der Plasmid-DNA und Kontrollspaltung mit SalI und SphI detek tiert werden. Im Vektor genannt pTrc99AilvGM (2), wird die Expression des ilvGM-Operons durch den Ptrc-Promotor, der sich stromaufwärts von der modifizierten Ribosombindungsstelle befindet, und durch die rRNA-Terminatorregion, die sich stromabwärts von den ilvGM-kodierenden Regionen befindet, reguliert.
4.3 Konstruktion von Vektor pFV31ilvGM
Der D-Pantothensäure herstellende Stamm FV5069/pFV31 von E. coli ist in EP-A-0 590 857 beschrieben und als FERM BP 4395 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt. Plasmid pFV31 wird von FV5069/pFV31 isoliert und mit dem Enzym BamHI gespalten, und die hervorstehenden 3'-Enden werden mit dem Klenow-Enzym behandelt. Diesem folgt eine alkalische Phosphatasebehandlung. Nach der Restriktion mit dem Enzym SspI und Abtrennung des Spaltungsgemischs in 0,8 -igem Agarosegel wird die ilvGM-Expressionskassette mit 2,8 kBp von in Beispiel 4.2 beschriebenem Vektor pTrc99AilvGM isoliert und mit dem linearisierten und dephosphorilierten Vektor pFV31 ligiert. Das Ligationsgemisch wird in den Stamm DH5α von E. coli transformiert, und Plasmid-tragende Zellen werden auf LB-Agar, welchem 50 μg/ml Ampicillin zugesetzt wurden, selektiert. Das erfolgreiche Klonieren der ilvGM-Expressionskassette kann nach Isolierung der Plasmid-DNA und Kontrollspaltung mit HindIII, SalI, SmaI, SphI und XbaI delektiert werden. Das Plasmid wird pFV31ilvGM genannt (3).
4.4 Herstellung des Stamms FE6-1ΔyjfA/pFV31ilvGM
Der in Beispiel 3 erhaltene Stamm FE6-1ΔyjfA und der Stamm FE6-1 werden mit Plasmid pFV31ilvGM transformiert, und Transformanten auf LB-Agar, ergänzt mit 50 μg/ml Ampicillin, selektiert. Die Stämme FE6-1ΔyjfA/pFV31ilvGM und FE6-1/pFV31ilvGM werden auf diese Weise gebildet.
4.5 Herstellung von D-Pantothensäure mit dem Stamm FE6-1ΔyjfA/pFV31ilvGM
Die Pantothenatherstellung der Stämme FE6-1/pFV31ilvGM und FE6-1ΔyjfA/pFV31ilvGM von E. coli wird in Chargenkulturen von 10 ml, enthalten in 100 ml Erlenmeyerkolben, überprüft. Zur Durchführung dessen werden 10 ml eines Vorkulturmediums der folgenden Zusammensetzung: 2 g/l Hefeextrakt, 10 g/l (NH₄)₂SO₄, 1 g/l KH₂PO₄, 0, 5 g/l MgSO₄·7H₂O, 15 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose und 50 μg/ml Ampicillin, mit einer einzelnen Kolonie beimpft und für eine Dauer von 20 Stunden bei 33 °C und 200 Upm auf einem ESR-Inkubator von Kühner AG (Birsfelden, Schweiz) inkubiert. Aliquote von 200 μl dieser Vorkultur werden in 10 ml Herstellungsmedium (25 g/l (NH₄)₂SO₄, 2 g/l KH₂PO₄, 1 g/l MgSO₄·7H₂O, 0, 3 g/l FeSO₄·7H₂O, 0,018 g/l MnSO₄·1H₂O, 30 g/l CaCO₃, 20 g/l Glucose, 20 g/l β-Alanin, 250 mg/l Thiamin) geimpft und für eine Dauer von 48 Stunden bei 37 °C und 200 UPM inkubiert. Nach der Inkubation wird die optische Dichte (OD) der Kultursuspension mit einem LP2W-Photometer von Dr. Lange (Düsseldorf, Deutschland) mit einer Wellenlänge von 660 nm bestimmt.
Die Konzentration von gebildetem D-Pantothenat wird dann in dem steril filtrierten Kulturüberstand durch den Lactobacillus Plantarum ATCC8014-Pantothenattest gemäß den Anweisungen von DIFCO (DIFCO MANUAL, 10. Auflage, Seite 1100-1102; Michigan, USA) bestimmt. Die Kalibrierung wird unter Verwendung von Calcium D(+)-Pantothenathydrat (Katalognummer 25,972-1, Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland) bewirkt.
Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Kurze Beschreibung der Figuren:
1: pMAK705ΔyjfA (= pMAK705deltayjfA)
2: pTrc99AilvGM
3: pFV31ilvGM
Die Längendaten sind als angenähert zu verstehen Die verwendeten Abkürzungen und Symbole weisen die folgenden Bedeutungen auf:

cat:: Chloramphenicolresistenzgen
rep-ts:: Temperatur empfindliche Replikationsregion von Plasmid pSC101
ytfP'-yjfA':: DNA-Sequenz enthaltend verkürzte Kodierungsregionen von ytfP und yjfA
Amp:: Ampicillinresistenzgen
lacI: Gen für das Repressorprotein des prc-Promotors
Ptrc:: trc-Promotorregion, IPTG-induzierbar
ilvG:: Kodierungsregion der großen Untereinheit von Acetohydroxysäuresynthase II
ilvM:: Kodierungsregion der kleinen Untereinheit von Acetohydroxysäuresynthase II
5S:: 5S rRNA-Region
rrnBT:: rRNA-Terminatorregion
panB:: Kodierungsregion von dem panB-Gen
panC:: Kodierungsregion von dem panC-Gen

Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme weisen die folgenden Bedeutungen auf:

EcoRI:: Restriktionsendonuklease von Escherichia coli
HindIII:: Restriktionsendonuklease von Haemophilus influenzae
NsiI:: Restriktionsendonuklease von Neisseria sicca
SacI:: Restriktionsendonuklease von Streptomyces achromogenes
SalI:: Restriktionsendonuklease von Streptomyces albus
SmaI:: Restriktionsendonuklease von Serratia marcescens
SphI:: Restriktionsendonuklease von Streptomyces phaeochromogenes
SspI:: Restriktionsendonuklease von Sphaerotilus species
XbaI:: Restriktionsendonuklease von Xanthomonas badrii

Sequenzliste

Claims

Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder ihrer Erdalkalimetallsalze oder ihrer Salze durch Fermentierung genetisch modifizierter Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, wobei die Aktivität oder Konzentration der Proteine, die durch das offene ytfP-Leseraster, das die Nukleotidsequenz der Nukleotide 376 bis 714 von SEQ ID NO: 1 aufweist, und das offene yjfA-Leseraster, das die Nukleotidsequenz der Nukleotide 727 bis 461 des Komplements von SEQ ID NO: 1 aufweist, kodiert sind, auf 0% der Aktivität oder Konzentration der entsprechenden Proteine in den Startmikroorganismen reduziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mikroorganismen, die in dem ytfP ORF und yjfA ORF genetisch modifiziert sind, durch einen Mutationsvorgang erhalten werden, ausgewählt aus der Gruppe der -Transversion, -Insertion und -Deletion.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei a) die D-Pantothensäure und/oder ihre Salze im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen angereichert werden und b) wenn die Fermentation abgeschlossen ist, die D-Pantothensäure und/oder ihre Salze isoliert werden, wobei die Biomasse und/oder andere Bestandteile der Fermentationsbrühe in einer Menge von ≥ 0 bis 100 % abgetrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Fermentation in Gegenwart von Erdalkalimetallsalzen durchgeführt wird, die in der erwünschten Menge kontinuierlich oder chargenweise zugesetzt werden, und ein Produkt erhalten wird, das ein Alkalimetallsalz der D-Pantothensäure enthält oder daraus besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Mikroorganismen der Gattung Escherichia verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Mikroorganismen der Gattung Escherichia aus der Spezies Escherichia coli abgeleitet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, das das Verstärken eines oder mehrerer endogener Gene umfasst, ausgewählt aus der Gruppe umfassend a) das ilvGM-Operon, das für Acetohydroxysäuresynthase II kodiert, b) das panB-Gen, das für Ketopantoathydroxymethyltransferase kodiert c) das panE-Gen, das für Ketopantoatreduktase kodiert, d) das panD-Gen, das für Aspartatdecarboxylase kodiert, e) das panC-Gen, das für Pantothenatsynthetase kodiert, f) das serC-Gen, das für Phosphoserintransaminase kodiert, g) die gevT-, gevH- und gcvP-Gene, die für das Glycinspaltungssystem kodieren und h) das glyA-gen, das für Serinhydroxymethyltransferase kodiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Aktivität oder Konzentration der Proteine, die durch eines oder mehrere endogene Gene kodiert werden, ausgewählt aus der Gruppe ausgewählt werden umfassend: a) das avtA-Gen, das für Transaminase C kodiert, b) das poxB-Gen, das für Pyruvatoxidase kodiert und c) das pckA-Gen, das für PEP-carboxykinase kodiert auf 0% der Aktivität oder Konzentration der entsprechenden Proteine in den Startmikroorganismen reduziert wird.
Genetisch modifizierte Mikroorganismen der Familie Enterobacteriaceae, wobei die Aktivität oder Konzentration der Proteine, die durch das offene ytfP-Leseraster, das die Nukleotidsequenz der Nukleotide 376 bis 714 der SEQ ID NO: 1 aufweist, und das offene yjfA-Leseraster, das die Nukleotidsequenz der Nukleotide 727 bis 461 des Komplements von SEQ ID NO: 1 aufweist, kodiert sind, auf 0% der Aktivität oder Konzentration der entsprechenden Proteine in den Startmikroorganismen reduziert wird.
Mikroorganismen nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus aus der Spezies Escherichia coli stammt.
Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder ihrer Salze durch Fermentation der Mikroorganismen nach Anspruch 9 oder 10.
Verfahren für die Herstellung von Tierfutterzusatzmitteln nach Anspruch 1, wobei a) > 0 bis 100 % der Biomasse aus der Fermentationsbrüles entfernt werden, die durch Fermentieren erhalten wird und D-Pantothensäure und/oder ihre Salze enthält, b) die dabei entstehende Mischung wahlweise konzentriert wird, c) die Mischung, die die Pantothensäure und/oder Pantothenat enthält, durch geeignete Mittel in eine fließfähige Form umgewandelt wird, und d) ein fließfähiges Produkt mit einer Teilchengrößenverteilung von 20 bis 2000 μm, insbesondere 100 bis 1400 μm zubereitet wird.
Verfahren nach Anspruch 12 mit einem Gehalt an D-Pantothensäure und/oder seinen Salzen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Magnesium- und Calciumsalze, wobei a) Wasser wahlweise aus der Fermentationsbrüles entfernt wird (Konzentration), b) die während des Fermentierens gebildete Biomasse in einer Menge von ≥ 0 bis 100 abgetrennt wird, c) D-Pantothensäure und/oder ihre Salze wahlweise den Fermentationsbrülen zugegeben werden, die a) und b) entsprechend behandelt werden, wobei die Menge an zugesetzten Verbindungen derart ist, dass ihre Gesamtkonzentration im Tierfutterzusatzmittel im Bereich von ca. 20 bis 80 Gew.-% (Trockengewicht) liegt und d) das Produkt in der erwünschten pulverförmigen Form oder bevorzugt in Granulatform hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei ein Produkt in der erwünschten pulverförmigen Form oder Granulatform aus der Fermentationsbrüle erhalten wird durch a) Trocknen und Verdichten oder b) Sprühtrocknen oder c) Sprühtrocknen und Granulieren oder d) Sprühtrocknen und Pelletisieren, wahlweise nach Zusetzen von D-Pantothensäure und/oder ihrer Salze und wahlweise nach Zusetzen organischer oder anorganischer Hilfssubstanzen.